（应用化学专业论文）β氨基酸对映体的分离、分析和制备.pdf

中文摘要 由争氨基酸构成的拟多肽即争肽的药理活性和构效关系的研究是近年来药 物科学领域的热点问题之一。将b 氨基酸引入多肽结构中，克服了* 肽易被蛋 白水解酶降解、口服可获性低等缺陷，p 肽显示出抑制代谢的活性、具有更加稳 定的二级结构且与目标酶和受体显示更强的亲和力。b - 肽对映异构体在体内可能 表现出不同的药理活性和药代动力学性质。为了研究单一对映体的药理行为和代 谢途经，首先必须获得p 肽的单一对映体。如果合成p 肽的消旋体再进行拆分， p 肽为大分子物质较难拆分；如果对其中间体0 - 氦基酸进行拆分，由于肛氨基酸 为小分子物质且含有酸性和碱性基团，可选择的分离分析模式多、方法简便，得 到的单一对映体再制各b 肽就较简单易行。在奉论文中我们分别采用毛细管电泳 法和高效液相色谱法这两种高效、简便、快速且应用晟广泛的拆分于段，对争 氨基睃外消旋体进千j = 了于性拆分并对其拆分机理进行了探讨，而且实现了制各， 并在此基础上初步探索了化学法和酶法拆分b - 氨基酸。 为了快速测定消旋体中的对映体比例，我们首先建立了b - 氨基酸的毛细管电 泳手性分离分析方法。以洒石酸为原料经过酯化、酰胺化、环合、脱酰胺保护 等步骤合成了手性拆分试剂1 8 冠矗四羧酸( i g c 6 h 4 ) 。基于在低p h 时氨基酸 对映体以伯胺离子形式与1 8 c 6 h 4 形成的两种非对映体络合物，在毛细管电泳的 条件f ，两者具有不同的迁移时问而得以分离。以于性冠醚为手件添加剂的毛细 管电泳法成功地川f 五种b 氮基酸对映体的分离，分离凼子高达1 0 8 。实验结果 表明，该方法快速、简便，町以用于非色谱法拆分b - 氨基酸的监测疗法。 发展了b 一氨肇酸的高效液相色谱手性分离分析方法。首先在流动相中加入光 学纯m 氯基酸作为手性配体，通过流动相中c u “与b - 氨基酸的d 和型对映 体形成两种非对映体的络合物平衡常数的差别，在反相液相色谱系统中可实现b 一 氨基酸对映体的拆分。该法选择性高，但系统平衡慢、基线波动大，色谱柱易堵 塞。为了克服e 迓弊端，我们将上a _ 氨基酸键合于硅胶上，制备了手性配体变换 色潜固定相，用于肛氨基酸对映体的分离。结果表明该方法可实现肛氧基酸对 映体的快速定性、定罩分析，还可用于对映体的制各分离。 进一步研究了配体交换快速色谱制各旷氨基酸对映体的方法。选j e j 以阳离 子交换树脂和十八烷基键合硅胶为吸附剂的固相萃取法从色谱流出液组分中除 c u ”，并优化了纯化条件。 本文还对非色谱法如化学成盐法和酶法拆分弘氩基酸进行了初步的摸索。但 是未取得成效有待进步筛选成盐手性拆分试剂和酶。 关键词：b - 氢基酸，手性拆分，毛细管电泳法，1 8 一冠一6 _ 四羧酸，高效液相色谱 法，快速色谱，同相萃取 a b s t r a c t t h ep a s td e c a d eh a s ag r o w i n g m 把r e s ti n 争a m i n oa c i d s ，w h i c ha r e i m p o r t a n ti n t g r m e d i a t a sf o rt h es y n t h e s i so f c o m p o t m d so f p h a r m a e e r t i e a li n t e r e s ta n d a i m p o r t a n tc o n s t i t u e n t so f n a t n r a lp r o d u c t ss u c h a l k a l a i d s ，p e p t i d e sa n db - l a c t u m a n t i b i o t i c s t h ci n c o r p o r a t i e no fo fi - a l l l i n oa c i d sh a sb e e ns u c c e s s f u li nc r e a t i n g p e p t i d o m i m e t i c st h a tn o to n l yh a y ep o t e n tb i o l o g i c a la c t i v i t y , b u ta r ea l s or e s i s t a n tt o p r o t e o l y s i s e n a n f i o m e r so f1 3 - a m i n oa c i dp r o b a b l ys h o wd i f f e r e mp h a r m a c o l o g i c a l b e h a v i o r sa n du n d e r g od i f f e r e n tm e t a b o l i cp a t h w a y si nv i v o t o s t u d yt h e p h a r m a c o l o g i c a la n dm e t a b o l i cp r o p e r t i e so fc h i m ld r u g s ，t h ep u r ee n a n t i o m e rm u s t b eo b t a i n e d i nt h i st h e s i s w er e p o r tt h ed e v e l o p m e n to fc h i r a ls e p a r a t i o nm e t h o d s u s i n gc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) a n dh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y f h p l c ) a n dt h e i ra p p l i c a t i o n si ns e p a r a t i o no f l 3 - a m i n oa c i de n a n t i o m e r s t h et h e s i s w o r kc a nb ed e v i d e di n t ot h l - e op a r t sa sf o l l o w s ： f i r s t ，w ed e v e l o p e dac a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e t i cm e t h o df o rs e p a r a t i o no f a n a n t i o m e r so fb a m i n oa c i d s i nt h i s m e t h o d , c h j r a le l o w ne t h e r ( - ) - 1 8 - c r o w n 一6 一t e t m c a r b o x y l i ea c i d ( 1 9 c 6 吼1w a sc h o s e na sc h i r a lr e s o l v i n ga g e n t t h ec r o v f l e t h e rw a ss y n t h e s i z e di n - b e u s eb yf o l l o w i n ge s t e r i z a t i e n a m i d i z a t i o n , c y c l o n i z a t i o n ，a n dh y d r a l y z a t i o ns t e p s t h ec h i r a ls e p a r a t i o ni sb a s e do nt h ef a c t t h a tp r i m a r ya m i n e sw h i c ha l - ep r o t o n a t e da tl o wp hv a l u e sc a nb ee n c l o s e di nt h e c h i r a lc a v i t yo ft h ec r o w ne t h e r , t h u sf o r m i n gt r a n s i e n tc o m p l e x e so fd i f f e r e n t s t a b i l i t yf o rap a i ro fe n a n t i o m e r s a l lf i v e1 3 - a m i n oa c i dr a c e m a t e sw e l er e s o l v e d i n t oe n a n t i n m e r sb yt h ec h i r a lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sd e v e l o p e di f lt h i sw o r kw i t h s e p a r a t i o nf a c t o ru pt oi 0 8 + w ef u r t h e rm e a s u r e dt h eb i n d i n gc o n s t a n t sb e t w e e n 1 8 c 6 h 4a n db - a m i n oa c i d sa c c o r d i n gt om o b i l i t ys h i t tm e t h o d p r e l i m i n a r yr e s u l t s i n d i c a t et h a tc h i m ls e p a r a t i o nm o t h o db a s e do nc ew i t hc h i r a ln d d j t i r eo f f e r st h e m e r i t s o f e a s yo p e r a t i o na n d f a s ts e p a r a t i o n s o fb - a m i n o a c i d s t h e n ，w ed e v e l o p e dt w oh p l cm e t h o d st h a ta l l o wt h es e p a m t i n no f1 3 - a m i n o a c i de n a n t i o m e r sf r o mt h e i rs y n t h e t i cr a c e m a t f i r s t l y , e h i r a ls e p a r a t i o no f 争a m i n oa c i d sw a sa c h i e v e di nar e v e r s ep h a s el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p l c ) u s i n g o p t i c a l l yp u r el - p h e n y l a l a n i n ea snc h i r a lm o b i l ep h a s ea d d i t i v e ( c m p a ) t h ec h i r a l l i g a n di nt h em o b i l ep h a s ec a l lf o r md i a s t e r e o m e r sw i t hr a c e m i c1 5 - a m i n oa c i d si nt h e p r e s e n c eo fm e t a li o n ss u c ha sc u 2 + a n dt h ed i a s t e r e o m e r sc a nb er e a d i l yr e s o i v e do n ar p l cs y s t e m h o w e v e r , t h ec m p am e t h o ds u f f e r sf r o man u m b e ro fp r o b l e m s s u c ha ss l o we q u i l i b r a t i o n ，b a s e l i n ef l u c t u a t i o na n db l o c k a g eo ft h ee o l m n n w e m m c do u re f f o r t st oc h i r a ls e p a r a t i o no fb _ i r ma c i d su s i n gc h e m i c a l l yb o n dc h i r a l s t a t i o n a r yp h a s e sf c s p ) l i g a n de x c h a n g ec s p sw c r ep r e p a r e db yc o v e n f l yb o n d i n g l - a - a m i n oa c i d ss u c ha sl - h y d r o x y p r o l i n e ，l - p r o l i n ca n dl - p h e n y l a l a n i n eo n t ot h e 7 - g l y e i d o x y p r o p y i b o n d e ds i l i c a s u p p o r t ，w i t ha l la q u e o u ss o l u t i o n o f c u p p c rs u l f a t e a st h em o b i l ep h a s e ，f i v ed i f f e r e n t1 - p h c n y l a l a n i n cm c a t n a t e sw c l ea l lb a s e l i n e s e p m a t t x lo l lt h el - h y d r o x y p r o l i n el i g a n de x c h a n g ec s p s c h i r n ls e p a r a t i o nm e t h o d b a s e do al i g a n de x c h a n g ec s p sc a nb cr e a d i l ys c a l e du pf o rp r e p a r a t i v es e p a r a t i o n so f 1 3 - a m i n oa c i d s f u r t h e r m o r e ，w ed e v e l o p e dc h i m ll i g a n de x c h a n g ef l a s hc h r o m a t o g r a p h yf o r p r e p a r a t i o no f u p t i c a t l yp u r eg - a m i n oa c i de f l a n t i o m e r s t h ee f f e c t so f c o n s t i t u e n to f m o b i l ep h a s ea n ds a m p l ev o l u m eo nt h es e p a r a t i o nw t r l ei n v e s t i g a t e da n dt h e s e p a r a t i o nc o n d h i o n sw e r eo p t i m i z e d b e c a u s et h e1 3 , - a m i n oa c i de n a n t i o m e r s c o l l e c t e df r o mt h ec o t l l n l le x i s ti nt h ef o r mo fc o p p e rc o m p l e x e s ，s o l i d - p h a s e e x t r a c t i o nu s i n ge i t h e rc a t i o n e x c h a n g e r e s i no ro e t a d e e y lb o n d e ds i l i c aw a s d e v e l o p e dt or e m o v et h ec 一+ i o n sf r o mt h ep r e p a r a t i o n f i n a l l y , w ec o n d u c t e db f i c fi n v e s t i g a t i o ui n t on o n - e h r o m a l n g r a p h i cm e t h o d sf o r r c s o i n t i o uo f - a m i n oa c i dc n a u t i o m e r s e n z y m i ca u dc h e r u i c a r e s o l u t i o nx a t e , r e s t u d i e di nv i e wo f 1 0 w e r i n gt h es e p a r a t i o nc o s t sa n df a c i l i t a t i n gi n d u s t r i a lo p e r a t i o n s k e yw o r d s ：l l - a m i n oa c i d ，c h i r a ls e p a r a t i o n ，c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r c s i s ， 1 8 - - c r o w n 一6 一t c t r a e a r b o x y l i ca c i d s ，h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p b y , f l a s h c h r o m a t o g r a p h y ，s o l i de x t r a c t i o np h a s e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得盘壅盘茎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：秉i 夸各 签字目期： 土一6 年 月3 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盘鲞盘翌有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨壅盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据厍进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：秉 专务 签字日期：上“年1 月3 日 导师签名：歹歹 签字嗍跏6 年j - 月多日 前言 与r 氨基酸相比，b - 氨基酸在自然界存在较少，然而这类化合物近年来受到 越来越广泛的关注。b 一氨基酸是许多具有p 一内酰胺结构的抗生索的合成前体，有 些旷氨基酸本身就具有重要的生物活性。b 一氨基酸也被引入到肽类药物中用以修 饰肽链结构，增强其在生物活体内的稳定性和活性。某些旷氨基酸构成的p 一肽可 形成稳定的二级结构，并具有潜在的活性。由于上述领域对于特定结构的1 3 一氨基 酸的需求，促使有机化学家不断合成新颢的、有效的这类化合物。b 一氨基酸的两 个对映体在体内药理活性、代谢过程和代谢产物及引起的毒副作用等方面都可能 产生显著的差异而导致不同的治疗效果、副作用甚至毒性反应，这就需要有高 效、可靠、简便的方法分离分析和制备对映体。本文希望建立毛细管电泳法和高 效液相色谱法分离分析6 一氨基酸对映体，以及色谱法制备单一对映体的方法。 毛细管i u 泳法具有高敞、快速、简便、绎济、多模式等优点，用于分离氨基 酸对映体的手性选择剂有环糊精及其行j 生物、c u 2 和氨基酸络台物、大环抗生素 手性胶束和于性冠醚等，其中( + 卜1 8 - 冠- 6 一凹羧酸作为手性添加剂拆分了p 一苯丙氨 酸，所咀本文将合成( ) 1 8 冠6 四羧酸，作为手性添加剂加入到运行缓冲液中， 基于冠醚大环与被分析物b 一氨基酸对映体伯胺阳离子的络合常数的差异，将两个 对映体分离，以期建立一种非色谱法( 如生物转化法、结晶法、萃取法等) 拆分 制各单一对映体行之有效的监测方法。 高效液相色谱法用于直接 性拆分宵曲种模式，分别为f 性流动自j 添加法和 手性固定柏法，两种方法各有优势。本文基j 雕体变换的机理将对这两种模j 进 行考察，建立氩摹酸不经衍生化直接用于高效液相色谱法手性拆分的方法，通过 比较不同的拆分模式和不同结构被分析物的分离探讨拆分机理。以期能够实现根 据拆分对象设计手性配体。 液相色谱方法不仅可以测定复杂基质中药物的对映体含量，提供精确、实时 的分析结果，而且也可以实现对映体约物的大规模工业化制备。在手性药物的开 发过程中，液相色谱方法不仅可以检测每一步骤的产量和纯度，而且可以大大缩 短药物上市的时间，这一优点是其他力法所不具备的。本文将用液相色谱法制各 p 氨基酸对映体，并采用化学或色谱方法后续除杂，最终得到高纯度的两种单一 对映体，可测定旋光确定构哩，用于单一对映体药鲆活性的研究。 传统的拆分方法有结晶法和酶法，尽管这些方法仅能得到一种对映体，而且 纯度不高，但不需要特殊的仪器设备。本文将h 这两种方法拆分b 一氨基酸对映 体，寻找合适的于性拆分试剂干u 酶，为实现上业化大规模制备提供实验依据。 第一章文献综述 第一章文献综述 近年来，合成蛋白组成和非蛋白组成的氨基酸已经引起人们的极大兴趣，它 们是合成蛋白质、肽和许多具有生物活性的天然产物的起始原辩。其中q 氨基酸 的含量最丰富，是肽、酶、蛋白质的主要组成部分，也可以用作合成中的手性试 剂。b - 氨基酸在自然界存在较少但在肽中也存在，近年来，人们把越来越多的 注意力转向b - 氨基酸的研究。这是由于p 氨基酸在肽骨架修饰和天然产物中显 示了g f 人注目的生物活性，它也是肽修饰的一个有用手段。尤其是* 羟基b 氨 基酸抗癌药物的出现，更显示了b - 氨基酸这一类化合物的重要性。 氨基酸最广 为人知的一点，它是b 内酰胺和f l - 内酰胺抗生素的前体，具有潜在的生物活性。 研究发现，b _ 肽在水溶液中能够形成短链的二级结构。对于肽酶和代谢转化稳定， 可以模拟m 肽参与肽一蛋白和蛋白一蛋白之间的相互作用，这些都引起生物物理 学家和生物化学家极大的兴趣。 1 1 自然界存在的结构中包含旷氨基酸的分子 尽管b 氢基酸被认为是非天然氧基酸，但是从海洋生物和原核生物中分离出 的一些肽中包含争氯基酸结构通常它们都具有生物活性。 1 1 1 结构中包含b - 氨基酸的分子 p 甘氨酸是最常地的 氨基酸，在许多生物肽中都存在，如c r y l o p h y c i n 是 从蓝绿藻中分离得剜的具有肿瘤选择性的羧酚肽。j a s p l a k i n o l i d e 是从海绵体分离 得到的，结构中含有 酪氨酸，见图1 1 ，这种海绵体的代谢物具有驱虫，杀虫、 鱼毒素和抗真菌的活性。哺乳动物体内的肌肽是含有阻氨基酸的二肽，包含有 - g t y h i s 序列，是肌肉和兴奋组织中含量丰富的组分，且具有较强的、特定的 执氧化特性】。 酪氧酸、 图i - ij a s p l a k l n o l i d e 的结构 f i g1 - ! s m u c - u a i eo f j a s p l a k i n o l i d e 2 第一章文献综述 b 一氨基丁酸已经在无脊椎动物蠓体内发现，而且在植物体内也存在，但其功 能仍未知。 p h a s c o l o s o m i u 是结构中含有胍基的睢氨基酸，在肌肉中浓度相对较低，在 内脏中较高( 是体内用于磷酰基受体的肛碱的平均浓度的2 - 4 倍) 。同源的脯氨 酸酯m e - p h p r o o m e 和m e - j 3 h p r o - o e t 是a l c g ：ac a t g c h up a l m a e 体内挥发性生物 碱。 一些藻类体内还含有反式毗咯烷- 2 , 4 - 二羧酸，能选择性抑制谷氧酸酯的 转运，谷氨酸酯在哺乳动物的大脑中能激发神经递质。 1 1 2 结构中包含旺- 烷基一b 一氨基酸的分子 从印度洋海兔d o l a b d l aa u r i e u l a r i a 分离得到具有抗肿瘤和抑制细胞生长的 肽d o l a s t a t i n 。是包含2 甲基- 3 氨基戊酸的环状缩酚肽，动物实验表明对鼠科p 3 8 8 淋巴癌具有抑制细胞生长的作用。m a j u s c u l a m i d ec 是从一种有毒的蓝绿藻 l y n g b y am a j u s c u l a 中分离得到的包含n 一取代一b 一氨基酸缩酚肽，能控制许多真菌 植物p h y t o p h t h o r ai n f e s t m s 和p l a s m o p o r au i t i c o l a 的生长吼从天然植物a s t c r 协t 撕c m 中提取得到的a s t i n a 、b 和a s t e r i n ，结构中含有 ( + ) ( 月) - 3 一氨基3 一苯 基丙酸和环状戊酸，具有抗癌活性。细胞毒素环肽o n c h i n d i n 和m o t u p o r i n 结构 中古有长链和结构复杂的* 取代争氨基酸，o n c h m d m 含有一种新型的p 氨基酸， 3 一氨基一2 一甲基一7 一烯基辛酸( a m o ) 。m o m p o r i n 是t h e o n e l l as w i n h o e i 中的一种环 状戊肤，结构中有包含多个手性中心的* 甲基，6 一氨基酸a d d a ，是蛋白磷酸酶 1 抑制剂。 1 1 3 结构中包含- 羟基一b 一氨基酸的分子 羟基一争氩基酸是一类具有生物活性的重要化台物，如一些蛋白酶抑制剂是 由* 羟基一b 一氢荜酸衍生化而来的，可以模拟蛋白酶水解转化态而起到抑制蛋白 酶的活性，还有许多具有抗a i d s 和抗高血压活性。昂著名的抗癌药紫杉醇t a x o l 结构中就含有a 羟基8 氨基酸侧链，结构见图i 2 ，由聚氧化二萜烯和( 2 r 3 跏 苯基异丝氨酸构成，通过阻止肿瘤细胞在有丝分裂过程中微管蛋白的形成而使细 胞凋亡，已用于冶疗乳腺癌和卵巢癌，且研究表明b - 氮基酸侧链对于其抗癌活性 是必需的i j j 。 第一章文献综述 p 羟基- p - 氨基酸 图1 2 紫杉醇的结构 f t 9 1 - 2t h es t m c t u r eo f t a x o l 另一个具有重要生物活性的羟基一阻氮基酸是异苏氨酸，是糖肽类抗生素 i - n - ( t h r e o - 3 一氯基一2 羟基丁醇) - 2 ，3 二脱氧卡那徽索a 的侧链。 b e s t a t i n 是一个由( 2 s , 3 r ) - 3 一氨基2 一羟基4 苯基丁酸( ( 2 s , 3 e ) - a h p a ) 和厶 亮氨酸形成的二肽，结构组成示于图l 一3 。它是免疫应答修饰剂，能抑制氨肽酶b 和亮氨酸氨肽酶活性，但不能抑制氨肚酶a 、羧肽酶和肽链内切酶。通过氨基保 护实验证明，游离氨基对于活性是非常重要的。 图i - 3b e s t a t i n 的结构 f i g1 - 3s t r t t c n n eo f b e s t a t i n 两个合成的三肽k y n o s t a t i n ( k n d 2 2 7 和鼢蛆2 7 2 结构中含有 ( 2 s 3 曲一a h p a ，具有高度的h i v - i 蛋白酶抑制作用，是一种选择性抗a i d s 的 候选药物，当用( 2 s , 3 r ) 的差向异构体代替( 2 s , 3 s ) - a h p a 后活性大大降低。其他 一些包含a 羟基， 氨基酸结构的小肚也已经从海绵体或海藻中分离得到，如 k e r a m a m i d ef ( k f ) 是海绵体t h e o n e l i a 细胞毒素的天然产物，这种环肽结构中包 含异丝氨酸残基为侧链”l 。 s c y t o n e m y na 是从蓝绿藻s c y t o n e m as p 中得到的环肽，结构中包含一种新 型阻氨基酸( 2 s 3 r ，5 聊- 3 氨基- 2 ，5 , 9 - - - = 羟基1 0 苯基癸酸( a h d a ) i ”。m i c r o g i n i n 是一种线形四肽在浅水蓝绿藻m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a 中发现，包含新型的3 一 第一章文献缘述 氨基2 羟基癸酸，具有血管紧张桑转化酶( a c e ) 抑制活性，而起到抗高血压作用。 自然界存在的a c e 抑制剂有一些局限性，如口服吸收差、作用时问短、蛋白水 解酶稳定性差、快速胆汁排泄等，基于上述原因，合成了结构中含有时基- 弘 氨基酸的新型抗高血压药物，如环己基n o r s t a t i n e 和( 2 足，3 s y 3 氨基4 环己基2 - 羟基丁酸。 p 脯氢酸甜菜碱和反式4 羟基p - 脯氨酸甜菜碱是环状争氨基酸，存在于多种 海藻中，这砦化合物的存在是生物体的特性，甜菜碱对于植物细胞质随渗透压的 改变渗透的调节具有关键性作用。 1 2b 一氨基酸在哺乳动物体内的代谢 除了组成蛋白的氨基酸如天门冬氯酸( a s p ) 、谷氮酸( g i u ) 及其酰胺( a s h ，g i n ) 外，口- 氨基异丁酸( $ h a l a ) 也存在于哺乳动物的代谢中。p 氨基异丁酸的两个对映 异构体，r 型是胸腺嘧啶的代谢产物，而矗型足缬氨酸的代谢产物，用色谱法分 离对映体显示人尿中h 含有h - r - 1 3 h a l a - o h ，而且犁仅存在于血浆中。 1 2 1r - 1 3 一氨基异丁酸的代谢 1 9 5 1 年自然界存在的置岳氨基异丁酸首次从昧液中分离得到，随后发现这 种氨基酸的分泌属于隐性遗传，所以大部分人仅在尿液中分泌少量的r - 争氮基异 丁酸( 0 】7 p g m g 肌氨酸) 临床上一些病人先天性缺失丙酮酸酯转氨酶而分泌 大量的r b 氯基异丁酸。这种缺失症称为“高b 氨基异丁酸耐酸症”，成为人类 “代谢多形态”的丌端( 5 一1 0 的高加索人种和4 0 5 0 的弧洲人种) 。月一b 一氨 基异丁酸是胸腺嘧啶的代谢产物，_ 二氰胸腺啼啶和d 一脲基基弹丁酸为中问代谢 物。前三个步骤胸腺嘧啶分解代谢，产生r d 氨基异丁酸：而二、三和旧步，阿 糖胞苷和尿嘧啶分解代谢，产生b 丙氨酸。废物利用和嘧啶之问的平衡将会影响 r b 氨基异丁酸含量，由于争脲基基异丁酸仅在肝脏中有活性，所以其及前体物 质将会被转运到肝脏，生成r - 1 3 一氰基异丁酸。f i n k 等早期研究表明，小鼠肝叶 将 c h r j 4 c 】胸腺嘧啶转化为放射性标记的葡萄糖和丙氨酸。p 氨基异丁酸的第一 步代谢为丙酮酸酯作为受体的转胺反应。胄一甲基丙二酸半醛( r m m s ) 被转化 为丙酰辅酶a ，最终成为琥珀酰辅酶a ，由于这条代谢途径是s - m m s 的，它不 一定适用于排异构体。 尽管二氢嘧啶脱氢嘧啶酶和 丙氯酸台成酶缺失会引起嚣一p 氩基异丁酸合 成受损，但是致病原囚和相关临床表型还小明确。另一方面研究还发现，在肿瘤 状态下或d o w n 氏综合症，体细胞随着嘧啶的代谢而增长，r b 一氨基异丁酸的分 泌随着分解代谢向增强。在这种情况下，主要分泌贾异构体。因此b 氮基异丁 酸的分泌能用柬摔制肿瘤治疗的进展和反映。 第一章文献综述 1 ，2 2 争b 一氨基异丁酸的代谢 一些b - 氨基酸在旺- 氨基酸的代谢过程中发挥重要的作用。如厶缬氨酸在其 分解代谢过程中转化为b - 氨基异丁酸。这个途径最初的步骤包括一个可逆的转氨 作用，成为m 酮式戊酸 然后通过不可逆的氧化脱羧反应，生成异丁酰辅酶a ， 脱氢转化为甲基丙烯酰辅酶a 。c = c 双键立体选择性的承合作用，随后硫醇酯 水解得到墨p 羟基异丁酸。譬m m s 的羟基氧化后，转氨生成岛降基异丁酸。 由于s - m m s 通过甲基丙二酸半醛催化的可逆络合反应，主要转化为丙酰辅酶a ( 进一步代谢为琥珀酰辅酶a ) ，所以璺b - 氨基异丁酸在血浆中的浓度很低 ( 1 s 叫5f l i k 当脱氢酶缺失时，量争氨基异丁酸的浓度会增大( 3 0 “m ) ，同 时3 羟基异丁酸、3 氨基异丁酸、3 羟基丙二酸、阻丙氨酸和2 - 乙基- 3 羟基丁酸 的浓度也增大。有趣的是，既然这样争氨基异丁酸在屎液中两种异构体应该是 等量的，但是m 和蜃比例约为9 5 ：5 ，3 - 羟基异丁酸约7 5 s 异构体和2 5 r 异 构体，而2 - 乙基- 3 羟基丁酸仅有尽异构体。 通过研究病人的成纤维细胞来研究缬氨酸的代谢产物，从而判断甲基丙二酸 半醛脱氢酶的缺失。从 1 1 4 c 】缬氨酸到“c 0 2 的氧化反应是正常的，而从 2 一“c 】 缬氨酸到4 c 0 2 的氧化反应未检测到，表明低于异丁酰辅酶a 水平时，缴氨酸的 代谢被阻滞。2 啦标记的缬氨酸能够被代谢为l - 位m m s ，如果甲基丙二酸半醛 脱氢酶保持话性则会生成标记的碳二氧化物，因此成标记的碟二氧化物的缺失表 明病人体内m m s 脱氢酶的缺失。 1 3p 氨基酸在生物学和医药掌中的应用 尽管肽序列己被用作生物活性抗原。但是用作治疗的肢还有很多局限性。 小驮构型不稳定，而且易被代谢，限制了其药用：肽透膜性差、易被蛋白水解 酶降解、能被迅遽清除、且在许多情况下溶解性差、易聚集，这些都使肽口服 可获性低且缺乏特定的转运系统限制其有效地到达作用部位，易受到肠胃、 血液和其他组织蛋白酶水解作用而降解。因此肽必须在消化和循环系统中，在 各种蛋白水解酶作用下不被降解仍具有药理活性，这就需要增强其代谢稳定 性。为此将b 氯基酸引入肽结构中，克服l 述缺陷【6 1 。 b 氨基酸与m 氨基酸结构相似，均含有氢基和羧基末端，不同的是两个末 端官能团之同有两个碳原子，就使p 氢基酸的同分异构体比相应* 氯基酸的 多，而且p 氢基酸的二取代或多取代更增加了其数量。已有大鼋合成争氨基酸 的方法，提供了多种多样的8 氯基酸供使用，有许多文献综述报道 氨基酸外 消旋体和对映异构体的合成。将畦氨基酸引入肽结构中不仪具有潜在的生物活 性，而且能抵抗蛋白酶的水解。b - 氨基酸的应用不仅是单取代，而且结合环状 6 第章文献综述 争氨基酸，合成拟肽功能的p - 肽，这些d 一肽已经显示出抑制代谢和更加稳定 的二级结构。除此之外，研究表明踟肽与目标酶和受体显示更强的亲和力。 1 3 1b 一氨基酸结构的研究进展 m u l l e r - h a r t w i c g 等对包含* 和扣氮基酸环状二肽的合成与构象进行了研究。 他们合成结构中包含 1 ，4 】d i a z e p a n e - 2 ，5 - - 酮的七员杂环化合物。研究目的为同相 和液相合成八种典型的环状结构并研究它们的构象特性。固相反应使用5 - ( 4 - 甲 酸基3 ，5 一二甲氧基苯氧基) 一戊酸为连结剂( b a l 1 i n k e r ) 在氮甲基聚苯乙烯树脂 上反应。当连结上瑾- 、b 氢基酸和脱保护的氨基官能团，得到了二肽酯。在固相 上用n a o m e 的m e o h n m p 溶液处理使分子环合，产物用t f a 从树脂上切断。 溶液反应是通过b o c 保护的l a 氢基酸和酽氨基酸酯( e d c 小o b t ) 合成线形二 肽。当二驮的n 和c 末端脱保护后，3f n me d c h o b t 在d m f 中，线形二肽 环合。产物在d m s o 中室温保存数周仍保持较高的化学稳定性。用x - 射线和 n m r 研究分子构象，n m r 说明分千有三种构象，x 射线数据验证了n m r 的结 论。通常七员环显示了较强的刚性，所以该结构用于新的受体一配体结合模趔较 理想【7 i 。 r o y 等对b 杂交肽包含两个连续p 氨基酸残基的聚肽螺旋结构进行了 研究。合成的11 氯基酸肽t _ 丁醇羰基( b o c ) 一v a l ，a l a - p h e - a - 氨基异丁酸( a i b ) 僻) - 旷- 缬氨酸( p ) - ( s ) p j 苯丙氢酸( p p h e ) - a 社v 甜一a l a - p h c - a i b 一甲基酯( o m e ) ( 肽1 ：1 位残基为1 3 v a l 和p p h e ) 的构象研究表明在聚肽螺旋结构中插入两个 连续的b 一氨摹酸贱摹并没育弓j 起结构明显扭曲。晶体结构分析表明，包绕肽l 的2 1 0 个残蘑彤成的连续的螺旋构象。在插入照p h 段的位点，螺旋形的氢键 环张大。n ，p ，p 片段c 1 5 氢键和两个a , i x ，1 3 或p ，* 片段被表征。即戋基的晶体结 构通过测定构象角度得到，1 3 v a l 一5 ( = 一1 2 6 i = 7 酽，p s i = 一1 2 4 ) ，l j p h e 一6 ( - 一8 8 。，= 8 0 口，p s i = 1 1 8 ) ，肽n 末端在晶体中被部分展开。5 0 0 m h z1 h n m r 研究表明c d c l 3 溶 液中肽的整个链呈连续螺旋结构，可以作为诊断核极化效应的依据，根据- n h 化 学位移得知七个分子内氢键的存在m j 。 l u p p i 采用全合成的方法得到p 一假肽折叠结构( 4 r ) ( 2 - 氧- l ，3 - 唑啉4 手 乙酸( d - o x a e ) 。d - o x a c 结构中包括氧唑啉_ 2 酮和b 氨基酸基团，可能构建成一 种新型的b 一假肽折叠结构。n m r 研究构象。八聚体构象在水和氯仿中的研究， 表明低聚物在相容性溶剂妇水中折卺成规则的螺旋状结构。由于水溶液具有生物 相容性，所以这砦分子有望被用于牛物体【9 】。 近几年，科学家对新犁合成肽的设计和构建产生了浓厚的兴趣，如拟蛋白二 级结构( 旋转，螺旋和折叠) 。外露的未取代的、束编码的和非手性的b 一氨基 酸，如b 一丙氨酸( i j - a l a ，3 - 或 氩基丙酸) 插入a 氮基酸h 链中形成的独特的 第一章文献综述 结构影响肽骨架。为三维结构设计和构建的多样性提供了条件。使用x 射线单 晶衍射的方法分析由一些短的环状和非环状的包含b 一丙氨酸的肽的构象参数引 起的残基折叠一折叠行为的变化。除此之外，也使用了理论构象能量的计算和不 同的光谱方法如1 h - n m r 、f t - 1 r 和c d 等。结果表明，短链的旷丙氮酸肽选择 性邻位侧链取代基如线性或环状的对称碳a 一二取代甘氯酸和其他的构象制约 的影响对控制旷丙氨酸残基的两个亚甲基( c 矿一c 酽一) 的折叠一展开构象是 重要的。考虑到p 一丙氨酸在植物和动物机体的存在，且肽结构中引入旷丙氢酸 残基引起的肽结构的显著的多样性，能够抵抗生物酶的降解，生物物理学家和生 物化学家不仅要设计拟蛋白二级折叠结构的分子，并且要发展具有独特药物活性 的肽类似物”q 。 1 3 2p 一氨基酸用于受体激动剂和秸抗剂 早在3 5 年前b - 氨基酸就被用作受体激动剂的结构设计，二十世纪六十年 代至七十年代初报道较多冉匀是b 氨基酸取代肾上腺皮质激素( a c t h ) ，血管紧 张素i i ，霄泌素和催产素后构效关系研究。许多配体如神经肽、血小板集落刺 激素、类脂体转运系统和味觉配体也曾被研究。 早期对血管紧张素i i ( a s p - a r g - v a l - t y r - l l e - h i s - 1 o - p i l e ) 的研究是用b _ d - a s p 和p - l - a s p 代替a s p - 1 ，以肾切除小鼠为低血压模型发现替代后的同系物比血 管紧张素i i 的活性增强5 0 ，并且药效时间延长了2 3 倍。活性的增强与其 能完全抵抗亮氨酸氨肽酶有关i ”j 。 1 9 7 5 年合成了一系列血管舒缓肽( a r g - p r o p r o - g l y - p h e - s e r - p r o - p h e - a r g ) 同系物，其中碳末端f l - p r o 血管舒缓肽的血管减压活性与血管舒缓肽是相同的。 尽管只有 卧p r o 同系物在体内是稳定的，但两种同系物都能有效地抵抗血管紧 张素转化酶的降解。 在胃泌素抑制胃酸分泌的研究中，用弘l e u 、1 3 - a 8 p 或f l - p h c 代替，将胃泌 素激动剂b o e t r p - l e u - a s p - p h e 转化为胃泌素拮抗剂。研究表明争l “或 a 印 引入一个亚甲基并不影响肽的结合。由此可得，在l e u - a s p 连接中引入b 一氨基 酸，提高稳定性，不易被切断增强拈抗剂活性1 1 ”。 自从发现b o m b e s i n 受体拮抗剂能抑制细胞增殖，引起人们极大的兴趣， 在癌症治疗方面