（遗传学专业论文）藤黄微球菌ad3的阿特拉津降解基因分析与降解特性研究.pdf

独创性声阴 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名：陬 时间： p 7 年4 目3 日 导师签名：喜7 参绰 时间： 枷刁年6 月，f 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：纵时间：z 一年f 砂日 导师签名：吾今；绎时间：z t 一年月i j 日 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 阿特拉滓是一种三嗪类除草剂，用于阔叶类杂草的防除，其生物毒性来自于其分子 中的一个氯原子。将阿特拉津完全降解成二氧化碳和水需要六步降解反应，其中降解途 径中第一个酶为阿特拉津氯水解酶( a t z a ) 或三嗪水解酶( t r z n ) ，其用途是催化阿特拉 津水解脱氯，生成无毒的羟基阿特拉津。 本研究从河北省宣化农药厂的阿特拉津工业废水中分离出一株阿特拉津降解细菌 藤黄微球菌( m i c r o c o c c u sl u t e u s ) a d 3 ，在前人研究的基础上，通过a d 3 菌株的分子杂 交，核苷酸序列测定，质粒检测，生物修复等方法对它的降解特性等进行了研究， 首先以a d 3 菌株总d n a 为模板，进行分子杂交，结果显示a d 3 不具有通常大多 数降解菌株含有的a t z a ，但具有a t z d ，说明a d 3 可能具有t r z n 和降解途径的后三个基 因。因此，我们以节杆菌t c l 的t r z n 的基因为参考序列，设计p c r 引物，通过p c r 扩增，得到t r z n 基因中心区片段，并将p c r 产物直接测序，通过与t c l 菌株的w z n 基 因中心区片段做同源性比较，发现a d 3 菌株和t c l 菌株的t r z n 核心区的同源性达到 1 0 0 ，同时还参照a d p 菌株的a t z b , a t z c ，a t z d , a t z e , a t z f 设计引物，通过对a t z b , a t z c 的序列结果和a t z d , a t z e , a t z f 的p c r 结果分析表明，a d 3 具有降解阿特拉津的全套基 因，能够完全降解阿特拉津。通过对其生长特性的试验表明，它的降解性能大大超过文 献报道的假单胞菌a d p ，并且a d 3 菌株利用碳源和氮源的物质广泛，具有较好的应用 价值。质粒分析显示a d 3 具有同a d p 大小相似的大质粒，但阿特拉津降解基因是否位 于这个大质粒上，需要进一步的实验去验证。 除此之外，我们还将a d 3 应用于阿特拉津工业废水的生物修复实验，结果显示， 单独用a d 3 可以除去部分废水中的阿特拉律，去除率为4 2 3 ，将物理化学方法和生物 法联合使用，可有效去除废水中的阿特拉津，去除率达到8 2 5 。 关键词：除草剂阿特拉津，微球菌，工业废水，生物修复 鲨堕奎些奎竺堡主堂垡丝兰 a b s t r a c t a t r a z i n ei sak i n do f t r i a z i n eh e r b i c i d e sf o rc o n t r o l l i n gb r o a d - l e a v e dw e e d s b e c a u s eo f t h ec h l o r i n ea t o mi ni t sm o l e c u l e ，a t r a z i n eh a sm o d e r a t et o x c i t y c o m p l e t e l yd e g r a d i n gt h e a t r a z i n et oc a r b o nd i o x i d ea n dt h ew a t e rn e e d ss i xs t e p so fd e g r a d a t i o nr e a c t i o n s t h ef i r s t e n z y l n eo fa t r a z i n eb i o d e g r a d a t i o np a t h w a y , a t r a z i n ee h l o r o h y d r o l a s eo rt r i a z i n e h y d r o l a s e ， h y r o l y z e sa t r a z i n ea n dr e p l a c e si t sc h o r i n ea t o m w i t hah y d r o x yg r o u p t h eh i g he f f i c i e n c ya t r a z i n e d e g r a d i n gs t r a i n s ，a d 3 ，w a gi s o l a t e df r o mi n d u s t r i a lw a s t e w a t e ro fh e b e ip r o v i n c ex u a n h u af a c t o r y s t u d i e si nt h ep r e d e c e s s o ri nf o t m d a t i o n , t h e a n a l y s i s f o rm o l e c u l a r h y b r i d ，t h en u c l e o t i d es e q u e n c e ，t h ep l a s m i de x a m i n a t i o n , b i o r e m e d i a t i o n w a sc a r r i e do u t f i r s t , i tt a k ea d 3s t r a i nt o t a ld n a 嬲t h et e m p l a t e , d i s c o v e r e da d 3d o e sn o th a v ea t z a b u th a sa t z db ym o l e c u l a rh y b r i d t h er e s u l t ss h o w e da d 3p o s s i b l yh a dt r z na n dt h e d e g e n e r a t i o nw a yl a t t e rt h r e eg e n e s ，t h e r e f o r eu s i n gt h ep r i m e rd e s i g n e da c c o r d i n gt ot r z n g e n ef r o ma r t h r o b a c t e ra u r e s c e n st c l 。t h e t o t a ld n ao f s t r a i na d 3a st e m p l a t e s ，a b t a 抽a n g t h ef r a g m e n t so ft r z ng e n ef r o ms t r a i na d 3b yp c r a m p l i f i c a t i o n s e q u e n c ec o m p a r i s o no f t h et r z n g e n e sf r o mt h es 讹d j l la d 3a n dt h es t r a i nt c li n d i c a t e dt h eh o m o l o g ya c h i e v e s1 0 0 r e f e r i n gt oa d p s t r a i na t z b , a t z c , a t z d , a t z e , t h ea t z fd e s i g np r i m e r , t h ea t z b ，a t z cs e q u e n c e r e s u l ta n da t z d ，a t z e , t h ea t z fp c rp r o d u c ta n a l y s i si n d i c a t e dt h a ta d 3h a ss i xg e n eo f a t r a z i n e d e g r a d i n gc a l lc o m p l e t e l yd e g r a d et h ea t r a z i n e t h ec h a r a c t e r i s t i ce x p e r i m e n to fi t s g r o w t hs h o wi t sd e g e n e r a t i o ns u r p a s s e st h ea d p a n da d 3s t r a i nu s ec a r b o ns o u r c e sa n d n i t r o g e n $ o u r e e si sw i d e s p r e a d ，h a st h eb e t t e ra p p l i c a t i o nv a l u e t h ep l a s m i da n a l y s i s d e m o n s t r a t e dt h a ta d 3h a st h ep l a s m i dw h i c hi st h es i z es i m i l a rt oa d p b u ti ti sw h e t h e r a t r a z i n ed e g e n e r a t i o ng e n el o c a t e do nt h i sb i gp l a s m i d ，n e e d s t h ef u r t h e re x p e r i m e n tt o c o n f i r m i na d d i t i o n ，a d 3i sa p p l i e dt ot h ea t r a z i n eb i o r e m e d i a t i o n o fi n d u s t r i a lw a s t e t h e r e s u l ti n d i c a t e d t h er e m o v i n gr a t ei s4 2 - 3 u s i n gt h ea d 3f l o n e c o m b i n a n tm e t h o do f p h y s i c s c h e m i s t r ya n db i o r e m e d i a t i o n ，t h er e m o v i n g r a t ea c h i e v e s8 2 5 k e y w o r d ：h e r b i c i d ea t r a z i n e ；m i c r o c o c c u sl u t e u s ；i n d u s t r i a l 、v 吼ew a t e r ；b i o r e m e d i a t i 沈阳农业大学硕士学位论文 月l j 吾 阿特拉津( a t r a z i n e ) ，商品名莠去津，化学名2 氯4 - 乙氨基6 异丙氨基i ，3 ，5 三嗪， 是一种选择内吸传导型苗前、苗后除草剂，适用于玉米、高粱、甘蔗、茶园、果园和林 地等防除一年生禾本科杂草和阔叶杂草，对多年生杂草也有抑制作用。其作用机理是破 坏植物体中叶绿体光系统。某些植物体内的谷胱甘肽可与阿特拉津结合，而不会对其 产生毒害。由于阿特拉滓分子中含有一个氯原子，所以具有生物毒性，而且它的矿化过 程十分缓慢，在土壤中的半存留期长达4 - 5 7 w ，因此容易对某些对阿特拉津敏感的后茬 作物如大豆、小麦、水稻等产生毒害，对土壤、地下水和表面水的污染及其对生态环境 的危害已引起广泛重视。美国环保局于1 9 9 2 年提出限制使用阿特拉津。我国2 0 世纪8 0 年代中期开始生产阿特拉津，用量逐年增加，现在年使用量已超过2 0 0 0 吨。因此，如 何有效地应对阿特拉津的污染已成为亟待解决的问题( 李清波等，2 0 0 2 ；蔡宝立，1 9 9 9 ； w a c k e _ t te ta l ，2 0 0 2 ) 。 2 0 世纪6 0 年代到8 0 年代，阿特拉津被认为是很难被生物降解的。那时人们普遍认 为阿特拉津必须经过化学作用才能脱氯。8 0 年代以来，至少在1 9 个属的细菌中发现具 有阿特拉津降解能力的菌株，包括诺卡氏菌属( n o c a r d i a ) ( g i a r d ie t a l ，1 9 8 5 ) 、红球菌 属( r h o d o c o c c u s ) ( b e h k ie ta l ，1 9 9 3 ) 、不动杆菌属翻c i n e t o b a c t e r ) ( m i r g a i ne ta l ，1 9 9 3 ) 、 土壤杆菌属( a g r o b a c t e r i u m ) ( s t r u t h e r se ta l ，1 9 9 8 ) 、假单胞茵属( p s e u d o m o n a s j ( m & n d e l b a u me ta l ，1 9 9 5 ) 、微球菌属( m i c r o c o c c u s ) ( 温雪松等，2 0 0 5 ) 、芽孢杆菌 ( b a c i l l u s ) ( 叶常明等，2 0 0 0 ) 、欧文氏菌属( e r w i n i a 人黄单胞菌属( x a n t h o m o n a s ) ( 蔡 宝立等，2 0 0 1 ) 、微小杆菌属( e x i g u o b a c t e r i u m ) ( 胡江等，2 0 0 4 ) 、节杆菌属( a r t h r o b a c t e r ) ( c a i ，2 0 0 3 ) 、根瘤菌属( r h i z o b i u m ) ( b o u q u a r d e ta l ，1 9 9 7 ) 、棍状杆菌属( c l a v i b a c t e r ) , 产碱杆菌属( a t c a l i g e n s ) , r a l s t o n i a ( d es o u z a e ta l ，1 9 9 8 ) 、螯合杆菌属( c h e t a t o b a c t e r ) 氨基杆菌属阻m i n o b a c t e r ) 、寡养假单胞菌属( s t e n o t r o p h o m o n a s ) ( r o u s s e a u x e ta l ，2 0 0 1 ) 、 假氨基杆菌属( p s e u d a m i n o b a c t e r ) ( t o p pe ta l ，2 0 0 0 ) 。其中，假单胞菌a d p 的降解机理 研究得最为清楚，是目前研究阿待拉津降解的模式生物。1 9 9 5 年，w a c k e a 实验室从施 用过阿特拉津的土壤中分离到能以阿特拉津为唯一氮源的假单胞菌a d p 以后，开始对 阿特拉津生物降解途径的分子机理的一系列研究。2 0 0 1 年，m a r t i n e z ( m a r t i n e ze ta l ， 2 0 0 1 ) 通过进一步的研究发现，a d p 菌株含有一个1 0 8 8 4 5b p 的阿特拉津降解质粒 d a d p 1 ，该质粒含有1 0 4 个o r f ，其中6 个o r f ( a t z a ，a t z b ，a t z c 和a t z d e f ) 编码 催化阿特拉津降解所需要的酶。在a t z a ，a t z b 和a t z c 基因编码的酶的作用下，先将阿 特拉津降解成氰尿酸，然后a t z d e f 基因编码的酶再将氰尿酸降解成二氧化碳和氨气。 另外一种阿特拉津降解途径是某些a r t h r o b a c t e r 细菌控制的途径，它们只能将阿特 拉津降解成氰尿酸，编码该途径降解酶的基因是t r z n 、a t z b 和a t z c ，t r z n 和a t z a 编码 的酶都是催化阿特拉津水解脱氯，但它们的核苷酸序列类似性只有2 6 ( s a j j a p h a ne ta l ， 2 0 0 4 ) 。 大多数阿特拉津降解菌能以阿特拉津为唯一氮源生长，也有一些细菌能以阿特拉津 为唯一碳源生长( y a n z e k o n t c h o uc ta l ，1 9 9 4 ) ，此外，t o p p ( t o p pe ta l ，2 0 0 0 ) 在比较三 种菌株对阿特拉津的降解性时，发现一个p s e u d a m i n o b a c t e r 菌株和一个n o c a r d i o i d e s 菌 株既能利用阿特拉津作为碳源也能以阿特拉津为氮源。胡江等在施用过阿特拉津的土壤 中分离的微小杆菌b t a h l 菌株也能以阿特拉津为唯一的碳源和氮源。 为了获得高效稳定的阿特拉津基因，就必须分离出更多的阿特拉津降解菌，从而发 现新的基因、改造现有的基因，不仅可以用于分析其结构和功能，而且有望获得活力大 大提高的新酶，用于阿特拉津污染环境的生物修复。我们从工业废水中分离到高效降解 除草剂阿特拉津的藤黄微球菌( m i c r o c o c c u sl u t e u s ) a d 3 ，本文用p c r 方法和d n a 杂 交实验对a d 3 菌株的阿特拉津降解基因进行了检测和测序，检测了a d 3 的大质粒。并 初步进行了工业废水中的阿特拉津去除试验，为今后实施生物修复奠定了理论基础。 6 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章综述 1 1 除草剂阿特拉津的性质 阿特拉津( a t r a z i n e ) 又称氯乙异丙嗪 2 一氯- 4 ( 乙基) - 6 ( 异丙氨基) 一1 ，3 ，5 - 三嗪】，商品名 莠去津，是一种广泛使用的三嗪类除草剂，用于阔叶杂草和禾革的防除，如玉米、高粱、 甘蔗和库区杂草等。阿特拉滓虽然是一种低毒除草剂，但由于它的结构比较稳定，被微 生物矿化的过程十分缓慢，在土壤中的半存留期长达4 5 7 周，所以在施用过这种除草 ；f f 的土壤中以及邻近的地下水和表面水中，其浓度远远超过最大允许值，造成对环境的 严重污染。表l 为阿特拉津的理化性质。 表1 - 1 除草剂阿特拉津的性质 t a b l e l lc h a r a c t e r o f h e r b i c i d e a w a z i n e 阿特拉津英文名为a t r a z i n c ，又称氯乙异丙嗪和莠去津 学名 化学式 纯品 分子量 熔点 溶解性 溶解度( 2 5 ) 相对密度( 水= 1 ) 稳定性 危险标记 2 氯4 乙基胺- 6 一异丙基胺l ，3 ，5 - 三唪( 2 - c h m r o - 4 - e t h y l a m i n o - 6 i s o p r o p y l a m i n o - s - t r i a z i n e ) c g h l 4 c i n 5 、 无色结晶，原药为白色粉末 2 1 5 7 2蒸汽压0 3 9 9 x l o - 7 l c p a ( 2 0 c 1 1 7 l 1 7 4 1 2沸点分解 难溶于水。微溶于多数有机溶剂 水3 3 m g l 。甲醇1 8 氯仿5 2 ，乙醚1 2 戊烷o 3 6 1 2 ( 2 0 ) 在微酸及微碱介质中稳定，但在高温、碱和无机盐条件下可将其水解为无除草活性的羟基衍生物 1 5 ( 有害品，远离食品) 1 2 除草剂阿特拉津的使用所带来的环境问题 阿特拉滓( a 舡a z i n e ) 又称氯乙异丙嗪 2 一氯- 4 ( 乙基) 一6 - ( 异丙氨基) 1 ，3 ，5 三嗪】( 结构式 见图1 - 1 ) ( d e n n i sc ta l ，1 9 9 8 ) ，商品名为莠去津，是一种选择内吸传导型苗前、苗后 除草剂，适用于玉米、高粱、甘蔗、茶园、果园和林地等防除一年生禾本科杂草和溷叶 杂草，对多年生杂草也有抑制作用。其作用机理是破坏植物体中叶绿体光系统i i 。某些 7 综述 植物体内的谷胱甘肽可与阿特拉津结合，而不会对其产生毒害。由于阿特拉津分子中含 有一个氯原子，所以具有生物毒性，而且它的矿化过程十分缓慢，在土壤中的半存留期 长达4 - 5 7 w ，因此容易对某些对阿特拉津敏感的后茬作物如大豆、小麦、水稻等产生毒 害，对土壤、地下水和表面水的污染及其对生态环境的危害已引起广泛重视。美国环保 局于1 9 9 2 年提出限制使用阿特拉津。我国2 0 世纪8 0 年代中期开始生产阿特拉津，用 量逐年增加，现在年使用量己超过2 0 0 0 吨。因此，如何有效地应对阿特拉津的污染已 成为亟待解决的问题( m a n d e l b a u m e t a l ，1 9 9 5 ) 。 i n 夕。n l l i ii i 即r 时q 心n 。一“2 也 阿特拉津能有效地抑制植物( 包括藻类) 的光合作用和生长。e l s h e e k h ( e l s h e e k h e ta l ，1 9 9 4 ) 等发现，当阿特拉津浓度达1 5 9 m o l l 时，小球藻的生长立即受到抑制。地 球上9 0 的光合作用由藻类植物完成，藻类植物受到危害会7 1 起食物链的改变，以至影 阿特拉律对鱼类也有影响。p r a s a da n dr e d d y ( p r a s a de l ：a l ，1 9 9 4 ) 发现阿特拉津能 使鱼体内c a 2 + m 9 2 + 等无机离子浓度显著下降。而这两种离子对于维持鱼类体内酶的活 性酸碱平衡及一些重要的生理功能可起到至关重要的作用，一旦其浓度发生显著的变 化，将导致一些重要的生理功能发生紊乱。 因为阿特拉津分子中含有一个氯原子，所以对人和哺乳动物也具有毒性。r o l o f f ( r o l o f f e ta l ，1 9 9 2 ) 等用浓度为2 0 r t g m l 的阿特拉津水溶液给小鼠饮用，9 0 天后发现 其骨髓细胞内染色体受到损伤：将人体的淋巴细胞进行体外培养后用阿特拉津处理，当 阿特拉津浓度为0 0 0 1 嵋l 时，淋巴细胞染色体轻微受损，当阿特拉津浓度达到0 0 0 5 i _ t g l 时，染色体发生显著损伤。 阿特拉滓在世界范围内已经使用了4 0 多年，所以对土壤，地下水和表面水造成了 严重污染。美国环保署规定饮用水中的阿特拉津含量不得超过3 9 l ，但是在污染严重的 沈阳农业大学硕士学位论文 地区，阿特拉津的浓度在土壤中l l o o m g k g ，表面水中1 6g ，l ，地下水中1 5 0 0 9 厄，其 在环境中的扩散引起广泛重视。 近年来，随着现代农业的发展，我国使用阿特拉滓的耕地不断增加，造成的污染有 扩大的趋势，部分地区的污染甚至非常严重，以本文研究涉及到河北宣化农药厂为例。 在1 9 8 7 1 9 9 4 的8 年间有3 年发生了水稻受害事件。下表是我们检测的该工厂排放阿 特拉津废水的有关数据，并与国标地表水环境质量标准g b 3 8 3 8 2 0 0 2 作比较，不难发现， 生态环境受到严重污染，有关污染的治理的基础理论和实际的工程研究迫在眉睫。 表1 2 宣化农药厂排放废水与国标地表水环境质量标准g b 3 8 3 8 - 2 0 0 2 的比较 t a b l e l 一2 c o m p a r ew a s t e w a t e ro f a g r i e h e m i e a lp l a n tt 0t l l ee a r e h w a t e ro f g b 3 8 3 8 2 0 0 2 1 3 阿特拉津生物降解概述 1 3 1 植物修复 植物修复可以通过根收获、叶表挥发和植物降解的方法消除有机污染物，在砂质土壤 中利用根吸收和收获进行植物修复污染土壤的方法证明是可行的，如利用胡萝b 吸收二 氯二苯基三氯乙烷，然后将胡萝b 收获、晒干，完全燃烧以破坏污染物。另外，通过植物 体的代谢活力可以降解土壤中的污染物。 一般来说，污染物对植物的毒害作用也具有选择性，例如，玉米、高粱、甘蔗、宿根 高粱等对阿特拉津的抗性较为稳定，在这些作物中含有一种谷胱甘肽s 一转移酶，可以促 进阿特拉津与谷胱甘肽生成可溶于水的结合体，使阿特拉津在这些作物体内失去活性，从 而使这些作物不致于遭受伤害。研究表明，在高梁叶片中，在7 h 内可以有6 2 被吸收 的阿特拉津转化为溶于水的化合物，即s 一( 4 一乙氨基6 异丙氨基2 均三氮苯) 谷胱甘肽和 y l 谷酰基s ( 4 乙酰基一6 - 异丙氨基2 均三氮苯) l 半胱氨酸。同样，阿特拉津可以使水 稻、大豆等作物致毒，机理是通过阻挡植物光合作用中光合体系i i 中的电子的转移而阻 抑光化合成反应，这种阻挡导致叶绿素毁坏、碳水化合物合成的抑制、碳源的还原和细 胞中c0 2 的产生( 蔡宝立等，2 0 0 2 ) 。 1 3 2 微生物修复 9 综述 在生态系统中，微生物对农药的分解起着重要作用。土壤微生物对农药的分解能消 除农药的残留，减少农药对生态系统的影响。目前发现可降解阿特拉津的微生物有以下 几种。 1 3 2 1 真菌修复 在阿特拉津降解过程中，真菌起着重要作用。烟曲霉( a s p e r g i l l u s f u m i g a t u s ) ，焦曲 霉口u s t u s ) ，白腐真菌( w h i t e r o tf u n g o ( 如肺形侧耳菌p l e u r o t u sp u l m o n a r i u s 和 p h e n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m ) 和菌根真菌( m y c o r r h i z a l f u n g i ) 等，都能降解阿特拉津。其中 自腐真菌具有较高的氧化降解能力，可降解多种环境污染物尤其是卤代芳烃和木质素。 m o u g i n ( m o u g i ne t a l ，1 9 9 4 ) 等认为它们降解污染物( 包括阿特拉滓) 与木质素降解 系统有关，该系统主要包括一些过氧化物酶。 在土壤中，阿特拉滓的脱烷基主要是由真菌完成的，其乙基比异丙基更容易被真菌 矿化( w o l f e ta l ，1 9 7 5 ) 。m a s a p h y ( m a s a p h ye ta l ，1 9 9 3 ) 等报道，肺形侧耳菌能使阿特拉 津脱烷基，生成脱烷基的产物，同时，还发现了一种异丙基l 号碳发生羟化的新的降解 产物2 氯4 乙基胺6 ( 1 羟异丙基) 胺1 ，3 ，5 - 三嗪。该菌不能脱氯，也不能继续降解脱烷 基的产物和羟化异丙基的产物。肺形侧耳菌不是从富集培养物中分离出来的，其降解阿 特拉津的能力不是诱导产生的，说明该细胞本身即具有代谢阿特拉津的活性。 菌根真菌能与植物根共生，真菌从植物根获取碳水化合物，同时将环境中的有机物 ( 如有机磷) 转化为无机物( 如无机磷) ，促进植物对无机离子的吸收。真菌与植物根 共生能促进真菌胞外酶的活性和增加其生物量，所以d o n e l l y ( d o n n e l l ye ta l ，1 9 9 3 ) 等认为 真菌与根共生形成的菌根( m y c o r r h i z a ) 能增强真菌降解阿特拉津的能力。 1 3 2 2 放线菌 至目前为止，所发现的参与阿特拉津降解的放线菌均为诺卡氏菌( n o c a r d i as p ) 。 g i a r d i n ( b u f f o n ee ta 1 1 9 7 9 ) 等从能以阿特拉津为唯一碳源和氮源的富集培养物中分离出 一株诺卡氏菌，该菌能将阿特拉津脱烷基生成2 一氯一4 ，6 。二氨1 ，3 ，5 三囔，然后再进一步 脱氨。 i 3 2 3 细菌 降解阿特拉津的细菌主要是红球菌饵h o d o c o c c u ss p ) ( c o o k ，1 9 8 6 ；b e h k i ，1 9 9 3 ； b e h k i ，1 9 9 4 ) 和假单胞菌( p s e u d o m o n a ss p ) ( b e h k i ，1 9 8 6 ；c o o k , 1 9 8 1 ；y a n z e k 1 9 9 4 ； m a n d e l d a u m 1 9 9 5 ) 。红球菌广泛存在于土壤中，具有降解多种有机污染物如烃类，卤代 沈阳农业大学硕士学位论文 烃类、卤代芳烃类化合物的能力( f i r m e r t y , 1 9 9 2 ；w a r h u r s t , 1 9 9 4 ) 。 c o o k 和h u t t e r ( c o o ke ta l ，1 9 8 6 ) 分离到珊瑚红球菌( r h o d o c o c c u sc o r a l l i n u s ) ，它能 将已脱去乙基的阿特拉津先脱氯再脱氨，但不能使之开环。b e h k i 等用红球菌t e l 菌株 ( b c h k i ，1 9 8 6 ) 和b - 3 0 菌株( b e h k i ，1 9 9 4 ) 分别降解阿特拉津，其主要降解产物均为含有一 个烷基的阿特拉津。b 3 0 菌株能使脱乙基的阿特拉津迸步脱异丙基形成2 氯- 4 ，6 二氨 - l ，3 ，5 - 三嗪，但是这种产物能反馈抑制b - 3 0 菌株对脱乙基阿特拉津的降解。t e l 菌株不 能降解含一个烷基的阿特拉津，当菌体处于稳定期时才会表现出主要的降解活性；而 b 一3 0 菌株在整个生命周期都具有较高的降解活性。这两个菌株必须在好氧条件下才能降 解阿特拉津，且均不能使其开环。 假单胞菌对阿特拉津的矿化起着重要作用，现在所发现的能矿化阿特拉滓的菌主要 是假单胞菌( y a n z e k 1 9 9 4 ；m a n d e l d a u me ta l ，1 9 9 5 ) 。b e h k i 和k h a n ( b e h k ie ta l ，1 9 8 6 ) 从土 壤中分离出能以阿特拉津为唯一碳源的3 株假单胞菌，它们能使阿特拉滓脱氯水解。产 物分析结果表明，异丙基比乙基易被矿化，这与真菌脱烷基正好相反。 虽然开环比降解支链难得多，但最近国外学者陆续发现了一些能开环的菌株，其中 仍以假单胞菌为主。c o o k 和h u t t e r 发现假单胞菌n r r lb 1 2 2 2 8 和n r r lb 1 2 2 2 菌株 能够以己脱氯和己脱烷基的阿特拉津环上的氮为唯一氮源，使之开环。c o o k 和h u t t e r 将r h o d o c o c c u sc o r a l l i n u s 和假单胞菌n r r lb 1 2 2 2 8 菌株混合培养，发现该混合培养物 能彻底矿化已经脱乙基的阿特拉津。 m u l b r y ( m u l b r y , 19 9 4 ) 从珊瑚红球菌r h o d o c o c c u sc o r a l l i n u sn r r lb 一1 5 4 4 4 r 菌株的 细胞内纯化出一种分子量为2 0 0 k d 的水解酶，此酶是一种诱导酶，能使已经脱乙基的阿 特拉律进一步脱氯羟化，使2 氯4 ，6 二氨1 ，3 ，5 三嗪脱氨，此酶不能直接作用于阿特拉 津，但可以通过对编码此酶的基因进行改造，获得直接作用于阿特拉津的酶。据报道， 编码此酶的基因序列已被测定。n a g y ( n a g y e ta l ，1 9 9 5 ) 等还发现红球菌n 1 8 6 2 1 菌株细胞 色素1 7 4 5 0 参与了降解阿特拉津的过程。将编码细胞色素p 4 5 0 的基因克隆到不能降解阿 特拉津的n 1 8 6 2 1 菌株的突变体f a j 2 0 2 7 和r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i ss q 的细胞内，这 两个菌株都获得了降解阿特拉津的能力。 m a n d e l b a u m 从施用过阿特拉津的土壤中取土样，用磷酸缓冲液清洗去除氮源，再 将土样在以阿特拉津为唯一氮源，乙酸、蔗糖为碳源的培养基中富集培养，发现该富集 培养物能使阿特拉津高效降解且开环。m a n d e l b a u m 等在以阿特拉津为唯一氮源。乙酸 综述 钠为碳源的培养基上从上述富集培养物中分离出假单胞菌a d p 菌株，该菌株能将培养 基中1 0 0 0 m g l 的阿特拉津高效降解，8 0 的环一1 4 c 被转化为h c 0 2 。当a d p 菌株获得 其它氮源时，仍能继续降解阿特拉津，说明a d p 菌株降解阿特拉津的能力很稳定。此 外，m a n d e l b a u m 等还发现a d p 菌株无论是生长细胞还是非生长细胞均能高效降解阿特 拉津。m a n d e l b a u m 将假单胞菌a d p 菌株细胞提取物经1 0 0 0 0 x g 或l0 0 0 0 0 。g 离心后， 在上清液中加入阿特拉津，一小时内9 0 的阿特拉津均被转化为水溶性物质，说明a d p 菌株内水溶性酶对阿特拉津的转化起重要作用。 许多研究表明，与农药生物降解有关的基因主要在降解质粒上，而假单胞菌有许多 质粒( v a n z e - ke ta l ，1 9 9 钔。b e h k i 和k h a n 为了研究假单胞菌1 9 2 1 9 5 、$ 5 5 菌株对阿特 拉津的降解是否与质粒有关，以恶臭假单胞菌( p s e u d o m o n a sp u d i 衄) 的质粒为标准对 这3 株菌的质粒进行研究，发现这3 株菌没有质粒或质粒不稳定，因此，b e h k i 和k h a n 认为这3 株菌降解阿特拉津是由染色体上的基因控制的。 b e h k i 还发现，红球菌t e l 菌株内一段长7 7 0 0 0 碱基对的质粒与脱烷基有关，失去 该质粒的t e 7 菌株不能降解阿特拉津，本身不能降解阿特拉津的t e l 0 和t e l 2 菌株在 获得该质粒的同时，也获得了降解阿特拉津的能力。 1 4 细菌降解阿特拉津的机制 ， 1 4 1 阿特拉津降解的氯水解途径 1 9 9 5 年m a n d e l b a u m 等从被阿特拉津污染的土壤中分离到一株能以阿特拉津为唯一 氮源的细菌假单胞菌a d p 菌株。该菌株代谢效率很高，能在阿特拉津的浓度大于 1 0 0 0 p p m 的培养基中生长，并在其菌落的周围产生清亮的晕圈，与其它菌株加以区别。 a d p 菌株能以二氧化碳的形式释放阿特拉津环上的碳原子。后来的一系列研究表明，它 降解阿特拉津的前三步反应需要三种酶催化( 见图l - 2 ) 。第一个酶是阿特拉津氯水解酶 ( a t z a ) ，催化阿特拉津水解脱氯反应，产生第一个中间代谢物，即无毒的羟基阿特拉津 ( d es o u z ae ta l ，1 9 9 6 ) 。第二个酶是羟基阿特拉津乙氨基水解酶( a t z b ) ，催化羟基阿特拉津 脱酰氨基反应，产生n 异丙基氰尿酰胺。第三个酶是n 一异丙基氰尿酰胺异丙基氨基水 解酶( a t z c ) ，转化n 异丙基氰尿酰胺，生成氰尿酸和异丙胺。编码这三种酶的基因已被 分离并测定了核苷酸序列。氰尿酸以后步骤的酶和基因( a t z d , a t z e , a t z f ) 也由m a r t i n e z 等测序鉴定。 沈阳农业大学硕士学位论文 a a 九a # 娜 锥 瓣暂 隹 萤嘛，啡 傀秘 觥o 啦卿辨 气姒 烈脚 舳曲哦l 瞰触黼 图l - 2 假单胞菌a d p 菌株的阿特拉津降解途径 f i g 1 - 2p s 叫d o m o n 罄s p 剜a a i n a d pa 士r a z i n c 。d e g r a d i n gs t e p s d es o u z a ( d es o u z ac ta l ，1 9 9 5 ) 等以假单胞菌a d p 菌株的基因组d n a 为材料，克隆到 一个与阿特拉津脱氯反应有关的2 1 5 k b 的e c o ri 片段( p m n l ) ，并证明羟基阿特拉津是 阿特拉津降解的第一个中间产物。通过上述d n a 片断的亚克隆和t n 5 插入突变分析， 证明1 9 k b 的a v ai 片段( p m d 4 ) 为阿特拉津脱氯反应所必需。对1 9 k b 的a v ai 片段进行 的核苷酸序列分析表明，它由1 8 6 1 个核苷酸组成，其中有3 7 5 个腺嘌呤( a ) ，4 8 3 个胞 嘧啶( c ) ，6 0 0 个鸟嘌呤( g ) 和4 0 3 个胸腺嘧啶( t ) 。该片段含有完整的a t z a 基因，从 第2 3 6 个核苷酸( 起始密码子a t g ) 开始到第1 6 6 0 个核苷酸( 终止密码子t a g ) 结束，共有1 4 2 5 个核苷酸。它的g c 含量很高，为5 8 4 6 ，因此熔解温度也高达8 8 5 2 ，这主要是因 为a t z a 基因中密码子在第3 位均偏好c g 。a t z a 基因编码4 7 4 个氨基酸的多肽序列，根 据每个氨基酸的分子量计算，这个多肽链的分子量约为5 2 4 8 5 0 5d a l t o n s ，等电点为 6 2 9 1 。以g g a g a 开始的假单胞菌核糖体结合位点位于转录起始密码子上游l l b p 处。 阿特拉津氯水解酶a t z a 可以通过硫酸胺沉淀和阴离子交换层析进行纯化。 s d s p a g e 电泳和凝胶过滤层析分析结果表明，a t z a 蛋白亚基和全酶的分子量分别是 6 0 0 0 0 和2 4 5 0 0 0 ，这表明天然酶可能是同源四聚体蛋白。天然酶几乎不含有金属离子， 等电点为5 2 5 。纯化的a t z a 蛋白不仅能催化阿特拉津的脱氯反应，还能催化脱乙基阿 特拉津、脱异丙基阿特拉津和西玛津水解( d es o u z a , c ta l1 9 9 6 ) 。同源性分析表明。a t z a 蛋白与来自珊瑚红球菌( r h o d o c o c c u sc o r a h i n u s ) n r r lb 1 5 4 4 4 r 菌株的t r z a 蛋白在氨 基酸水平上有4 1 的同源性。后者能催化密胺的脱氨反应和脱乙基阿特拉津的脱氯反 弋众 幛 综述 应，但不能催化阿特拉津的脱氯反应。而a t z a 蛋白能催化阿特拉津、西玛津和脱乙基 阿特拉津脱氯，但不能催化密胺降解( d es o u z a e ta l ，1 9 9 8 ) 。 另外一种阿特拉津降解途径是某些a r t h r o b a c t e r 细菌控制的途径，它们只能将阿特 拉津降解成氰尿酸，编码该途径降解酶的基因是t r z n 、a t z b 和a t z c ，该途径的第一个降 解基因是三嗪水解酶基因t r z n ，t r z n 和a t z a 编码的酶都是催化阿特拉津水解脱氯，但它 们的核苷酸序列类似性只有2 6 。与a t z a 相比，t r z n 能够降解更广泛的三嗪类化合物 ( s 面a p h a n ，2 0 0 4 ) 。 1 4 2 阿特拉津降解基因的质粒遗传 d es o u z a ( d es o u z ae ta 1 1 9 9 8 ) 等发现，假单胞菌a d p 菌株降解阿特拉津的表型很 不稳定。在无阿特拉津、以n h 4 c l 为唯一氮源的培养基中培养时，降解阿特拉津的能力 容易丢失，成为a t r 菌株。a t r 菌株既不能降解阿特拉津，也不能降解羟基阿特拉津， 因此推测它可能至少缺失阿特拉津降解途径中所需的前两个酶。以a t z a 、b 和c 基因的 合成引物对a t r 菌株的基因组d n a 进行p c r 扩增时，没有相应的基因被合成：s o u t h e r n 杂交实验发现，当以a t z a 、占或c 的基因为探针时，它们都能与野生型假单胞菌a d p 菌株( a 仃十) 的基因组d n a 杂交，而不能与a t r 一菌株的基因组d n a 杂交。这些都说明 这类菌株己丢失了编码阿特拉津降解途径前三步反应所需酶的基因。 基于假单胞菌a d p 菌株降解阿特拉滓的能力的不稳定性，d es e u z a 等设计了个 实验，以证明是否阿特拉津降解基因位于一个质粒上，并能自我转移。用假单胞菌a d p 菌株( n a l r , a t r + ) 作供体，e c o t i a d 2 5 6 ( r e c a 5 6 s r c 3 0 0 ：t n l o ；t e g ) 作受体，在l b 平板上进行 混合培养，然后在含阿特拉律( 5 0 1 t g m 1 ) 的l b 平板上选择t e t r 菌落，再在阿特拉津平板 上筛选a t r + 接合体，并且验证这类接合体在萘啶酮酸州a 1 ) 平板上不能生长。这样从5 0 个克隆中筛选到3 个阳性克隆，它们能降解阿特拉津，但不是获得四环素抗性的假单胞 菌a d p 菌株，而是以4 7 1 0 之，受体的接合效率产生的能降解阿特拉津的e c o l i 接合体菌 株。s d s 聚丙稀酰胺凝胶电泳表明，这三个e c o l i 按合体菌株的可溶性蛋白