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文档简介
直链淀粉 /支链淀粉测定试剂盒 用于测定淀粉中的直链淀粉和支链淀粉含量 AMYL 11/99 简介 : 决定谷物淀粉最终的特殊用途取决于淀粉众多特性中的直链淀粉 /支链淀粉比率,因此,对于淀粉加工企业,淀粉中直链淀粉含量是一项非常重要的指标。 测定谷物淀粉中的直链淀粉通常采用电位测定法、糊化染色法或旋光分析法,即通过测定碘与直链淀粉结合生成直链淀粉 -碘复合物的方法来评估直链淀粉含量,然而由于支链淀粉 -碘复合物在此过程中同样会形成,因此这些方法的准确性常遭到质疑。利用非比色方法测定游离碘离子的减少和通过比色测定直链 淀粉 -碘复合物的方法会导致高估直链淀粉的含量,是用此方法可能出现的更多问题请参考 Gibson et al11。 目前, 国际上普遍采用结果更加准确的利用 伴刀豆凝集素 A(Con A)沉降支链淀粉 ,然后测定直链淀粉含量的方法,在特定的温度、 pH和离子强度下, Con A可以特定的连接含 吡喃葡萄糖 基a-D-glucosepyranosyl或 吡喃甘露 基 a-D-mannopyranosyl的支链多聚糖,因此会优先于直链淀粉与支链淀粉形成沉淀 复合物。 原理 : 加入二甲基亚砜 (DMSO)的淀粉样品通过加热被完全溶解,乙醇洗脱样品中的油脂,回收洗涤后的淀粉样品,并用醋酸 /钠盐溶液溶解,加入 Con A后支链淀粉被特异性的沉降,离心分离支链淀粉,保存于悬浮液中的直链淀粉被酶水解生成葡萄糖,利用葡萄糖氧化酶 /过氧化物酶测定葡萄糖的含量。溶解于醋酸 /钠盐溶液中的总淀粉同样可以被水解成葡萄糖,并利用萄糖氧化酶 /过氧化物酶测定葡萄糖。在 510nm测定利用 Con A沉降后悬浮液中 GOPOD吸光度的比率变化来计算直链淀粉的浓度,同样道理可计算出总淀粉浓度。 此方 法适用于所有的 纯净淀粉样品 和 谷物面粉。 精确性 : 对于纯净淀粉和 10%的谷物面粉,批内偏差 12,000 U/升 过氧化物酶 650 U/升 4-氨基安替比林 0.4 mM 稳定性: 4C保存, 2-3个月或 -20C保存, 12个月 葡萄糖标准溶液 葡萄糖标准溶液( 100g/0.1ml;保存于 0.2%的苯甲酸中),室温保存 5年。 淀粉参考标样 瓶签上标注有直链淀粉含量 缓冲液(试剂盒中未提供) 1. 醋酸钠缓冲液 (100mM, pH 4.5) 5.9ml冰醋酸 (,1.05g/ml)加入 900ml蒸馏水,用 1M NaOH(4g/100ml)调节 pH到 4.5(大约需要 30ml),然后加入叠氮化钠 (0.2g)并补液至1L。室温中保存。 注意: 叠氮化钠是一种有毒化学物质应妥善保存。叠氮化钠是葡萄糖缓冲液稳定剂,稀释操作过程中必须带防护手套进行操作。 二甲基亚砜对皮肤具有刺激性,应谨慎使用。 2. 浓缩 Con A缓冲液 (pH 6.4, 600mM) 无水醋酸钠 (BDH Cat No: 10236) -49.2g 氯化钠 (BDH Cat. No: 10241)- 175.5g CaCl2.2H2O (Mallinckrodt Cat. No: 4160)-0.5g MgCl2.6H2O (BDH Cat. No: 10149) -0.7g MnCl2.4H2O (Ajax Cat. No: 307) -0.7g 将上述试剂溶解于 900ml蒸馏水中,滴加冰醋酸调节 pH到 6.4,用蒸馏水补液至 1L, 4C保存。 注意: 调节 pH时必须谨慎小心,如果该溶液的 pH低于 6.4,将会产生沉淀物,重新调节 pH沉淀物不会再溶解,因此,必须重新配置新的溶液。 3. Con A缓冲液 (工作液 ): 使用当天,用 100ml蒸馏水稀释 30ml浓缩 Con A缓冲液。 4. 二甲基亚砜 (DMSO) 分析纯试剂 (BDH Analar Cat. No: 10323) 设备 : 1. 玻璃器具 -试管 (圆底 ; 16x120 mm, 15ml) -容量瓶 (25ml) -螺口戴帽样品管 (10ml) 2. 离心机( 2,000g) 3. 微量移液器 (50-1000l). 4. 连续分配器 5. 分析天平 . 6. 分光光度计 510 nm. 7. 漩涡混合器 8. 定时钟 9. 沸水浴锅 10. 微量离心机( 14,000g) 11. 控温水浴箱( 40C) 12. 微量离心管 (2.0ml) 注意事项 1、淀粉样品必须用乙醇进行处理以去除油脂,如果样品不能用乙醇处理,样品中的直链淀粉含量可能会被低估 50% 实验步骤 A. 淀粉前处理 1、 准确称取淀粉和面粉样品 20-25mg,加入到螺口试管中,记录样品重量(精确到 0.1mg)。 注意: 每批试验必须包括参考标样 每第五个样品设定重复管 2、 加入 1ml的 DMSO,用漩涡混合器低速的轻轻振荡,盖住试管帽在沸水中加热直到完全溶解(大约 1分钟),确保没有凝胶块残留。 3、 用漩涡混合器高速混合,再次将试管置于沸水浴锅中加热 15分钟,并间断性的用漩涡混合器高速混合。 4、 室温下放置大约 5分钟,加入 2ml乙醇( 95%),漩涡混合器混合,并再次加入乙醇 4ml,振荡,将形成淀粉沉淀物,静置试管 15分钟(或过夜)。 5、 离心 5分钟( 2,000g),弃去悬浮液,并用吸水纸吸干试管中的液体,确保去除所有的乙醇溶液。 6、 加入 2ml的 DMSO,用漩 涡混合器低速振荡,沸水浴锅中加热15分钟,并间断性的混合,以避免凝胶形成。 7、 加入 4ml稀释的的 Con A缓冲液(工作液),混合均匀,然后转移到 25ml的容量瓶中,并用 Con A缓冲液反复冲洗试管并一同加入容量瓶中,用 Con A缓冲液定溶至刻度线。( 此溶液为溶液1) 注意: 必须在 60分钟之内对此溶液进行测定。 B. 用 Con A沉淀支链淀粉,并测定直链淀粉 1、 取 1ml 溶液 1到 2.0ml的微量离心管中,加入 0.50ml的 Con A缓冲液 (4mg/ml),盖紧试管,轻轻的反复颠倒混合, 避免样品起泡 。 2、 在室温中静 置 1小时, 20C下离心 10分钟( 14,000g)。 3、 转移 1ml的上层液到 15ml的离心管中,加入 3ml的醋酸钠缓冲液( 100mM; pH 4.5),轻轻的盖住试管盖,在沸水中加热 5分钟。 4、 将试管置于 40C的水浴箱中孵育 5分钟,加入 0.1ml的淀粉葡萄糖苷酶 / -淀粉酶,并继续在 40C的水浴箱中孵育 30分钟,2,000g下离心 5分钟。 5、 加入 4ml 的 GOPOD试剂,在 40C下孵育 20分钟,同时孵育空白对照和葡萄糖质控。 6、 相对于空白对照在 510nm下读取每个样品和葡萄糖质控的吸光度值。 注意: 空白对照 : 1.0ml醋酸那缓冲液 +4ml 的 GOPOD试剂,在 40C下孵育 20分钟 葡萄糖质控: 0.1ml的葡萄糖标准液 (1mg/ml)+0.9ml醋酸那缓冲液+4ml 的 GOPOD试剂,在 40C下孵育 20分钟 C. 测定总淀粉 1、 取 0.5ml 溶液 1,加入 4ml的醋酸钠缓冲液( 100mM; pH 4.5)。 2、 加入 0.1ml的淀粉葡萄糖苷酶 / -淀粉酶,在 40C的水浴箱中孵育 10分钟。 3、 转移 1.0ml(两份)到测定试管中,加入 4ml 的 GOPOD试剂,在 40C下孵育 20分钟,同时孵育空白对照和葡萄糖质控。 计算直链淀粉含量( %) Con A悬浮液吸光度 6.15 100 直链淀粉 ,% = x x 总淀粉吸光度 9.2 1 Con A悬浮液吸光度 = x 66.8 总淀粉吸光度 注释: 6.15和 9.2分别代表 Con A和总淀粉在提取时的稀释系数 注意 : 1、 加入 Con A缓冲液的样品(如:在试验步骤 A中的 溶液 1)中的直链淀粉有衰退和沉淀倾向,因此不能放置过长时间。 2、 为了达到 Con A沉淀 支链淀粉的效果必须在室温中放置 60分钟(步骤 B1),但是不能超过 120分钟,因为直链淀粉有衰退倾向。 3、 利用乙醇可去除样品中可溶性的糖,因为可溶性的糖会干扰试验。 参考文献 : 2. Juliano, B.O. (1971) Cereal Sci.Today 16, 334-338, 340, 360. 3. Berry, C.S., lAnson, K., Miles, M.J., Morris,V.J. and Russel, P.L.J. (1988) Cereal Sci. 8, 203-206. 4. Sievert, D. and Pomeranz,Y. (1989) Cereal Chem. 66, 342-347. 5. Tester, R.F. and Morrison,W.R. (1990) Cereal Chem. 67, 551-557. 6. Leloup,V.M., Colonna, P. and Buleon,A. (1991) J. Cereal Sci. 13, 1-13. 7. Matheson, N.K. (1971) Phytochem. 10, 3213-3219. 8. Morrison,W.R. and Laignet, B. (1983) J. Cereal Sci. 1, 9-20. 9. Knutson, C.A. (1986) Cereal Chem. 63, 89-92. 10. Chrastil, J. (1987) Carbohydr. Res. 159, 154-158. 11. International Organisation for Standardisation (1987) ISO 6647:1987E. Rice: determination of amylose content. 12. Gibson,T.S., Solah,V.A. and McCleary, B.V. (1996) “A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with Con A.” J. Cereal Science, 25, 111-119. 13. Matheson
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