（环境科学专业论文）基于微流控芯片细胞中非稳态物质超氧自由基的分析检测.pdf

山东师范大学硕士学位论文 检测方法得到的浓度更逼近了细胞0 2 - 的真实水平，力图为具有潜在生物医学 应用价值的微流控自由基分析检测奠定基础。本论文共分三章，概述如下： 第一章，微流控芯片用于细胞组分分析研究的概述。 第二章，我们选用实验室合成的2 氯1 ，3 二苯并噻唑林环己烷( d b z t c ) 为荧光 标记试剂，以微芯片电泳激光诱导荧光检测( m c e l i f d ) 为分析技术平台，建 立了一种快速检测肝癌细胞匀浆中0 2 1 的方法。最佳的电泳条件下，3 0 s 内实现 了超氧自由基的检测，得到的线性范围为4 0 x1 0 7 - 1 o l o 。5 m ；浓度检测限 ( s n = 3 ) 为0 1 5 肛m ，质量检测限为0 0 3f m o l ( 样品进样体积y 口2 0 0p l ) ；峰面积和 迁移时间的相对标准偏差( r s d s ) 分别为2 6 和3 8 。干扰试验表明，该方法在 生物体系中，1 0 0 0 倍过量h 2 0 2 不干扰检测。最后将该方法应用到肝癌细胞和p m a 刺激的小鼠巨噬细胞d 0 0 2 - 的检测，回收率分别为9 7 - 3 和9 8 6 。 第三章，基于第二章已建立的分析体系，我们进行了微流控芯片上单个肝癌细 胞中0 2 一的分析检测方法的研究。在完成肝癌细胞培养、确定芯片结构的基础上， 针对细胞的强吸附、无规律群聚以及芯片内外需要等渗压的特点，探索了细胞表 面预处理以及微流控芯片上操纵单细胞的方法。确定了电动操纵单细胞的最佳电 压条件。初步实现了单个肝癌细胞的进样、分离。单细胞溶膜及胞内0 2 。的检测 有待进一步实验优化。 关键词：微流控芯片；肝癌细胞；超氧阴离子自由基；2 氯l ，3 二苯并噻唑林 环己烷( d b z t c ) , 激光诱导荧光检测； 分类号：t b3 8 3 2 山东师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t c e l li st h eb a s i cu n i to fo r g a n i s ms n l l c t l l r ea n df u n c t i o n s n u m e r o u sf r e er a d i c a l s a r eg e n e r a t e di nt h ec o u r s eo fb i o l o g ym e t a b o l i s m s u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l ( 0 2 。) ， h y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) ，h y d r o x y lr a d i c a l s ( h o ) ，a n dp e r o x y n i r t e ( o n o o 。) a r e s o m et y p i c a lo n e s t h e yh a v ei m p o r t a n tr e l a t i o nw i t ha g i n ga n dm a n yd i s e a s e s i ti s r e p o r t e dt h a ta p p r o p r i a t el e v e lo fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) c o u l dh e l pt ob u i l d b i o l o g i c a li m m u n es y s t e m ，w h i l ee x c e s sr o sh a v ed a m a g e so no r g a n i s m s r e c e n t s t u d i e sd e m o n s t r a t e dt h a tr o sc a nc a u s em a n yd i s e a s e ss u c ha sh e 积d i s e a s e c a n c e r , m a l i g n a n c ya n ds oo n 0 2 一s e r v e sa sap r e c u r s o rt oo t h e rr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) f o re x a m p l e ，0 2 一c o n v e r t st oh 2 0 2s p o n t a n e o u s l yo ru n d e ra c t i o n o f s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ；0 2 一r e a c t sw i t hn o t of o r mt h ep o w e r f u lo x i d a n tp e r o x y n i t r i t e a l t h o u g hs e v e r a lm e t h o d st od e t e c t0 2 一s u c ha se l e c t r o ns p i nr e s o n a n c e ( e s r ) ， e l e c t r o c h e m i s t r y ，f l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r ya n dh p l ch a v eb e e nd e v e l o p e d ，t h e r e w e r es o m ed r a w b a c k sf o rt h ea b o v em e n t i o n e dm e t h o d s ，i n c l u d i n gt h el a r g es a m p l e v o l u m e ，t h el o n ga n a l y z i n gt i m e ，i n c o n v e n i e n c et oo p e r a t eo rc o s t l i n e s s t h e r e f o r e ， r a p i d , s e n s i t i v ed e t e c t i o na n dq u a n t i f i c a t i o no f i n t r a c e l l u l a r0 2 i sc r i t i c a l l yi m p o r t a n t i nu n d e r s t a n d i n gi t sp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n sa n dp a t h o g e n e s i so fv a r i o u sd i s e a s e s a s s o c i a t e dw i t hr o s s i n c e19 9 0 s ，m i c r o f l u i d i cc h i po rl a bo nac h i pp r o v i d e san e wt e c h n o l o g yp l a t f o r m f o rt h er e s e a r c hi nc h e m i s t r y , b i o l o g y , m i c r o e n g i n e e r i n ga n do t h e rr e l a t e dm i c r o s y s t e mf i e l d s ，d u et oi t ss h o r t e ra n a l y z i n gt i m ea n dr e d u c i n gs a m p l er e q u i r e m e n t s a n e wm e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no fc e l l u l a rn o n s t e a d ys u b s t a n c e ss u c ha ss u p e r o x i d e f r e er a d i c a lo nt h em o l e c u l el e v e lw a sd e v e l o p e d ，w h i c hw a sf o c u s e do nt h e a p p l i c a t i o no fm i c r o f l u i d i cd e v i c ea n df r e er a d i c a lf l u o r e s c e n tp r o b e ，c o u p l e dw i t h h o m e l ym a d el a s e r - i n d u c ef l u o r e s c e n c e ( l i f ) t h el e v e lo fc e l l u l a r0 2 一d e t e r m i n e d b yt h i sm e t h o di sm o r ec l e a rt ot h er e a lc o n c e n t r a t i o n t h et h e s i sw a st od e v e l o pt h e r e l a t e dt e c h n i q u e so f p o t e n t i a l l yb i o m e d i c a ls i g n i f i c a n c e t h r e ec h a p t e r sa r ei n c l u d e d ： i nc h a p t e ro n e ，c e l l u l a rc o n s t i t u e n ta n a l y s i z i n go nm i c r o c h i pw a ss u m m a r i z e d i nc h a p t e rt w o ，am e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no fs u p e r o x i d ef l e er a d i c a l ( 0 2 一) b a s e d o nm i c r o c h i pe l e c t r o p h o r e s i sw i t hl i fw a sd e v e l o p e d f l u o r e s c e n tr e a g e n t2 - c h l o r o - 1 ， 3 - d i b e n z o t h i a z o l i n e c y c l o h e x e n e ( d b z t c ) ，w h i c hw a ss y n t h e s i z e di no u rl a b o r a t o r y ， w a se m p l o y e da st h el a b e l i n gr e a g e n t o p t i m a ld e t e r m i n a t i o no f0 2 - w a sa c h i e v e do n ag l a s sm i c r o c h i p ，u s i n g5 0 m mh e p e sb u f f e r ( p h 7 4 ) u n d e rt h e o p t i m i z e d 3 山东师范大学硕士学位论文 c o n d i t i o n s ，l i n e a r i t yo fr e s p o n s ew a s o b t a i n e di nt h er a n g eo f4 0 x10 。7 _ 1 0 10 m ， t h ed e t e c t i o nl i m i t ( s n = 3 ) w a s0 15 1 x m ，t h er s d so fm i g r a t i o nt i m ea n dp e a ka r e a w e r e2 6 a n d3 8 ，r e s p e c t i v e l y t h ei n t e r f e r e n c ee x p e r i m e n t sw a si n v e s t i g a t e da n d t h er e s u l ti n d i c a t e st h a t10 0 0 一f o l dm o l a re x c e s so fh 2 0 2d o s en o ti n t e r f e r et h e d e t e r m i n a t i o no f0 2 i nc o m p l e xs y s t e m f i n a l l y ，t h em e t h o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l y a p p l i e dt od e t e r m i n e 0 2 一i nh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a ( h e p g 2 1c e l l sa sw e l l 舔 p m a - s t i m u l a t e dr a w 2 6 4 7 m a c r o p h a g e s t h ea v e r a g er e c o v e r i e sw e r e9 7 3 a n d 9 8 6 ，r e s p e c t i v e l y i nc h a p t e rt h r e e ，b a s e do nt h es e c o n ds y s t e m ，d e t e r m i n a t i o no f0 2 一。i ns i n g l e h e p g 2c e l lw a ss t u d i e d a f t e ri n c u b a t i o nc e l l sa n dd e t e r m i n a t i o nm i c r o c h i ps t r u c t u r e ， t h ep r o c e s si ns i n g l ec e l la n a l y s i so i lm i c r o f l u i d i cc h i p ，i n c l u d i n gc e l ll o a d i n g ，c e l l s e p a r a t i o n ，c e l l u l a r0 2 一d e t e r m i n a t i o n ，w e r ee x p l o r e d t h ef u r t h e re x p e r i m e n tw a s n e e d e dt oo p t i m a i z e d k e yw o r d s ：m i c r o f l u i d i cc h i p ；h e p g 2c e l l s ；s u p e r o x i d ef r e er a d i a c a l ；2 - c h l o r o - 1 ， 3 - d i b e n z o t h i a z o l i n e c y c l o h e x e n e ；l a s e r - i n d u c ef l u o r e s c e n c ed e t e r m i n a t i o n c a t e g o r yn u m b e r ：t b38 3 4 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名： 引靳 、 弋拟屯 剔币答毛 窍清由易 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 套1 韧 导师签字： 签字日期：2 0 0 9 年后月 7 日 签字日期：2 0 0 9 年 月7 日 山东师范大学硕士学位论文 第一章绪论 1 引言 细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本单元。细胞的异质性导致细胞在化 学组成、生理响应时间等方面存在差异。研究细胞内化学组分的信息能使人们更 好地了解细胞中某些特殊的功能，从大量的细胞群体中筛选并检测出单个特异性 细胞的生理、病理的变化，在重大疾病早期诊断、治疗、药物筛选和细胞生理、 病理过程的研究方面有重要意义。为此，对细胞内化学组分进行分析非常重要【】j 。 在生物的氧化代谢过程中不断产生各种活性氧自由基，如超氧阴离子自由基 ( 0 2 ) 、羟基自由基( h o ) 、单线态氧( 1 0 2 ) 等非稳态物质，它们在各种疾病的产生 过程中都是重要的介导因素【2 】。生物体中适当水平的活性氧是机体维持良好免疫 应答的基础，而活性氧自由基大量存在时则是有害的。目前研究的证据表明【3 】， 氧自由基几乎和人类大部分常见的几种主要疾病如心脏病、癌症、恶性肿瘤等都 有关系。其中，超氧阴离子作为其他r o s 的前导物，可以通过其它途径转化成毒 性更大的h o 、h 2 0 2 、1 0 2 等自由基。它们与生物体的衰老及许多疾病的发生都 有重要关系，能诱发诸如冠心病、动脉硬化、肿瘤等多种疾病【4 】。北京大学分子 医学研究所程和平教授等i s 基于一种新颖的高特异性超氧指示剂，即基因编码 的、定位于线粒体的可用于实时测量的荧光蛋白，研究发现一种新的细胞超氧生 成事件，并命名为“超氧炫”( s u p e r o x i d ef l a s h e s ) 。超氧炫是细胞内( 含1 0 2 1 0 4 个 线粒体) 单个线粒体中超氧信号的瞬时爆发现象( f i g 1 ) 。超氧炫为线粒体膜通透性 转运孔道( m p t p ) 开放所触发，与线粒体电子传递链活性密切相关。该发现对自 由基和线粒体研究领域有一定的指导意义，如：超氧炫可作为氧化应激相关疾病 的生物标记物。因此，如果能建立一种适用于生理条件下的超氧自由基的快速、 定量检测方法，在疾病的早期发现等方面将具有十分重要的意义。 目前，用于检测超氧阴离子自由基的方法包括：电子顺磁共振法【6 】，s o d 酶活 性测定法忉，化学发光法【8 】，高效液相色谱法( h p l c ) 【9 】以及荧光分析法【1o 】等。上 述方法中，荧光法具有高的灵敏度和选择性在细胞自由基的研究中表现出了一定 的优势。但是由于细胞尺度小( 直径p m 级、体积在p l 几级) 、细胞内非稳态物 质如活性氧含量低( z m o l 级) 、生化反应快( 通常在m s 级) ，一些传统的观察与分析 山东师范大学硕士学位论文 方法因存在取样体积大、质量检测限高、分析信号获得时间长等不足，而难以用 于单个细胞内活性氧含量的测定。2 0 世纪8 0 年代发展起来的毛细管电泳( c e ) 因其接近细胞尺寸、适合多组分分离、柱效高等特点在细胞组分分析方面取得一 些成果【1 1 - 15 1 。2 0 0 8 年m e a n y ，d l 掣16 】以常规荧光试剂二溴已啡啶( h e ) 为衍生试 剂，以用毛细管电泳一激光诱导荧光检测技术为平台，检测了小鼠腹腔线粒体中 0 2 1 。但是，生物体内其他活性物质和氧自由基同样可以与h e 反应【17 1 ，使得荧 光试剂h e 对o f 的选择性大大降低。此外，c e 分析由于其一维结构的限制， 进样和分离操作繁琐、费时，不易实现连续操作。自2 0 世纪9 0 年代初兴起的微 流控芯片，可以讲进样、分离、检测等更多的功能集成在一起，从而大大简化了 操作步骤。该技术与高选择性、高灵敏度荧光探针的结合为细胞中组分检测尤其 是单细胞中化学组分的检测提供了广阔的应用前景。 e t c ， 1 ，q 睫h 湘i 哪 黼 f i g u r e 1s c h e m a t i cm o d e lf o rs u p e r o x i d ef l a s hg e n e s i s 【5 】 2 微流控芯片用于细胞组分分析检测概况 2 1 微流控芯片概述 6 1 9 9 0 年瑞士科学家m a n z 和w i d m e r 等【1 8 】首次提出微全分析系统 ( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，g - t a s ) 的概念。经过近2 0 年的发展，p t a s 已经越来越显示出其重要性。l a - t a s 发展的目标是将生物化学、分析化学、医 学等领域生化样品的筛选、进样、混合、反应、分离、检测等操作单元集成到 一个微芯片分析装置上。作为“t a s 领域中最瞩目的一项技术平台，微流控芯 片分析是以微机械加工、微流体驱动控制、检测等技术为依托，以微通道网 山东师范大学硕士学位论文 络为结构特征，以分析化学为基础，以生命科学为目前主要应用对象的重点发 展领域。它的终极目标是把生物和化学等实验室的功能，包括采样、样品预处 理、反应、分离、检测等集成在微芯片上完成。微流控芯片电泳( m c e ) 因使样 品与试剂消耗降低到微升至纳升级( 甚至是皮升级) ，而且使分析速度成十倍、 百倍地提高；同时将多种分析功能单元集成于一个芯片向实现维持一个闭合系 统迈进了一大步，从而可以实现完全的自动化，减少污染、降低干扰和人为误 差。尤其是近年来，微芯片毛细管电泳对细胞代谢产物 1 9 , 2 0 ，d n a 2 1 , 2 2 】、r n a 2 3 2 4 ，多肽和蛋白质【2 5 。2 - q 等生物大分子所表现出来的高分辨、高速、高通量的 分离分析能力，使它成为后基因时代中蛋白质组学研究的重要的分离分析手段 之一。微流控芯片电泳用于细胞组分分析具有如下几方面特点：微流控芯片通 道直径通常在1 0 1 0 0 1 加n ，与单个生物细胞在尺度上具有相容性；微流控芯片具 有网络式二维或三维通道，容易操纵单细胞，可集成多种操作分析方法；微流 控芯片为平版式几何构型，更容易进行观察、检测；由于几何尺寸较小，可以 用小的电压获得大的电场强度，电泳分离时间显著加快。因此，在微流控芯片 上进行细胞分析越来越受到人们的重视。 2 2 微流控芯片用于细胞组分分析概况 微流控芯片细胞组分分析一般包括细胞提取液( 匀浆) 和活体细胞两部分。 细胞组分分析多采用微流控芯片电泳进行分离分析。微流控芯片用于细胞组分分 析通常包括细胞样品预处理、细胞样品或单细胞进样、溶膜、分离及组分检测等 多个步骤。 在微流控芯片上，普遍采用电泳和电渗相结合的方式来转移和分离分子及细 胞。h a r r i s o n 研究组【2 8 】首先在电渗流操纵细胞方面进行了研究。他们在简单的双 t 通道芯片上，利用电渗流将细胞从进样通道转移到分离通道，并且导入溶膜试 剂进行细胞溶膜。当在样品池和样品废液池之间施力1 1 1 0 0 v 的电压时，细胞靠电渗 流在进样通道内运动，细胞充满进样通道后改变施加在各贮液池的电压，通道内 液体流向改变从而将细胞切入分离通道，进行分析检测。 r a m s e y 等 2 9 】在微流控芯片上实现了高通量的细胞处理、快速溶膜、分离检测 操作( f i g 2 ) 。他们利用注射泵将经荧光试剂处理的细胞导入芯片进样通道后，进 样通道的侧面通道加入乳化剂，在细胞溶膜前对细胞进行预处理，通过c c d 观察 7 山东师范大学硕士学位论文 细胞到达交叉口处，分离通道立刻施加正相方波脉冲电压细胞处于持续高频的 脉冲电场时3 3 m s 内即可实现溶膜，细胞质荧光染料o r e g o ng r e e t l 和c a r b o x y f l u o r e s c e i n 被释放并在分离通道内电泳分离( f i g3 ) ，激光诱导荧光检测，分析速 度达到每分钟1 1 2 个细胞。 琴弯 f i g u r e 3 细胞溶膜后电泳分离过程示意图 f i g u r e3 c c di m a g e so fc e l ll y s i s ( a ) t h ej u r k a tc e l l l o a d e dw i t hc a l c e i na m ( w i t h i nw h i t eo v a l ) i sb e i n gh y d r o d y n a m i c a l l yt r a n s p o r t e dt ot h el y s i si n t e r s e c t i o nr b l t h ec e l lh a se n c o u n t e r e dt h ee l e c t r i cf i e l da n db e e nl y s e dt h ef l u o r e s c e n t l yl a b e l e d c o n t e n t s8 r ei n j e c t e di n t ot h es e p a r a t i o nc h a r m e la n dm i g r a t et o w a r dt h ea n o d e ( c ) t h es e p a r a t i o no f t w oo f t h ef l u o r e s c e n t l yl a b e l e dc o m p o n e n t s ( m a r k e db ya s t e r i s k s ) i nt h es a m “o nc h a n n e li ss e e n t h i sm i e r o c t d pd e s i g ni sd i f f e r e n tf r o mt h a t d e s c r i b e di nt h ee x p e r i m e n t a ls e c t i o ni th a sa na d d i t i o n a lc h a n n e l ( # ) t h i sc h a n n e l ， h o w e v e r ，h a sb e e nb l o c k e dw i t hav i s c o u sp o l y m e rp l u gt oe l i m i n a t ef l o wm a k i n gt h e m i c r o c n pf u n c l i o n a l l ye q u i v a l e n tt ot h a td e s c r i b e di nt h ee x p e r i m e n t a ls e c t i o n 山东师范大学硕士学位论文 y a g e r 研究组【3 0 】在微流控芯片上对大肠杆菌进行溶膜，提取细胞中的b 半乳 糖苷酶，采用荧光素酶对p 半乳糖苷酶进行检测。该技术不仅能用于分析大肠杆 菌，还可以用于其他许多不同类型细胞分析。w h e e l e r 等【3 l 】设计了一种可用于细 胞分析的芯片装置，对细胞内钙离子进行了测定：他们还采用l i f 和p m t 联合检 测，在十字微通道的玻璃芯片上，使用s d s 和s b 1 2 混合硼酸缓冲液的胶束电动 色谱模式，在5 分钟内完成了c a t h a 神经元细胞内的1 2 种神经递质和氨基酸的 分离和检测。r o p e r 等 3 2 】在电泳芯片采用竞争性免疫电泳分析法动态监测了胰岛 细胞分泌胰岛素的过程，在芯片通道内其胰岛素的检测限达到了3 n m 水平，还对 单个胰岛的胰岛素分泌过程进行了长达3 0 分钟的连续监测。i r i m i a 等【3 3 】在微流控 芯片2 5 p l 微室中进行单细胞快速溶膜，检测了单细胞中可溶性染料浓度和不溶性 肌动蛋白含量。这一工作减小了进样体积，消除了试剂对细胞内物质稀释带来的 影响。 然而，微流控芯片用于细胞中超氧自由基的报道很少。秦建华等瞰】在简单的 十字芯片上，采用芯片区带电泳模式，以氧化砷诱导急性早幼粒白血病细胞为模 型，激光诱导荧光同时检测了细胞匀浆中的活性氧( r o s ) 和还原型谷胱甘肽。 方肇伦研究组【3 5 】在简单十字型芯片上以红细胞为分析模型，电泳分离结合激光 诱导荧光检测了单个红细胞中的谷胱甘肽和r o s 。该课题组【3 6 】又设计了一种进样 通道和分离通道不同的三维微流控芯片，以肝癌细胞为研究对象，针对肝癌细胞 体积大，易沉降和聚集，难溶膜的特点，通过加宽加深进样通道，即在玻璃底层 片上组装样品通道( 深3 7 肛n ) 、分离通道( 深1 2 9 m ) ，结合在p b s 缓冲中加入4 的 h p m c ，减少细胞在进样池的聚集和进样通道的贴壁，使肝癌细胞顺利地在进样 通道流动，并通过在分离通道设置围堰( 长l m m ，围堰部分的通道深6 岫) ，使细 胞截留在固定位置溶膜，以h e 为荧光标记试剂，激光诱导荧光检测了肝癌细胞 中的超氧自由基( f i 9 4 1 。 9 山东师范大学硕士学位论文 f i g u r e4 实验装置示意图0 3 6 i f i g u r e 4 s c h e m a t i c so f ( a ) t h ec h a n n e ld e s i g no ft h em u l t i - d e p t hm i c r o f l u i d i cc h i p ( d i m e n s i o n sa r eg i v e ni nm i i l ) a n d ( b ) t h ee x p e r i m e n t a ls e t u p 2 3 细胞操纵 微流控芯片用于单细胞组分分析通常包括细胞分选、单细胞进样、分离及组 分检测等多个步骤。面临的首要问题是如何对细胞进行操纵，使单个细胞从细胞 群体中分离出来，实现单细胞进样。微流控技术用于单细胞操纵，人们采取了多 种微通道液流控制技术，主要包括液压、气压等机械力控制，电压、介电电泳等 电控制，以及光学陷阱( 光镊) 等，或者上述几种技术的结合。 t o m o k a z um a t s u e 研究组【3 7 】构建了一个利用直流电场操纵酵母细胞的芯片，主 通道( 长2 0 m m ，宽1 5 0 p r o ，高1 0 岬) 制作在p d m s 上，微分析室( 长1 0 0 1 a m ，宽2 0 1 a m ， 高l o i - t m ) 刻在玻璃基片上。一个较宽的电极( 5 0 1 t i n ) 位于主通道的中心部位，两个 微电极e l ，e 2 ，都位于主通道的一侧的凹槽分析室内( f i g 5 ) 。利用直流电场将带 l o 山东师范大学硕士学位论文 负电的单个酵母细胞筛选进入微室中进行基因表达分析分析完成后叉通过施加 方向相反的直流电将该细胞推出微室，进入主通道进行收集。 ， ) u t ec o s t an i ”9 o 一u h e ， 巴墨嘤熙黑_ 墨墨哑i _ 墨面墨l 刨广国 ! r i 啊。i f i g u r e 5 芯片结构及实验过程示意圉p 1 f i g u r e s ( a ) s c h e m a t i cc r o s s - s e c t i o n a v i e wo ft h ec o n f i g u r a t i o no ft h ea n a l y t i c a l c h a m b e ri n c l u d e dp r i n c i p l e sb e h i n dt h ee n z y m a t i cr e a c t i o na n dt h ee l e c t r o c h e m i c a l d e t e e t i o t l ( b ，o p t i c a l i m a g eo f t h e w h o l e m c r o 日u i d i cd e v i c ew i t ha na r r a yo f f o u r a n a l y t i c a lc h a m b e r s ( c ) p r i n c i p l e so f ( c la n dc 3 1t h em a n i p u l a t i o no fc e l l sa n d ( c 一2 ) t h ee l e c t r o c h e m i c a lm e a s u r e m e n to fe x p r e s s e de n z y m ei nt h em i c r o f l u i d i c d e v i c e 卅 l u n g m i n gf u 研究组敛力干微流体的电动聚焦研究，提出种利用电动聚焦精 确控制样品进样量的方法c 3 s 删。最近本研究组叉提出 种新的细胞操纵装置 。1 1 ， 流体在微通道中处于层流状态，细胞或粒子在聚焦后的边鞘流中流动，其将产生 挤压跳跃现象( s q u e e z e - j u m p i n ge f f e c t ) ，即在微流体聚焦作用下细胞或粒子无法 1 叫 山东师范大学硕士学位论文 稳定流动在尺寸小于该粒子直径的流层中，将从宽度较小的流层挤压进入宽度较 大的流层中，从而实现对细胞或粒子的分类筛选( f i g 7 ) 。文献中，作者利用电动 聚焦精确控制微通道中层流流体的宽度( f i g 6 ) ，结合上述理论实现了对5 i n n 酵 母细胞，l o 岫和2 0 岬聚苯乙烯( p s ) 混合液的分类，分类效率到达8 7 7 ，芯片 结构如f i g 8 。 f i g u r e6 微流体聚焦压缩现象示意图【4 l 】 山东师范大学硕士学位论文 ( a ) f i g u r e 7 微流体粒子细胞分类原理示意图1 4 1 c c h o a n l l e c n t e i o ”n 砷一c c h o a l l e c t i 0 1 n 、研 “” 参一r ， 一 、 s i d ec h a n n e 7 l2 0 螽，m a i n “”。 一一s i d e c h a n n e l l f i g u r e 8 芯片结构示意图1 4 2 0 0 5 年p a u l chl i 箐”“设汁了一种简单的微芯片用丁监测心肌细胞中f l ! j c a 卜 ( f i g9 ) 。在常规的t 形芯片l 一没置一个扩张室，| j ：交叉处设置一v ”型坝，用于 定位细胞。通过锓微镜观察细胞到达v 弘抄l 的入口时立即抬高贮液池c 的液 面，将细胞推入v 型坝中，然后分别装载入可以标记c a ”一的荧光染举g f l u o - 4 a m e s t e r 柬监洲细胞内c a 卜的变化情况。2 0 0 8 年p a u lc hl i 课题组以白血病细胞 为例，研究了多药耐药细胞的曲物输送机制，提出一种“微流控匕片分析同细 胞”的方法。刘定位后的同一个白血瘸细胞进行药物刺激和药物抑制研究，与传 山东师范大学硕士学位论文 统的流式细胞仪分析细胞的多药耐药相比，泼方法只需要少量的细胞大大节省 了时间，简化了细胞操纵和荧光信号采集步骤，进一步可以研究细胞时间依靠的 药物动力学输送和细胞形态分析( f i gl o ) 。 程介克研究组件i 在芯片上使用流体重力驱动单个细胞，将细胞定位在微池内。 另一通道引入刺激剂，采用碳纤维电极测定了单个p c i 2 细胞中神经递质多巴脓 量子释放。 沪爵 f i g u r e9d e s i g nl a y o u to ft h em i e r o f l u i d i cc h i pw ，w i d t hl ，l e n g t l l ( i ni l m ) t h e w i d t h so fc h a n n e l s1a n d2a r e5 0f m m a dt h a to fc h a n n e l3i s1 0p mt h ei n s e t s h o w st h ed i m e n s i o no f t h ec e l lr e t e n t i o ns t r u c t u r ea l ls p e c i f i c a t i o n sa r et h o s eo nt h e p h o t o m a s k b e f o r ew e te t c h 山东师范大学硕士学位论文 - 誓一= ，剑 红y 。尸i 套 f i g u r e1 0l a y o u to ft h em i c r o f i u i d i cc h i p ( a ) t h es c h e m a t i c so ft h em i c r o f l u i d i c c h i pc o n s i s t i n go f3 s o l u t i o nr e s e r v o i r sa n dac e l lr e t e n t i o ns t r u c t u r e ，w i t ht h e d i m e n s i o n s ( i nl a m ) s h o w ni nt h ei n s e t ( b ) a ni m a g eo f t h em i c r o c h i pf i l l e dw i t har e d f o o dd y eac a n a d i a nd i m e ( 1 0c e n t s ) w a sp l a c e do nt h ec h i pf o rs i z ec o m p a r i s o n ( c ) a n i m a g eo f ar e t a i n e d l i v es i n g l ec e m v l bc e l l ，a ss t a i n e db y f i u o r e s c e i nd i a c e t a t e ( 2 5g m ) t h es c a l e b a r i s5 0 m 介电电泳是另一种常用的操纵和分类细胞的方法( f i g1 1 ) 。其主要利用粒子或 细胞与外部溶被环境不同的介电特性( 电率和介电常数l ，同时利用非均匀交流电 场，使粒子产生非均匀的诱导偶极，粒子受电场力的作用将会向高或低的场强移 动，从而实现细胞或粒子的操纵和分类”1 。细胞含有大量的有机分子和无机盐离 子，在非均匀场强下细胞容易被极化，而且不同种类的细胞由于形状、结构和膜 的通透性不同而具有不同的介电性质，利用这些性质可以对细胞进行分类和操 纵，细胞经过这类电场作用后，其生长投分裂性质不会改变。通常，施加于细胞 的介电泳力很小，单独依靠介电力量很难实现细胞的操纵，与其它方法如：流体 动力细胞或微粒重力等结合使用，可以达到更佳的细胞操纵分类效果。另外， 介电涮j 属于非接触式操控且工作电压低，所以对细胞、会具有破坏性，卧论 细胞本身是否具有电性皆可适用。 山东师范大学硕士学位论文 f i g 1 l 介电电泳微电极原理 a 底层电极；b 一绝缘层；c 上层电极；d 一细胞；1 一1 0 为电极阵列 虽近，v o l d m a n 4 6 4 7 瞎课题组又构建了柱状电极和上下对称电极等三维电极。 其中ht o ms o h 研究组构建了一三维介电电泳操纵分类酵母细胞芯片。将对 电极分别沉积在上下基片上，用不同粒径的聚苯乙烯荧光微球标记酵母细胞来构 成粒径不等具有介电响应的微粒，采用的缓冲溶液为：0i xp b s ，1 b s a + 2 0 甘油，谈缓冲体系下溶液的介电能力大于标记细胞的介电能力，细胞受到负向介 电泳，向远离f 巳极方向运动。在介电泳力和连续流的台力作用f ，细胞因受到力 的大小方向不同而产生不同偏转角度，从而实现对酵母细胞分类( f i g1 2 ) 。该课 题组9 1 又同步化处理人类胸腺导管癌细胞，根据有丝分离不同阶段细胞粒径的差 异，在构建的缓冲体系中，细胞受到太小和方向不同的负向介电泳力，根据受力 后运动的方向不同而分类。与生物学常用的使细胞同步化方法相比该细咆分类 法更温和，对细胞的活性的损伤更小。h u 等i ”1 也设计了一种三维介电电泳芯片， 通道上下表面蚀对称的线性电极。在介电场作用力和连续流作用下标记有介 电响应的细胞受到较强的负向介电力作用而偏离流体方向进入中l 副细胞收集通 道。采用该法极大地提高了分选的灵敏度和通量，每秒分选1 0 4 个细胞，回收率 达9 5 。 山东师范大学硕士学位论文 f i g u r e 1 2 a ：实验装置示意图：b ：分类原理示意图 光钳或光学阱( o p t i c a lt r a p p i n g ) 是指采用光的力量使流体中细胞或其它粒子在 运动过程中发生偏转，一束激光经过聚焦后它的辐射压力可以抓住微小的颗粒， 其至将其移到指定的某个空间位置。由于光钳每次只能对一个细胞进行操纵因 此工作量大、耗时长。j o e l v o d m a n 研究组口”设计了一种激光光镊系统用于细胞 的筛选。利用注射泵产生的流体动力推动细胞在通道里流动，在通道底部设置陷 阱捕获细胞，然后通过激光光镊挑选目标细胞，f i g1 3 为激光光镊“