（遗传学专业论文）mir24下调喉癌s100a8表达的体内研究.pdf

目录 7 iyiflllilliilill8ulll9illllr3lllfllollilll5lllill8iiinl f y18 9 3 0 5 8 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要一4 二、英文缩略语”7 三、论文 自 言8 日u 舌子 材料与方法“9 实验结果2 1 讨论一2 7 结论3 0 四、本研究创新性的自我评价3 1 五、参考文献3 2 六、附录 综述3 6 在学期问科研成绩4 4 致谢4 5 个人简介4 6 中文论著摘要 m i r 2 4 下调喉癌s 1 0 0 a 8 表达的体内研究 刖 吾 喉癌是呼吸道第二大常见恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2 3 ，占耳鼻喉恶性 肿瘤的11 , - - , 2 2 。在我国，特别是东北地区，喉癌的发病率呈逐年上升趋势。早期 喉癌通常以单纯放疗或手术切除为主，对于进展期喉癌，在世界范围内，手术仍然是 首选的治疗方法。但手术、放疗、化疗致残率高、并发症多、毒副作用大，因此，术 后复发和转移仍是喉癌患者主要的致死原因，5 年生存率很难有突破性的进展。因此， 寻找有效、简便、毒副作用小的治疗方法成为临床工作者关注的焦点。肿瘤生物治疗 是应用现代生物技术及产品进行肿瘤防治的新疗法，它通过调动宿主的天然防御机制 或者给予天然( 或基因工程) 产生的靶向性很强的物质达到抗肿瘤的效果。 目前，对喉癌$ 1 0 0 a 8 基因表达调控机制的研究相对有限。体外研究发现s i o o a 8 基因表达受许多前炎症因子( t n f a 、i l 1 ) 和其上游的转录因子( a p 1 、n f k a p p ab 、 c e b p 、k l e m p t 等) 的调控【1 。3 1 。 尽管转录是基因表达过程中必不可少的首要阶段，但转录水平的调节对引起表型 改变的功能性蛋白产物的产生并不起决定作用。未来研究的方向将集中在复杂的基因 调控网络如何进化及这些进化如何引起表型改变，而实现这一目标的首要步骤即是明 确调控因子及其与靶基因的相互作用机制【4 】。微小r n a ( m i c r o r n a ，m i r n a s ) 是近 年来发现的基因转录后调节因子，它是一长约2 2 个核苷酸的非编码小r n a ，能与靶 m r n a3 非翻译区( 3 u t r ) 特异性位点结合，在肿瘤发生、发展过程中发挥癌基因 或抑癌基因的作用【5 1 。已有文献报道m i r n a s 的异常表达与特定的肿瘤具有相关性。 例如，慢性淋巴细胞性白血病( c l l ) 存在m i r 1 5 a 和m i r 1 6 a 表达异常；弥漫性大 b 细胞淋巴瘤( d l b c l ) 存在m i r 1 5 5 表达异常；在结直肠癌中存在m i r 1 4 3 和 m i r 1 4 5 表达异常；肺癌中存在1 e t 7 的表达异常。近年来，计算机技术和实验室技术 的完美结合使得对m i r n a s 及其结合位点的研究成为可能。既往研究中，我们构建了 野生型( w t u t r ) 和突变型( m u t u t r ) 荧光报告素酶表达载体，通过瞬时共转染 、报告基因质粒和m i r 2 4 2 前体、m i r 2 4 拮抗剂到h e p 2 细胞中，分别检测荧光报告素 1 酶活性及s i o o a 8 基因在m r n a 及蛋白表达水平上的改变，揭示m i r 2 4 2 前体能明 显抑制野生型荧光报告素酶活性，并能降低$ 1 0 0 a 8 基因在蛋白质表达水平的改变， 而m i r 2 4 拮抗剂能逆转这一效应，该结果表明在体外环境下喉癌h e p 2 细胞中m i r 一2 4 2 能靶向负性调节s i o o a 8 基因的表达。在体内情况下，m i r 2 4 2 是否也具有相同或相 似的作用，是本研究拟解决的关键问题。本研究在利用瞬时转染技术将s 1 0 0 a 8 报告 质粒和m i r 2 4 2 前体转染到h e p 2 细胞中，并建立裸鼠喉鳞癌移植肿瘤动物模型，利 用动物模型观察裸鼠移植瘤的生长情况，阐述m i r 2 4 2 在喉癌治疗中的作用；检测 移植瘤组织内$ 1 0 0 a 8 的表达，验证m i r 2 4 2 在体内环境中对s i o o a 8 基因的靶向负 性调控作用。相信对s i o o a 8 基因及其调控因子m i r 一2 4 哟深入了解，不仅有助于认识 生命过程，而且有助于以m i r n a s 为靶点的新药开发，从而为肿瘤和其它疾病的治疗 提供新的线索。 材料与方法 本研究在利用瞬时转染技术将s 1 0 0 a 8 报告质粒和m i r 2 4 2 前体转染到h e p 2 细 胞中，并建立裸鼠喉鳞癌移植肿瘤动物模型，观察荷瘤裸鼠动物模型的体重变化及肿 瘤大小绘制生长曲线以裸鼠移植瘤组织标本为实验材料，应用免疫组化、r t - p c r 和 w e s t e r nb l o t 检测喉磷癌组织中s i o o a 8 的表达水平。 实验结果 1 、h e p 2 细胞体外荧光素酶报告基因活性检测结果显示：共转染l u t s 1 0 0 a 8 一w t + p r e m i r 一2 4 组报告基因活性相对于其它各组明显降低，具有统计学意义( p 0 0 5 ) ； 2 、荷瘤裸鼠肿瘤体重和体积检测结果显示：共转染l u t s 1 0 0 a 8 一w t + p r e m i r 2 4 组的裸鼠体重显著增加、肿瘤体积显著降低( p 0 0 5 ) ； 4 、免疫组化结果显示：转染p r e - m i r 2 4 组和共转染l u t s 1 0 0 a 8 w t + p r e m i r 2 4 组的s 1 0 0 a 8 蛋白表达水平与空白对照组相比明显降低； 5 、w e s t e r nb o l t 结果显示：裸鼠移植瘤组织中p r e m i r 2 4 + l u t s 1 0 0 a 8 w t 组 2 l u t s10 0 a 8 w t 组、p r e - m i r 一2 4 组和c o n t r o lm i r 组的s10 0 a 8 蛋白与1 3 - a c t i n 的平均 灰度比值分别为0 6 2 3 + 0 1 6 7 ，1 4 3 74 - 0 3 7 5 ，1 0 1 4 4 - 0 7 0 6 和1 6 9 7 4 - 0 1 5 8 。 p r e m i r 一2 4 + l u t s 1 0 0 a 8 w t 组s 1 0 0 a 8 蛋白表达水平显著低于其他组( p o 0 5 ) 。 结论 在体内m i r 一2 4 2 通过抑制s i o o a 8 表达抑制喉癌细胞的生长。 关键词 $ 1 0 0 , 4 & m i r 一2 4 2 ；h e p 2 ；荷瘤裸鼠 3 英文论著摘要 v i v os t u d yo fm i r - 2 4 d o w n r e g u l a t e s t h ee x p r e s s i o n o fs10 0 a 8i nl a r y n g e a lc a r c i n o m a i n t r o d u c t i o n l a r y n g e a lc a r c i n o m ai s t h es e c o n dm o s tc o m m o nt y p eo fr e s p i r a t o r yt r a c to f m a l i g n a n tt u m o r s i ta c c o u n t sf o r2 t o3 i na l lt h em a l i g n a n tt u m o r s a n d1l t o2 2 o f e n tm a l i g n a n tt u m o r s i no u rc o u n t r y , e s p e c i a l l yi nt h en o r t h e a s tp a r t ，t h el a r y n g e a l c a r c i n o m ai n c i d e n c ei n c r e a s e sr e c e n t l y t h ee a r l ys t a g eo fl a r y n g e a lc a r c i n o m ai st r e a t e db y p u r er a d i o t h e r a p yo rs u r g i c a lr e m o v a l h o w e v e r , f o rt h em i d d l ea n da d v a n c e ds t a g eo f l a r y n g e a lc a r c i n o m a ，w h o l el a r y n g e a lr e s e c t i o ni s s t i l lt h ep r e f e r r e dt r e a t m e n tw o r l d w i d e s u r g e r y , r a d i o t h e r a p y , a n dc h e m o t h e r a p yc a n c a u s eh i g hr a t eo fd i s a b i l i t ya n d c o m p l i c a t i o n sa sw e l la sm a n ys e r i o u st o x i ca n ds i d ee f f e c t s t h e r e f o r e ，p o s t o p e r a t i v e r e c u r r e n c ea n dm e t a s t a s i sa r es t i l lm a i nc a u s eo fd e a t hf o rt h ep a t i e n t sw i t hl a r y n g e a l c a r c i n o m a t h ef u r t h e rr i s eo f5 - y e a rs u r v i v a lr a t eh a sc o m et oab o t t l e n e c ks t a g e ，w h i c h m e a n si ti sh a r dt om a k ea n yb r e a k t h r o u g hp r o g r e s s t h e r e f o r e ，o u rf u t u r ew o r ks h o u l d f o c u so nl o o k i n gf o rn e we f f e c t i v ea n ds i m p l et r e a t m e n tm e t h o d sw i t h o u to rw i t hs l i g h t s i d ee f f e c t s t u m o rb i o t h e r a p yi san e wt r e a t m e n tf o rt u m o rp r e v e n t i o n i td e p e n d so n m o d e mb i o l o g i c a lt e c h n i q u ea n di t sp r o d u c t s t h i sk i n do ft h e r a p ya c h i e v e sa n t i t u m o r e f f e c tb ya c t i v a t i n gt h ei n n a t ep r e v e n t i o nm e c h a n i s mo ft h eh o s to rd e p e n d i n go nt h e m a t e r i a l sw i t hh i g hp e r t i n e n c ya n dt a r g e t i n gc h a r a c t e r i s t i ct h a ta r ep r o d u c e dn a t u r a l l yo r t h r o u g hg e n e t i ce n g i n e e r i n g a tp r e s e n t ，r e s e a r c ho nr e g u l a t i o nm e c h a n i s mo fs i o o a 8i nl a r y n g e a lc a r c i n o m a m a i n l yf o c u s e so nt r a n s c r i p t i o nl e v e l f o re x a m p l e ，s i o o a 8g e n ei sr e g u l a t e db ym a n y f o r m e ri n f l a m m a t o r yf a c t o r s ( t n f - a ，i l 1 ) a n du p s t r e a mt r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ( a p 一1 ， n f k a p p ab ，c e b p , k l e m p t ，e t c ) 【1 3 1 a l t h o u g ht r a n s c r i p t i o ni st h ee s s e n t i a la n dp r i m a r ys t a g ei ng e n ee x p r e s s i o np r o c e s s ，i t i sn o td e c i s i v ef o rt h ep r o d u c t i o no ft h ef u n c t i o n a lp r o t e i n p o s t t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i o n 、 a l s op l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei ng e n ee x p r e s s i o n ，w h i c hh e l p su st ou n d e r s t a n dh o w c o m p l e x g e n er e g u l a t i o n n e t w o r ke v o l v e sa n dh o wt h e s ee v o l u t i o n sc a u s et h ep h e n o t y p e 4 c h a n g e t h e r e f o r e ，t h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mo fr e g u l a t o r yf a c t o r sa n dt h ec o r r e s p o n d i n g t a r g e tg e n e ss e e m sc r i t i c a li na n s w e r i n gt h ea b o v ep r o b l e m s 【4 】m i c r o r n a ，w h i c hi sa n o n c o d i n gr n aw i t h18 2 2n u c l e o t i d e ，i sau s e f u lr e g u l a t o r yf a c t o rp o s t t r a n s c r i p t i o n a l l y m i e r o r n a sa c ta si n h i b i t o r st h r o u g hc o m b i n i n gw i t hm r n a3 u t ro ft a r g e tg e n e si n a l la n i m a l sa n dp l a n t sg e n o m e i ti sc l e a rt h a tm i r n ah a sas i m i l a rf u n c t i o nt oo n c o g e n e o r t u m o rs u p p r e s s o rg e n ei no c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n tt u m o r s s o m ev i r u s e se n c o d e m i r n at oa f f e c th o s tc e l l s ，w h i c hc o u l dr e s u l ti no n c o g e n e s i s 5 1 u n u s u a le x p r e s s i o no f m i e r o r n ai sr e l a t e dt os p e c i f i ct u m o r s f o re x a m p l e ，a b n o r m a le x p r e s s i o no fm i r 一15 aa n d m i r 一16 ai nc l l ，m i r 一15 5i nd l b c l ，m i r - 14 3a n dm i r - 14 5i nc o l o na n dr e c t a lc a n c e r s ， a n dl e t 一7i nl u n gc a n c e rw a sf o u n d r e c e n t l y , t h ec o m b i n a t i o no fc o m p u t e ra n dl a b o r a t o r y t e c h n i q u e si su s e f u li ns t u d i n gm i c r o r n aa n di t st a r g e tg e n e s i nt h i ss t u d y , w ef o u n dt h a t m i r 一2 4 - 2c o u l db i n dt o3 u t ro fg e n es i o o a 8 m i r 一2 4 2h a s9 5 h o m o l o g yb e t w e e n r a t sa n dh u m a n s of a r , s t u d yo nm i e r o r n a si nc o n t r o l l i n gs i o o a 8e x p r e s s i o na n dm i r 一2 4 - 2 i n v o l v i n gi nb i o p r o c e s s e so ft u m o r si n v a s i o na n da p o p t o s i sh a v en o tr e p o r t e d b a s eo nt h eh e p 2c e l lm o u s em o d e lw ec o n s t r u c t e d ，t r a n s i e n tt r a n s f e c t i o nt e c h n i q u e w a su s e dt oo b s e r v et h ec e l l u l a rg r o w t hs t a t u sa n dt h ee x p r e s s i o nl e v e l so f s l o o a 8i nh e p 2 c e l l st r a n s f e c t e dw i t hm i r 一2 4 - 2 o u rr e s u l t sr e v e a lt h a tm i r - 2 4 - 2p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei n o c c u r r e n c e ，d e v e l o p m e n ta n dp r o g n o s i so fl a r y n g e a lc a r c i n o m a t h i ss t u d yn o to n l yh e l p s u st ou n d e r s t a n dl i f ep r o c e s s e s ，b u ta l s od e v e l o pn e wm i r n a sa st a r g e t si nc a n c e r t r e a t m e n t m a t e r i a l sa n dm e t h o d t oc o n f i r mw h e t h e rs 10 0 a 83 7 u t ri sf u n c t i o n a lb i n d i n gs i t ef o rm i r - 2 4 ，w e c o n s t r u c t e dt h es io o a 83 u t re x p r e s s i o nv e c t o r r t - p c ra n dl u c i f e r a s er e p o r t e ra s s a y s w e r eu s e dt od e t e c ts i o o a 8e x p r e s s i o nl e v e li nh e p 2c e l l st r a n s f e c t e dw i t hs i o o a 8v e c t o r c e l l u l a rm o r p h o l o g y , p r o l i f e r a t i o na n di n v a s i o nw e r eo b s e r v e da n dd e t e c t e di nh e p 2c e l l s t r a n s f e c t e d b yp r e - m i r 一2 4 + l u t - s10 0 a 8 一w t ，c o m p a r e d t ot h o s et r a n s f e c t e d b y l u t s10 0 a 8 一w t ，p r e m i r 一2 4o rc o n t r o lm i c r o r n a m e a n w h i l e ，h e p 2c e l ln u d em o u s e m o d e lw a se s t a b l i s h e da n dt h et u m o rs i z eo fh e p 2c e l ln u d em o u s em o d e lw a sm e a s u r e d s i o o a 8e x p r e s s i o nl e v e l si nl s c ct i s s u e so b t a i n e df r o mt h em o u s em o d e lw e r ed e t e c t e d b yi m m u n o h i s t o c h e m i s t y , r t - p c ra n dw e s t e r nb l o t ，r e s p e c t i v e l y 5 r e s u l t s 1 r e s u l t sf r o ml u c i f e r a s er e p o r t e ra s s a ys h o w e dt h a tt h er e p o r t e ra c t i v i t i e si ng r o u p p r e - m i r - 2 4 + l u t - s10 0 a 8 - w ta n dp r e - m i r - - 2 4w e r es i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h o s ei no t h e r g r o u p s ( p o 0 5 ) 2 r e s u l t sf r o mt h ed e t e c t i o no ft u m o rs i z ea n dw e i g h ti nm o u s em o d e li n d i c a t e dt h a t b o t ht h et u m o rs i z ea n dw e i g h tw e r es i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di nt h em i c ei n o c u l a t e db y h e p 2 c e l lt r a n s f e c t e dw i t hp r e - m i r 一2 4 + l u t slo o a 8 - w tc o m p a r e dt ot h o s ei nt h ec o n t r o l s ( p o 0 5 ) ； 4 i m m u n o h i s t o c h e m i c a la s s a yr e s u l t sd i s p l a y e dt h a tt h en u m b e ro fs10 0 a 8 - p o s i t i v e c e l l sw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e ri nt h et u m o rc e l l so b t a i n e df r o mt h em i c ei n o c u l a t e db yh e p 2 c e l l 仃a n s f e c t e de i t h e rw i t hp r e m i r 2 4 + l u t s10 0 a 8 一w to rp r e m i r 2 4t h a nt h a tf r o mt h e c o n t r o lt r a n s f e c t e dw i t hc o n t r o lm i e r o r n a ( p o 0 5 ) ； 5 w e s t e r nb l o tr e s u l t ss h o w e dt h a ts i o o a 8p r o t e i nl e v e l b - a c t i np r o t e i nl e v e lo f p r e m i r 一2 4 + l u t s10 0 a 8 一w t ，l u t s10 0 a 8 - w t ，p r e - m i r 一2 4a n dc o n t r o lm i rg r o u pw e r e o 6 2 3 士o 1 6 7 ，1 4 3 74 - 0 3 7 5 ，1 0 1 4 土0 7 0 6 和1 6 9 7 + 0 1 5 8 ，r e s p e c t i v e l y s i o o a 8p r o t e i n e x p r e s s i o nl e v e ls i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di ng r o u pc o t r a n s f e c t e dw i t hp r e - m i r - 2 4a n d l u t s1o o a 8 - w tc o m p a r e dt ot h a ti nt h ec o n t r o l si nv i v o ( p 0 0 5 ) c o n c l u s i o n m i r 一2 4 2p r e v e n t st h eg r o w t ho fl s c cv i ai n h i b i t i n gt h ee x p r e s s i o no f s lo o a 8i nv i v o k e y w o r d s s 10 0 a 8 ；m i r - 2 4 2 ：h e p 2 ；n u d em i c eb e a r i n gt u m o r 6 英文缩略语 l s c c l a r y n g e a ls q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a 喉鳞状细胞癌 s 1 0 0 a 8 s 1 0 0c a l c i u mb i n d i n gp r o t e i na 8s 1 0 0 钙结合蛋白a 8 m i r - 2 4m i c r o r n a 一2 4 m i c r o r n a 一2 4 3u t r3 u n t r a n l a t i o nr e g i o n 3 非翻译区 t s g t u m o rs u p p r e s s o rg e n e肿瘤抑制基因 r t - p c r r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 反转录一聚合酶链反应 c d n a c o m p l e m e n t a r yd n a 互补d n a s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基磺酸钠 p m s f p h e n y l m e t h y ls u l f o n y l f u o r i d e 苯甲基磺酰氟化物 t r i s 联s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 三( 羟甲基) 氨基甲烷 b s ab o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清白蛋白 d h f r d i h y d r o f o l a t er e d u c t a s e 二氢叶酸还原酶 7 论文 m i r 一2 4 下调喉癌s i o o a 8 表达的体内研究 刖罱 喉癌是呼吸道第二大常见恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2 3 ，占耳鼻喉恶性 肿瘤的1 1 2 2 。在我国，特别是东北地区，喉癌的发病率呈逐年上升趋势。早期 喉癌通常以单纯放疗或手术切除为主，对于进展期喉癌，在世界范围内，全喉头切除 术仍然是首选的治疗方法。但手术、放疗、化疗致残率高、并发症多、毒副作用大， 因此，手术后复发和转移仍是喉癌患者主要的致死原因，5 年生存率一直没有突破性 的进展。因此寻找有效、简便、毒副作用小的治疗方法成为临床工作者关注的焦点。 肿瘤生物治疗是应用现代生物技术及产品进行肿瘤防治的新疗法，它通过调动宿主的 天然防御机制或者给予天然( 或基因工程) 产生的靶向性很强的物质来达到抗肿瘤的 效果。 从分子水平上研究相关基因在喉癌发生和转移中的作用及分子机制，将有利于发 现喉癌基因诊断和生物治疗的线索，也会为临床医生提供肿瘤诊断分型、治疗方案和 分析预后的一种重要手段。包括喉癌在内的所有肿瘤分子发生机制的研究仍是目前肿 瘤研究的重点和难点。近年来，m i c r o r n a s ( m i r n a s ) 在肿瘤发生、发展和侵袭转 移等分子机制的研究中扮演着越来越重要的作用，已经迅速地发展成为肿瘤等疾病潜 在的重要分子标志物【6 】。某些m i r n a 如m i r n a 1 7 9 2 在肿瘤中高表达，通过促进肿 瘤细胞分化和凋亡直接参与肿瘤的发展。还有一些m i r n a 通过抑制癌基因和或抑癌 基因间接参与肿瘤的发展过程，这些m i r n a 为治疗肿瘤提供了新的思路【7 】。 m i r n a 是近年来发现的一类长度约2 2 个核苷酸的内源、单链、非编码小r n a ， 主要通过抑制它的靶基因而起调控作用【8 】。m i r n a 在生物体的物质代谢、细胞周期、 细胞分化、凋亡、个体形态的形成和发育等一系列重要生命活动的调控过程中起着重 要作用。m i r n a 通过与靶基因m r n a37 u t r 以完全或部分互补配对的方式降解靶 m r n a 或抑制其翻译 9 - 1 1 】。m i r n a 的表达异常可以导致众多复杂疾病的产生，更与 肿瘤的发生发展密切相关。m i r n a 的表达失调很可能引起大量相关基因的表达异常， 导致细胞功能紊乱，最终导致疾病的发生。m i r n a 在肿瘤发生发展过程中具有与癌 8 基因或抑癌基因相似的作用，有些致瘤病毒也编码m i r n a ，通过影响宿主细胞在肿 瘤发生中可能发挥重要作用。前期，我们对s i o o a 8 基因在喉癌中的作用和分子机制进 行了一系列研究，结果提示s 1 0 0 4 8 基因在喉癌中高表达，可能是一重要的癌基因n 引； 我们还发现s i o o a 8 基因在喉癌中存在转录水平和翻译水平表达不一致的现象，因此， 我们推测s i o o a 8 基因在转录水平和翻译水平之间存在某种调控机制。通过软件预测， 我们发现某些m i r n a 如m i r - 2 4 - 2 可靶向结合酣删占基因m r n a3 非翻译区，应用终 点p c r 和荧光定量p c r 技术检测7 种肿瘤细胞系和1 0 例喉癌组织中m i r 2 4 2 表达的 情况，结果表明喉癌中m i r 2 4 2 表达显著降低，且与s 1 0 0 a 8 基因在喉癌中高表达存 在显著相关，提示其低表达是造成s 1 0 0 a 8 基因在喉癌中高表达的原因之一。c h e n g 等通过筛查发现了一些参与细胞生长和凋亡的m i r n a ，其中，m i r 2 4 2 可以抑制h e l a 细胞的生长n3 1 。p r a s u n 等研究结果表明m i r 2 4 能增加人类纤维肉瘤细胞h t l 0 8 0 对 甲氨蝶呤的敏感性n4 l 。还有学者认为m i r 2 4 可能是卡波西肉瘤的特异性生物标记n 。5 1 。 上述研究结果均提示m i r 一2 4 可能是肿瘤重要的生长调控基因之一。m i r 2 4 2 由人类 1 9 号染色体的基因间隔区序列所编码，其成熟序列是：t g g c t c a g t t c a g c a g g 从c a g 。人 类m i r 2 4 2 与大鼠的同源性高达9 5 。迄今为止，有关m i c r o r n a 调控卯俐孑基因 表达的研究未见报道，也未见m i r 一2 4 2 参与肿瘤肿瘤治疗的相关研究。 实验材料和方法 一、实验材料 l 、细胞系 人喉癌h e p 2 细胞系购于中科院上海细胞库。 2 、实验动物 b a l b c 纯系裸小鼠1 5 只，4 - 5 w 龄，体重1 6 - - 。2 0 9 , 均为雌性，购自北京维 通利华有限公司。 3 、主要试剂 ( 1 )反转录试剂盒( t a k a r a 公司) ( 2 ) p c r 相关试剂( m b i 公司) 9 ( 3 ) p y r o b e s td n ap o l y m e r a s e ( t a k a r a 公司) ( 4 ) 琼脂糖( g e n e t e c h 公司) ( 5 ) b c a 蛋白浓度测定试剂盒( 碧云天公司) ( 6 ) s a b c 免疫组化试剂盒( 博士德公司) ( 7 ) 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗( 北京中杉生物技术公司) ( 8 ) 辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗( 北京中杉生物技术公司) ( 9 ) 1 3 - a c t i n 蛋白抗体( 碧云天公司) ( 1 0 ) p v d f 膜( m i l l i p o r e 公司) ( 1 1 ) e c l 发光试剂( 碧云天公司) ( 1 2 ) 丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺( b i o s h a r p 公司) ( 1 3 ) 提取d n a 相关试剂：蛋白酶k ( a m r e s c o 公司) ( 1 4 ) 提取总r n a 相关试剂：t r i z o lr e a g e n t ( i n v i t r o g e n 公司) ( 1 5 ) 提取蛋白质相关试剂：r i p a 裂解液( 强) ( 碧云天公司) 、p m s f ( 上海 华舜公司) ( 1 6 ) 其它常用试剂：1 0 s d s 、1 m i r i s h c l 、p h 8 0t e 、3 mn a a c 、乙醇、 异丙醇( 参照分子克隆实验指南配制) ( 1 7 ) 羊抗人s 1 0 0 a 8 多克隆抗体( s a n t ac r u z e 公司) ( 1 8 ) r p m i1 6 4 0 培养基、胎牛血清( g i b c o 公司) ( 1 9 ) 内切酶b g l1 1 、历以i ( t a k a r a 公司) ( 2 0 ) t 4d n a 连接酶( t a k a r a 公司) ( 2 1 ) 胰蛋白胨、酵母提取物( s i g m a 公司) ( 2 2 ) u n i q 1 0 柱式d n a 片段纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒( 上海生工 生物工程技术服务有限公司) ( 2 3 ) 高纯度质粒小提中量试剂盒( t i a n g e n 公司) ( 2 4 ) 6 孔板( c o s t e r 公司) ( 2 5 ) 脂质体转染试剂l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 ( i n v i t r o g e n 公司) ( 2 6 ) 质粒中提试剂盒( p r o m e g a 公司) ( 2 7 ) p g l 3 一p r o m o t o rv e c t o r ( p r o m e g e 公司) 1 0 ( 2 8 ) p r l t kv e c t o r ( p r o m e g e 公司) ( 2 9 ) c o n t r 0 1 m i ra n dp r e m i r 2 4 ( a m b i o n 公司) ( 3 0 ) d u a l - l u c i f e r a s er e p o r t e rs y s t e m ( p r o m e g e 公司) 4 、主要仪器 ( 1 ) h e i d o l ph d l a x 6 0 0 匀浆器( 德国f l u k o 公司) ( 2 ) p c r 扩增仪( 4 8 0 ，2 4 0 0 ，9 6 0 0 型，p e 公司) ( 3 ) h e r m l e z 3 2 3 k 台式低温超速离心机( 美国s i g m a 公司) ( 4 )台式高速离心机( t g l 1 6 g 上海生物仪器厂) ( 5 ) x w - 8 0 a 涡旋混合器( 上海医科大学仪器厂) ( 6 )水浴锅( l k b ，w e s tg e r m a n y ) ( 7 )紫外检测仪( 上海生物仪器厂) ( 8 )凝胶自动成像仪g d s 8 0 0 0 ( u v p 美国b i o r a d 公司) ( 9 )紫外分光光度仪( 日本b i o c h r o m 公司) ( 1 0 )恒温振荡器( t h z 9 5 型北京四环科学仪器厂) ( 11 ) 酶标仪( m o d e l 6 8 0 ，b i o r a d ) ( 1 2 ) 电泳仪( b i o r a d m o d e l 2 5 0 2 5 ，s w e d e n ) ( 1 3 )电泳槽( b i o r a d m i n ip r o t e a nl lt m ，s w e d e n ) ( 1 4 )蛋白转膜电泳槽( 美国b i o r a d 公司) ( 1 5 ) p o w e r l o o ki i i 扫描仪( u m a x 公司) ( 1 6 )s c s 2 4 型温控摇床( 上海市离心机械研究所) ( 1 7 )光学显微镜( 日本o l y m p u s 公司) ( 1 8 )超净工作台( 上海医用仪器厂) ( 1 9 ) 荧光素酶分析仪( 美国p r o m e g a 公司) 二、实验方法 ( 一) 细胞培养 人喉癌曼蝗细胞系在含1 0 胎牛血清、1 0 0 u m l 链霉素、1 0 0 9 9 m l 青霉素的 r p m l l 6 4 0 培养基于3 7 c 、5 c 0 2 饱和湿度条件下培养，取指数生长期的细胞进行 后续实验。 ( 二) 质粒抽提 应用p r o m e g a 公司p u r e y i e l d t mp l a s m i dm i d i p r e ps y s t e m 型号a 2 4 9 2 质粒抽提试 剂盒提取质粒。 ( 1 ) 按1 ：