（环境工程专业论文）鼠李糖脂生产条件优化及对液态发酵中微生物产酶的影响.pdf

a b s t r a c t t h eo p t i m a lc u l t u r e m e d i u mo fp s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a a b 9 3 0 6 6f o r p r o d u c i n gr h a m n o l i p i dw a so b t a i n e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h ea d d i t i o no f h i g h p e r f o r m a n c es u s p e n d e dm a c r o p o r o u sc a r r i e r s ( h s m c ) i n t o t h i s o p t i m a l c u l t u r e m e d i u mi n c r e a s e dt h er h a m n o l i p i dp r o d u c t i o nu n d e ra l m o s tt h es a m ec o s t t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h ec u l t u r ew i t hh s m ce x h i b i t e d12 1 h i g h e ro p t i c a ld e n s i t yc o m p a r e d t ot h o s eo b s e r v e di nh s m c f r e ec u l t u r e a d d i n gh s m ci n t o f e r m e n t a t i o nb r o t h t r i g g e r e da ni n c r e a s e i nr h a m n o l i p i dp r o d u c t i o n ，w h i c hw a s51 2 h i g h e rt h a nt h e c o n t r 0 1 a n dt h eb e s tp e r i o df o rr h a m n o l i p i dp r o d u c t i o nw a sb e t w e e n4 8 - 6 0 h t h e c r u d er h a m n o l i p i dw a sp u r i f i e db yc o l u m nc h r o m a t o g r a p h yu n t i lm o n o r h a m n o l i p i d a n dd i r h a m n o l i p i dw e r eo b t a i n e d d i r h a m n o l i p i dw a s u s e di nt h ef o l l o w i n gs t u d i e s t h ee f f e c t so fb i o s u r f a c t a n td i r h a m n o l i p i da n da n i o nc h e m i c a ls u r f a c t a n ts o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ( s d s ) o nl i g n i np e r o x i d a s e ，m a n g a n e s ep e r o x i d a s e ，l a c c a s e ，c m c a s e a n dx v l a n a s ef r o mp h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u mw e r ei n v e s t i g a t e dd u r i n gt h ew h o l e p r o c e s so fs u b m e r g e df e r m e n t a t i o n t h e d i r h a m n o l i p i d w i t ht h a to fc h e m i c a l s t u d yc o m p a r e dt h ee f f e c t so fb i o s u r f a c t a n t s u r f a c t a n ts d sa n do f f e r e ds o m eu s e f u l i n f 6 r m a t i o no ne n h a n c i n gt h ee n z y m ea c t i v i t i e sf o ro t h e rr e s e a r c h e r s t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a td i r h a m n o l i p i da tb o t hc o n c e n t r a t i o ne n h a n c e dc m c a s e ，x y l a n a s ea n d l i g n i np e r o x i d a s ea c t i v i t i e sw h i l ei n h i b i t e dm a n g a n e s ep e r o x i d a s ea c t i v i t i e s ，a n dt h e s t i m u l a t i v ee f f e c to nl i g n i np e r o x i d a s ea c t i v i t ya n dx y l a n a s ea c t i v i t yw a s m u c hm o r e e f f e c t i v e t h i ss t u d ys h o w e dt h a tt h ee f f e c t so fd i r h a m n o l i p i do nd i f f e r n te n z y m e s p r o d u c e db yt h es a m e s t r a i nw e r ed i f f e r e n t d u r i n gt h ew h o l ef e r m e n t a t i o n ， d i r h a m n o l i p i d a tt h ec o n c e n t r a t i o no f0 013 o b v i o u s l yi n c r e a s e d t h e l i g n i n p e r o x i d a s e ，a n dt h ep e a kl i g n i np e r o x i d a s ea c t i v i t yw a s 6 1 9 8 h i g h e rt h a nt h a to ft h e c o n t r 0 1 h o w e v e r , c h e m i c a ls u r f a c t a n ts d s a tb o t hc o n c e n t r a t i o n si n h i b i t e do rh a dn o e f f e c t o nt h ef o u r e n z y m e a c t i v i t i e s l a c c a s ep r o d u c e db y p h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u mw a sv e r yl o wu n d e r a l lt h et r e a t m e n t s k e yw o r d s ：p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ；r h a m n o l i p i d ； m a c r o p o r o u s c a r r i e r s ；p h a n e r o c h a e t e h i g h p e r f o r m a n c es u s p e n d e d c h r y s o s p o r i u m ； s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ；l i g n i np e r o x i d a s e ；m a n g a n e s ep e r o x i d a s e ；x y l a n a s e i i 鼠李糖脂生产条件优化及对液态发酵中微生物产酶的影响 插图索引 图1 1 生物表面活性剂参与的有机污染物降解过程中各组分的关系2 图1 2 部分生物表面活性剂的典型结构1 0 图1 3 鼠李糖脂的两种分子结构式1 1 图2 1 高效悬浮载体用量与鼠李糖脂产量关系图3 2 图2 2 菌体吸光度随时间的变化情况3 3 图2 3 发酵液表面张力值随时间的变化情况3 4 图2 44 8 h 时发酵液表面张力值随稀释倍数变化情况3 4 图3 1 表面活性剂对黄孢原毛平革菌产纤维素酶( c m c a s e ) 的影响一4 4 图3 2 表面活性剂对黄孢原毛平革菌产木聚糖酶( x y l a n a s e ) 的影响4 4 图3 3 表面活性剂对黄孢原毛平革菌产漆酶( l a c ) 的影响4 5 图3 4 表面活性剂对黄孢原毛平革菌产木素过氧化物酶( l i p ) 的影响一4 5 图3 5 表面活性剂对黄孢原毛平革菌产锰过氧化物酶( m n p ) 的影响4 6 v i 硕： 学位论文 附表索引 表1 1 生物表面活性剂及其产生菌3 表1 2 生物表面活性剂的各种生物合成方法6 表1 3 部分生物表面活性剂的表面张力【1 1 1 一7 表1 4p s e u d o m o n a ss p 产生的鼠李糖脂在模拟地层水中4 0 ( 2 下的表面活性和界 面活性1 2 表2 1 水平因素表2 8 表2 2 正交表l 9 ( 3 4 ) 2 8 表2 3 正交试验结果3 0 表2 4 正交试验直观分析表3 1 v i i 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法 律后果由本人承担。 作者签名：日期：裙年f 月r 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编 本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保酬 ( 请在以上相应方框内打“) 作者签名： ，) 至 日期：) 钟，月r 日 刷磁轹移夕翻秽。讪步，胡丁日 硕二学位论文 第1 章绪论 1 1 堆肥微环境中生物表面活性剂的引入 堆肥系统是一个既有有机物又含有无机物，既有非生命体又有生命体，且不 断地进行物理、化学、生物反应的微生态系统，堆肥化过程是微生物对垃圾中各 种有机物进行矿质化和腐殖化的过程，在好氧堆肥中，微生物对有机物的分解是 在间隙中垃圾颗粒表面的一层液态膜中进行的。因此，反应体系内垃圾颗粒间隙 的物化条件对堆肥结果有很重要的影响。鉴于垃圾颗粒闻隙是微生物反应的生态 微环境，如何改善这个微环境，使之有利于微生物对有机垃圾的分解反应，是提 高堆腮处理效率的关键之一。 改善介质物化条件的传统方法有：控制堆肥系统的c n 、温度、湿度、氧气、 空隙率等。这些手段在难肥过程中的应耀是必要的，僮这些方法的主旨均在于改 善物质传输或有利于微生物生长，而在改良微生物与介质的相互作用以及直接促 进微生物对难降解有机物的分解过程却难有作为。 一些具有特殊结构的物质( 如表面活性剂) 的加入将是改善微生物反应生态微 环境的有益尝试。表面活性剂是一种可以降低液固交界面表面张力的活性物质。 一旦表面活性剂被引入垃圾颗粒的闻隙，表面活性剂分子的疏水端将与有机垃圾 亲和，使分子固定在垃圾颗粒表面，亲水端溶于颗粒空隙内的水中。这种两亲基 团的不同作用使水在垃圾颗粒表面形成稳定的液膜，最大可能的为微生物的反应 提供表面环境。同时，表面活性剂分子的疏水端会提高有机物在水膜中的溶解度， 从而加速微生物对有机物的分解；另外，表面活性剂的加入还有剩于提高难降解 有机物的生物可利用性。 然两，现有的“传统表面活性剂 对垃圾中的微生物有毒性，“而绿色表面活 性剂 则太容易被微生物优先降解，从而失去其作为表面活性剂的意义。 目前，一类新的表面活性剂已经引起了一些微生物学家的关注。这种表面活 性荆是微生物在代谢过程中生成的自我调节生物微环境的物质，即生物表面活性 剂。一般认为，生物表面活性剂是一种微生物为适应在憎水性有机化合物中生长 丽产生的物质【l ，筋，由于含有亲东基和疏承基两性基团的两亲懂纯合物，它能够 很好地联接在不同相的界面，如固液相之间、气液相之间的界面，降低它们的表 面张力和界面张力l 奠。生物表面活性裁还可以增大憎水性有机化合物与液相之阀 的接触面，从而增加憎水性有机化合物的含水量，使微生物能够更有效对其进行 吸收降解利用l 引，因此，它在隧在促进诸如石油烃类憎水性有机污染物降解的工 鼠李糖脂生产条件优化及对液态发酵中微生物产酶的影响 程领域有较广泛的应用。z h a n g 等”】证实了生物表面活性剂在厨房垃圾等易降解 有机质的降解过程中能够大量产生，同时可能起到促进微生物生长繁殖和改善降 解微环境的作用。由于生物表面活性剂的特殊性质，将它作为介质改良剂应用到 堆肥中，有可能提高堆肥中易降解和难降解有机物的降解而提高堆肥效率。在生 物表面活性剂的参与下，有机污染物的降解过程是一个堆肥介质、污染物、生物 表面活性剂以及微生物互动的过程，它们之间的相互关系如图1 1 所示。 图1 1 生物表面活性剂参与的有机污染物降解过程中各组分的关系 许多以堆体中这种有机物为碳源的微生物能够分泌生物表面活性剂，且生物 表面活性剂对这类物质降解过程的促进作用得到了许多研究的证实。生物表面活 性剂对污染物的生物可利用性的影响包括：在生物表面活性剂的作用下污染物 向堆肥液相中的分散；在生物表面活性剂的作用下污染物向降解菌种的传质； 微生物细胞向污染物源的接近性能以及污染物的摄取模式。通过利用城市生活 垃圾中的部分成分为原料采用特殊菌种制取生物表面活性剂，再将它回用于垃圾 堆肥，可以产生实际意义。 1 2 生物表面活性剂的生产及合成 1 2 1 生物表面活性剂的生产 生物表面活性剂已有2 0 多年的发展历史，人们对产生生物表面活性剂的微生 物及其产生机理已有了较多的认识。在通过发酵法生产生物表面活性剂的过程中， 2 硕十学位论文 可以利用不同条件下的微生物细胞生产生物表面活性剂，很多微生物菌种可以以 很多不同的基质为营养源生产生物表面活性剂。菌种生长在非水溶性的物质中， 如石油烃、聚苯乙烯、煤油、甲苯、凡士林、二甲苯等，并以它们为食物源进行 新陈代谢。例如铜绿假单胞菌可以以c 1 1 和c 1 2 的链烷烃、琥珀酸盐、丙酮酸酯盐、 柠檬酸盐、果糖、甘油、橄榄油、葡萄糖以及甘露醇为碳源生产鼠李糖脂。另外 许多生物表面活性剂生产菌是从污染物中分离得到的，如提高采收率的生物表面 活性剂生产菌，多数是从被原油污染的土壤、海水、地表废水中分离出来的，这 些微生物能有效的降解脂肪族和芳香族的烃类化合物，它们利用这些化合物，在 微生物细胞和烃接触的界面上产生生物表面活性剂。主要的生物表面活性剂及其 产生菌如表1 1 。 表1 1 生物表面活性剂及其产生菌 生物表面活性剂名称( b i o s u r f a c t a n t )产生菌( m i c r o b i a lo r i g i n ) 1 r h a m n o l i p i d s 鼠李糖脂p s e u d o m o n a ss p p 假单胞菌 2t r e h a l o s el i p i d s 海藻糖脂 3 s o p h o r o s el i p i d s 槐糖脂 4 g l u c o s e - ，f r u c t o s e ，s a c c h a r o s e l i p i d s 葡萄糖脂，果糖脂和蔗糖脂 p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 铜绿假单胞菌 a r t h r o b a c t e rp a r a f f i n e u s 石蜡节杆菌 c o r y n e b a c t e r i u ms p p 棒杆菌 m y c o b a c t e r i u ms p p 分枝杆菌 m y c o b a c t e r i u mp a r a f f i n i c u m 石蜡分枝杆菌 m y c o b a c t e r i u mp h l e i 草分枝杆菌 m y c o b a c t e r i u ms m e g m a t i s 耻垢分枝杆菌 m i c r o m o n o s p o r a 小单胞菌 r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s 红串红球菌 c a n d i d as p p 假丝酵母 p s e u d o m o n a ss p p 假单胞菌 t o r u l o p s i sb o m b i c o l a 球拟酵母 t o r u l o p s i sa p i c o l a ( 尖型) 球拟酵母 a r t h r o b a c t e rs p p 节杆菌 a r t h r o b a c t e rp a r a f f i n e u s 石蜡节杆菌 c o r y n e b a c t e r i u ms p p 棒杆菌 c o r y e b a c t e r i u mh y d r o c a r b o c l a s t u s 解烃棒杆菌 r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s 红串红球菌 5 c e l l o b i o s el i p i d s 纤维二糖脂 u s t i l a g om a y d i s 6 p o l y o ll i p i d s 多羟基脂 r h o d o t o r u l ag l u t i n u s r h o d o t o r u l ag r a m i n u s 3 鼠李糖脂生产条件优化及对液态发酵中微生物产酶的影响 7 p h o s p h o l i p i d s 磷脂 8 9 1 0 1 l 1 2 s u l f o n y l i p i d s 磺酰基脂 m o n o 一，d i g l y e e r i d e sd i g l y c o s y l d i g l y c e r i d e s 甘油单脂和二脂，糖基 甘油脂 甘露糖赤藓糖醇j j 旨( m e l ) l y s i n - l i p i d 赖氨酸脂 o r n i t h i n e - l i p i d 鸟氨酸脂 1 3 n u t r o l i p i d 中性脂 1 4 1 5 1 6 1 7 m y c o l a t e so fm o n o ，d i - a n d t r i s a e c h a r i d e l i p o p o l y s a c c h a r i d e s 脂多糖 a c i n e t o b a c t e rs p p 不动杆菌 c o r y n e b a c t e r i u ms p p 棒杆菌 c o r y n e b a c t e r i u ma l k a n o l y t i c u m 解烷烃棒杆菌 m i c r o c o c c u ss p p 微球菌 t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s 氧化硫硫杆菌 c a p n o c y t o p h a g as p p 噬纤维菌 a c i n e t o b a c t e rs p p 不动杆菌 l a c t o b a c i l l u sf e r m e n t i i 发酵乳杆菌 c a n d i d aa n t a r c t i c 假丝酵母 a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s 根癌土壤杆菌 p s e u d o m o n a sr u b e s c e n s 浅红假单胞菌 t h i o b a c i l u st h i o o x i d a n s 氧化硫硫杆菌 n o c a r d i ae r y t h r o p l i s ( 红球) 诺卡氏菌 c o r y n e b a c t e r i u md i p h t h e r i a e 白喉棒杆菌 a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u s ( r a g 一1 ) 乙酸钙不动 杆菌 p s e u d o m o n a ss p p 假单胞菌 c a n d i d al i p o l y t i c a 解脂假丝酵母 p o l y s a c c h a r i d e p r o t e i nc o m p l e x 多 c o r y e b a c t e r i u mh y d r o c a r b o c l a s t u s 糖蛋白质复合物 c a r b o h y d r a t e p r o t e i n - - l i p i dc o m p l e x 碳水化合物蛋白质脂质化合物 18 l i p o p e p t i d e s ( s u r f a c t i n ，v i s c o s i n ， 解烃棒杆菌 p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n s 荧光假单胞菌 a r t h r o b a c t e rs p p 节杆菌 g r a m i c i d i n ，p o l y m i x i n s ，e ta 1 ) 脂肽 b a c i l l u sb r e v i s 短芽孢杆菌 和脂蛋白( 莎梵婷，粘质，短杆菌 肽，多粘菌素等) b a c i l l u sp o l y m y x a 多粘芽孢杆菌 b a c i l l u sp u m i l i s 短小芽孢杆菌 b a c i l l u ss u b t i l i s 枯草芽孢杆菌 b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 地农芽孢杆菌 c a n d i d al i p o l y t i c a 解脂假丝酵母 c a n d i d ap e t r o p h i l i u m 石油假丝酵母 p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n s 荧光假单胞菌 s e r r a t i am a r c e s c e n s 粘质沙雷氏菌 4 硕士学位论文 1 2 2 生物表面活性剂的合成 虽然生物表面活性剂的种类很多，但在其合成途径及调节方面，仍有一些共 同的原则可循。如生物表面活性剂中最大一类一糖脂的生物合成途径有下述四种： ( 1 ) 糖基和类脂基均由全程合成；( 2 ) 糖基由全程合成，类脂基的合成视烃基质的链 长而定；( 3 ) 类脂基由全程合成，糖基合成视烃基质而定：( 4 ) 糖基和类脂基合成均 视烃基质而定。 表1 2 n 生物表面活性剂的主要生物合成方法【6 】。这些生产方法分别取决于微 生物和合成产物的性质。许多胞壁结合生物表面活性剂可能是生长相关型，而许 多胞外离子表面活性剂常常只能在细胞稳定生长期才能观察到过量产生。 1 3 生物表面活性剂的性质 生物表面活性剂主要是由微生物代谢过程中分泌出来的具有一定生物活性的 代谢产物【7 1 ，像合成表面活性剂一样，生物表面活性剂由亲水基和疏水基两部分 组成，但生物表面活性剂比合成表面活性剂更具潜在的优势，如结构的多样性、 生物可降解性、对环境的温和性等，因而随着人类环保意识的增强，更加快了生 物表面活性剂取代合成表面活性剂的发展进程【8 】。这里所指的生物表面活性剂主 要是一类由微生物产生自我调节生物微环境的且具有一定表面活性的两性物质， 它一般是微生物在一定条件下培养时，在其代谢过程中分泌出的代谢产物，而大 多数生物表面活性剂是次级代谢产物。生物表面活性剂具有：能促进微环境的 改善，从而提高微生物对垃圾的降解效率；不对微生物造成伤害；不是体系 中微生物的优先降解物质，但表面活性剂作为一种有机物质最终可以被微生物降 鼠李糖脂生产条件优化及对液态发酵中微生物产酶的影响 解。 表1 2 生物表面活性剂的各种生物合成方法 主要合成方法一览 ( 1 ) 与细胞生长相关的方法 ( a ) 用亲油介质诱导生产 ( b ) 用优选介质组成达到增产 ( c ) 用优选环境影响因素( p h 、温度、通气、搅拌、速度等) 达到增产 ( d ) 加入能引起细胞壁通透性变化的试剂( 青霉素、乙胺丁醇、e d t a 等) 增产 ( e ) 加入能促进胞壁结合生物表面活性剂与胞壁分离，从而使该生物表面活性剂介质中 的试剂( 如烷烃、煤油、e d t a 等) 增产 ( 2 ) 在控制下由生长细胞生产 ( a ) 限氮生长 ( b ) 限多价阳离子生长 ( c ) 在控制下改变p h 或温度等条件增产 ( 3 ) 由休止细胞生产 ( a ) 由游离休止细胞生产 ( b ) 由固定化休止细胞生产 ( c ) 由固定化休止细胞经随程提取法生产 ( 4 ) 由生产细胞游离休止细胞，固定化休止细胞经加入前提法生产 然而目前，生物表面活性剂在工业上的应用远不如合成表面活性剂广泛，从 与合成表面活性剂相竞争的角度而言，生物表面活性剂在商业上的应用取决于其 成本与性质【9 】，从复杂发酵液中分离和纯化生物表面活性剂使生物表面活性剂可 能占总成本的大部分【1 0 】，这些化合物的低浓度和两亲性常妨碍其有效分离。因此， 找到一种经济的、对环境友好的方法来提取和纯化生物表面活性剂是必要的。 1 3 1 生物表面活性剂的物理性质 多数生物表面活性剂可将表面张力减少至3 0 m n m 。它们在决定界面的流变 学特性以及两相间的物质传递方面起着十分重要的作用。与一般化学合成的表面 活性剂一样，生物表面活性分子中也含有憎水基团和亲水基团两部分，憎水基一 般为脂肪酰基链，极性亲水基则有多种形式如中性脂的酯或醇功能团、脂肪酸或 氨基酸的羟基、磷脂中含磷的部分以及糖脂中的糖基。生物表面活性剂能显著降 低表面张力和界面张力，表1 3 列出了部分生物表面活性剂溶液的表面张力值。 一般地，非极性糖脂，如非离子海藻糖6 ，6 棒杆霉菌酸双酯，溶于氯仿的 憎水性溶剂中；极性大些的糖脂，如阴离子海藻糖四酯，溶于氯仿甲醇混合溶剂。 两种含有两个脂肪酸残基的鼠李糖脂( r 1 ，r 2 ) 都溶于甲醇、氯仿、乙酸乙酯、乙 6 硕士学位论文 醚和n a h c 0 3 溶液，但不溶于正己烷。 蔗糖脂溶于室温下的醚、正己烷和氯仿，以及热丙酮、甲醇中。其它糖的棒 杆霉菌酸酯、内酯型槐糖脂、含氨基酸内脂也是如此。莎梵婷( s u r f a c t i n ) 溶于碱性 水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和乙酸中，但不溶于水，石 油醚和乙烷中。含蛋白表面活性剂能溶于水( 如类蛋白活化剂) ，也可以被氯仿抽 提( 如肽糖脂) 。黑粉菌酸晶体溶于甲醇、热乙醇、丁醇、丙酮、n a o h 溶液及n a h c 0 3 溶液，不溶于乙醚、二硫化碳和乙酸戊酯中 表1 3 部分生物表面活性剂的表面张力 1 1 】 注：n a 表不禾测定。 1 3 2 生物表面活性剂的化学性质 生物表面活性剂具有一定的化学活性，分子中的酯键会因碱性水解而断裂， 而o 配糖键则因酸性水解而断裂。此外，还容易发生其他化学反应，如氧化、酯 化等。但目前有关生物表面活性剂的反应性和稳定性的文献报道还很少1 4 】。 1 4 生物表面活性剂的性能和特性 1 4 1 生物表面活性剂的性能 生物表面活性剂结构的多样性决定了功能的多样性。生物表面活性剂的分子 7 鼠李糖脂生产条件优化及对液态发酵中微生物产酶的影响 结构中既有极性基团，又具有非极性基团，是一类两性分子。因此，它们能在两 相界面定向排列形成分子层，能降低界面的能量，具有表面或界面活性、增溶、 润湿、乳化、发泡等性能，其原理同一般表面活性剂。 1 4 2 生物表面活性剂的特性 ， 由于生物表面活性剂的来源特殊，它又有其特殊性。 生物表面活性剂除了能显著降低表面张力和界面张力外，还具有其他特异性 能。p s e u d o m o n a ss p 产生的鼠李糖脂乳化性能很好，优于常用的化学合成乳化剂。 生物表面活性剂的另一个特异性是具有良好的抗菌性能，这也是一般的合成表面 活性剂难以匹敌的。如日本的i t o h 实验室从p s e u d o m o n a ss p 得到鼠李糖脂具有一 定的抗菌、抗病毒和抗枝原体的性能等。生物表面活性剂具有良好的热及化学稳 定性，如地衣芽孢杆菌f b 1 i c h e n i f o r m i sj f - 2 ) 生产菌产生的脂肽在7 5 时，至少可 耐热1 4 0 h 。生物表面活性剂在p h5 5 1 2 之间保持稳定，当p h 小于5 5 时，会 逐渐失活【坨】。有些生物表面活性剂可以耐强碱、强酸如仅，a d 海藻糖6 棒杆 霉菌酸酯，在0 1 n 盐酸中7 0 h 仅有1 0 的糖脂被降解【l 引。p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a s 7 b l 产生的类蛋白活化剂在p h 为1 7 l1 4 范围内非常稳定i l4 。鉴于人们对生物 表面活性剂的研究还很少，因此对各种生物表面活性剂的各种性质的测试报道还 不多。 很多化学表面活性剂对降解微生物的毒性得到了研究和确定【l5 1 6 】，而关于生 物表面活性剂毒性的报道却不多，尽管它们也可能存在对污染物降解的抑制作用 【1 7 】。化学表面活性剂的毒性被认为是因为它们能够溶解细胞酶、细胞受体和蛋白， 导致细胞膜的生理功能紊乱或者细胞膜损伤，从而改变细胞膜的透过性能，使胞 内物质外流而引起的【l5 1 。而生物表面活性剂对污染物降解的抑制作用主要是因为 它们负面的物化作用或者它们作为优先碳源物质被其它微生物所利用，而这些微 生物的增殖抑制了降解微生物的生长而造成的。如r h o d o c o c c u ss p e c i e s 4 13 a 生产 的糖脂在萘的增溶实验中的毒性比用t w e e n 8 0 小5 0 t 1 8 】。在八种化学表面活性剂 和九种生物表面活性剂的毒性考察中，生物表面活性剂总体上毒性更低并且更容 易生物降解【l9 。 当然，一些生物表面活性剂也存在着反面作用，例如中性环境中，低浓度的 o 8 h m e l a ：r 1 = r 2 = a c m e l - b ：r 1 = a c r 2 = h m e l - c ：r 1 = h r 2 = a c ( n = 5 - 9 ) 硕十学位论文 p s e u d o z y m aa p h i d i s 产生的甘露赤藻糖脂 c a n d i d ab o m b i c o l a 产生的槐糖内脂( 左) 和2 烷基槐糖脂( 右) p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 产生的单鼠李糖脂r 1 ( 左) 和双鼠李糖脂r 2 ( 右) b ) 多聚糖类 氨基糖骨架 d - g a l a c t o s o a m i n e d g a l a c t o s o a m i n e n e u r o n i ca c i d c ) 聚缩氨酸类 脂肪酸 c 1 2 h y d r o x yc 1 2 h y d r o x yc 1 4 c 1 6 c 1 8 占h ： ii 手ch2广 i il b a c i l l u ss u b t i l i s 产生的莎梵婷 9 鼠李糖脂生产条件优化及对液态发酵中微生物产酶的影响 d ) 磷脂类 e ) 脂肪酸类 叫一h 咖一一。h 亍h 2 1 ：一f = o b c h 2 1 良h - - o h ( 渺 u 三 ：2 l冒 洲2 一。一百一。一x ，o o h 图1 2 部分生物表面活性剂的典型结构 阴离子型表面活性剂与烃结合形成的复合物带有负电，它与带负电的细胞壁产生 静电排斥，从而强烈抑制细胞与烃的亲和，反而抑制了细菌的生长【2 们。另外，细 胞与生物表面活性剂分子长期接触，不仅会对膜结构造成一定的破坏，还将引起 膜活性的改变，干扰正常的摄取同化机制。 总之，生物表面活性剂与化学合成的表面活性剂性能相似，但相比之下生物 表面活性剂具有许多优势【2 0 。2 3 】：良好的生物可降解性；毒性较低，对环境较 为温和，具有良好的环境友好性；对油水的乳化更加稳定；一般不致敏、可 1 0 2ri卜如 h 一 。_1h 硕十学位论文 消化，因此可用于化妆品，甚至作为功能性食物的添加剂；结构多样，有可能 适用于特殊领域。 1 4 3 生物表面活性剂一鼠李糖脂的基本特性 1 鼠李糖脂的产生 细菌p a e r u g i n o s ad s m2 6 5 9 能够产生4 种不同形式的鼠李糖脂 ( r h a n m o n l i p i d ，缩写为r l ) ，图1 3 中给出了鼠李糖脂的两种分子结构式【l 】。一 些文献中还记载了鼠李糖脂的一些其他的制法【i4 1 。b e r g s t r o m 等人用p s e u d o m o n a s p y o c y a n e a 于3 7 下在葡萄糖中培养4 8 d ，得到一种碳水化合物的类脂，经证实 为q l 鼠李糖。h i s a t s u k a 等发现，将p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s as 7 8 1 在正十六烷、 正构石蜡混合物或葡萄糖中于3 0 下培养6 d 得到鼠李糖脂r 1 ，即2 一o 0 【l 砒喃 鼠李糖基一a l 砒喃鼠李糖基一p 一羟基癸酰b 一羟基癸酸酯。i t o h 等发现鼠李糖脂r 2 由两份脂肪酸和一份鼠李糖组成，化学名为l q 砒喃鼠李糖基p 一羟基癸酰p 羟基 癸酸。它可以有p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ak y4 0 2 5 在1o 正构石蜡中于3 0 下培 养5 5 h 获得。s y l d d a t k 等分离出只含一个脂肪酸残基的两种新的鼠李糖脂r 3 和 r 4 。他们将p s e u d o m o n a ss p d s m2 8 7 4 的休止细胞于3 0 下在n a c l 溶液中培养， 产生了两种首先见报的糖脂和两种与r 1 、r 2 不同的新的鼠李糖脂。由于这两种 鼠李糖脂中不含酯键，故碱性水解时不产生脂肪酸。这一结果亦反证出分子中只 含一个脂肪酸残基。这种鼠李糖脂的表面张力为2 9 m n m 1 2 4 1 。 2 鼠李糖脂的基本性质 鼠李糖脂作为一种阴离子性的生物表面活性剂，它具有一般表面活性剂亲水 亲脂两亲性的特点。表1 4 【1 4 j 中列出了p s e u d o m o n a sd s m2 8 7 4 产生的四种鼠李糖 脂的表面活性和界面活性。它们可以将模拟地层水的丫s 降到2 5 3 0 m n m ，并将 n hh 2 c 一0 一c c c 0 0 h l ( c h 2 ) e f c h a 宫hh 2hh 2 一c 一0 ccc 0 0 h i ( c h 2 ) 8 e l l a 图i 3 鼠李糖脂的两种分子结构式 水正十六烷的丫i 降到 1m n m 。其c m c 在5 2 0 0 m g l 变化。同时含有两个脂 肪酸残基的鼠李糖脂都溶于甲醇、氯仿、乙酸乙酯、乙醚和n a h c 0 3 溶液，但不 溶于正己烷。鼠李糖脂具有很好的乳化性能，有p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 菌体在 产生鼠李糖脂的同时，还产生类蛋白物质，进一步提高阴离子型鼠李糖脂的乳化 能力。鼠李糖脂具有两亲性的特点，它的这种性能可以增强有机无物在水溶液中 鼠李糖脂生产条件优化及对液态发酵中微生物产酶的影响 的溶解度。同时，鼠李糖脂具有好的抗菌性能。日本i t o h 实验室【2 4 1 从p s e u d o m o n a s 印得到的鼠李糖脂具有一定的抗菌、抗病毒和抗支原体的性能。 表1 4p s e u d o m o n a ss p 产生的鼠李糖脂在模拟地层水中4 0 下的表面活性和界面活性 注：组成：n a c i1 0 0 9 l ，c a c l 22 8 9 l ，m g c l 21 9 9 l 。 水正十六烷界面。 1 5 生物表面活性剂的分离提纯 目前，生物表面活性剂工业规模的应用于合成的表面活性剂相比并不具有优 势，主要是由于生物表面活性剂的生产费用较高，而产物的提取货称下游的处理 费用占生产费用的6 0 - - 7 0 ，因此选择合适的产物提取方法是保证生化生产工 艺成功的一个十分重要的环节。而生物表面活性剂在发酵液中的低浓度和两亲性 常妨碍其有效分离。随着研究的不断深入，一些传统的方法不断完善，新的方法 不断出现。 有多种方法可以用来提取、纯化生物表面活性剂，采用什么方法必须视待分 离物性质( 水溶剂还是非水溶剂阴离子或非离子，胞外结合或胞壁产物) 而定【i 4 1 ， 分离生物表面活性剂存在一定的方法，但不存在一定的规则。通过微生物发酵培 养得到的原料液，应首先将其中的菌体或细胞与培养液分离。如果目标产物为胞 外物，可直接利用培养液进行以后的分离纯化操作，如果目标产物为胞内物，则 要对菌体或细胞进行适当的处理，释放目标产物，然后除去细胞或其碎片，再进 行目标产物的分离纯化【2 5 1 。如从培养物分离糖脂时，一般先要确认它是胞外产物 还是胞壁结合型产物。离子型糖脂一般是胞外产物，它主要是由细胞分泌进入培 养介质中；非离子型糖脂主要是胞壁结合型产物，但是也有例外，如内脂型糖脂 在过量生产也会在胞外蓄积。 生物表面活性剂的分离提纯主要包括萃取、结晶和沉淀、泡沫层析法、超滤、 柱色谱、薄层色谱、高效液相色谱。 1 5 1 萃取 溶剂萃取一种常用的化学分离方法，它是利用物质在不同的溶剂中的溶解度 不同和分配系数的差异使物质达到相互分离和浓缩的方法，是生物表面活性剂经 典提取方法之一，特别是对于亲油性的生物表面活性剂。萃取方法经济可行，操 1 2 硕+ 学位论文 作方法简便，因此在生物表面活性剂的提纯中得以较广泛的运用。 萃取溶剂的选择，一般根据“相似相溶”的原理。适当改变溶液的p h ，有时 可以使某些组分的极性和溶解度发生改变。各种有机溶剂，如甲醇、乙醚、乙酸 乙酯、戊烷、丁醇、氯仿、丙酮、二氯甲烷等已被广泛运用于生物表面活性剂的 提取，它们或者单独使用，或者被联合使用f 9 】。实验室里，使用得最多的是氯仿 和甲醇的各种比例的混合物，这种萃取剂的极性很容易调整到目标萃取物所需的 极性，因而很受科研工作者的青睐。如对鼠李糖脂的萃取，一般首先将离心后的 发酵上清液的p h 值调为2 ，加入等体积的氯仿甲醇2 ：l 的萃取剂，振荡、摇匀 后、静置，上层液用同样的方法多次萃取，合并下层液，用旋转蒸发器挥发后可 得到粗制的鼠李糖脂。j u a nc m a t a s a n d o v a l 等【2 6 】在对铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s eu g 2 ) 产生的鼠李糖) 旨( r h a m n o l i p i d ，缩写为r l ) 生物表面活性剂的提取 过程中采用了氯仿：甲醇( 2 ：1 ) 的萃取液，取得了很好的效果。用氯仿甲醇萃取可 得到较好的效果，但通常导致有毒废水的产生和释放。 尽管氯仿甲醇有较好的萃取效果，然而，在工业上，大量的使用氯仿作为萃 取剂是不经济的。而且，氯仿是高毒性的含氯有机物，对环境、对人体都有害。 因此，寻找一种适合工业运用的，费用较低、毒性较小的溶剂来萃取生物表面活 性剂是十分必要的。分离具有较低亲水、亲油平衡性的非离子型糖脂类表面活性 剂需要具有较低极性的溶剂。m a r i a s k u y u k i n a 等【9 1 对生物表面活性剂的萃取液进 行了研究，他们用甲基叔丁基醚( m t b e ) 萃取r h o d o