直链淀粉,支链淀粉测定试剂盒

直链淀粉 /支链淀粉测定试剂盒 用于测定淀粉中的直链淀粉和支链淀粉含量 AMYL 11/99 简介 : 决定谷物淀粉最终的特殊用途取决于淀粉众多特性中的直链淀粉 /支链淀粉比率，因此，对于淀粉加工企业，淀粉中直链淀粉含量是一项非常重要的指标。 测定谷物淀粉中的直链淀粉通常采用电位测定法、糊化染色法或旋光分析法，即通过测定碘与直链淀粉结合生成直链淀粉 -碘复合物的方法来评估直链淀粉含量，然而由于支链淀粉 -碘复合物在此过程中同样会形成，因此这些方法的准确性常遭到质疑。利用非比色方法测定游离碘离子的减少和通过比色测定直链 淀粉 -碘复合物的方法会导致高估直链淀粉的含量，是用此方法可能出现的更多问题请参考 Gibson et al11。 目前， 国际上普遍采用结果更加准确的利用 伴刀豆凝集素 A(Con A)沉降支链淀粉 ，然后测定直链淀粉含量的方法，在特定的温度、 pH和离子强度下， Con A可以特定的连接含 吡喃葡萄糖 基a-D-glucosepyranosyl或 吡喃甘露 基 a-D-mannopyranosyl的支链多聚糖，因此会优先于直链淀粉与支链淀粉形成沉淀 复合物。 原理 : 加入二甲基亚砜 (DMSO)的淀粉样品通过加热被完全溶解，乙醇洗脱样品中的油脂，回收洗涤后的淀粉样品，并用醋酸 /钠盐溶液溶解，加入 Con A后支链淀粉被特异性的沉降，离心分离支链淀粉，保存于悬浮液中的直链淀粉被酶水解生成葡萄糖，利用葡萄糖氧化酶 /过氧化物酶测定葡萄糖的含量。溶解于醋酸 /钠盐溶液中的总淀粉同样可以被水解成葡萄糖，并利用萄糖氧化酶 /过氧化物酶测定葡萄糖。在 510nm测定利用 Con A沉降后悬浮液中 GOPOD吸光度的比率变化来计算直链淀粉的浓度，同样道理可计算出总淀粉浓度。 此方 法适用于所有的 纯净淀粉样品 和 谷物面粉。 精确性 : 对于纯净淀粉和 10%的谷物面粉，批内偏差 12,000 U/升 过氧化物酶 650 U/升 4-氨基安替比林 0.4 mM 稳定性： 4C保存， 2-3个月或 -20C保存， 12个月 葡萄糖标准溶液 葡萄糖标准溶液（ 100g/0.1ml；保存于 0.2%的苯甲酸中），室温保存 5年。 淀粉参考标样 瓶签上标注有直链淀粉含量 缓冲液（试剂盒中未提供） 1. 醋酸钠缓冲液 (100mM, pH 4.5) 5.9ml冰醋酸 (,1.05g/ml)加入 900ml蒸馏水，用 1M NaOH(4g/100ml)调节 pH到 4.5（大约需要 30ml），然后加入叠氮化钠 (0.2g)并补液至1L。室温中保存。 注意： 叠氮化钠是一种有毒化学物质应妥善保存。叠氮化钠是葡萄糖缓冲液稳定剂，稀释操作过程中必须带防护手套进行操作。 二甲基亚砜对皮肤具有刺激性，应谨慎使用。 2. 浓缩 Con A缓冲液 (pH 6.4, 600mM) 无水醋酸钠 (BDH Cat No: 10236) -49.2g 氯化钠 (BDH Cat. No: 10241)- 175.5g CaCl2.2H2O (Mallinckrodt Cat. No: 4160)-0.5g MgCl2.6H2O (BDH Cat. No: 10149) -0.7g MnCl2.4H2O (Ajax Cat. No: 307) -0.7g 将上述试剂溶解于 900ml蒸馏水中，滴加冰醋酸调节 pH到 6.4，用蒸馏水补液至 1L， 4C保存。 注意： 调节 pH时必须谨慎小心，如果该溶液的 pH低于 6.4，将会产生沉淀物，重新调节 pH沉淀物不会再溶解，因此，必须重新配置新的溶液。 3. Con A缓冲液 (工作液 ): 使用当天，用 100ml蒸馏水稀释 30ml浓缩 Con A缓冲液。 4. 二甲基亚砜 (DMSO) 分析纯试剂 (BDH Analar Cat. No: 10323) 设备 : 1. 玻璃器具 -试管 (圆底 ； 16x120 mm, 15ml) -容量瓶 (25ml) -螺口戴帽样品管 (10ml) 2. 离心机（ 2,000g） 3. 微量移液器 (50-1000l). 4. 连续分配器 5. 分析天平 . 6. 分光光度计 510 nm. 7. 漩涡混合器 8. 定时钟 9. 沸水浴锅 10. 微量离心机（ 14,000g） 11. 控温水浴箱（ 40C） 12. 微量离心管 (2.0ml) 注意事项 1、淀粉样品必须用乙醇进行处理以去除油脂，如果样品不能用乙醇处理，样品中的直链淀粉含量可能会被低估 50% 实验步骤 A. 淀粉前处理 1、 准确称取淀粉和面粉样品 20-25mg，加入到螺口试管中，记录样品重量（精确到 0.1mg）。 注意： 每批试验必须包括参考标样 每第五个样品设定重复管 2、 加入 1ml的 DMSO，用漩涡混合器低速的轻轻振荡，盖住试管帽在沸水中加热直到完全溶解（大约 1分钟），确保没有凝胶块残留。 3、 用漩涡混合器高速混合，再次将试管置于沸水浴锅中加热 15分钟，并间断性的用漩涡混合器高速混合。 4、 室温下放置大约 5分钟，加入 2ml乙醇（ 95%），漩涡混合器混合，并再次加入乙醇 4ml，振荡，将形成淀粉沉淀物，静置试管 15分钟（或过夜）。 5、 离心 5分钟（ 2,000g），弃去悬浮液，并用吸水纸吸干试管中的液体，确保去除所有的乙醇溶液。 6、 加入 2ml的 DMSO，用漩 涡混合器低速振荡，沸水浴锅中加热15分钟，并间断性的混合，以避免凝胶形成。 7、 加入 4ml稀释的的 Con A缓冲液（工作液），混合均匀，然后转移到 25ml的容量瓶中，并用 Con A缓冲液反复冲洗试管并一同加入容量瓶中，用 Con A缓冲液定溶至刻度线。（ 此溶液为溶液1） 注意： 必须在 60分钟之内对此溶液进行测定。 B. 用 Con A沉淀支链淀粉，并测定直链淀粉 1、 取 1ml 溶液 1到 2.0ml的微量离心管中，加入 0.50ml的 Con A缓冲液 (4mg/ml)，盖紧试管，轻轻的反复颠倒混合， 避免样品起泡 。 2、 在室温中静 置 1小时， 20C下离心 10分钟（ 14,000g）。 3、 转移 1ml的上层液到 15ml的离心管中，加入 3ml的醋酸钠缓冲液（ 100mM； pH 4.5），轻轻的盖住试管盖，在沸水中加热 5分钟。 4、 将试管置于 40C的水浴箱中孵育 5分钟，加入 0.1ml的淀粉葡萄糖苷酶 / -淀粉酶，并继续在 40C的水浴箱中孵育 30分钟，2,000g下离心 5分钟。 5、 加入 4ml 的 GOPOD试剂，在 40C下孵育 20分钟，同时孵育空白对照和葡萄糖质控。 6、 相对于空白对照在 510nm下读取每个样品和葡萄糖质控的吸光度值。 注意： 空白对照 ： 1.0ml醋酸那缓冲液 +4ml 的 GOPOD试剂，在 40C下孵育 20分钟 葡萄糖质控： 0.1ml的葡萄糖标准液 (1mg/ml)+0.9ml醋酸那缓冲液+4ml 的 GOPOD试剂，在 40C下孵育 20分钟 C. 测定总淀粉 1、 取 0.5ml 溶液 1，加入 4ml的醋酸钠缓冲液（ 100mM； pH 4.5）。 2、 加入 0.1ml的淀粉葡萄糖苷酶 / -淀粉酶，在 40C的水浴箱中孵育 10分钟。 3、 转移 1.0ml（两份）到测定试管中，加入 4ml 的 GOPOD试剂，在 40C下孵育 20分钟，同时孵育空白对照和葡萄糖质控。 计算直链淀粉含量（ %） Con A悬浮液吸光度 6.15 100 直链淀粉 ,% = x x 总淀粉吸光度 9.2 1 Con A悬浮液吸光度 = x 66.8 总淀粉吸光度 注释： 6.15和 9.2分别代表 Con A和总淀粉在提取时的稀释系数 注意 : 1、 加入 Con A缓冲液的样品（如：在试验步骤 A中的 溶液 1）中的直链淀粉有衰退和沉淀倾向，因此不能放置过长时间。 2、 为了达到 Con A沉淀 支链淀粉的效果必须在室温中放置 60分钟（步骤 B1），但是不能超过 120分钟，因为直链淀粉有衰退倾向。 3、 利用乙醇可去除样品中可溶性的糖，因为可溶性的糖会干扰试验。 参考文献 : 2. Juliano, B.O. (1971) Cereal Sci.Today 16, 334-338, 340, 360. 3. Berry, C.S., lAnson, K., Miles, M.J., Morris,V.J. and Russel, P.L.J. (1988) Cereal Sci. 8, 203-206. 4. Sievert, D. and Pomeranz,Y. (1989) Cereal Chem. 66, 342-347. 5. Tester, R.F. and Morrison,W.R. (1990) Cereal Chem. 67, 551-557. 6. Leloup,V.M., Colonna, P. and Buleon,A. (1991) J. Cereal Sci. 13, 1-13. 7. Matheson, N.K. (1971) Phytochem. 10, 3213-3219. 8. Morrison,W.R. and Laignet, B. (1983) J. Cereal Sci. 1, 9-20. 9. Knutson, C.A. (1986) Cereal Chem. 63, 89-92. 10. Chrastil, J. (1987) Carbohydr. Res. 159, 154-158. 11. International Organisation for Standardisation (1987) ISO 6647:1987E. Rice: determination of amylose content. 12. Gibson,T.S., Solah,V.A. and McCleary, B.V. (1996) “A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with Con A.” J. Cereal Science, 25, 111-119. 13. Matheson