（动物学专业论文）人类心脏发育候选新基因hnulp1的克隆与功能研究.pdf

摘要 碱性螺旋一环一螺旋蛋白( b a s i ch e l i x - l o o p h e l i x ，b h l h ) 是真 核生物中的一种特殊的转录因子，它们在神经发生、肌细胞发生、心 脏发育和血细胞发生、癌症发g 三过程中发挥着重要的调节作用。 h n u j p l 就是本文作者在利用生物信息学方法筛选人类心脏发育候选 基因的过程中发现的一个人类新基因。其c d n a 全长2 2 7 0 个碱基， o r f 全长2 0 3 1 个碱基，编码一个长6 7 6 个氨基酸残基的蛋白质。该 蛋白包含一个b h l h 和一个功能未知命名为d u f 6 5 4 的结构域。在小鼠 等物种中均发现了它的同源蛋白，并且它们之间具有极高的保守度， 说明此蛋白所在的亚家族可能具有相当重要的功能。组织表达分析表 明该基因在胚胎和成体中有不同的表达模式，且在成体心脏组织中有 较高水平的表达。荧光素酶报道基因信号途径分析表明，该蛋白作为 一个转录抑制子对s r f 信号途径起着极强的抑制作用，并且该抑制作 用通过新的未被鉴定功能的d u f 6 5 4 结构域表现出来。这些结果预示 着人类b h l h 转录因子h n u l p l 在心脏发育的晚期通过s r f 信号途径 对心脏发育起着重要的调控作用。 同时，我们还通过酵母双杂交实验筛选剑人类心脏特异性表达基 因f h l 2 作为h n u l p l 的相互作用侯选蛋白。随后，我们通过免疫共沉 淀技术证明了其在细胞内的相互作用。荧光共定位实验结果表明 h n u l p l 与f h l 2 共定位于细胞质与细胞核中。荧光素酶报道基因分析 表明f h l 2 对h n u l p l 的转录活性起到负训控作刚。该实验结果为进一 步研究h n u l p l 在心脏发育中的功能，以及f h l 2 与h n u l p l 的相互作 刚模式打下了基础。 关键词：心血管疾病，h n u l p j ，f h l 2 ，s r f 信号途径，转录活性， d u f 6 5 4 结构域，碱性螺旋一环一螺旋蛋白 a b s t r a c t t h eb a s i ch e l i x l o o p ：h e l i x ( b h l h ) p r o t e i ni sad i s t i n c t e u k a r y o t i ct r a n s c r i p t i o nf a c t o ri n v o l v e d i nm a n yi m p o r t a n t p h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e s ， w h i c hi n c l u d en e u r o g e n e s i s ， m y o g e n e s i s ，t u m o r g e n e s i s ，h e m a g e n e $ i sa n dd e v e l o p m e n tp r o c e s s i nt h e p r e s e n ts t u d y ，w er e p o r t t h ei d e n t i f i c a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o no fan o v e lb a s i ch e l i x l o o p h e l i xp r o t e i n ， h n u l p l ，f r o mah u m a ne m b r y o n i ch e a r tc d n ali b r a r y t h ec o m p l e t e s e q u e n c eo ft h eh n u l p lc d n ais2 2 7 0 b p inle n g t ha n dc o n t a i n s ap u t a t i v eo p e nr e a d i n gf r a m eo f2 0 3 1n u c l e o t i d e s ，w h i c h e n c o d e sap u t a t i v ep r o t e i no f6 7 6a m i n oa c i d s t h i sp r o t e i n c o n t a i n sab h l hd o m a i na n dad u f 6 5 4d o m a i ni nn 。t e r m i n a la n d c - t e r m i n a l ，r e s p e c t i v e l y h n u l p i i s h i g h l yc o n s e r v e d f r o m y e a s t ，z e b r a f is h ，c h i c k e n ，彳t h a l i a n a , ee l e g a n s , d r o s o p h i l a e t om o u s e ，w h i c hs u g g e s t st h a ti tp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei n e v o l u t i o n n o r t h e r nb l o t t i n ga n a l y s i ss h o w st h a ta2 3 一k b t r a n s c r i p te x p r e s s e db r o a d l yi nb o t he a r l yh u m a ne m b r y o n i ca n d a d u l tt i s s u e s ，e s p e c i a l l yw i t hah i g h e rl e v e li na d u l th e a r t t h ea n a l y s iso ft h eg a l 4l u c if e r a s er e p o r t e rg e n ei n d i c a t e d t h a th n u l p lf u n c t i o na sat r a n s c r i p t i o n a ls u p p r e s s o ra n dc a n i n h i b i tt h et r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t i e so fs r f f u r t h e r m o r e ， t h ed u f 6 5 4m o t i f r e p r e s e n t s t h eb a s a lt r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s i v ea c t i v i t y t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a td u r i n gt h el a t e d e v e l o p m e n to fh e a r th n u l p lm a yb ei n v o l v e di nt h er e g u l a t i o n o ft r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t i e so fs r ft h r o u g hd u f 6 5 4d o m a i n m o r e o v e r ，w eid e n tif ie dt h a tt h eh e a r ts p e c if ice x p r e s sio n g e n ef h l 2i sac a n d i d a t ei n t e r a c t i n gp r o t e i no fh n u l p lb yu s i n g t h ey e a s tt w o h y b r i d iz a ti o ns y s t e m n e x t ， w ec o n f i r m e dt h e i n t e r a c t i o n o ft h e s et w op r o t e i n si nt h ec e ll sb yu s i n g i m m m u n o p r e c i p i t a t i o na n a l y s i s s u b c e l l u l a rc o l o c a l i z a t i o no f t h e s et w op r o t e i n si n d i c a t e dt h a th n u l p la n df h l 2c o l o c a li z e d i n c y t o p l a s m aa n dn u c l e a r g a l 4l u c if e r a s er e p o r t e rg e n e a n a l y s i ss h o w st h a tf h l 2i n h i b i t st h et r a n s c r i p t i o n a la c t i v i t y o fh n u i p i t a k e nt o g e t h e r ，t h e s er e s u l t st h e r e f o r el a y ss o li d b a s i sf o rt h es t u d yo ft h ef u n c t i o n a li n t e r a c t i o no ff h l 2a n d h n u l p l k e yw o r d s ：c a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e ，h n u l p l ，f h l 2 ， s r fs i g n a l t r a n s d u c t i o n ，t r a n s c r i p t i o na c t i v i t y ，d u f 6 5 4d o m a i n ，b a s i c h e li x 。l o o p h e li xp r o t e i n i v 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文，p 已经注明引用的内容外，本论 文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：寿弱 渺多年月。日 渺秒年参月日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留，使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密酣，在乡年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 。( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名：霹糌日期：础多月日 导师签名：缓葭厶 日期：u 年6 月 日 人类心脏教育候选新鉴内h n u 加，的兜隧目l 功能训f 究 1 引言和文献综述 1 1 碱性螺旋一环一螺旋基因家族的结构特点 凡足能与d n a 结合的蛋白大都具有两个共周特征，即存在结合d n a 的螺旋区和形成蛋白质二聚体的能力。b h l h 蛋白同i 时具有这两个特 征，并且含有大概由6 0 个氨基酸残基构成的序列。在这个区域的n 末 端足可以识n 6 个核苷酸保守序列的e 盒的碱性区域，该碱性区域含有 1 5 个氨基酸，其中大约有6 个保守残基“1 。b h l h 转录因子的碱性区域 与特异性的d n a 序列即e 盒结合，不同家放的b h l h 蛋白所识别的e 盒序 列也有所不同。1 。氨基酸序列的c 一末端含有两个两亲性的。螺旋， 螺旋区长1 5 - 1 6 个氨基酸，每个螺旋区都含有儿个保守残基，两螺旋 之间是一个不同长度的连接区( 环) ( 如图1 一1 ) 。 碱性区域螺旋环螺旋 围卜1 碱性螺旋环一螺旋的结构示意囤 两个b l 蛋白通过两个螺旋相应表面的琉水残基的相互作用，可形成同舜二泉体，也可以彤 成异源二聚体这些两素性螺旋形成二聚体的能力是所有i i l i t 蛋白质都具有的 域1 。学似论文 围卜2 碱性螺麓一环一螺旋二聚体结合d 的模式雷 螺旋一环一螺旋是双重结构城，螺旋一环一螺旋区域既是形成= 聚体的结构域又是彤成螺旋的区 域碱性区域( b a s i cr e 2 i 0 1 1 ) 是 i n k 结台区域 由b h h 蛋白组成的二聚体与d n a 结合的能力各不相同，其d n a 结合j ：j j 能是山一个较短的富含碱性氨基酸区所决定的。例如，e 4 7 同 源- 二聚体、e 1 2 一e 4 7 异源二聚体和m y o d e 4 7 异源二聚体都能高效结 合d n a ，然而e 1 2 同源二聚体丑容易形成但与d n a 结合力差，m y o d 同 源二聚体化能力也很差“。 b h l h 蛋白可以分成两利类型：“是普遍发达的蛋白质，如哺乳 动物的e 1 2 e 4 7 ：二是以组织特异办式表达的蛋白质，如m y o d 、肌生 成索( m y o g e n i n ) 、和m y f 一5 ( 肌肉形成过程一i ，的炎转录斟子) ”1 。组 织特| 片的b b l h 蛋白可以与酱遍表达的配体形成异源二聚体，这利，异 源二聚体的碱性区域( + 十+ ) 与干日对应的e 盒( c a n n t g ) 序列相互作用， e 盒序列位于靶基因的调仃区域的d n a 结合区域( 蓟i 图卜3 ) 。 人类心脏发育候选新基冈h n u 加，的兜隆和_ l ：j j 睫 l f 究 b h l h 蛋白家族成员的转录作j _ i ；j 是通过与它蛋白形成周源或异源 二聚体复合物并与d n a 结合来完成的。只有两个含有碱性区的b h l h 蛋白亚基结合所形成的二聚体才能与d n a 结合 有一些h l h 蛋白虽可 以与碱性螺旋一环一螺旋蛋白形成异源二聚体，但是由于没有碱性区 域，所以不能与d n a 结合( 图卜4 ) “”。 键豁铱豁远 r n a 转旱 田卜3 碱性螺旋一环一螺旋蛋白的作用模武圈 改绘自g o n er lcd ls s e c i i o f fo fh e a 儿d o v e lo p l c nl ) 硕+ 学位论文 a b 缺乏- 与d n a 结合的能力 。刀毽彩吣氐 图卜4h l h 蛋白二聚体通过碱性区域与d n a 结合 ：两个碱性h l h 蛋白形成的二聚体，可以通过碱性区域与d n a 结合：b ：碱性h l h 与非碱性 h l h 蛋白形成二聚体，因为一个亚单位缺乏碱性区，该二聚体不能与d n a 结合 1 2 碱性螺旋一环一螺旋蛋白的分类 b h l h 基序是m u r r e 等在研究鼠的转录因子e 1 2 不n e 4 7 的过程中发现 的，最早的分类方法是根据蛋白在组幺一1 1i c l i 的分布、d n a 的结合特异性、 可能存在的二聚体等各种特性，把b h l h 蛋白家族分成6 类脚1 。最近， 随着b h l h 蛋白种类的不断发现，其分类方法也有所改变。最新的分类 方法是通过进化关系，根据与e 盒( e - b o x ，其序列为c a n n t g ，其中n 代表任何碱基) 结合基序的数量、其它残基的保守性以及有无其它的 结构域等特征把b h l h 蛋自家族分h e a 、b 、c 、d 四大类1 。基因组测 序工作的完成使b h l h 蛋白家族又增添了两个成员e 、f ( 表1 一1 ) 。表卜1 4 人类心脏发育候选新基冈砌，加，的兜隧硐f 功能研究 足根据进化分类的，分类的一个基本特征为是否有其它的结构域，其 中最常见的结构域是p a s 、o r a n g e 和亮氨酸拉链结构域。 表卜l 螺旋环螺旋蛋白的分类 券羹组 描述 膏u r r e 的分类 举例 a n b 组的b h l h 蛋白是能与e 盒序列结合的，其中a 组成员是与 c a c c t g 或者c a g c t g 的d n a 序列结合，而b 组成员则是与c a c g t g 或者 c a t g t t g 的d n a 序列结合。几乎所有的酵母和植物b h l h 蛋白都属于b 组。 b 组是b h l h 家族中最常见的的蛋白，通常在第二个螺旋附近含有 一个亮氨酸拉链结构域( 1 e u c i n ez i p p e r ，l p ) ，位于碱性螺旋一环一 螺旋的c 一末端，可形成蛋白质一蛋白质二聚体”3 。只有一个亮氨酸拉 链结构域与碱性区域相连的蛋白是碱性一亮氨酸拉链，命名为b z i p ( b a s i cl e u c i n ez i p p e r ，b z i p ) 。碱性亮氨酸拉链蛋白质分子的肽链 上每隔6 个氨基酸就有一个亮氨酸残基，形成q 一螺旋，结果就导致这 些亮氨酸残基都在a 螺旋的同一个方向出现。亮氨酸残基问的疏水作 j j 力形成一条拉链，产生蛋白质二聚体( 如图1 - 5 ) 。该二聚体的另一 端的肽段富含碱性氨基酸残基，利用其正l 乜荷与d n a 双螺旋链上所带 埘十学似论文 负l u 荷的磷酸基团结合( 如图卜5 ) ，若不形成二聚体则与d n a 结合的 米和力明显降低。m a x 是含有亮氨酸拉链的b h l h 蛋白，主要是与b 组的 j e 它成员如m y c 、m a d 、m n t 和m g a 等形成二聚体，这些二聚体复合物都 含打一个特异的d n 结合基序。 一魁矗驰 怒 ：篙 囤卜5 碱性亮氟醺拉链结构及其与d n 的结台 c 组蛋白通常含有一个p a s 结构域。p a s 结构域是以3 个含有p a s 的蛋白的第一个字母命名的，即果蛐p e r 蛋白、人芳香羟受体核易位 子( a r n t ) 和果蝇s i m 蛋白。p a s 结构域通常位于碱性螺旋一环一螺 旋的c 一末端，但是不像z i p 结构域，不直接与碱性螺旋一环一螺旋区 相邻。它能与a c g t g 或者g c g t g 的d n a 序列干日结合。p a s 结构域大约 有2 6 0 3 1 0 个残基，含有5 - 6 个反f 行的b 一折叠、3 - 4 个q 一螺旋以 及与b 一折叠相连的环，这种结构类似于手套，其主要功能是与各种 小配体结合，或者与其它的p a s 蛋白和非p a s 蛋白相结合。 d 纰蛋白只含有螺旋一环一螺旋区域。没有碱性结构域，因而不能 人类心脏发育候选新基冈h n u i p ，的兜隆羽l 功能研究 与d n a 结合。这组蛋白的主要功能是抑制a 类的碱性螺旋一环一螺旋蛋 白与d n a 结合。 e 组蛋白能够与n - b o x 基序c a c g c g 或者c a c g a g 的d n a 序列结合， 通常含有一个o r a n g e 结构域和一个w r p w 基序“引。o r a n g e 结构域也 是位于b h l h 蛋白的c 一末端，含有3 0 个氨基残基。含有o r a n g e 结构 域的b h l h 蛋白和h e y 蛋白组成了进化关系的e 组，其功能目前还不 是很清楚，有人认为可能与分子的聚合有关系。w r p w ( 色氨酸一精氨酸 一脯氨酸一色氨酸) 基序大多数位于蛋白的c 一端，能够与抑制蛋白 g r o u c h o 相互作用，为发挥转录抑制活性所必需。 f 组蛋白主要是c o e 家族n 3 1 。c o e 含有一个类似锌指结构的结合 d n a 的结构域、一个功能不明的类似免疫球蛋白的结构域和一个四螺 旋结构域，这组蛋白的主要功能可能与d n a 结合和形成二聚体有关。 1 3 碱性螺旋一环一螺旋转录因子的功能 b h l h 蛋白的作用体现了转录调控的两个基本原则，即少量蛋白质 形成复合物。在与d n a 结合和转录调控方面，特定的复合物组合可能 具有不同的功能。到目前为止对组织特异性和广泛存在的b h l h 蛋白 质的相应功能还不完全理解。同一组的蛋白质是通过参与复合物来行 使其功能的。分化作用既可以依赖非碱性h l h 组特定抑制蛋白质的存 在，也可以依赖于这些特定抑制蛋白的缺失。b h l h 蛋白对多种细胞系 或组织的发生和发育有重要的调控作用，尤其对神经发生、血细胞的 发生、肌细胞的发生、心脏发育和肿瘤发生等均有着重要的作用( 表 烦十学位论文 l 一2 ) 。 表1 - 2 碱性螺旋一环一螺旋蛋白的调控作用 1 3 1 碱性螺旋一环一螺旋转录因子与神经发生 一部分碱性螺旋一环一螺旋蛋白控制脊椎动物的神经发生。例如： 脊椎动物中的m a t h - 1 和n e u r o g e n i n s 对最初的神经细胞的决定有着重 要的作用，而n e u r od 、n e u r od 2 、m a t h - 2 $ h 其它的因子是分化因子 n 札i s ，m a s h l 与自主神经系统和嗅觉神经系统的产生有密切的关系。 小鼠基因打靶试验证明，鼠的a t o n a l i 亩j 源基i 天j i m a t h l 与小脑颗粒神经 元和小脑表层生发层的发育有关系引，同时m a t h - 1 还与内耳毛细胞的 发育有关n 。将与n e u r od 有关的b h l h 因子n e u r o g e n j n1 ( n g n l ) m r n a 注入到爪蟾胚胎，能导致神经发生的异位和舱，r d 刎) 表达。尽管爪蟾 n e u r o g 的表达也促进了神经元异位的产生，但是它并不激活n g n l 的表 达n 引。n g n l 敲除鼠不能激活n e u r o l 样, j 表达，并存在脑感觉神经的发育 缺陷。b h l h 因子除了在神经发生过程中有激活作用外，也有的b h l h 人类心脏发育候选新基冈h n u 勿7 的兜降雨f 功能研究 因子抑制神经的发生。例如，艇s 1 ( h a i r ya n de n h a n c e ro fs p li t ) 基因缺失鼠的神经管有缺陷，这可能是神经发生过早的结果u 9 1 。 螺旋一环一螺旋因子的i d 家族在神经发生过程中也起着重要的作 用。i d 蛋白主要与b h l h 形成二聚体，这些i d b h l h 异源二聚体不能结 合d n a 。大多数b h l h 蛋白正调节细胞分化，因此i d 蛋白被认为是细胞 分化相关b h l h 蛋白与d n a 结合的抑制剂。i l f l i 乳动物的4 个乃基因在发育 中的脑和脊髓均有表达，墟因这种特异性表达说明每一个基因都执 行一种特异的或者非冗余的作用。鸡胚的逆病毒介导的过表达试验证 明燧因能促进神经的过早发生。另外，鼢位可以使外胚层转变 成神经嵴细胞，说明在这些组织中的过早蛋白对决定细胞最终分化成 神经细胞还是表皮细胞有一定的作用陋埘。 1 3 2 碱性螺旋一环一螺旋转录因子与血细胞的生成 b h l h 蛋白的一个转录因子干细胞白血病( s t e mc e l 1l e u k e m i a ， s c l ) 蛋白对造血作用有着重要的作j 一日，而且与急性t 细胞白血病有关。 b h l h 蛋白s c l t a l l ( t - c e lla c u t el y m p h o b l a s t i cl e u k e m i a ) 对于 所有的生血细胞系的发生有重要的意义，小鼠的勉：仿- - 基因突变会 导致早期胚胎致死和完全没有血液。t a l l 缺失鼠的胚胎、胎盘和卵黄 囊中没有未成熟的红细胞，说明t a l 尉红细胞的发生有重要作用。研 究还发现t a l l 蛋白还参与b 细胞系和t 细胞的发育心引。 1 3 2 碱性螺旋一环一螺旋转录因子与肌细胞的发生 肌源性调节因子( m y o g e n i cr e g u l a t o r yf a c t o r s ，m f r ) 有4 个基因，它们的蛋白产物都是调节肌源细胞系( m y o g e n i cl i n e a g e ) 硕十学位论文 的建立和分化乜：1 。这4 个基因的编码蛋白分别命名为m y o d 、m r f 一4 、 m y f - 5 ( 是肌肉形成过程中的一类转录因子) 和肌生成素( m y o g e n i n ) ， h t f j 在碱性螺旋一环一螺旋区域有大约8 0 的相似性。所有的m r f 都能 够使中胚层细胞系c 3 h 1 0 t 1 2 转变成肌细胞，如成肌细胞。n o r t h e r n 印迹分析显示所有的m r f 在骨骼肌中都有强烈的表达，利用原位杂交 试验分析小鼠的胚胎发育发现m r f 在体节和肢芽处表达，这与在骨骼 肌的发育中的作用相符合。小鼠基因打靶试验证明m r f 对于不同时期 的肌肉发育有重要作用。例如：m y o d 和m y f - 5 都缺失的纯合小鼠在 出生后死亡并且缺乏骨骼肌晗 。m y o g e n i n 基因的产物是肌肉发育后 期所必需的，尤其在成肌细胞向肌管发育的末期分化阶段心5 1 。 1 3 2 碱性螺旋一环一螺旋转录因子与肿瘤的发生 m y c 家族是在各种细胞中普遍表达的b h l h 蛋白。m y c 基因与人的 肿瘤的发生有关，m y c 蛋白调节翻译的启动，它与m a x 蛋白形成的异 源二聚体可以充当转录激活因子，然而也有一些实验证明m y c - m a x 二 聚体复合物有时可以抑制转录。m a x 可以与其它b h l h 蛋白包括m a d 形成同源或者异源二聚体。m a x 与c m y c 形成二聚体后募集s a g e 、 s w i s n f 因子从而反式激活细胞内的增殖基因的活性心引。 1 4 碱性螺旋一环一螺旋转录因子与心脏发育 目前，很多参与心脏发育调控的重要b h l h 转录因子家族已经被 克隆并鉴定。这些家族包括m y o d 基因家族、h e y 基因家族和h a n d 基 因家族等。其中，m y o d 家族属于生肌碱性螺旋一环一螺旋转录因子， 包括4 个b h l h 成员：m y o d 、m y o g e n i n 、尬f 5 和脚沪4 。该家族成 人类心脏发育候选新簦w 加f ，助，的兜降承l 功能研究 员在时空表达上具有特异性，对调控成肌细胞的分化、肌肉组织同时 也包括心肌的发育具有重要作用。g y o d 通过调控肌动蛋白来激活肌 肉特定基因，e 盒是生肌决定因子m y o d 、m y o g e n i n 结合基序妇引。 另一个重要的参与心脏发育调控的基因家族是h e y 基因家族心引。 该家族编码的是b h l h 转录因子中一个新的业家族，代表n o t c h 信号 途径中一个新的调节因子。h e y 基因在动物发育过程中的表达是动态 的，主要是集中在体节发生、神经发生和心血管发生的过程中。h e y 蛋白之间可以通过特异地结合e 盒序列发生聚合反应。h e y 蛋白最明 显的特点是具有b h l h 、o r a n g e 结构域以及其所特有的终末端 c a r b o x y l 结构。h e y 蛋白还可以与h e s 家族蛋白，如m y o g e n i c 因 子、m y o d 相互作用，甚至还与i e 蛋白家族的e 2 2 和e 2 5 相互作用。 在小鼠的发育过程中，h e y l 和h e y 2 从心脏发育的早期开始一直在 心脏中表达，并且h e y l 在心房中限制性表达而h e y 2 在心室表达心驯。 h e y 基因可能是心血管系统n o t c h 信号途径中主要的转换分子，因为 一些已知的h e y 候选基因几乎不在血管中表达。h e y 2 的敲除，出现 了非常明显的心脏缺损表型，纯合体h e y 2 卜小鼠不能存活，大部分在 出生几天内就死亡。这些现象已经在3 个相互独立的敲除品系中观察 到。“引1 。所有这些品系出现的共同特点就是一个大的膜性室间隔缺损 ( v s d ) 并且延伸到了隔的肌肉层，伴随产生的是两心室肥大。在很 多情况下还会更复杂，如三尖瓣狭窄或闭锁，肺瓣狭窄，卵圆孔永存 或房间隔缺损( a s d ) 。d o n o v a n 等人认为这利，表型与人的法洛氏四联 症相似。州。 硕一i - 学位论文 b h l h 转录因子h a n a r 基因在心肌发生、肢体形成和脊椎动物的发育 过程具有非常重要的作用。两个胁口基因在发育过程中的心脏、侧板 中胚层、神经嵴中均有表达刭。e h a n d 在胚泡植入前的发育期就开始 表达，植入后，其表达局限于胎盘的滋养层，以后局限于胚胎的心脏 和神经嵴细胞，主要在左侧环状心管中起作用。e h a n d 在胚胎心脏发 育早期沿着左右轴对称表达，此外，它还在外胚层中表达。剔除e h a n d 等位基因，纯合子小鼠胚胎在8 5 - - 9 5 天由于外胚层缺陷和卵黄囊异 常而死亡c 州。d h a n d 生要在右心室和蜕膜中表达，剔除d h a n d 等位基因， 纯合子胚胎不能形成右心室制。e h a n d , 丕可以控n d h a n d 的表达，在没 有e h a n d 醛j 情况下不会出现心管向右环化及心室的形成。h a n d t 基因在 心脏的发生过程中与心管的正确环化和心室的发育有关。由于在 d h a n d y 基因突变的胚胎中可以看n e h a n d 和d h a n 堪因特异性地在右心 室、左心室以及发育不全的右心室中表达，因此可以判断d h a n 斫口 e h a n 堪因在心脏发育过程中是控制分节发育的侯选基因，在人类胚 胎中可能对左右心室的发育不全有一定的影响。人类的综合病症如 c a t c h 一2 2 是一种起源于神经嵴细胞类型的缺陷，这种心脏缺陷主要是 流出道和主动脉弓处的缺陷，包括永存动脉干、法洛四联症、双出口 右心室和主动脉弓中断。小鼠如果缺乏e t - 1 和受体就会出现类似于 c a t c h 一2 2 的症状，在e t 一1 突变鼠中h a n d 基因的负调节和在d h a n c p a 耋因 突变鼠中主动脉弓发育的缺陷表明h a n d 基- 因可能与形成正常的心脏 和咽的神经嵴的发育有一定的关系m 1 。 人类心脏发育候选新罄冈h n u l n l 的兜降雨f 功能研究 1 5 本文的研究意义 心脏形成是一个错综复杂的过程，其中，信号途径以及一些转录 因子对心脏细胞分化、心脏细胞的多样性以及不同心脏细胞的形态发 生起调控作用。心脏发育的转录调控过程涉及许多转录调控因子在胚 胎发育过程的不同时间、不同空间的先后表达和相互作用。碱性螺旋 一环一螺旋蛋白( b a s i ch e l i x 一1 0 0 p _ h e lix ，b h l h ) 是真核生物中的一 种特殊的转录因子，与包括果蝇、线虫、脊椎动物在内的各种多细胞 生物发育密切相关，尤其在肌细胞发生、心脏发育和血细胞发生以及 痛症发生过程中发挥着重要的调节作j j 。 我们克隆的h n u l p l 基因是一个含有碱性螺旋环一螺旋( 1 b h l h ) 结构域的转录因子。该蛋白除了含有一个特殊的碱性螺旋一环一螺旋 的结构域之外，在其c 端还具有一个功能未知的命名为：d u f 6 5 4 的结 构域，很可能代表了新的一类具有碱性螺旋一环一螺旋的结构域的转录 因子超家族。通过初步研究我们发现该蛋白做为一个转录抑制子对 s r f 信号途径起着极强的抑制作用。周时，我们还对该转录因子的相 互作用蛋白和对细胞生长的影响做了全面的功能分析。可以预计，阐 明该基因及其所代表的b h l h 转录因子的超家族对于探讨人类死亡率 最高的疾病一心脏病的机理，为系统的阐明该基因生物学功能都有十 分重要的意义。 硕十学位论文 2 1 材料 生物信息学软件 2 材料和方法 b l a s t 程序逝p ；丛必盟丑堡坠i ：堕! 塑：旦i h ：g q 坐! 垦丞用于核酸蛋白质序列 匹配查找； h t t d ：w w w n c b i n l m n i h g o v g o r f 用于开放阅读框( o r f ) 分析： - _ _ 一i t _ - - - _ _ _ _ 一 定位分析； u c s c 程序h t t p ：g e n o m e u c s c e d u 用t - 染色体定位分析和确定内 含子外显子交界； e s p a s y 服务器中的p r o t p a r a m 工具分析蛋白质理化特性h t t p ：w w w e x p a s y c h t o o l s p r o t p a r a m h t m l ； s m a r t 分析蛋白质结构域h t t p ：s m a r t e m b l - h e i d e l b e r g d e ； p r o s i t e 分析蛋白质基序h t t p ：w w w e x p a s y c h p r o s i t e ； m o t i fs c a n 程序分析蛋白质模体和结构域h t t p ：s c a n s i t e m i t e d u ； p s o r t 分析亚细胞定位h t t p ：p s o r t n i b b a c j p f o r m 2 h t m l ； w e b c u t t e r 分析限制性内切酶酶切位点h t t p ：w w w f i r s t m a r k e t 一 c o m c u t t e r c u t 2 h t m l j e l l y f i s h1 4 下载自h 堑p ；垃巡坠i q 型i 盟：曼q 幽用于d n a 序列、开放 1 4 入类心脏发育候选新基冈h n v l p ln 勺兜隆年l i 功能研究 阅读框分析； b c ms e a r c hl a u n c h e r - c l u s t a l w1 8 在线分析程序 h t t p ：s e a r c h l a u n c h e r b c m t m c e d u m u l t i - a l i g n m u l t i - a l i g n h t m l 于 d n a 和蛋白质的序列比较； p r i m e rp r i m i e r5 0 软件用于酶切位点的分析和p c r 引物设计； b i o e d i t 软件用于序列编辑，寻找特征序列等； d n h s t a r 软件用于d n a 序列、蛋白质性质及进化关系分析： 主要的基因工程酶和试剂盒为购自大连t a k a r a 和上海生工、上 海品美生物有限公司，其中： r a p i dm r n a t mp u r i f i c a t i o nk i t ， a m r e s c o 公司； c d n a s y n s i sk i t s c d n ap c r l i b r a r yk i t s ， t a k a r a 公司； t a k a r a 公司； s m a r tr a c ec d n a a m p l i l f i c a t i o nk i t ， c l o n t e c h 公司； l i g a t i o nk i t2 0 试剂盒， t a k a r a 公司； u n i q 1 0 柱式d n a 胶回收纯化试剂盒， 上海生工； u n i q 2 0 0 质粒大量抽提试剂盒， 上海生工； l i p o f e c t a m i n ep l u s t mr e a g e n t 试剂盒， t r l z o l 试剂， 细胞、菌株和质粒 l i f et e c h n o l o g i e s ； p r o m e g a 公司 哺乳动物c o s - 7 细胞系，h e l a 细胞系：本实验室保存。 大肠杆菌e c o l id h 5 a ：本实验室保存。 p m d l 8 一t 载体：购自上海生工公司，该载体是线状d n a ，大小 硕十学位论文 为2 7 k b ，3 端己加t ，。可插入p c r 产物，插入位点两侧有常用限制 性内切酶位点和t 7 、s p 6r n a 聚合酶转录起始位点，可对插入序列 进行正反向测序。此载体具有氨苄青霉素( a m p ) 抗性基因。 人类多组织膜m u l t i p l et i s s u en o r t h e r nb l o t s ： 成人组织m r n a 膜，c l o n t e c h 公司； 胚胎组织总r n a 膜，本实验室制备。 缓冲液、培养基和重要试剂 标准d n a 分子量m a r k e d1 0 0 0 b p ，3 0 0 0 b p ，10 0 0 0 b pg e n er u l e r 州) ， 上海晶美； 引物由英俊公司合成，2o d ，已纯化。 i p t g 和x g a l ，t a k a r a 公司； r n a s e a ，上海生工； 琼脂糖( a g a r a ) 、胰蛋白胨( t r y t o n e ) 和酵母提取物( y e a s te x t r a c t ) ， 加拿大b b i 公司； 氨苄青霉素和链霉素，b b i ； 琼脂糖粉，上海y i t o 公司； e b 染液，s y b r 染料，深圳市达科生物技术有限公司。 【0 c - 3 2 p d c t p ，北京亚辉公司； t a e ( 5 0 x ) 缓冲液和l b 培养基采用标准方法配制。 捉质粒用溶液：s o l u t i o ni ，s o l u t i o ni i ，s o l u t i o ni i i s o l u t i o ni ：5 0 m m o l l 葡萄糖2 5 m m o l l t r i s h c l ( p h 8 0 ) 10 m m o l e d t a ( p h 8 0 )灭菌15 m i n4 c 储存 人类心脏发育候选新基冈h n u l p l 的兜隆平功能研究 s o l u t i o ni i ( 临时) ：0 2 t o o ln a o h ，i s d s s o l u t i o ni i i ：p h 4 8 乙酸钾溶液( 6 0 m l5 m o l lk a c ，11 5 m l 冰醋酸， 2 8 5 m lh 2 0k + 3 m o l la c 。5 m o l l 灭凶15 m i n 4 c 储存 主要实验仪器 d n a 扩增仪，购自l i f es c i e n c e 公司；低温高速离心机，购自德 国e p p e n d o r f 公司；核酸、蛋白定量国产；凝胶成像分析系统，购自 长沙肯基公司；p y x d h s 5 0 x 6 5 隔水式电热恒温培养箱；h h c p t 型二氧化碳细胞培养箱；i - i z q - a 恒温培养摇床；s h a c s h a c a 数 显水浴恒温振荡器：超净工作台s w - c j i f 型，购自苏州净化设备 公司；t j r 一2 8 0 2 型紫外可见分光光度计：m i l l i p o m 纯水器，购自美国 m i l l i p o r e 公司；t d 一2 0 2 0 荧光检测计；柯达m7 b 全自动沈片机： 8 0 超低温冰箱等。 2 2 方法 2 2 1h n u 伽7 全长序列的计算机克隆 从蛋白质数据库( h t t p ：w w w s w i s s p o r t t o m ) 获得b h l h 结构域的 保守序列( c o n s e n s u ss e q u e n c e ) 被提交到人类e s t 数据库 ( h t t p ：w w w n c b i n i h g o v ) ，利用b l a s t x 程序进行检索，获得的包含 编码b h l h 结构域信息的人类e s t 被进一步用于人类基因组数据库 检索，b l a s t n 程序被用于此项检索。部分的c d n a 序列被检出经返 查基因数据库被确认为人类未被研究的基因，并且该基因与小鼠 颂 学位论文 n u l p j 基因同源度为8 9 。我们将此人类新基因命名为人类小鼠 n u l p l 同源基因( k n u l p ) 并提交剑g e n b a n k 数据库，登录号为： n o d 0 3 2 1 7 0 3 。 2 2 2 用p o r 反应从人类心脏e d n a 文库中分离h n u i p l 2 2 2 1h n u 仞，开放阅读框序列的p c r 扩增 以人类心脏c d n a 文库( 由本实验室构建) 为模板对h n u l p j 的 开放阅读框序列进行p c r 扩增，在0 2 m lp c r 反应管中依次加入超 纯水1 6 2 9 l ：1 0 x b u f f e r 2 5 9 l 、d n t p 2 5 p l 、p r i m e r 1( 5 一 g c g g a a r t c g t g g t c g t t c g g t c c n 盯g t c 3 ) 和p r i m e r2 ( 5 t c g g a a t t c 唧c g g t c a c c t c t g c g g a 3 ) 引物各 1 3g