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糖蜜酒精废液酚类物的分离及其抗氧化活性的研究 摘要 糖蜜酒精废液是一种高浓度有机废水，它含有较多的色素，这 种色素颜色深、难于降解，是造成废液中c o d 、b o d 含量高的主要 原因。然而糖蜜酒精废液色素是一种天然色素，是甘蔗生长和制糖 加工过程中逐步产生的一种混合色素，主要包括酚类色素、焦糖色 素和美拉德色素等。其中的酚类色素是一种多酚类物质，它具有一 定的抗氧化活性，有很高的经济价值，可以作为一种天然抗氧化剂， 广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。因此，研究从酒精废液色 素中分离出酚类色素，既可以降低酒精废液对环境的污染，又可以 回收有价值的资源，降低治理污染的成本，一举两得。本课题研究 的主要内容与相关结论如下： 1 研究乙醇对酒精废液酚类色素粉末的提取粗酚类色素的效 果，通过单因素及正交实验表明，最佳条件是乙醇浓度9 5 、温度 5 0 。c ，固液比为1 ：1 5 ，时间为1 h ，浸提次数为3 次。 2 采用膜分离、聚酰胺树脂分离的方法对酚类色素样品进行纯 化。通过分级膜纯化试验发现，分子量处于3 0 0 d - 8 0 0 d 的截留物 中酚类色素含量最高，属于强抗氧化成分。通过聚酰胺树脂纯化试 验，可知最佳纯化条件是：室温，吸附时间7 0 m i n ，聚酰胺目数6 0 - 8 0 目，洗脱液9 0 乙醇，1 9 树脂最多能吸附9 0 5 m g 酚类物。 3 通过四种不同的体系( 油脂、o h 、d p p h 、亚油酸) ，研究 了酒精废液酚类色素的抗氧化活性，结果表明试样a 、b 都有抗氧 化活性。在油脂体系中，抗氧化活性大小关系为：v c 试样b 试 样a 。在o h 体系中，抗氧化活性大小关系为：试样b v c 试样 a ，且当试样浓度超过1 6 m g m l 时，清除o h 的能力逐渐趋于稳定。 在d p p h 体系中，对自由基的清除效果为：v c 试样b 试样a ， 最佳反应时间是3 0 m i n ，最佳p h 5 。在亚油酸体系中，抗氧化能力 为：v c 试样b 试样a ，且v c 的抗氧化能力远大于试样a 和试样 b 。 4 紫外检测显示，分离物都具有类黄酮类结构；红外光谱检测显 示分离物都含有o h 、苯环、c = o ，具有酚类化合物的典型谱图特征； 高效液相分析显示，分离物b l 可能含有没食子酸、芦丁、绿原酸， 分离物b 2 含有没食子酸、槲皮素、儿茶素、绿原酸，且分离物b 1 中黄酮含量较多，分离物b 2 中黄酮苷含量较多。 关键词：酒精废液酚类色素提取纯化抗氧化活性 s t u d yo ne x t r a c t i o na n da n t i o d a n to f p o l y p h e n o lf r o mm o l a ss e s a l c o h o lw a s t e 馅t e r a bs t r a c t a l c o h o lw a s t e w a t e ri sah i g h c o n c e n t r a t i o no r g a n i cw a s t e w a t e r w i t h p i g m e n t s t h e c o l o u ro fp i g m e n t si s v e r yd e e p ，v e r yh a r d l y d e g r a d n e d ，a n di ti st h ei m p o r t a n tr e a s o nt h a tc o d a n db o di ss oh i g h i na l c o h o lw a s t e w a t e r t h ep i g m e n tf r o mm o l a s s e sa l c o h o lw a s t e w a t e ri s an a t u r a lp i g m e n t ，w h i c hi sf o r m e da n da c c u m u l a t e di nt h es u g a rg r o w i n g a n dp r o c e s s i n g i ti n c l u d e sp o l y p h e n o lp i g m e n t ，c a r a m e lp i g m e n ta n d m a i l l a r dp i g m e n t i ti s r e p o r t e d t h a t p o l y p h e n o lp i g m e n th a st h e a n t i o x i d a n ta c t i v i t ya n di su s e da san a t u r ea n t i o x i d a n t ，w h i c hi su s e d g e n e r a l l ym u c hv o c a t i o n ( f o o d ，m e d i c i n e ，c o s m e t i c s ) s oi ti si m p o r t a n tt o e x t r a c tp o l y p h e n o lp i g m e n tf r o ma l c o h o lw a s t e w a t e r i ti sa d v a n t a g e o u s f o ru st os o l v ep o l l u t i o np r o b l e mw h e na t t a i nt h ea n t i o x i d a n tw i t hh i g h a d d i t i o n a lv a l u e t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa n dr e s u l t so ft h i st h e s i sa r e r e p o r t e da sf o l l o w i n g ： m 1 t h ee x t r a c t i n gr e s u l to fa l c o h o lw a ss t u d i e do np o w d e r yp i g m e n t f r o ma l c o h o lw a s t e w a t e r b yt h eo n ef a c t o ra n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t ， t h eb e s te x t r a c t i n gc o n d i t i o ni s ：9 5 a q u e o u se t h a n o l ，t e m p e r a t u r e5 0 。c ， r a t i oo f l i q u i d s o l i da s1 ：1 5 ，t i m el h ，d e g r e e3 2 t h e s a m p l e sw e r es e p a r a t e da n dp u r i f i e dw i t hm e m b r a n ea n d p o l y a m i d e b ym e m b r a b ee x p e r i m e n t ，i tw a sf o u n dt h a t3 0 0 d - - 8 0 0 d g r o u ph a ds t r o n g e s ta n t i o x i d a n ta c t i v i t y b yp o l y a m i d ee x p e r i m e n tt h e b e s tp u r i f i c a t i o nc o n d i t i o ni s ：t e m p e r a t u r e4 0 * ( 2 ，a d s o r p t i o nt i m e3 0 m i n ， 6 0 8 0o r d e r sp o l y a m i d e ，9 0 e t h n o ls o l u t i o n d e s o r p t i o n ，t h el a r g e a d s o r p t i o nc a p a c i t yw a s9 0 5 m gp e rp o l y a m i d e 3 t h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fs a m p l e sw a ss t u d i e db yf o u rd i f f e r e n t s y s t e m ( o i l ，o h ，d p p h a n dl i n o l e i ca c i d ) t h e r e s u l ts h o w e dt h a t s a m p l e sh a dc e r t a i na n t i o x i d a n ta c t i v i t y i n a l ls y s t e mt h e a n t i o x i d a n t a c t i v i t y o ft h es a m p l eaw a sl e s s p o w e rt h a nt h es a m p l eb t h e i r a n t i o x i d a n ta c t i v i t ye n h a n c e dw i t ha d d i n go fc o n c e n t r a t i o n 4 t h ed e t e c t i o no fu vs h o w e dt h a ts a m p l e sc o n t a i n e df l a v o n o i d s t h ed e t e c t i o no fi rs h o w e dt h a t s a m p l e s c o n t a i n e d h y d r o x y , p h e n y l ，c a r b o n y la n dh a dt y p i c a lc h a r a c t e rs p e c t r u mo fp h e n o l c o m p o u n d t h ed e t e c t i o no fh p l cs h o w e dt h a ts a m p l e sc o n t a i n e d d i f f e r e n t m a t t e r s s a m p l e b1c o n t a i n e d g a l i ca c i d ，r u t i n ，c h l o r o g e n i c a c i d ，w h i l es a m p l eb 2c o n t a i n e dg a l i ca c i d ，q u e r c e t i n ，c a t e c h i na n d c h l o r o g e n i ca c i d s a m p l eb 1c o n t a i n e dm o r ef l a v o n e ，w h i l es a m p l eb 2 c o n t a i n e dm o r ef l a v o n i dg l y c o s i d e k e yw o r d s ：a l c o h o lw a s t e w a t e r ；p h e n o l i cp i g m e n t ；e x t r a c t i o n ； p u r l f i c a t i o n ；a n t i o x i d a n ta c t i v i t y i v 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成 果和相关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表 或使用本论文的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的 研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提 供过重要帮助的个人和集体，均己在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： 经峄疲 加。吕年月缮日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 目即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者躲经稚导师签名孑f 缎7 r ic o 口日 广西大学硕士学位论文糖蜜酒精废液酚类物的分离及其抗氧化活性的研究 第一章绪论帚一早三百t 匕 1 1 糖蜜酒精废液中的色素及其抗氧化活性 糖蜜酒精废液色素是一种天然色素，主要包括焦糖色素、美拉德色素、酚 类色素。在制糖加工的过程中糖受热发生分解而生成了咖啡色的焦糖色素，还 原糖与氨基酸反应则生成了深色的美拉德色素，而酚类色素的生成则是由于原 来甘蔗中的酚类物质在多酚氧化酶和铁离子的作用下生成的深色的酚类色素 【l 】 o 焦糖色素( f o o da d d i l i v ec a r a m e l ) 是当今世界上食用量最大的一种天然食 用色素。1 9 9 8 年下半年统计，焦糖色素占据天然色素总量的7 2 , - - + 8 0 2 1 。我 国焦糖色素g b 8 8 1 7 2 0 0 1 标准中，将焦糖色素和美拉德色素同归为焦糖色素。 酚类色素具有抗氧化活性，但它的成分很复杂。酚类色素中一小部分直接 来源与甘蔗中原有的色素，它是甘蔗中最主要的植物色素，另一部分是在制糖 过程中形成的。目前，甘蔗中已被鉴定的酚类物质有低分子量的酚酸、黄酮类 物质以及一些高分子量的聚合物( 鞣制、单宁) 【3 】。这些酚类物质具有较强的 抗氧化活性，它们在甘蔗中原有的颜色不深，但是在压榨的过程中细胞破碎， 暴露出来的多酚氧化酶同酚类物质发生氧化反应，生成了深色的酚类色素；另 一方面，在后续榨糖过程中酚类物质与铁离子结合形成深色的络合物一酚类色 素。随着工艺的进行，大部分酚类物质最终流入到酒精废液中，这也是酒精废 液色素具有抗氧化活性的原因。 焦糖色素对酸碱度不敏感，颜色较稳定；酚类色素的分子结构中包含一个特 定的共振电子体系，因而它对p h 值较敏感，其色泽随着p h 值的升高而急剧的 降低。酚类色素溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂中，而焦糖色素不易溶于甲醇、 乙醇中。吴振强等人h 1 采用凝胶渗透色谱法测定糖蜜酒精废液色素成分，其分 子量的范围在4 2 2 - - 5 6 2 3 之间，焦糖色素、美拉德色素及酚类色素的平均分子量 分别为2 18 9 、9 8 7 、4 3 9 d a 。韦丰红等人巧1 用d p p h 法测定了甘蔗提取物( 如废 蜜、糖浆、压榨汁) 的抗氧化活性。张吉等人哺1 测定了糖蜜酒精废液中的黄酮物 广西大学硕士学位论文糖蜜酒精废液酚类物的分离及其抗氧化活性的研究 质的含量；王标诗r 刀发现废液色素具有抗氧化活性，并初步鉴定为酚类物质； j o a q u i m 等人陷1 发现甘蔗汁中具有抗氧化活性功能的物质是酚类物质；s a n d r am 四3 等研究了甘蔗酒精中酚类物质的定量分析与对自由基形成和清除的影响； c o o n m b s 等人们发现甘蔗汁中含有较多的绿原酸。 糖蜜酒精废液中色素是造成酒精废液中c o d 、b o d 含量高的主要原因， 也是废液中色素难以降解的原因。酒精废液色素中的焦糖色素是一种天然的食 用色素，可以广泛的应用与食品和饮料的染色工作中；而酚类色素具有较强的 抗氧化活性，可以作为一种天然的抗氧化剂。因此，寻找一种合适的方法将酒 精废液中的色素提取分离开，将具有重要的研究价值，这样既能解决造成的污 染问题，又能可提高其附加值、变废为宝。 1 2 天然抗氧化剂一多酚类化合物 近年来，随着科技的进步以及市场的开发，人们逐渐认识到一种天然的抗 氧化剂一多酚类化合物。这类物质资源丰富、来源范围非常广，既可以作为一 种食品添加剂使用，又对人体有良好的保健功能，它能够预防心脑血管疾病、 消除人体过多的自由基、抗癌、抗衰老、提高机体的免疫力 1 1 3 。这一类化合物 都来源与天然植物，基本上不存在毒副理作用，因此，它们受到市场上广泛的 欢迎。随着研究的深入，多酚类化合物在医学、食品、日用化工等方面表现出 越来越重要的作用。 1 2 1 多酚类化合物的分类 多酚类化合物是指其分子结构中有若干酚羟基的植物成分的总称。 人们习惯将多酚分为两类，一类是单体类多酚，它主要包括各种黄酮类化 合物、绿原酸类、没食子酸和鞣花酸类，也包括一些接有糖苷基的复合类多酚 化合物。另一类则是由单体聚合而成的低聚或多聚体，统称为单宁类物质，包 括原花色素、没食子酸单宁、鞣花单宁等 1 2 3 。现已开发利用的主要的多酚类见 表1 1 1 3 】。 也可根据多酚的应用性质，将其分为两大类。二类是从茶叶、药用植物等 中提取的多酚类化合物，这一类多酚能够有效的抑制致病性细菌、抗氧化、防 2 广西大学硕士学位论文糖蜜酒精废液酚类物的分离及其抗氧化活性的研究 诱变等性质，现已在食品、药品、化妆品工业中得到了广泛的应用；另一类主 要来源与林副产业的植物多酚，其价值不如前一类的百分之一，这类植物多酚 的资源非常丰富，尚未得到充分利用【1 4 1 。 表! - i 多酚类化合物及提取物n 3 1 t a b 1 1p o l y p h e n oa n de x t r a c t i o n 1 3 1 多酚类名称代表物 多酚单体 黄酮( f l a v o n ) 异黄酮( i s o f l a v o n ) 黄酮醇( f l a v o n 0 1 ) 黄烷酮( f l a v o n o n e ) 黄烷醇( f l a v a n 0 1 ) 黄烷酮醇( f l a v a n o n 0 1 ) 花色素苷( a n t h o c y a n i n ) 查儿酮( c h a l c o n e ) 绿原酸( c h l o r o g e n i ca c i d ) 没食子酸( g a l l i ca c i d ) 鞣花酸( e l l a g i ca c i d ) 多酚聚合物 甘草油性提取物，洋葱提取物 大豆异黄酮，油菜籽提取物 杨梅提取物，养麦提取物 柑桔皮提取物 绿茶提取物 松树提取物 蓝梅提取物 花红素 向日葵提取物 月见草提取物 紫地丁提取物 1 2 2 多酚类化合物的性质 水溶性。多酚类化合物的溶解度因结构及存在状态不同而有很大的差异。 一半游离多酚难溶于或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机 溶剂或稀碱液中。其中黄酮、黄酮醇类由于具有平面的分子结构，使水分子难 以进入，故微溶于水；而异黄酮、二氢黄酮则较易溶于水。黄酮苷类一般溶于 水、甲醇、乙醇等极性强的溶剂中，糖的结合位置不同，对苷的水中溶解度也 有一定影响：以棉黄素( 3 ，5 ，7 ，8 ，3 ，4 一六羟基黄酮) 为例，其3 一o 一葡萄糖苷 的水中溶解度大于7 一o 一葡萄糖苷【1 5 】。 弱酸性。多酚类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性水溶 液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。由于酚羟基数目及位置不同，酸性强弱也 不同。而有些酚类物含有梭基c o o h ，它们的酸性较强( 类似一般的有机酸) ，能 在弱酸性下离解。 3 广西大学硕士学位论文糖蜜酒精废液酚类物的分离及其抗氧化活性的研究 对酸碱性较敏感。许多有色多酚类物质，在不同的p h 呈现出不同的颜色。 花色素及其苷元的颜色随p h 不同而改变，一般显红( p h 8 5 ) 等颜色。 多酚类化合物易与蛋白质、生物碱、多糖反应。例如茶叶中的多酚使人感 到涩味【1 6 1 ，薯莨单宁用于丝绸染色【1 刀等，均利用了植物多酚与蛋白质结合的性 质。 多酚类化合物与金属离子的络合。多酚类物质分子中的多个邻位酚羟基结 构，可以作为一种多基配体与金属离子发生络合反应。两个相邻的酚羟基能以 氧负离子的形式与金属离子形成稳定的五元环鳌合物，邻苯三酚结构中的第三 个酚羟基可以促进另外两个酚羟基的离解，从而促进络合物的形成及稳定【1 8 】。 例如制革领域中1 2 l ，用多酚对裸皮进行预鞣，然后用铝盐复鞣，则可以达到良 好的鞣制效果。 多酚类物质的抗氧化性。由于多酚类物质是极好的氢或电子供体，形成的 酚类游离基中间体的共振非定域作用和没有适合分子氧进攻的位置，性质比较 稳定，不会引发新的游离基或者由于链反应而被迅速氧化，同时多酚类物质也 是良好的金属离子螯合剂，因而表现出良好的抗氧化活性【1 9 2 0 l 。分子量较大的 多酚的抗氧化性远较茶多酚、没食子酸等小分子多酚强，多酚的抗氧化性也较 常用的抗氧化剂v e 、v c 强，而且多种抗氧化剂同时存在时还具有协同抗氧化 效应。作为天然的抗氧化剂，多酚类物质在医药、食品、化妆品、电化学等很 多领域被广泛应用。 1 2 3 多酚类化合物的生物活性 大量的研究工作表明，多酚类化合物具有良好的生物活性，能够抗肿瘤、 抗衰老、抗诱变、提高机体免疫力等等。这些生理活性既与多酚和蛋白质、生 物碱、生物大分子、多糖复合有关，又与多酚本身具有较强的清除自由基、抗 衰老有关。多酚通过清除自由基能对自由基诱发的生物大分子损伤起保护的作 用，进而维持细胞膜的流动性和蛋白质的构型和构象，防止辐射诱发的d n a 断裂。因为多酚类物可以与微生物、细菌、病毒的蛋白质结合，使它们丧失活 性，并且多酚与金属离子络合后能抑制微生物代谢酶的活性，所以多酚还具有 优良的抗微生物、抗病毒的能力。长期受到日光中的紫外线照射，会诱发皮肤 4 广西大学硕士学位论文糖蜜酒精废液酚类物的分离及其抗氧化活性的研究 癌等病变，而多酚类物质则可以防止这类病的突发。多酚类物质还可以与酪氨 酸转化酶结合1 2 1 2 2 1 ，从而阻止黑色素的生成，防止雀斑、褐斑的产生。 目前研究最多的是葡萄多酚【2 5 , 2 6 1 。葡萄酒中含有的花色苷、黄酮醇、黄烷 酮醇、儿茶素类、白藜芦醇、原花色素等多酚类物质，具有较强的抗氧化活性， 可以抑制人体低密度脂蛋白( l d l ) 的氧化，从而能够阻碍动脉粥样硬化的形 成，防止由动脉硬化引起的冠心病的发生。 有些粮油作物会存在异味，如大豆制品的豆腥味，而茶多酚则可以有效的 去除这些异味【2 3 l ；戚向阳等对苹果多酚提取物研究发现，苹果多酚具有良好的 抗氧化活性【2 4 】；刘孟军等人对枣和酸枣等1 4 中植物的c a m p ( 环磷酸腺苷) 含量 进行研究，并发现c a m p 具有降血压血脂的功效【2 7 1 。原花青素是由不同数量的 儿茶素或表儿茶素缩和而成，具有抗氧化、抗腹泻、抗癌、抗菌、降血压、清 除自由基及促进毛发生长等多种功效【2 4 】。竹叶提取物具有优良的抗自由基能力 和确凿的类s o d 活性。 据荷兰h e r t o g 等人对7 个国家的免疫学调查，凡黄酮类化合物( 多酚类中 的一类) 的摄入量较多的，患冠状动脉疾病的人和死亡率较低。另据芬兰人 a l d e r c r e u t s 的调查，尿中的黄酮和异黄酮含量高的，乳腺癌等癌症的死亡率较 低。日本人因食用大豆类较多，从大都制品中平均可获得异黄酮1 8 m g d 【2 羽。因 此，对果蔬、豆类消费较少，或者以方便主食为主者，应当摄入多酚类物，以 预防疾病的发生。 1 2 4 多酚类化合物的抗氧化机理 抗氧化剂是指能够清除氧自由基，抑制或消除以及减缓氧化反应的一类物 质。其抗氧化机理主要包括一下几种原因： 1 2 4 1 清除自由基( f r e er a d i c a l ) 自由基是指包含一个未成对电子的原子、原子团或分子。生物体内最常见 的自由基是氧自由基，也就是由基态氧接受电子后形成的自由基。比如，超氧 阴离子自由基( 0 2 ) 、过氧化氢、羟基自由基( o h ) 、n o 自由基、烷氧基自 由基( r o ) 等。h a r m a n 和t a p p e l 研究表明，自由基对肌体的损伤可归纳为四 个方面【2 9 3 0 l ： 一是脂质过氧化而造成的损害。脂质过氧化作用是指不饱和脂肪酸共价键 5 广西大学硕士学位论文糖蜜酒精废液酚类物的分离及其抗氧化活性的研究 上发生的一系列自由基反应； 二是d n a 、r n a 的交联或氧化破坏所造成的损害； 三是蛋白质、氨基酸的氧化破坏或交联而造成的有害变化； 四是自由基对多糖高分子的氧化降解而造成的有害作用。 自由基会夺取蛋白质、脂肪酸、维生素、酶、生物膜等物质中的氢原子， 从而造成细胞结构和功能的破坏。植物多酚含有多个酚羟基，能够提供氢原子 与自由基结合，达到清除自由基的目的，从而保护生物体免受自由基的损伤。 1 2 4 2 螯合金属离子 过渡金属离子在脂类化合物氧化的过程中起着重要的催化剂的作用，过渡 金属离子在价态转化的过程中能够传递电子，缩短链引发期的时间，加速脂质 氧化。有研究表明在亚油酸体系中脂过氧化的启动中f e 2 + 和c u 2 + 都能使含有过 氧化成分的亚油酸进一步过氧化，却不能启动纯的亚油酸的过氧化【3 。而即使 在最新鲜的动物脂中仍然会有极微量的脂质过氧化氢，一旦存在即便是痕量的 过渡金属离子就可以迅速地引发烷氧基的生成。多酚类物质则可以通过螯合这 些过渡金属离子，阻止过渡金属离子与脂质接触，进而达到预防脂质氧化的发 生。 1 2 4 3 清除氧 脂类的氧化主要是指脂类与氧分子的直接反应，称之为“自动氧化”。另有 光敏氧化、和酶氧化。其中最主要的是自动氧化，油脂的变质大部分就是由于 自动氧化造成的。 多酚类物质对活性氧等自由基具有很强的捕捉能力，尤其是具有邻位酚羟 基的多酚，很容易被氧化成醌类结构。因此，多酚类物质可以吸附氧，发生自 身的氧化，从而避免油脂自动氧化的发生。 不同的多酚类物由于具有不同的结构，在抗氧化方面按照不同的方式阻止 或延缓脂质的氧化。 1 2 5 抗氧化活性的评价 抗氧化剂抗氧化活性测定的目的就是最高限度地、客观地反映所测的抗氧 化剂的抗氧化活性。目前，测定抗氧化活性的方法有很多，主要分为脂质过氧 化检测法、清除自由基能力检测法和动物试验。 6 广西大学硕士学位论文糖蜜酒精废液酚类物的分离及其抗氧化活性的研究 1 2 5 1 脂质过氧化检测法 脂质过氧化反应是自由基攻击细胞膜上的多聚不饱和脂肪酸( p u f a ) 而引 发的一系列链式反应【3 2 1 。目前检测脂质过氧化的常用方法有以下3 种。 硫代巴比妥酸( t b a ) 法：脂质过氧化反应的最终产物有丙二醛( m d a ) 。 测定m d a 的含量，在一定程度上可以反映脂质过氧化损伤的程度，m d a 的性 质比较稳定，便于检测，是目前公认的反映脂质过氧化的指标。丙二醛在酸性 条件下可以与硫代巴比妥酸( t b a ) 反应( 室温反应5 h ，不时摇动) 生成红棕 色的三甲川，在5 3 2 n m 处有吸收峰，可以计算出m d a 的量，从而得知脂质过 氧化的情况。为避免过量的氧化物使三甲川退色，可在加入t b a 以前，加入三 氯醋酸或丁基羟基甲苯阻断反应。t b a 法常用于检测受试物是否对生物体系( 如 红细胞、脂蛋白、组织匀浆、肝微粒体、肝线粒体、肝细胞等) 具有抗脂质过 氧化作用。 油脂稳定性试验：油脂中含有很多不饱和脂肪酸，在加热过程中会发生水 解反应、氧化反应等一系列化学变化，使油脂变质。因此测定氧化反应的过氧 化产物的量可以间接反应抗氧化剂的活性。 实验方法为油脂处理，按比例添加抗氧化剂，置于密闭棕色瓶中，在不同 温度下储藏一定时间，定期取样测定过氧化值( p o v ) 。过氧化值的测定可以用 经典的分析化学方法：以淀粉为指示剂，用硫代硫酸钠滴定被氧化的碘化钾。 二烯共轭法：不饱和脂肪酸在氧化过程中会形成共轭双键，这种结构可以 吸收波长为2 3 0 n m - - 一2 3 5 n m 的紫外光，抗氧化剂可以延长形成共轭双键的诱导 时间，利用这个性质可以测定抗氧化剂活性。该法适用于对纯脂的过氧化研究， 但非脂质过氧化会干扰其检测。 1 2 5 2 清除羟基自由基( o h ) 能力的分析检测方法 生命活动的代谢过程所产生的自由基中o h 是体内最活泼的活性氧，氧化 能力极强。能够产生o h 的体系有很多，其中芬顿( f e n t o n ) 体系是最常用的【3 3 1 。 具体试验中，应根据目的和条件的不同，选择不同的体系。 比色法。比色法是利用某些体系在氧化过程中生成o h 自由基，其能与某 些化合物作用，产生具有特定吸收的有色物质，用分光光度计进行测定。产 生o h 的体系主要是芬顿( f e n t o n ) 体系，反应式为：f e 2 + 十h 2 0 _ 2 f e 3 + 十o h 十o h 一，与之类似的可以用c 0 2 + 代替f e 2 + 也会有相同的效果。利用上述体系产 7 广西大学硕士学位论文 糖蜜酒精废液酚类物的分离及其抗氧化活性的研究 生的o h ，可与水杨酸、邻二氮菲、脱氧核糖等在添加适量抗氧化剂的条件下 反应，在各自的吸收范围内测定吸光度值的变化可得到受试抗氧化剂清除o h 的情况。 荧光法。因为o h 具有很强的氧化性，能将c e ”氧化成c e 4 + ，用荧光光度 计( 于5 0 0 n m 处，激发波长为3 3 0 n m ) i 贝l j 定c e 3 + 的荧光强度变化即可间接测定 o h 的产生量。在该体系中加入一定量的抗氧化剂，即可得出抗氧化剂浓度与 清除率之间关系的曲线图。另有文献报道，o h 可与苯甲酸反应生成具有荧光 的羟苯甲酸，荧光光谱的激发波长为3 0 0 n m ，发射光诺为4 0 8 n m ，通过检测羟 苯甲酸的荧光值可以间接测得o h 的生成量。 化学发光法。o h 攻击发光剂，使之氧化发光，发光强度与o h 呈一定得 相依关系，可用抑制发光5 0 的清除剂浓度( i c 5 0 ) 来衡量不同受试物清除o h 的 能力。在v c u 2 + 一酵母一鲁米诺- h 2 0 2 体系中，o h 可使鲁米诺受到激发， 在回到基态时发出光子，在加入抗氧化剂时，由于对o h 的清除作用，发光强 度减弱，因此可以根据发光抑制程度来反映对o h 的清除能力。 1 2 5 3 清除超氧阴离子( 0 2 ) 自由基能力的检测方法 超氧阴离子自由基也是生命活动代谢过程中产生的一种重要的自由基，具 有很强的氧化能力，因此在检验抗氧化物质的活性时经常把清除超氧阴离子自 由基作为其中一个重要的指标阴】。产生超氧阴离子自由基的体系有黄嘌呤一 黄嘌呤氧化酶、碱性d m s o 、甲硫酸非那宗- n a d p h 以及碱性连苯三酚等。 比色法是利用某些体系在氧化或自氧化过程中生成超氧阴离子自由基，其 能与某些化合物作用，产生具有特定吸收的有色物质，用分光光度计进行测定。 受试物若能清除超氧阴离子，则吸光度值发生变化，可间接判断受试物对超氧 阴离子的清除作用。主要包括：连本三酚自氧化法，肾上腺素法，氮蓝四唑法， 化学发光法，电化学法。 1 2 5 4 清除二苯基苦基苯肼自由基( d p p h ) 能力的分析检测方法【3 5 】 l ，l 一二苯基苦基苯肼( 1 ，1 - d i v p h e n y l 一2 - p i c r y l h y d r a z y l ，d p p h ) 是一种 很稳定的以氮为中心的自由基，其结构中含有3 个苯环，1 个氮原子还有1 个 孤对电子，通过检测生物试剂对d p p h 自由基的清除能力可以表示其抗氧化能 力的强弱。若受试物能清除它，则说明它具有降低羟基等自由基和打断脂质过 8 广西大学硕士学位论文 糖蜜酒精废液酚类物的分离及其抗氧化活性的研究 氧化链反应的作用。d p p h 有个单电子，在5 1 7 n m 有强烈的吸收峰，其乙醇水 溶液呈深紫色，加入受试物后，在不同时间测定清除d p p h 而引起吸光度的减 少可以反映其抗氧化能力的强弱。另外，因为该自由基只有一个单电子，也可 以应用电子自旋共振( e s p ) 法来检测，原理与羟基自由基的清除相同。d p p h 法 具有直接、灵敏、快速、简便的优点。 1 2 5 5 检测清除h 2 0 2 能力的方法【3 6 3 7 】 用过氧化物酶催化东莨菪原被h 2 0 2 氧化生成非荧光产物。将受试物加入该 反应体系，检测非荧光物质的生成情况，以了解受试物同h 2 0 2 反应的情况。必 须注意受试物本身应不是过氧化物酶的底物，可通过在过氧化物酶h 2 0 2 混合物 中加受试物后，观测吸收光谱的变化来测知。如果受试物可与过氧化物酶反应， 光谱会出现很明显的变化；0 2 。可与过氧化物酶反应使检测h 2 0 2 受影响，为避 免之，可加入超氧化物歧化酶( s o d ) 清除0 2 。如果受试物会干扰上述系统， 则可用酸化的高锰酸钾滴定法来测受试物对h 2 0 2 的清除作用或将含有缓冲液 及大量过氧化氢酶的反应混合物注入0 2 电极，通过测0 2 的释放( 1 m o l 0 2 相当于 2 m o l h 2 0 2 ) 来测受试物对h 2 0 2 的清除作用。 1 2 5 6 动物实验 人体自由基代谢酶类包括超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、谷胱 甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 等t 3 引。体内抗氧化试验通常为受试物喂养或注射动物 一段时间，处死动物后测定血液或组织中的s o d 、c a t 、g s h p x 的含量，若 含量升高则说明受试物具有抗氧化能力。也可以测定m d a 或单胺氧化酶 ( m a o b ) 的含量，若含量降低，则同样可以说明其具有抗氧化能力。 1 2 6 天然产物的提取分离及鉴定的方法 1 2 6 1 天然产物的提取分离 从动植物体内提取具有生物活性的有效成分的方法有很多，目前采用的主 要有t 溶剂萃取法、沉淀法、树脂吸附法、膜技术纯化法、超临界萃取法、超 声法、微波法等1 1 4 3 9 柏1 。 溶剂萃取法：该方法是一种传统的提取工艺。根据天然产物中各种有效成 分在溶剂中溶解度的不同，将活性成分与杂质分开，可达到精制纯化目的。例 如植物叶子的醇浸液，可用石油醚处理，以便除去叶绿素、胡萝b 素等脂溶性 9 广西大学硕士学位论文糖蜜酒精废液酚类物的分离及其抗氧化活性的研究 色素。而某些提取物的水溶液经浓缩后则可加入多倍量浓醇，以沉淀除去蛋白 质、多糖类等水溶性杂质。常用溶剂的极性强弱顺序可表示如下：石油醚( 低 沸点一高沸点) 四氯化碳 二氯乙烷 苯 二氯甲烷 氯仿 乙醚 乙酸乙 酯 丙酮 乙醇 c d ，即乙醇浓 度、温度、固液比、时间，得到最佳提取方案为a 3 8 3 c 2 d l 。因此确定最佳浸提 条件为乙醇浓度9 5 ，温度5 0 ，固液比为l ：1 5 ，时间为1 h 。 2 4 8 添加回收实验 分别取色素粉末数份，分别添加适量芦丁标样，置于摇床上振荡1 0 m i n 后， 测定总酚含量，以加标测得量减去芦丁标样含量，除以加标量，计算回收率。 由表2 5 分析可知，该实验具有良好的回收率，系统误差较低。 表4 - 2 加标回收实验结果 ! 垒! ：! ：兰垦呈! 旦! 12 1 堡! ! 璺i 翌呈圣仑宝盟巴兰翌! 翟液中( r a g 总酚) 加标量( m g ) 测富量 回收率( )平均回收率( ) 2 4 9 在最佳条件下提取酚类色素 根据单因素及正交实验得出的最佳条件，提取酚类色素，结果见表4 3 。 由表4 3 分析可知，标准条件下乙醇的平均提取率是8 9 6 5 ，原料中的酚 类物质得到最大程度的浸提，提取物中多酚的含量在4 3 左右。 表4 3 标准条件下的提取效果 t a b r e s u l to fe x t r a c t i o no ns t a n d a r dc o n d i t i o n 广西大学硕士学位论文糖蜜酒精废液酚类物的分离及其抗氧化活性的研究 2 4 1 0 酚类色素水溶性试验 4 5 4 3 5 8 3 窝 9e 七。 墨 2 q1 5 1 0 5 0 2 0 02 5 03 0 03 5 04 0 0 w 翁e k n 豇缸n ) 图2 6 不同浓度试样的紫外可见谱图 f i g 2 - 6s c a n n i n gf i g u r eo fu vv i s i b l el i g h to nd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s a 添加5 提取物；b 原色素溶液；c 提取酚类色素后的溶液：d 添加1 0 将提取的酚类色素按照0 、5 、1 0 的比例添加到原色素水溶液中，观察酚 类色素溶解性，并在2 0 0 - - 4 0 0 n m 之间扫描图谱。 由图2 - 6 分析可知，高浓度的乙醇提取的酚类色素能够完全溶解与水中， 在提取前后酚类色素的溶解性没有发生变化，结构谱图一致，即物质的结构没 有发生变化；提取酚类色素后剩余的溶液在紫外区没有明显的吸收峰，可见酒 精废液在紫外区有峰吸收主要是由于酚类色素引起。 2 4 1 1 酚类物的定性鉴定 用三氯化铁、香草醛、明胶、对氨基苯磺酸、锌粉、三氯化铝等定性检验 试剂对分离的糖蜜酒精色素试样进行鉴定，鉴定色素试样是否是酚类色素，同 时鉴定色素试样中的酚类成分。结果见表1 ： 由表l 可知：在色素试样中加入三氯化铁后，溶液颜色加深，由原来的浅 黄色变成紫红色，可知该色素中含有酚类色素；香草醛试验可知色素试样在滴 加香草醛盐酸后出现红色斑点，说明试样有多元酚存在；氯化钠明胶试验显 示色素试样中含有鞣质；对氨基苯磺酸试验显示色素中含有一定量的多酚类物 质；盐酸锌粉试验显示色素中含有黄酮类物质；浓氨水实验显示提取物中含有 黄酮类物质；三氯化铝试验显示色素中含有黄酮苷类物质。由于鞣质、黄酮都 2 4 广西大学硕士学位论文糖蜜酒精废液酚类物的分离及其抗氧化活性的研究 属于特殊的酚类物质，所以该色素属于酚类色素。 表4 3 显色反应结果 t a b 4 - 3r e s u l to fe o l o u rr e a c t i o ne x p e r i m e n t 2 5 结论 本章节详细的探讨了酒精废液色素中酚类物的提取工艺，为综合利用这一 资源打下理论基础。通过单因素实验以及正交实验得出浸提的最佳条件为乙醇 浓度9 5 ，温度5 0 ，固液比为l ：1 5 ，时间为l h ，浸提次数为3 次。在最佳 条件下，乙醇的提取率是8 9 6 5 ，提取物中酚类物质的质量分数是4 3 左右。 高浓度的乙醇浸提后的酚类色素能够完全溶解在水中，且酚类色素的分子结构 没有发生变化，酒精废液在紫外区的吸收主要是由于酚类色素吸收引起。乙醇 提取的色素物定性试验显示，该提取物含有黄酮、鞣质、多元酚、黄酮苷类等 酚类物质。 广西大学硕士学位论文糖蜜酒精废液酚类物的分离及其抗氧化活性的研究 第三章酚类色素的纯化 糖蜜酒精废液色素中的酚类色素具有较强的抗氧化活性，但是由于废液的 成分较复杂，利用乙醇提取的酚类色素的纯度不够高，故必需对酚类色素进行 纯化。目前，常用的分离纯化方法有很多，主要包括沉淀法嘲1 、酸碱法嘲1 、 吸附法6 如、层析法张6 5 3 、超临界流体法舔6 7 、超滤法 4 0 j 。 膜分离技术的大规模应用是从2 0 世纪6 0 年代的海水淡化工程开始的。目 前除了大规模应用于淡化海水及纯水、超纯水的生产外，还涉及到食品加工、 饮料、医药、环保等行业。在天然产物提取行业主要采用微滤、超滤、纳滤、 反渗透、透析、气体膜分离等技术。这种技术能够针对性的保留有效成分，使 小分子物质透过，而大分子物质如多糖、蛋白质、胶体、细菌残核等不能透过， 从而达到分离、纯化的目的。该方法操作方便，效率高，无二次污染，是一种 新型的分离手段。本实验首次采用膜技术纯化酚类色素，并检测膜技术对酚类 物的分离效果。 聚酰胺树脂针对酚类物质具有较强的吸附性，聚酰胺分子中的酰胺基与酚 类物质上酚羟基形成氢键缔合而产生吸附。吸附的强度取决于羟基的数目和位 置，溶剂与化合物或者溶剂与聚酰胺之间形成的氢键的缔合能力。聚酰胺与酚 类物质形成的氢键缔合的能力在水中最强，在含水醇中则随着醇浓度的增高而： 相应减弱，在高浓度醇或者其它有机溶剂中则几乎不缔合。故在聚酰胺柱色谱 柱分离时，通常采用水法装柱，样品也尽可能做成水溶液上柱以利于聚酰胺对 酚类物质的充分吸附，随后采用不同浓度的含水醇洗脱，并不断提高醇的浓度， 逐步增强从柱上洗脱物质的能力。故本实验采用水样上柱，不同浓度的乙醇进 行洗脱。 3 1 实验材料 糖蜜酒精废液酚类色素浓缩液( 第二章制备) 、乙醇、氢氧化钠、乙酸 柱层析聚酰胺( 尼龙6 ) ( 浙江省台州市路桥四甲厂) 广西大学硕士学位论文糖蜜酒精废液酚类物的分离及其抗氧化活性的研究 卷式膜小型实验机( 大连屹东膜工程有限公司) u v - 2 5 0 1p c 紫外可见分光光度计( 日本岛津公司) r e 5 2 a a 旋转蒸发仪( 上海亚荣生化仪器厂) f d 1 c e 冷冻干燥机( 郑州长城科工贸有限公司) s b b 9 5 a 循环水式多用真空泵( 郑州长城科工贸有限公司) b p 2 1 0 s 电子分析天平( 德国) u v - 2 8 0 2 h 型紫外可见分光光度计( u n i c o ( 上海) 仪器有限公司) b s z 1 0 0 自动部分收集器( 上海沪西分