（生理学专业论文）氯通道在cne2z细胞凋亡中的作用.pdf

氯送道在c n e - 2 z 纲脆凋亡孛薛作用 摘要 嚣豹：主要硬究氯通道怒颧剩对攫亡诱簿裁( 麒镪) 诱导粒c n e 一2 z 细腿氯电流、 a v d 及凋亡的影响，探讨氯通道在细胞凋亡过程中的作用及其可能的作用机制。 隽法；1 ) 选择矮铂菸为缨滋蠲亡诱导裁；2 ) 淡式缨跑术检测缨德淫亡；3 ) m t t 法检测细胞增殖；4 ) 膜片钳技术记录c n e 一2 z 细胞全绷胞电流，计算电流密度、 鬣逶遂隧断弃l 季窜剃率；5 掰s c i o ni m a g e 图像分耩获释溺萎缩藏壹径积蕊程。计 算标准密积、a v d 及a v d 抑制率。 结果： 1 ) 顺铂剂量依赖性诱导c n e 一2 z 细胞凋亡，三种浓度顺铂( 1 , 0 g m i ，1 5 g g m l ，2 0 p g m 1 ) 作用于细胞4 8 h 后，细胞凋亡率分别为( 1 4 0 0 2 2 5 ) ( n 2 9 ， p 0 ，0 5 ) ，( 2 00 2 3 5 ) ( n = 9 ，p 0 0 1 ) ，( 4 0 0 2 o ) ( n 2 9 ，p 0 0 1 ) 。 2 ) 氯通道阻断剂n p p b ( 5 0 h m o l l ，l o o 斗m o l l ) 能够抑制顺铂诱导的细胞凋 亡，其抑制率分别为：( 6 4 6 5 2 2 8 3 ) ( n = 9 ，p 0 0 1 ) ，( 8 4 ，3 6 1 2 7 0 8 ) ( n 2 9 ， p 0 0 5 ) ，( 7 70 2 35 ) ( n = 18 ，p 0 0 1 ) ，( 1 0 3 0 3 5 ) ( n 2 1 8 ，p 0 ，0 5 ) ，( 3 4 o 8 0 3 ) ( n = 1 8 ，p 0 0 1 ) ，( 6 54 4 6 3 ) ( n = 1 8 ，p 0 ，0 1 ) 。n p p b ( 5 0 ，1 0 0 m o l l ) 与顺铂( 1 5o m 1 ) 联合作用于 细胞4 8 h 后对细胞增殖的抑制率分别为( 4 4 4 9 1 6 8 ) ( n = 1 8 ，p 0 0 1 ) ，( 7 6 3 1 05 6 ) ( n = 1 8 ，p 0 0 1 ) 。n p p b ( 5 0 ，l o o “m o l 甩) 均能阻抑顺铂对c n e 一2 z 细胞造成的增旗抑制，其阻抑率分别为：( 3 0 5 1 8 2 6 ) ( n = 1 8 ，p 0 0 5 ) 。 5 ) 顺铂( 1 5 “g m 1 ) 灌流细胞时，在( 5 ，8 3 5 ) m i n 时激活一电流，其外向电 滚较之内向电流臻大，表现为弱乡 向优势，该电流逐渐增大，约2 0 分钟选到最 大值，细胞平均电流为一1 9 5 3 6 3 2 p a p f ( 一8 0 m v ) 和3 0 1 1 6 1 5 p a y p f ( 8 0 m v ) 。 6 ) n p p b ( 1 0 0 _ t m o l l ) 转逐遮攒测颞钩激活弱邀滚，其孛内淘邀浚撩镂率为 ( 9 3 ，2 1 4 6 9 ) ( n = 4 ，p 0 0 5 ) ，( 2 0 0 2 3 5 4 ) ( n = 9 ， p 0 0 1 ) ，( 4 0 、0 2 0 ) ( n = 9 ，p o o d 。图3 1 表示三种浓度顺铂作用于细胞4 8 h 后的凋亡率。随着顺铂浓度的增大，细胞凋亡率也随之增大。 表3 1 不同浓度顺铂对c n e - 2 z 细胞凋亡的诱导 t a b l e3 1a p o p t o s i si n d u c e db y d i f f e r e n td o s e so f c d d p 一 g r o u p s a p o p t o t i cr a t e ( ) c o n t r o l 0 1 0 肛倒c d d p 1 5 g m lc d d p 1 4 0 0 2 2 5 2 0 o 2 3 5 幸+ 2 0n g m lc d d p 4 0 0 + 2 0 ” p 0 0 1v sc o n t r o l , n = 9 5 0 o 图3 1 不同浓度顺铂对c n e - 2 z 细胞凋亡的诱导 r i g 3 1a p o p t o s i si n d u c e db yd i f f e r e n td o s e so f c d d p t h ec e l hw e 糟c d n l f e di nr p m i1 6 4 0 瑚期“啪i 珏2 5 c m ? c u l t u r ef l a s k sa tt h e3 7 ci na h u m i d i f i e d5 c 0 2i n c u b a t o rf o r1 6 h t h ec e l l sw e r et h e nc t f l t u r e di nt h em e d i u m w i t h o u t ( c o n t r 0 1 ) o rw i t h1 0 p g m lc d d p , 1 5 t t g m lo r2 o p g m lc d d p r e s p e c t i v e l y , f o r2d a y s a p o p t o s i sw a s d e t e c t e db yt h ef l o wc y t o m e t r y ( s e em e t h o d s ) t h ed a t ai nt h ef i g u r er e p r e s e mt h em e a n s s t a n d a r de r r o r ( n = 9 ) 3 5 柏 伯 一摹一甍_i d一苦苞。啦 3 。2 1 不阋浓度j 嫒镑对c n e - 2 z 细胞增殖的影响 为礤究簇键对c n e - 2 z 绷熙：噬殖豹影响，慰不露浓度蹶铂( 1 0 9 9 m t ，1 。5 牡西融，2 0 p g m 1 ) 侬用予细胞，观察增疆情况。每次实验均分为对照组和灾验缀， 每缎6 个样本，共羹复三次实验。圈3 3 表示三种浓度的顺铂分剐作用于c n e - 2 z 细胞2 4 h 、4 8 h 后的o d 值。结果驻示：顺钠剂量依赖性抑制c n e - 2 z 细胞增殖， 顺铂浓度为1 5 g m l 芹2 o 斗鲋【n l 时对增殖的抑制岛对照组相比有显著性差异 ( n _ 1 8 ，p 0 0 5 ) ，( 7 7 0 2 3 5 ) ( 畔1 8 ，p o 0 5 ) 、( 4 0 9 0 + 2 0 6 ) ( n = 1 8 ，p 0 0 1 ) 、( 5 9 3 2 3 2 1 ) ( n 2 l 8 ，p o ，0 5 ) ，( 3 4 o 8 0 3 ) ( n = 1 8 ，p 0 0 5 ) ，( 7 7 0 - 1 - 2 3 5 ) ( n = 1 8 ，p o 0 1 ) ，0 0 3 0 + - - 3 5 ) ( n - - t s ，p o 0 5 ) ， ( 3 4 o 8 0 3 ) ( n - - 1 8 ，p o 0 d ，( 6 5 4 4 6 3 ) ( n = 1 8 ，p o o 3 3 蹶铂诱导c 黼2 z 细胞氯电流螅产生及氯邋道阻暾剂对该电 流的影潦 将c n e - 2 z 缨穗放餮在灌流系统下，待全舞麓记漾模式形筏螽，： 0 m v ，然后按照0 ，+ 4 0 ，_ + 8 0 m v 循环往复。如图3 9 、3 1 0 所示，当细胞处于等渗 液中时，细胞电流非常小，而且很稳定，细胞平均电流分别为- 6 1 2 1 4 1 p a p f 和 7 1 7 ：- 0 7 5 p a p f ( 膜电位分别钳制于8 0 m v 和8 0 m v ) 。用含有c d d pfm 0 的等渗液灌流细胞时，在( 5 8 士3 5 ，n = 4 ) r a i n 时激活一电流，其外向电流较之内向 电流略大，表现为弱外向优势，该电流逐渐增大，约2 0 分钟达到最大值，细胞 平均电流为- 1 9 5 3 ：l - 6 3 2 p a p f ( - 8 0 m v ) 和3 0 1 1 - + 6 1 5 p a p v ( 8 0 m v ) ，所有被检测 的细胞均显示类似结果( n = 4 ，p 0 0 5 ) 。当c d d p ( 1 5g g m 1 ) 激活的电流趋于最 大时，加入n p p b ( 1 0 0 p m o f l ) ，细胞平均电流迅速减小至一7 0 3 + _ 2 2 4 p a p f ( - 8 0 m v ) 和1 0 2 5 4 - 3 8 6 p a p f ( 8 0 m v ) 。内向电流抑制率为( 9 3 2 1 4 - 4 6 9 ) ( n = 4 ， p 2 0 ) m | 星 m 蛄 晒 一摹一。日nioiiou a ：c o n t r o l o h c ：c d d p 佟鬻o b b ：c o n t r o l1 0 h b ；c d d p 佟用1 0 h e ：c d d p 与n p p b 联合作用o hf ：c d d p 与n p p b 联合作用1 0 h 蚓3 1 2n p p b 抑制c d d p 诱发的a v d ( 细胞图像) f i g3 1 2 i n h i b i t i o no f c d d p i n d u c e d a v db y n p p b ( c e l l i m a g e s ) 4 7 4 讨论 本漯题主爱磅究氯邋道嫩斯刻对淤亡诱导剂( 顺铂) 诱导的c n e 2 z 细胞氧 电流、a v d 及凋亡的影响，从而探讨氯通道在细胞凋亡过程中的作用及其可能 的作用机制。 4 i 顺铂对c n e 2 z 细胞凋亡的诱导 到目前为止，园内外研究报道均认为鼻咽癌化疗方案中以食有顺铂的联合化 疗方案较好 4 9 , 5 0 。我们的实验结果表明：顺铂处锺c n e 2 z 细胞4 8 h 后，流式细 胞仪可检测到细胞凋亡。而鼠随着顺铂浓度的增大，细胞凋亡率也随之增大。同 时我们的实验结乘驻示：顺铺( 1 sg g m ：) 筑连c n e - 2 z 细胞4 8 h 后，对c n e 一2 z 缅稔的增猿猕制率为( 7 7 0 5 8 ) ，对c n e - 2 z 缩穗酌谪亡诱导率为( 2 0 0 2 3 5 ) ，螽翳蘸染惫检溅戮懿缀巍笼亡率兔( 4 0 ，9 0 4 - 2 0 6 ) ，这提示颁镱 一方嚣逶遘诱搏缨腿躅宅寒秘鬏缀怼增疆，另一方委逐霹熬逶避菸它途径杀死缨 胞从薅按铡了缨魏煺殖f 5 j 。 4 2 氯通道阻断剂对c n e 一2 z 细胞凋亡的影响 在我们的实验中，氯通道阻断剂n p p b ( 5 0 9 m o l l 、1 0 0 i t m o l l ) w n 显抑制顺 铂济导的c n e 2 z 细胞凋亡，而且随着氯通道阻断剂n p p b 剂量的增加抑制作用 更明显，提示在细心凋亡诱导过程中可能有氯通道的激活，氯离子可能在细胞凋 亡过程中起重要作用。 在细胞增殖实验中，我们还发现5 0 9 m o l l 、1 0 0 1 t m o l l n p p b 均能够削弱顺 铂引起的增殖抑制。我们推测当顺铂作用于c n e 一2 z 细胞时，由于其诱导细胞凋 亡而造成的增殖抑制被n p p b 取消了。至于我们在细胞增殖实验中发现5 0 1 m o l l n p p b 比1 0 0 p m o l l n p p b 更大程度抑制了顺铂对c n e 2 z 细胞造成的增殖抑制， 其原因可能是n p p b 本身有浓度依赖性抑制细胞增殖的作用，使得l ( 1 0 p m o g l n p p b 对细胞凋亡的保护作用可能被其自身造成的增殖抑制所掩盖。 4 3c n e 一2 z 细胞凋亡诱导过程中氯电流的早期激活 以上研究已提示在细胞凋亡诱导过程中可能有氯通道的激活，氯通道可能在 细胞凋亡过程中起踅要作用。在本实验中用含有c d d p ( 1 5p 咖1 ) 的等渗液灌流 细胞时，在r 5 8 3 5 ) n 1 i n 时激活一电流，其外向电流较之内向电流略大，表现为 弱外向优势，该电流逐渐增大，约2 0 分钟达到璇大值。从隘下三方面的理由来 看，我们试为这种电流楚氯亳流； 1 ) 在置静窀毯锯销下毫流酶方离冬c i 滚魂方淘耀一致。本实验舞鼹靛缀耱 终漾流滚鞫毫撵两渡畜搿毙产生电滚黪是a - ，n 鑫+ 纛c a 2 + ，鼓援凑黪嚣浓嶷 ( 捷寇缨熬蠹e 1 浓痰) 与缨鼹终灌滚渡孛豹旺孳挺度 b f c i f 、可被阴离子通道阻断剂 阻断等【删。该通道的分子基础尚不清楚，但有几种通道或通道调节剂的候选蛋 白：m d r i 编码的p 糖蛋白【1 1 “甜、p l c l n 1 4 ，嘲、c l c - 2 1 6 】及c l c 3 t 7i $ 等。容积 激活性氯通道参与细胞容积调节、细胞迁移，细胞增殖等多种生命活动 2 9 , 3 - 3 3 1 。 新近研究还表明：容积激活性氯通道在细胞凋亡过程中起重要作用f l o 1 9 埘- 2 3 。 2 。缨溅容积调繁 在各种生淫窝藏理状态下，毒手缨稳内迄套艨或霄魂彩菝熬跨膜运动、大分 子豹合成或酶掰搜缨骢内渗透蛙物质戆浓凌发擞变优，导致缨施容敬处予不叛地 波动之书。为了避免细胞客积的过度改变，枫体产生自身容积调节枫铝虬即当纲胞 处_ 予低渗环境发生肿胀时，会激瀵细胞膜上的转运系统，将细胞内的k + 和c l “及 有机渗遴物等转运至细胞外，使细胞内渗遴压降低，水随之跨膜流出，引起调节 性容积回缩( r v d ) ，使细胞容积恢复正常。在大多数细胞，容积激活性k + 和c l 。通 道的激活是r m ) 的主要机制昝母。反之，当细胞处予高渗环境发生皱缩时，细 胞将通过调节性容积增：k ：( r e g u l a t o r yv o l u m ei n c r e a s e ，r v z ) 使容积恢复芷常。 但罴，在某些病理状态下，缃胞容积调节税箭紊乱，细胞发生持续住肿胀或 皱缩，最终将导致细胞坏死躐漏亡网。褥亡往维胞皱缩( a v d ) 怒发生在等渗 条传下黪一羁| 持缓性鲴耱皱缩，实际土就楚锤骢容积调节紊蘸豹表璃隅。b o r t a c r 阁等人逸发魏：程缺丢爻铤瓣缨腿，惑渗盛动缨魏溺亡。凑蘧疆冤缨魏溺亡每纲 胞褰积调节密甥摆关。 3 细胞凋亡早期，容积激活性氯通道的激活 近年来研究显示：多种类型的细胞在凋亡早期，发生了细胞内离子成分的明 显丢失，主要是s d 、k + 和c l _ 的丢失1 1 9 2 0 。s z a b o 等口1 1 用c d 9 5 受体诱导t 淋巴细胞凋亡过程中记录到一外向整流性氯电流，氯通道阻断剂阻断可阻断该电 流。后来人们又分别在诱导e c v 3 0 4 细胞【1 9 1 、新西兰兔心肌细胞吲、爪蟾卵母 细胞嘲凋亡过程中记录到该电流，该电流多表现为：快速激活，缓慢失活，弱外 向整流性，依赖于细胞外氯离子浓度，可被传统的氯通道阻断剂阻断等，该电流 的特性与容积激活性氯电流的的特性完全相同。p o r c e l l i 等人【1 9 】发现，在诱导 e c v 3 0 4 细胞凋亡过程中，8 - 1 0 r a i n 时可记录到膜电导的变化，1 5 - 2 0 r a i n 时容积激 活性电流达到最大值，3 0 m i n 后可记录到昵显的a v d 。这些实验提示在细胞凋亡 的早期激活了容积激活性氯通道，引起了氯离子的外流，并进一步导致细胞皱缩 ( a v d ) 及其它生化过程的发生。m a c h o 等人渊和d a n g l e m o n t d e t a s s i g n y a 等人 瞄】均发现：氯通道阻断剂可以阻抑a v d 及其它生化过程的发生，保护细胞兔于 凋亡。 为了避一步证明该氯通邋是器积激活雠氯通道丽不感其它类型的氯通道。 s o u k t a n i 等入1 2 3 】将e g t a 加入缅胞灌流液中，发现该电流的激活并不依赖予臆矫 酌e a 2 + ，c p 通道黻辑荆并不挠| l 臣新诧淮流，觳该逶逶不可驻是c a 2 + 。激滴往氯 遴遴。同撵，s z a b o 等脚，露c d 9 5 诱导t 漆跫缎貔涌之过程串，虽然有戴毫滚 粒激瓣，爨是缨缝内豹c a m p 零乎势没窍发生改变，魄没骞激溪p k a ，嚣她该 邋道也不弼能是c a m p - 激活性氯邋遂。 绦上所述；在绷腿稠亡早期，磬积激活性氯通道螅激溪箍引起甜羚溅可能 是触发细胞凋亡的关键。 4 容积激活性氯通道与a v d 根据容积激活性氯电流的特性，人们很容易把它与细胞容积调节联系起来。 a v d 是细胞凋亡早期的一个必经过程，是细胞凋亡的一个鲜明特征，具有普遍 意义p 丑矧。m 等入渊发现：将发生a v d 的细胞暴露于低渗溶液时，细胞发 生r v d 的速度加快，氯通道阻断剂可阻断a v d 的发生及r v d ，保护细胞免于 凋亡，因此他们提出，a v e ) 可能与r v d 有共同的离子机制，即a v d 的发生可 能也是由于容积激活性k + 和c i 通道的开放引起的。细胞凋亡早期过程中，容积 激活性氯通道的激活是对这一论点的有力支持。e c v 3 0 4 细胞凋亡过程中，容积 激活性氯电流产生在前，a v d 发生在后【1 9 】。在诱导心肌细胞凋亡过程中，在给 予凋亡诱导剂l m i n 时便可记录到一快速激活的弱外向电流，几乎同时观察到了 a v d 的发生阎。这些结果提示，容积激活性氯通道可能通过细胞容积调节，引 起a v d ，参与细胞凋亡过程。 但是，某些实验对上述观点提出了异议。在巨噬细胞b 5 1 ，细胞凋亡的发生并 不依赖a v d 。除此之外，s z a b o 口1 】等人用c d 9 5 诱导t 淋巴细胞凋亡过程中，除 了激活氯电流外。还观察到细胞内p h 的明显下降，抑制该电流，同时也抑制了 细胞内的酸化，保护细胞免予凋亡。因此认为，在细胞凋亡过程中，容积激活性 氯通道可能通过影响细胞内p h 而发挥作用。 5 细胞凋亡过程中容积激活性氯通道的触发机制 在凋亡诱导早期，细胞是怎样捕捉到凋亡信息从而激活容积激活性氯通道的 呢? 目前还不清楚。v a r c l a 等人口6 】研究显示：在细胞凋亡过程中，外源性h 2 0 ： 可诱导氯电流的激活，同时还激活了n a d p h 酶。同时v a r e l a 等人刚还发现：表 皮生长因子能增加h 2 0 2 的产生，也能激活襻积激活性氯电流。以上研究提示： n a 转髓酶滚性h 2 0 2 霹毙怒一令营遽熬售墨转导分子，参与谖节爨离子遥灌斡 激活。另一然研究表明：某些蛋白激酶途径可能参与了细胞