（微生物学专业论文）应用rnai技术对球孢白僵菌羧基转运蛋白基因bbjen1的初步研究.pdf

摘要 羧基转运蛋白基因是近年来分离出的新基因，在虫生真菌中，它既与穿透昆虫体 壁所需的能量有关，也受昆虫体壁的诱导，因此推测是一种重要的毒力因子，但确切 功能尚需确定。本研究运用r n a 干扰的方法，通过将球孢白僵菌羧基转运蛋白基因 b b j e n l 沉默来初步研究其功能。 实验构建了两种干扰载体：( i ) p r n a i ：根据基因库上的b b j e n l m r n a 序列，设 计并合成两端含有酶切位点的6 4 个碱基的寡核苷酸链。寡核苷酸链退火后用t 4 d n a 连接酶连接到线性化的p r n a u 6 1 - h y f f o 质粒中，转化大肠杆菌，并对重组质粒进行 菌落p c r 及测序鉴定。( 蛩p b a r g p e l r n a i ：根据g e n b a n k 中的b b j e n i 基因组d n a 序列设计两对分别含有特定酶切位点的特异引物，以球孢白僵菌基因组d n a 为模板 扩增目的基因片段。将正反向目的片段插入p b a r g p e l 质粒中，转化大肠杆菌，对重 组质粒进行菌落p c r 扩增及测序鉴定。 干扰载体构建成功后，通过对分生孢子的抑制性实验，筛选出潮霉素b 对球孢 白僵菌的最佳抑制浓度为6 0 0 t g m l 。采用原生质体转化和芽生孢子转化两种方法转 化球孢自僵菌，均获得转化子。其中芽生孢子转化法获得的转化子为7 个l a g d n a ， 原生质体转化法获得的转化子为0 9 个i _ t g d n a 。r t p c r 结果显示：构建的干扰载体 抑制了b b j e n l 的表达。其中有三个干扰载体获得了较好的沉默效果，抑制率分别达 到了7 1 、7 5 和8 2 。 接着对转化子和原始菌株进行菌丝生长速度、产孢、孢子萌发以及抗逆性等生物 学特征进行了测定。结果显示：转化子与原始菌株间生长速率和产孢量差异不显著， 表明b b j e n l 基因与菌丝生长和产孢无关。二者孢子萌发率无显著差异，但转化子孢 子萌发时间却明显滞后：原始菌株的孢子萌发中时为1 4 2 4 + 0 5 8 h ，而导入p r n a i 一1 、 p r n a i 2 、p r n a i 。3 和p b a r g p e l r n a i 的菌株分别为1 4 4 5 + 0 7 9 h 、1 6 2 2 4 ：1 0 2 h 、 1 6 13 4 - 1 6 6 和1 6 0 0 士o 4 1 h 。经抗逆性测试发现，各转化子的活孢率均低于野生菌株， 其中导入p r n a i 2 ，p r n a i 3 和p b a r g p e l r n a i 致使b b j e n l 基因沉默的菌株活孢 率显著低于野生菌株差，而导入p r n a i 1 的菌株与野生菌株差异不显著。这说明 b 幻日w 基因与抗逆性有关。 对马尾松毛虫( d e n d r o l i m u sp u n c t a t u s ) 进行生物测定的结果显示：对于原始菌 株b b l 3 ，最低剂量引起的累计校正死亡率为1 4 6 8 5 2 5 ，最高剂量的累计校正死 亡率为8 7 0 7 7 6 7 。而基因沉默菌株b b l 3 s 的最低剂量累计校正死亡率为6 9 2 4 9 8 ，最高剂量的累计校正死亡率为7 1 5 6 - 1 - 4 9 6 ，分别低于原始菌株。野生 型菌株b b l 3 两个浓度2 5 l o7 和1 2 5 x 1 0 8 的致死中时分别为6 4 9 o 3 9 天和5 5 7 0 2 8 天，b b l 3 - s 两个浓度2 5 1 07 和1 2 5 x 1 0 8 的致死中时分别为8 0 9 o 4 1 天和7 1 7 0 3 6 天，均较野生菌株长1 6 0 天，杀虫速度平均降低2 6 6 5 。b b l 3 的致死中浓 度和致死中量分别为2 7 9 x 1 0 6 0 2 1 x 1 0 6 e o n i d i am l 1 和8 4 1 2 4 1 1c o n i d i am m ， 而b b l 3 s 的致死中浓度和致死中量分别提高为1 2 7 x 1 0 7 o 1 9 x 1 0 7c o n i d i am l 。和 3 8 2 9 2 2 4 3 2c o n i d i am l n 一，相对野生型菌株平均增加了3 6 倍的孢子用量。从致死 中时、累计死亡率、致死中浓度和致死中量看，改造后的菌株b b l 3 s 的毒力较野生 型菌株有明显下降，从而证明b b j e n l 基因是一个与毒力相关的基因。 关键词：r n a 干扰，基因沉默，毒力，发芽率，抗逆性 a b s t r a c t c a r b o x y l i et r a n s p o r tp r o t e i ng e n ei san e wg e n ei s o l a t e di nr e c e n ty e a r s ，w h i c hm a y b er e l a t e dt oe n e r g ym e t a b o l i s mi n v o l v e di n f u n g a lp e n e t r a t i o no fi n s e c ti n t e g u m e n t ， p r e s u m i n gi tt ob eav i r u l e n c ef a c t o rf o re n t o m o g e n o u sf u n g i i no r d e rt oa s c e r t a i ni t s f u n c t i o ni nb e a u v e r i ab a s s i a n a ，t h eg e n eb b j e n lw a ss i l e n c e db yr n a i n t e r f e r e n c e i nt h ep r e s e n t s t u d y ，t w oi n t e r f e r e n c ev e c t o r sw e r ec o n s t r u c t e d ：p r n a i ：a c c o r d i n g t ob b j e n im r n a s e q u e n c ei ng e n b a n k ，ap a i ro f6 4 一n to l i g o n u c l e o t i d e s ，e a c hc o n t a i n i n g t h es i t e so fr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s ea tb o t h e n d s ，w e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d o l i g o n u c l e o t i d e sw e r ea n n e a l e da n dl i g a t e dw i t hl i n e a r i z e d p r n a u 6 i h y g r ow i t h t 4 d n a l i g a s e t h ep l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t oe c o l id h 5 c ta n df i n a l l yi d e n t i f i e db y c o l o n yp c ra n ds e q u e n c i n g p b a r g p e1 一r n a i ：b a s e do nb b j e n lg e n es e q u e n c ei n g e n b a n k ，t w op a i r so fs p e c i f i cp r i m e r sc o n t a i n i n gs p e c i a lr e s t r i c t i o ne n z y m es i t e sw e r e d e s i g n e d t h et a r g e tf r a g m e n t sf o r w a r da n dr e v e r s e ，w e r ea m p l i f i e da n di n s e r t e di n t ot h e p l a s r n i dp b a r g p e 1 t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t oe c o hd h 5 瓯a n d f i n a l l yi d e n t i f i e db yc o l o n yp c ra n ds e q u e n c i n g a f t e rt h ec o n s t r u c t i o no ft w o i n t e r f e r e n c e v e c t o r s ，t h eo p t i m a li n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o nf o rh y g r o m y c i nbs e l e c t e db yd r u gr e s i s t a n c ea s s a y sw i t hc o n i d i aw a s 6 0 0 p g m l t r a n s f o r m a n t sw e r eo b t a i n e db yt w od i f f e r e n tg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o nm e t h o d s ： p r o t o p l a s tt r a n s f o r m a t i o na n db l a s t o s p o r et r a n s f o r m a t i o n t h eb l a s t o s p o r et r a n s f o r m a t i o n f r e q u e n c yw a s7t r a n s f o r m a n t s p gd n a ，w h i l et h a to fp r o t o p l a s tt r a n s f o r m a t i o nw a s0 9 t r a n s f o r m a n t s p gd n a t h er e s u l t so fr t p c ri n d i c a t e dt h a tc o n s t r u c t e di n t e ! r f 彻c e v e c t o r si n h i b i t e db b j e n le x p r e s s i o ni nb b a s s i a n ao b v i o u s l y t h r e ei n t e r f e r e n c ev e c t o r s r e s u l t e di ng o o ds i l e n c i n ge f f e c t ，w i t h s i l e n c i n ge f f i c i e n c ya t71 ，7 5 a n d8 2 ， r e s p e c t i v e l y b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c ss u c ha sh y p h a lg r o w t h ，s p o r u l a t i o n ，c o n i d i u mg e r m i n a t i o n a n ds t r e s sr e s i s t a n c eo ft h et r a n s f o r m a n t sa n dt h eo r i g i n a ls t r a i nw e r et e s t e d t h er e s u l t r e v e a l e dt h a tg r o w t hr a t ea n ds p o r u l a t i o nb e t w e e nt h et r a n s f o r m a n t sa n dt h eo r i g i n a ls t r a i n w e r en o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t ，s u g g e s t i n gb b j e n li sn o ta s s o c i a t e dt oh y p h a lg r o w t ha n d s p o r u l a t i o n , w h i l eg e r m i n a t i o no ft h et r a n s f o r m a n t sw a ss i g n i f i c a n t l yr e t a r d e d m e d i a n g e r m i n a t i o nt i m eo ft h eo r i g i n a ls t r a i nw a s14 2 4 + 0 5 8 h ，w h i l et h o s eo ft h eh - a n s f _ o n n a n t s w i t hp r n a i 一1 ，p r n a i - 2 ，p r n a i 一3a n d p b a r g p e 1 r n a iw e r e14 4 5 + 0 7 9 h ，16 2 2 + 1 0 2 h 16 13 ：t ：1 6 6 ha n d16 0 0 a ：0 41h ，r e s p e c t i v e l y s t r e s sr e s i s t a n c er e s u l t ss h o w e dt h a tc o n i d i a l i i i s u r v i v a lr a t e so ft h et r a n s f o r m a n t sw e r el o w e rt h a nt h a to ft h eo r i g i n a ls t r a i n a m o n gt h e m ， 也er a t e so ft h es i l e n c e di s o l a t e st r a n s f o n n e dw i t hp i n a i 一2 ，p r n a i 一3a n dp b a r g p e l 一 r n a iw e r es i g n i f i c a n t l yl o w e r , w h i l et h a tt r a n s f o r m e dw i t hp r n a i - 1n o ts i g n i f i c a a n t l y l o w e r t h i ss u g g e s t e dt h a tb b j e n lg e n ei sr e l a t e dt os t r e s sr e s i s t a n c e b i o a s s a yw a sr u nw i t ht h et r a n s f o r m a n t sa n dt h eo r i g i n a ls t r a i nf o rt h e i rv i r u l e n c eo i l t h ec a t e r p i l l a r t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta c c u m u l a t e dc o r r e c t e dm o r t a l i t yo fb b l3b yt h e l o w e s td o s a g ew a s14 6 8 + 5 2 5 a n dt h a tb yt h eh i g h e s td o s a g ew a s8 7 0 7 + 7 6 7 w 1 l i l e t h o s eo ft h et r a n s f o r m a n tb b l 3 sw e r e6 9 2 + 4 9 8 a n d7 1 5 6 + 4 9 6 ，r e s p e c t i v e l y ，l o w e r t h a nt h o s eo ft h eo r i g i n a lw i l dt y p es t r a i n l t ：0o fb b l3w e r e6 4 9 - j ：0 3 9 da n d5 5 7 士0 2 8 d a tt w oc o n c e n t r a t i o n s ，2 5 1 0 7 a n d1 2 5 x 1 0 5 c o n i d i at o n i 之，w h i l et h o s eo fb b l 3 一s ，t h e s i l e n c e ds t r a i n ，w e r e8 0 9 a ：0 41da n d7 17 + 0 3 6 d ，r e s p e c t i v e l y ，b o t h1 6 dl o n g e rt h a nt h e o r i g i n a ls t r a i na tr e s p e c t i v ec o n c e n t r a t i o n ，w i t hk i l l i n gr a t er e d u c e db y2 6 6 5 a v e r a g e l y l c 5 0a n dl d 5 0o f t h eo r i g i n a ls t r a i nw e r e2 7 9 x 1 0 6 4 - 0 2 1 x 1 0 6 c o n i d i am l - a n d8 4 1 2 _ - k 4 1 1 c o n i d i a m m ，r e s p e c t i v e l y ，w h i l et h o s eo f t h et r a n s f o r m a n tw e r e1 2 7 x 1 07 士0 1 9 x 1 0 7 c o n i d i a m l - 1a n d3 8 2 9 2 = i ：2 4 3 2 c o n i d i ai i l n l r e s p e c t i v e l y s p o r e sn u m b e rn e e d e dw a sa v e r a g e l y 3 6 一f o l d sm o r et h a nt h a to ft h ew i l dt y p e i n d i c a t i n gas i g n i f i c a n t l yd e c l i n e dv i r u l e n c e i t s u g g e s t st h a tb b j e n lg e n ei sr e l a t e dt ov i r u l e n c e k e yw o r d s ：r n ai n t e r f e r e n c e ，g e n es i l e n c e ，v i r u l e n c e ，g e m i n a t i o n ，s t r e s sr e s i s t e n c e i v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谫 的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：时间： 0 7 年 关于论文使用授权的说明 白7 日 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 第一导师签名： 月f7 日 时间： 。f 年月f 7 日 1 文献综述 r n a 干扰( r n a i n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 是指在进化过程中高度保守的、由双链r n a ( d o u b l e s t r a n d e dr n a ，d s r n a ) 诱发的、同源m r n a 高效特异性降解的现象。r n a i 是在研究秀丽新小杆线虫( ce l e g a n s ) 反义r n a ( a n t i s e n s er n a ) 的过程中发现的。 1 9 9 5 年，g u o 等【1 】发现注射正义r n a 和反义r n a 均切断了秀丽新小杆线虫p a r d 基 因的表达途径，该结果与传统上对a n t i s e n s e r n a 技术的解释恰好相反。直到1 9 9 8 年，f i r e 等【2 1 证实g u o 等发现的正义r n a 抑制同源基因表达的现象是由于体外转录 制备的r n a 中污染了微量d s r n a 而引发，该小组将这一现象命名为r n a i 。 此后d s r n a 介导的r n a i 现象陆续发现于水螅【3 1 、斑马鱼【4 1 等多种真核生物中。 随着研究的不断深入，r n a i 的机制正逐步被阐明，对它的研究也得到了越来越多人 的重视。r n a i 技术被s c i e n c e 杂志评为2 0 0 1 年的十大科学进展之一，并名列2 0 0 2 年十大科学进展之首。 1 1r n a i 的作用机制 1 1 1 参与r n a i 作用的相关酶 r n a i 的作用过程复杂，需要多种酶的参与。其中最重要的一种酶是双链r n a 特 异性核酸内切酶( d s r n a s p e c i f i ce n d o n u c l e a s e ，d i c e r ) ，d i c e r 酶是r n a s ei i i 家族中特异 识别双链r n a 的一员，它能以一种a t p 依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基 因，病毒感染等各种方式引入的双链r n a ，切割将r n a 降解为1 9 2 1 b p 的双链 r n a s ( s i r n a s ) ，每个片段的3 端都有2 个碱基突出【5 】。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分 析发现，d i c e r 酶可与d s i a 在多个位点结合形成沉默复合物【6 j 。其主要结构包括： n 端螺旋酶区、p a z 区、c 端r n a s e l i i 区、a t p 结合区和d e c h 盒【j 。 除d i c e r 酶之外，r n a i 的作用过程还需要解旋酶、r n a 依赖性r n a 多聚酶 ( r n a d e p e n d e n t r n ap o l y m e r a s e ，r d r p ) 、a t p 酶等的参与。其中s i r n a 解链而形成 正义链和反义链需要解旋酶的作用；s i r n a 还可作为引物与靶向m r n a 结合，在r d r p 的作用下合成新的d s r n a ，使干扰作用进一步放大倍增；而将较长的d s r n a 剪切成 大量的s i r n a ，需a t p 酶提供能量【8 l 。 1 1 2r n a i 的作用机制 迄今r n a i 的详细机制和过程还不十分清楚，但大致可以分为启动、效应、倍增 三个阶段。启动阶段即s i r n a 的形成阶段：外源长d s r n a 进入体内后在d i c e r 酶的 作用下将其剪切成2 1 - - 2 3n t 的s i r n a ；效应阶段即同源m r n a 降解的阶段：在解旋 酶的作用下，s i r n a 可解链而形成正义链和反义链，其中的反义链可指导形成一种核 蛋白体复合物，称之为r n a 诱导的沉默复合体( r n a i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ， r i s c ) i 9 1 。r i s c 是由多种蛋白成分组成的，包括内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和 同源r n a 链搜索活性等【lo 】；倍增阶段即干扰效应扩增放大的阶段：s i r n a 一方面可 引导r i s c 特异性剪切同源单链m r n a ，使m r n a 降解；另一方面s i r n a 还可作为 引物与靶向m r n a 结合，在r d r p 的作用下合成新的d s r n a ，新合成的d s r n a 再次 经d i c e r 酶切割，形成新的s i r n a ，并作用于靶向m r n a i l 。 1 1 3r n a i 作用机制的重要特征 q - ) r n a i 是d s r n a 介导的p t g s 机制：迄今为止的研究认为r n a i 对染色体d n a 序 列的复制和转录过程不产生任何影响。高度特异性：小干涉r n a 除正义链3 端的 两个碱基在序列识别中不起主要作用外，其他单个碱基改变就可能使r n a i 失效【j2 1 。 高效性：仅需少量的d s r n a ( 几个数量级浓度) 就能有效的抑制靶基因表达，抑制的 效率在低等动物中 9 0 ，即其发生过程中存在着正反馈的信号放大效应。可传播 性：基因表达的效应可以跨越细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持。 在线虫中干涉效应甚至可通过生殖系传递到后代中去【13 1 。a t p 依赖性【1 4 1 ：即r n a i 效应是一个依赖a t p 的过程，在s i r n a 的产生和r i s c 的形成过程中均需要有a t p 的参 与。 1 2sir n a s 的制备方法 1 2 1 化学合成 目前，a m b i o n 和q i a g e n 等公司可以根据用户要求提供高质量的化学合成s i r n a 。 这种方法可以省去实验人员不少时间和精力，但由于实验往往需要合成多对s i r n a s ， 因此价格非常昂贵。 1 2 2 用r n a s ei il 消化长片断双链r n a 韦i j 备s i r n a 这个方法通常是选择2 0 0 1 0 0 0 碱基的靶m r n a 模版，用体外转录的方法制备长片 断双链d s r n a ，然后用r n a s ei i i ( o rd i c e r ) 在体外消化，得到一众s i r n a s “混合鸡尾 酒”。此种方法可省去筛选有效s i r n a 序列的步骤，但很可能会引发非特异的基因沉 默。 1 2 3s i r n a 表达载体 构建载体虽然比较费时，但却是迄今最广泛被使用的方法，因为s i r n a 表达载体 的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法。 1 2 4s i r n a 表达框架 s i r n a 表达框架( s i r n ae x p r e s s i o nc a s s e t t e s ，s e c s ) 是一种由p c r 得到的s i r n a 表 达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。此种方法省去了载体 克隆、测序等步骤，节省了实验人员的时间，但p c r 产物很难转入细胞中。 1 2 5 体外转录 此种方法使用t 7r n a 聚和酶体外转录d n a ，直接产生小片断的s i r n a ，快速、 2 灵活，适用于s i r n a 序列的筛选以及化学合成s i r n a 价格昂贵时，但可重复性差， 不适用于长期研究和需要大量单一s i r n a 序列的研究。表1 一l 总结了5 中不同的制备 s i r n a 的方法【1 5 】。 表1 - 1 五种制备s i r n a 方法的比较 ：! 呈坐! ：! 2 竺i p “s o no f f i v em d h o d s f o r p mr 卫i 翌! 竺垡墅坠! 垒 - _ _ i _ _ l l - _ l l _ _ l - _ - _ _ _ _ - _ - _ _ - 。- l 一_ 。_ 。一 比较项目化学合成体外转录 d s r n r n a s ea表s 达i r n 载a 体表p 达c 框r l i l 降解 材料需求 2 1 m e t i t n a o l i g o s ( - - 对1 2 9 - m c rd n a转录模版 o l i g o s ( - - 对) ( 2 0 0 一i o o o 研, ，两 侧带t 7 启动 子1 全部制备合成时间所需4 天2 周 2 4 h + d n al 天+ 转录模 时间o l i g o 合成时间 版制备时间 是否需要验证和寻找最 有效s i r n a 能否标记s i r n a ( 例如 用于荧光显微镜分析 s i r n a 进入细胞过程或 者在细胞中的定位) 转染的相对难易程度 可筛选性( 例如抗生素 筛选) 能否用于长效抑制 能否大规模制备 检测总体转染效率 需要 能 好 不可以 不可以 需要 能 好 不可以 不可以 不需要 能 好 不可以 不可以 5 5 6 0 m c r约5 0 一m e rd n a d n a o l i g o k - - 对) o l i g o s ( 一对) 5 天以上+ d n a o l i g o 合 成时间 需要 不能 6 h + d n a o l i g o 合成时间 需要 不能 差 差 可以不可以 可以( 抗生素 不可以 筛选) 可以有限 有限可以有限 不可以不可以 不可以可以不可以 每个基冈的相对费用 高中等低 中等中等 1 3r n a i 技术的应用 1 3 1 基因功能的研究 由于r n a i 能高效特异的阻断基因的表达，因而r n a i 成为研究基因功能强有力 的工具。郝冉【1 6 】等针对旋毛虫t s 8 7 基因序列设计并合成d s r n a 、s i r n a ，并通过浸泡 方式将其导入肌幼虫体内，发现t s 8 7 基因与肌幼虫体外存活率有关。李晓瑾【1 7 】等通 过体外转录d s r n a ，电转化烟曲霉，使n u d c 基因沉默后发现烟曲霉生长受阻。m i s q u i t t a 3 等【1 8 1 通过注射n a u t i l u sd s r n a 于果蝇胚胎中，发现其表现型与没有n a u t i l u s 表达的细 胞表型相似，肌肉不能形成，从而确立了n a u t i l u s 在果蝇胚胎肌肉形成中的功能。另 外，r n a i 技术能同时封闭多个基因或基因家族，甚至在基因组水平上构建针对基因 组的r n a i 表达载体1 9 ，2 0 1 ，用于研究基因之间的相互作用和进行基因功能的高通量 筛查。 1 3 2 基因治疗 由于r n a i 可以特异性的抑制基因表达，所以可用于基因病、病毒感染或寄生病 原性蛋白表达引起的疾病、癌症的治疗，尤其有希望用于抑制癌基因或突变基因引起 的癌症的基因治疗之中 2m 】。j a c q u e 等【2 2 1 针对h i v 1 基因组的l t r ( l o n g t e r m i n a l r e p e a t e ，l t r ) 、v i 卿n e f 设计了s i r n a ，将s i r n a 转染进h i v 后，这些基因的水平降低 了9 5 。b e r tr a n d 等【2 3 】研究表明，在培养的h e l a 细胞中分别转入反义寡核苷酸 ( a s o d n ) 和s i r n a ，结果s i r n a 比a s o d n 能更有效地抑制基因表达。 1 3 3 抗病毒治疗 目前利用r n a i 技术抗病毒感染的研究已经展开，主要集中在对人类威胁性较大 的肝炎病毒例和人类免疫缺陷病掣2 5 1 。c o b u m 等【2 6 】针对h i v - 1 的t a t 和r e v 基因 设计并合成s i r n a ，特异性地抑制t a t 和r e v 的表达。在流感病毒中，利用r n a i 技 术也取得了较好的抑制病毒复制的效果。 1 4 丝状真菌基因功能的研究方法 1 4 1 转座子标签技术 转座子是染色体上一段可移动的d n a 片段，它可从染色体的一个位置跳到另一 个位置。当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产 生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又可得一恢复。 丝状真菌转座子类型有很多种，目前已在1 9 种丝状真菌中发现了5 2 个不同类型的转 座子【2 7 1 。目前，烟曲霉似f u m i g a t u s ) 中一些与生长相关的基因【2 8 ( t o l y p o c l a d i u m i n f l a t u m ) 中的硝酸盐调控基因【2 9 1 瘟菌( g r i s e a ) 的致病基因o r p l 3 0 】分鉴定和功能分析 就是通过该方法进行的。 1 4 2 超表达 超表达技术是一种正向的研究基因功能的方法，它是将克隆的目标基因与启动子 连接后，转入某一细胞中，强化目标基因的表达，通过研究其表型及生理生化特征的 变化来研究其功能。目标基因一般与强启动子或可诱导的启动子相连，启动基因的表 达。s t l e g e r 将虫生真菌金龟子绿僵菌( 膨a n & o p l i a e ) 的 j 蛋白酶基因插入到原有的 绿僵菌基因组中使竹7 蛋白酶基因超表达后，发现菌株的毒力大大提高：被改造菌株 侵染的烟草天蛾( m a n d u c as e x t a ) 的取食量下降4 0 ，虫体死亡时间缩短2 0 ，由此 4 证明：州是与绿僵菌杀虫毒力密切相关的重要因子【3 。 1 4 3 基因敲除 基因敲除又称为基因打靶，它是指用外源d n a 与受体细胞基因组中顺序相同或者 相近的基因发生同源重组，整合到受体细胞基因组中并得到表达的一种外源d n a 导人 技术。在丝状真菌中，基因敲除通常需要构建重组敲除载体，然后将载体转入真菌。 丝状真菌的同源重组率低，一般需要l k b 甚至更长的同源序列，重组效率才能达到1 0 3 0 【3 2 1 。 1 4 4 基因捕获技术 基因捕获技术是基因打靶技术的进一步发展，是通过向基因中增i j i i d n a 片段。 使基因发生随意的突变，从而确定基因的位置和功能。基因捕获技术是通过捕获载体 实现的。捕获载体所带的基因只有当整合到宿主功能基因内部且与融合的宿主基因编 码框一致时才能得以表达1 3 引。 1 4 5r n a 干扰技术 传统的研究基因功能的方法如基因敲除有周期长、成本和技术要求高等缺点。在 某些体系中，特别是丝状真菌中目标整合频率很低，而且可能会产生致死表型或者在 异核组织观测不到表型变化。而反义技术及核酶技术的抑制基因表达效率低，远远满 足不了大规模基因功能研究的需要。r n a 干扰技术的诞生恰好弥补了这些缺陷。r n a 干扰技术对基因的表达抑制率高，且操作较简单，还可以克服基因敲除中由于基因冗 余造成表型被掩盖的缺陷即】。在产油丝状真菌高山被孢霉( m o r t i e r e l l aa l p i n a ) 中，通 过该技术干扰0 【2 一去饱和酶基因表达，可大大改善所产脂肪酸的成分和产量，无需进 行其他的菌株突变和遗传操作【3 ”。宅e m g r i s e a q l 研究发现，r n a i 可使内源基因表达下 调7 0 9 0 1 3 6 】。 1 5 虫生真菌的遗传转化方法 d n a 遗传转化是人们进行菌种改良、有用基因克隆或基因功能研究的重要途径。 采用适当的遗传转化方法将干扰载体导入体内，关闭或下调基因表达，从而研究基因 功能也是当前研究的热点。目前，应用于昆虫病原真菌转化的方法很多，最常用的转 化方法有农杆菌转化法、原生质体转化法、基因枪转化法和电击转化法等。 1 5 1 农杆菌介导法 农杆菌介导法是目前应用较为广泛的一种转化方法。当中间表达载体构建好以 后，就需要将它进一步转移到含有经改造过的t i 质粒的农杆菌中，这样制备成的农杆 菌称工程农杆菌。目前，根癌农杆菌介导的真菌遗传转化方法具有转化效率高、操作 简便，转化子遗传稳定等特点，是一种很有前途的真菌遗传转化方法。c a n t o n e 和 v a n d e r b e r g ( 1 9 9 9 ) 3 7 】利用农杆菌介导法和b a r 基因选择性标记对虫生真菌玫烟色拟青 5 霉进行了遗传转化。f a n g 等【3 8 】用农杆菌介导法和b a r 基因标记对球孢白僵菌进行了遗 传转化，获得了较高的转化效率。 1 5 2p e g 介导的原生质体转化法 聚乙二醇( p e g ) 是一种选择性化学渗透剂，它可以使细胞膜之问或是d n a 与膜形 成分子桥，促使相互间接触和粘连，并可通过改变细胞膜表面的电荷，引起细胞膜透 性变化，从而促进外源大分子进入原生质体【”】。目前，原生质体转化法在真菌的遗传 转化中也是较为常用的方法。1 9 7 8 年，h i n n e n 等首先利用聚乙二醇作介质转化酵母原 生质体获得成功，此后该方法逐渐延伸到粗糙链孢霉【4 0 1 、构巢曲霉( a s p e r g i l l u s n i d u l a n s ) 等丝状真菌，在粗糙脉孢霉【4 l 】中利用原生质体转化也获得了成功。 s a n d h u ( 2 0 0 1 ) 4 2 】利用p e g 原生质体法转化球孢白僵菌，获得了稳定的遗传转化子。 但原生质体转化法也具有明显的缺点：一、原生质体阶段易导致异核现象及转 化子的不稳定【4 3 1 。二、原生质体不能长期保存。三、原生质体的产率低，转化效率 低，4 5 1 。因此，杨旭芬等人在原生质体转化的基础上做了进一步改进：加入限制 性内切酶进行转化，即限制性内切酶介导转化法( r e s t r i c t i o ne n z y m em e d i a t e d i n t e g r a t i o n 、r e m i ) ，这种转化方法的转化效率有所提高。 1 5 3 基因枪转化法 基因枪法又称微弹轰击法、粒子轰击法等。是一种借助高速金属微粒将d n a 分子 引入活细胞的转化技术。其基本原理是利用火药爆炸、高压放电或高压气体做驱动力， 将载有外源d n a 的金粉或钨粉等金属微粒加速，射入受体细胞或组织，从而达到将外 源d n a 分子导入细胞的目的。m a u r i c i o 47 l 在进行对金龟子绿僵菌的遗传转化时，每微 克d n a 可获得3 2 2 0 1 个转化子，并且遗传稳定性达9 0 。但由于基因枪转化法价格昂 贵、嵌合体不易排除、易造成多拷贝化等原因使其在实践应用中受到一定的限制。 1 5 4 电击转化法 电击法也称电穿孔法，是利用高压电脉冲作用使细胞膜上形成可逆性的瞬问通 道，从而使外源d n a 分子进入细胞的转化方法。p f e i f e r h 和k h a c h a t o u r i a n s 4 8 j 利用电击 法在球孢白僵菌转化时获得0 2 。0 6 个转化子每微克d n a 。由于此法转化效率较低， 近期j i a n d 4 9 】改进方法，用球孢白僵菌的芽生孢子进行电击转化，大大的提高了转化 效率。另外，采用此法易造成细胞膜的损伤，而且仪器比较昂贵，各项转化参数需根 据不同物种进行摸索。 1 5 5 醋酸锂转化法 用高浓度的“可以诱导并增强细胞的渗透性，使细胞壁吸收外源d n a ，不用制备 原生质体。其基本原理是用l i a c 或其他一价金属离子f n a 、k 、c a 、r b 等) 处理对 数生长期的细胞使之成为感受态，经热休克( h e a ts h o c k ) 处理，在p e g 帮助下质粒d n a 进入真菌细胞，形成转化子。此法转化率较高，但使用仅仅局限于少数种类的丝状真 6 菌【5 0 1 。y i n g 在醋酸锂转化的基础上，采用芽生孢子遗传转化方法对球孢白僵菌的b a r 和e g 邱融合转化，每微克d n a 获得了2 4 个转化子。 1 6 羧基转运蛋白基因的研究现状 羧基转运蛋白是一种将带有羧基的小分子能量物质( 例如乳酸) 转入细胞中的一 类载体蛋白，为无氧的条件下的细胞提供能量【5 。1 9 9 9 年，c a s a l 5 2 】等从酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 中分离出羧基转运蛋白基因，它和能量代谢密切相关。 2 0 0 3 年，方卫国等对金龟子绿僵菌羧基转运蛋白基因及其启动子进行克隆及分析，发 现羧基转运蛋白在昆虫体壁诱导培养基中有表达，它的功能可能是将虫生真菌分解体 壁所产生的能量物质转入真菌细胞内，可见该蛋白载体可能与虫生真菌的毒力有关 【5 3 】。g b j e n l 上游序列含有可能的压力元件s t r e s ，在压力胁迫如高渗透压、加热、 低p h 等条件下，介导酵母相关基因的转录激活瞰】。2 0 0 4 年，方卫国等在对球孢白僵 菌羧基转运蛋白基因及其启动子进行克隆及分析时推测该元件在球孢白僵菌中也可 能具有类似功能