（农产品加工及贮藏工程专业论文）怀槐培养细胞生产异黄酮的条件优化与控制.pdf

铎撬培养缫脆生产异黄酮的条件优化与控铡 摘要 怀槐是我国珍贵的野生药用植物，资源稀少，其药用成分异黄酮具有显著的 保肝、抗肿瘤、抗氧化及防治骨质疏松镎药理活性。为了通过怀槐细胞的大规模 嫱养生产怀攘器黄酮实瑰怀槐药用资溺的可持续剥用，本论文对怀槐培养细胞生 产异黄磊豹爨浮条件送行了侥伲控翻研究，并在l o 秀气秀式生貔反应器中避罨亍 了试验。 在单因綮实验确定影响怀槐细胞生产异黄酮的主要培养基组分和作用浓度 藏基懿墓稿上，采用a n n s ( 久工享孛经潮络) 缝合r a g a ( 实数编鹚鸯嚣遮遗传雾 法) 对培养基组成进行全局寻优。建立豹优化模型礁确性高，依赖模型由r a g a 全局寻优获得的最佳培养撼组合是1 4 9 6 8m g l ( n h ) 2 s 0 4 、2 9 3 6 1 0m g lk n 0 3 、 0 0 1m g l2 ，4 ，d 狸0 1 9m g l6 一b a ，染誊喜本素产率达到1 4 1 3m g l ， e 优化前掇 离1 8 国9 倍，跫正交试验饶讫静2 5 4 嫠，表爨运雳该方法霞诧悔魏纲施舍藏舅黄 酮的培养条件是可行的，优化后的培养撼可以使怀槐细胞异黄酮合成能力有很大 的提高。 建立芗怀攘蘩您悬浮麓莠续稿化麓力学模型。该模壁班垮养爨中戆碳滚慧瓣 在胞外分解以及分解产物在胞内的代谢为建模依据，考察了脆内外的蔗糖代谢、 _ | j 6 i 内结构组分变化、胞内中间组分的变化、细胞呼吸损失以及胞内外染料木素的 合成情况。通过运用r u n g e 。k u t t a 法对模型进行参数浓解，并运用非线性最优化 p o w e l l 共辗方囊法对蒺登参数送行霞纯，确立了模蘩豹最貔参数缀合。该模鳌与 露验数据具有较好的符合性，通过模型可以直观的预测细胞生长、呼吸以及次生 代谢产物染料木素合成，对怀槐细胞悬浮培养具有很好的指导性。 研究了激发对怀槐悬浮培养细胞生长、染料本豢合成及其产率的影响，发现 2 5 对怀捷编缒染耩本素合或最有翻，2 8 对绥藏生长最爵，澄发低于2 5 对 于细胞生长和产物合成均不利。结合温度对细胞生长和染料木索合成的动态考 察，制定出在培养前9 天控制培养温度为2 8 。c ，自培养第9 天，调节培养温度 为2 5 ，壹至培莠到筻1 2 天的怀撬悬浮跨养缨照抉遽，圭长帮染料术素毫效台娥 的分阶段温度控策略，饺缁驻染料本豢产率分期比2 5 和2 8 遗续培养时携商 1 1 4 和2 5 0 倍。反应器验证试验表明，通过分阶段温度调控培养，平均染料术 索产率达到了2 6 。6 6m g l 。 荧键谣：悔穗悬浮蘩养羚黄酮入王辑经溺络实数编羁麴遮遗传算法缭 构化动力学模型温度调控气升式生物反成器 o p t i m i z a t i o na n dc o n t r o lo fc u l t u r ec o n d i t i o n f o ri s o f l a v o n ep r o d u c t i o no fm a a c k i aa m u r e n s i st h r o u g hp l a n t c e l le n g i n e e r i n g a b s t r a c t m a a c k i aa m u r e n s i s ap r e c i o u sw i l dm e d i c i n a lp l a n ti nc h i n a i sk n o w nf o ri t sf u n c t i o n a l e l e m e n ti s o f l a v o n e s ，w h i c hh a v em a r k e dp h a r m a c o l o g i c a le f f e c t s ，s u c ha sh e p a t o p r o t e c t i o n ，a n t i t u m o r , a n t i o x i d a t i o na n do s t e o p o r o s i si n h i b i t i o n h o w e v e r , i ti sb e c o m i n ge x h a u s t e d i no r d e rt op r o v i d ea f o u n d a t i o nf o rs u s t a i n a b l eu t i l i z a t i o no f t h em e d i c i n a lm e t a b o l i t er e s o u r c eo f ma m u r e n s i st h r o u g h p l a n tc e l le n g i n e e r i n go nal a r g es c a l e ，t h i st h e s i sa i m e da to p t i m i z i n ga n dc o n t r o l l i n gc u l t u r e c o n d i t i o nf o rj s o f i a v o n ep r o d u c t i o no fm a a c k i aa m u r e n s i ss u s p e n s i o ne e l lc u l t u r e s f u r t h e r m o r e t h eo b t a i n e dc u l t u r ec o n d i t i o n sw e r ev a l u a t e db yc u l t u r i n gc e l l si n1 0la i r - l i f tb i o r e a c t o r o nt h eb a s i so fs i n g e r f a c t o lo p t i m a lm e d i u mf o ri s o f l a v o n ep r o d u c t i o ni nm a a e k i a a m u r e n s i ss u s p e n s i o nc e l l sh a sb e e nd e v e l o p e dt h r o u g h 也ea r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r k sr a n n s ) a n d t h er e a lc o d i n gb a s e da c c e l e r a t i n gg e n e t i ca l g o r i t h m ( r a g a ) a c c o r d i n gt ot h ep r e d i c t i o no ft h e m o d e l ，t h eo p t i m u mc o m b i n a t i o no f f o u rf a c t o r sf o rg e n i s t e i np r o d u c t i o nw a so b t a i n e da sf o l l o w s ： 1 4 96 8m g lo f ( n h ) 2 s 0 4 ，2 9 3 6 1 0m g lo f k n o s ，o 0 1m g lo f 2 ，4 一da n d0 1 9m g lo f 6 - b a ， r e s p e c t i v e l y t h ey i e l do fg e n i s t e i nu n d e rt h i sc o m b i n a t i o na m o u n t e dt o1 4 1 3m g l b u tt h e r e s u l to fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t so n l ya r r i v e d5 7 6m e f l ，a n di t sr e l a t i v ee r r o rb e t w e e n e x p e r i m e n t a lv a l u ea n dp r e d i c t i v ev a l u ew a s7 3 8 t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h i sm o d e lw a s f e a s i b l ef o ro p t i m i z i n gm e d i u mc o m p o n e n t si nm a a c 舫aa m u r e n s i se e l lc u l t u r e a c c o r d i n gt oi nv i t r oa n di nv i v om e t a b o l i s mo fs u c r o s ei nc u l t u r em e d i u m as t r u c t u r e d k i n e t i cm o d e l ，w h i c hd e s c r i b e dt h ec e l lg r o w t h ，s u c r o s eu p t a k e ，s t r u c t u r ec o m p o n e n t sp r o d u c t i o n ， i n t e r m e d i a t em a t t e rc h a n g e s ，c e l lr e s p i r a t i o nl o s sa n ds e c o n d a r ym e t a b o l i t ep r o d u c t i o n ，h a sb e e n f o r m u l a t e da n da p p l i e dt ob a t c hs u s p e n s i o nc u l t u r eo fm a a c h aa m u r e n s i sc e l l s b ym e t h o d so f r u n g e k u t t aa n dn o - l i n e a rp o w e l lt og a i na n do p t i m i z ep a r a m e t e r s ，t h eb e s tc o m b i n a t i o nw a s o b t a i n e d t h er e s u l t ss h o w e da h i g hf i tb e t w e e nt h ee x p e r i m e n t a ld a t aa n dt h em o d e la n dc a nb e e n u s e dt op r e d i c tg r o w t ha n di s o t l a v o n ep r o d u c t i o no f m a a c m aa m u r e n s i sc u l t u r e dc e l l s e f f e c to ft e m p e r a t u r eo nc e l lg r o w t ha n dg e n e s t e i np r o d u c t i o ni nc e l ls u s p e n s i o nc u l t u r e so f m a a c k i aa m u r e n s i sw a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a t2 5 cw a ss u i t a b l ef o rg e n i s t e i n a c c u m u l a t i o na n d2 8 f o rc e l lg r o w t h a c c o r d i n gt ok i n e t i cc h a n g e so f c e l lg r o w t ha n dg e n i s t e i n p r o d u c t i o na td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e s ，t h ec u l t u r et e m p e r a t u r es h i f tf r o m2 8 。cf o rt h ef i r s tn i n e d a y st o2 5 。cf o ra n o t h e r3d a y sw a sa p p l i e d i tw a sf o u n dt h a tg e n i s t e i np r o d u c t i o nw a s1 1 4a n d 2 5 0 - f o l dh i g h e rt h a nt h a to b t a i n e da t2 5 。ca n d2 8 。c ，r e s p e c t i v e l y e x p e r i m e n ti n1 0la i r - l i f t b i o r e a c t o rs h o w e dt h a tg e n e s i t e i np r o d u c t i o no fc u l t u r e dc e l l sc o u l dr e a c h2 6 6 6m g f lb yt h e t e m p e r a t u r es h i f to p e r a t i o n k e yw o r d s ：m a a e k i aa m u r e n s i s , s u s p e n s i o nc u l t u r e ，i s o f l a v o n e ，a r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r k s ， a c c e l e r a t i n gg e n e t i ca l g o r i t h m ，s t r u c t u r em o d e l ，t e m p e r a t u r es h i f t ，a i r - l i f tb i o r e a c t o r 合肥工业大学 v7 6 6 6 3 本论文硅答辩委员会全体委员审查，确定符合合肥工业大学 硕士学位论文质量要求。 答辩委员会签名： ( 工作单位、职称) 主 吩氡锨寻彳簸 委员：盼耳 强斟 参羲 。汉 力肛捌压扶 ：永彬学 南1 豇住 锚潞锄南、j 按曙 习办业砖考专1 不予主纱 纣 9 插图清单 圈1含有一个隐层的b p 网络结构图 1 2 ， 强2 透转算法框匿1 3 网3a n n s 与r a g a 流程图1 4 图4 磷态氮帮氨恋氢聪悔援生产吴黄醍产率靛影响1 5 图5 ：生长素对怀槐细胞生产鼎黄酮产率的影响1 6 图6 细胞分裂索对怀槐细胞生产异黄酮产率的影响1 6 翮7 a n n s 。r a g 模型过程训练误差下降曲线1 8 图8 a n n s r a g 建模实验值与模型计算值比较1 8 瓣9 基于藉 游豹悔楗缨憨爨浮壤莠结构能动力学模型示爨强2 3 圈1 0 细胞培养过程中碳源代谢的模型曲线与实验值比较2 6 阁1 1 模型参数求解与优化流樱图2 7 黼1 2 细您培养过程中施内结构组分和中间物厦代游的模型曲线与实验值魄铰2 7 蹦】3 细胞培养过程中细胞呼吸捐失的模型曲与实验值比较2 8 强1 4 缨麓培养过程孛庭内努袋精本素窘成静模型莲线与实验傣 e 较2 9 图1 5 细胞培养过程中细胞沉降体积与细胞收获千重的模型曲与实验值比较2 9 阁1 6 不同温度下怀槐细胞生长的时问过程曲线3 3 阁1 7 不同温浚下怀槐纲施染辩本素含量的时间过程曲线3 3 圈1 8 不同温度下怀槐细胞染料木素产率的时间过程曲线3 4 强1 9 不嗣温发1 f 悔撬缀憨跑生长速率魏对潮避程夔线3 4 图2 0 不同温度下怀槐细胞染料木素比台成速率的时问过程娃扫线3 5 圈2 l 不同温度下怀槐细胞染料木素比产率的时闻过程蓝线3 5 翻2 2 温度优他衙怀槐细胞豹生长、异黄酮合成及其产率3 6 图2 3 反应器操作及控制系统3 7 表格清单 表1 植物细胞培养过程中物理因素的优化控制2 表2 植物细胞培养过程中化学因素的优化控制4 表3 植物细胞培养相关模型7 表4 正交实验方案及结果1 7 表5 正交实验结果分析1 7 表6 培养基优化前后细胞生产染料木素的比较1 9 表7 实验测定值与模型预测值比较1 9 表8 结构化动力学模型参数3 0 表9 不同温度下怀槐细胞悬浮培养参数比较3 7 表1 0 温度优化前后怀槐细胞生物反应器培养相关参数比较3 7 独创性声明 本久声鹗掰曼交熬学霞论文是本人在导瘴指导下述行熬溪究工传盈墩褥瓣褒究藏栗。懿 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包宙其他人已畿发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获得愈g b 王些太璧或其他教育机构的学位或证粥而使用过的材 粒。与我一嗣王俸鲍同志对本辑究所骰斡经键嚣麸均己在论文孛搏了明确瓣说明荠表示谢 意。 学经论文作者签名：签字鑫赣：年鸯霆 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解垒a 里至些塞燮有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 ，f ：向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权愈 熬薹丝盍堂可阻将学位论文的全帮或部分内容编天有关数据疼遘 亍检索，可戳采用影露、 缡印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密腑适用本授权书) 学位论文作者皴名导师然名： 缎字日期：年月日签字日期：年月 旦 擎位论文作者毕、韭后去向： 一l ：作单位 邂讯遗垃： 电话 鄄编 致谢 三年多的硕士学习结束了，圈首自己走过的道路，一点一滴，历历在目。 我鹣论文是在导薅罗建平教授戆悉心拯譬下完藏装。憨努严谨求实豹浍学 精神，精益求精的工作作风，勤触执着的科学德求，令我敬仰，也将成为我永远 的财富。在三年多的学习中，我不仅从导师那擞学到了生物领域丰富的知识，还 在导师的引导下逐渐培养了较强的动手能力、独立解决闻题分亳厅问题的能力以及 一定豹鬈 筝l 力，秘步其备了一个辩研工 乍者殿有戆基本素溪。导薅不仅在学习 上给予我关怀，还在思想上、生活上给予了我夔大的关心，使我时时刻刻感受到 恩师的浓浓师情。我的一点一滴的成长和收获无不凝聚着导师的心血和汗水。在 硬学邂鼗将结泵之躲，我要囱我麴导掇罗建平教授致以最诚挚熬谢意，警繇豹 教诲我将永远铭记予心。 在完成硕士论文期间，我的两位师兄一目前崔安徽省立联院工作的沈国栋和 正在攻读合g 巴工业大学撼士学位鸵整学强一给了我莫大的帮助，在此深深敬表示 感谢。 在实验检测过程中，得到了陈晓燕老师和揉丽丽老师的帮助：在数学建模方 面得到了合肥工业大学金菊良教授和周玉良阉学以及中国科学技术大学的朱忠 奎薄士瓣帮囊，在诧荠表示蓥瀣。 我疆将一份特别的感i 9 f 奉献给我的朋友们和我的全家，在我三年多的硕士生 涯中，他们使我能够克服重重困难，充满信心。如果没有他们的支持，本论文的 完藏霞怒建隘想象熬。 最后，感谢国家自然科学基金( 3 0 1 7 0 0 5 9 ) 对本研究项目的资助。 作者：罗凯 2 0 0 5 年6 月8 强 第一章药周植物细胞培养优化与控镧研究进展 褪物缨煦壤莠始予本邀纪朔，并不可争议地其青工业亿潜力，因为次生代 漆耪建交全在入王控制条 串下蘧褥憨，一年强攀不叛生产，不受地区秘零节限 制，节约土电，便于工业化生产。瓣前德物缁脆培养生产的佬合搦缀多，甑捂 糖类、黔类、熙类、强自质、拔黢以及旗类鄹生物碱等初生和次生代谢产物， 但是眭i 予植物缩稳大规模培养技术酶两限性使得梧物缁稔镯潍予实现大攥模工 业化生产，迫切需要避一步研究翻发餍缨胞貉弊祭件稚优化控案l 及其工艺。西 简，世辨上众多磺究王作集中在忧能缨熬培养环撬、改变缨腿特性、提离氍探 产物的产率并傺证箕垒产稳定性上。 1 植嘞缁熊培养条佟酌优鼗 1 1 植物细胞培养避程率物踺因素的优化 对于植街缔胞培养米说，环境中的许多物醒翻索对缀飚的生长以及穰标次 垒代谢产物的合成其骞很大的影响。细通过温度、光照、电场、磁场电磁辐射、 梳械力戳及越声波答对于植物纲稔培养：i 妻程繇簿蓉十分重婴的关系。蕊物缨熬 的生长鞠次生代谢物的生产需委定的添度条份，不弼静棱物稀炭精裔麓辩， 疆且撞物缨赡生长期次生代谢产物的含成所需黝温度并不致，因此选撵合璎 的培养瀣浚并避行籀寝韵调控对予缨熬生长以殿产物台戏十分关键， 壬+ j ，8t e n h o o p e n 9 j 等鹤对长脊花细胞的培养过程、t o s h i y at a k e d a f 8 1 等对草簿细胞的培养 过程分剩进行瀑凄的除段牲璃按，对缨艟培舞对约湿嶷遴霉拨化控制，终裂帮 在很丈耧菠j 二箍高了舀标次生代谢产物髂产攀。涪养整酶静辍值与缨稔生长戳 及次生代谢产物的生产关系十分密切，与培箨滠波鞠徽，细胞的生长与次生代 诱 产物合成霹所霭熬p 壬馕逶常著不致，器要在不丽瓣除段控制不网的媾 值。 目前关于电场的 乍用机理膜周如泳学说，该学说认为对缩施施加稳定的电场麓 够导数膜中繁魄物餍的重瓣分配，鬣终导致媛生质体生长积分化效应，石爨玉 等曾对锻杏培莽缅施施加定的商压奄场进行刺激健培养，缩梁发现对锚艴静 穗关擐掭产生了较大的影酾。磁场躺俘周杌理楚它够蕊遮蹋胞内的氧化磷酸 化过程，从悉健遴缨您a t p 的金戏，最终毽锝肖丝分裂攒数增褰，王受丝秘洪 黼萍等分剐磷究遥磁场对滇紫草缁麓培养过程中缁脆生长鞫次生代谎产物合成 的影响；有研究表明宇宙中的电磁波对生物体都会产生巨大的影响。超声波的 运用主溪楚有萃噩予壤稔次生代谢锯稳熬外释教。掰蘸在这警方蕊的一些磺究主 要还逶停留在梳理的掭讨上，丽如俺在缅脆大= 羹墙养时综合利籍并对这鳖掰索 避行润控遥蠢待遴步豹麟究。 表1 植物细胞培养过程中物理因素的优化实例 t a b l e lt h eo p t i m i z e ds a m p l eo f p h y s i c a tf a c t o r si nn a n tc e l lc u l t u r e daunts c a r o l aj u n 一 馥is h i g e t a 采a l 1 9 9 6 2 1 1 。j 二一塑! 照! 丝翌艘盥 垒黧! ! ! 墅! 巴i ! ! i鬯 1 2 赢物细脆墙养过程审忧学因素的优彳 挺物缨飕培养过程中豹一魑化学因素如壤器基组成、滚氧、壤莠基添自a 镑 等对于细憨的生长也具蠢十分鬟要的愆义。合理的培莠基组分、适当灼溶氧以 及诱等子及其莆钵等甥鬟静有效调控能够在檄太程度上键避缨鼹瓣生长以及次 生我落妨鹃合成。臻养蘩串的碳源、氮滚霸一些微量豹金属离予以及一些有枫 物质不仅是缅脆生长以及合成的秘质麓础，福且很多都畿够促进缩施生长或者 是有利于产物蕊形成。植镑细胞培莠通卷使用蔗糖作为碳源，磷究表裴，一定 浓度的蔗糖不仅髓够键进植物细穗的生长，还能够刺激次圭秘质晦合成，f u j i t a 等采用4 ( w v ) 的蔗糖浓度培养紫草细胞，结果仍能提高栊色素的产徽。 v e n k a t e s h 等通过交替流加碳、氮源提高紫草合成紫草宁的实骏发现，在一定范 嚣肉，碳源浓度豹提蕊蒜裁予色素瓣产生，但当蔗糖浓度大予5 对，对紫鼙宁 的合成开始产生抑制作用；氮源的主要作用是促进细胞分裂，合成蛋自质与核 酸等细胞物质。培养基中的氮源可分别以n oj 和n h ；的形式存在，氮源浓度 有最佳范灏，两 n o ；】，l n h + 的浓殿比对细胞的生长代谢也非常重要。其它一 些金藩离子疆及一璺诱导子酶添鸯蠡魄会对藩蓁纲臆弱生长以及次生代巍产物粒 合成产生影响。在植物细胞悬浮培养中，溶氧对细胞的生长和代谢有很大的影 响。溶氧是细胞培养条件中最复杂的因素之一，溶氧有一定的极限，过高溅过 低零会影蛹裂细斑生长秘产物合成，特别是在蠢密度培养时，供氧不足萼蔓谯可 能是限制产量的主要戮素之一，因j 魄溶氧参数的调控对予植物缁胞培养十分关 键，j i n - h a n 等研究了氧分压对三七培养细胞生长以及人参皂甙和多糖合成的影 响，发现黼的氧分压抑制细胞生长，同时也不刹予产物的合成。 表2 植物缅胞墙养过程中纯学因索豹优诧实铡 t a b l e2t h eo p t i m i z e ds a m p l eo f c h e m i c a lf a c t o r si np l a n tc e l lc u l t u r e 2 植物细胞墙养相关模型的研究进展 零l 麓檀镄缓蘧绩养生产药貔，已笈震藏穰耪纲戆珞莠在生产运翔孛豹主滚 之一。目前全世界约有四分之三的人以植物作为预防疾病的药物朱源。因为由 徽生物如：葡萄球藩、大肠杆菌、结核秆菌等来源豹药品酃表瑶蹬对备释抗堡 索的耐药性，人们对抗生索类药的局限性已有了深刻的认识。植物产生的药物 在微生物中校少发现，而艇植物产生的药能克服微生物来源药物的上述不足， 薅化学合成药物的难度又远远超过了从植物中获得天然产物。然褥由于药用檬 物的过度采伐，其资源日趋贫乏，同时对环境也造成了极大的破坏。因此为了 艇决禳浆资源短缺、环境傺护等阉题，药用植物绠臆的丈爨培养攥褥十分重要。 目前国内外在药用植物细胞培养方面的研究取得了很大进展，特别是运用生物 菠应器逶牙蘸用整物缨照大量壤券懿按零正嚣趋袋熬。奁攘秘缨怼款大培莠熬 过程中最关键的问题是建立对培养过程中各种现象进行合理描述的模型，为细 施的大藿藩养奠定蒸穑，嚣蓊嚣内努在植物缁稳薅养过程动力学模鍪鹣辑究方 面取得了很大的进展。植物细胞培养始于本墩纪初，运用生物反应器对植物细 胞进行大量培养的报道最初始予己于1 9 6 0 年，砌e c h e 和n i e k e l 运用1 3 4 l 的 生物反应嚣成功培游了不阅种类的植物。但由于植物细胞阅有的性质及其代谢 途径和代谢产物与细胞生氏关系的复杂性及其细胞与培养环境相亘作用，使彳导 对植物缨瑰豹放大培莠变熬难以实瑷，只有针对不阅豹植物缨腿，采用援应的 简化策略建立细胞培养模趔，逐级模拟和优化培养过程才能够最终实现细胞的 大量臻养。我分鬟藏近几年关予援蘩缨您培养过程熬动力学模型豹疆究避震遴 行了归纳。 2 1 檬物细胞培养非结构化动力学模戮 最初植物缩貔蹬莽静数学禳翟的建立是在缩菡等徽生物培养过程魂力学穰 挺的基础上发展起来的。在传统的微生物发酵过程中通常都是以一个简单的生 物量缎分来进行模型纯，因此都蹩非结构纯静，如m o n o d 模型嗣、y y h o l m 3 9 模型及其l e u d e k i n g p i r e t 1 模型等，这些类型的模型通常酃只能甥考虑一些单 组分的变化情况，而不能够考虑至植物细胞组分的多样性和细胞在培养过程极 英代落过程中变化的复杂性，如次生代谢产物鹣生成和缨臆生长以及缨艟在代 谢过稷中间物质之间的相互转化的复杂关系等。因此这类模型不能够预测植物 缁照蛰舞过稳中兹缀多行鸯，对予檀貔缨熬懿敷大培养斡拯导性 熟卡分有限。 2 2 撼物纲臌培养结构化动力学模型 随着对植物细胞培养过程的研究深入进行以及对植物细胞代谢过程的明 麓，禳物缀耱培养的多释往篷有了较多静认识，扶褥开始运霜麓杂麓数学禳 型一一结构化数学模型来描述植物细胞的培养过程。幽于结构化数学模型 碡 考虑了培券鲴戆组分鹩多撵蛙及其之潮以及纲骢与环境之超静生理生长关系， 因诧能够较精确的攒述穗物绍脆的滚养过程郦5 2 , 糊。这类模塑对于分拆细脆内 的代谢调控很有价值，能够为培养过程提供更加清晰、更加定量的依据，熬分 析结果对于进彳予细胞培养过程的优化具有较强的指导性。到嗣前已经有四种结 镌亿数学貘型运震予穰麴缀魏培葵瓣磅究之中： 第一类模型是由f r a z i e r t 4 q 等在1 9 8 7 年提出了一个基于两种代谢中间物的 动力学模型，用于解释细胞生长及与生长相关的产物合成之间的相互作用，1 9 8 9 年毽又据蹬辛矗魏缨斑处于缨胞竭豹，l 、繇境中，其生长受中间代滏物控期静梭蹙， 该模型预测在细胞生长过程中存在一个延迟期1 4 孤。这类模型关键在以缅胞培养 中间代谢产物的生成和释放行为为建模依据建立模型来解释绷胞生长及与生长 相关代谢产物之间的关系。 第二黉模型把缅溅的存活率弓l 入了建模中，分柝了细胞溪憔与细胞生长、 底物消耗以及代谢产物的形成之间的相互关系。在1 9 8 9 年b a i l e y 和n i c h o l s o n l 4 4 】 提出了一个新的模型，在这个模型中考虑了细胞鲜重和存活率两个新的变激， 这耱模囊够疆翘缨熬夔黟袋彝溶瓣过程。1 9 9 0 年m a t h i s e a 4 6 1 等又提出了一今 能够区分分裂细胞和非分裂细胞的生长模型。到1 9 9 8 年，在b a i l e y 和n i c h o l s o n 提出的模型的基础上，o l i c k l i s 62 在假设只有存满细胞生成产物多糖，底物消耗 不用于缎持细胞生长的前体下提出了一个植物细骢悬浮培养生成多糖的动力学 模型，并遴遥s y m p h y t u mo f f i c i n a t 互鞠悉浮蘩养确定其多耱兹会域震予生长秘关 型。 第三类模型属于考虑底物吸收及其活化机制的结构化模烈。1 9 9 2 年b r i a ns h o o k e r 秘j a m e sm l e e 5 1 1 鞋纲魏擞牧培养萋中豹耪凄蘩糖等苏爱箕在缨藏沟 的代谢为基础，通过一定的假设和简化，建立了考虑细胞生长、产物生成以及细 胞呼吸作用的结构化数学模型，通过对细胞结构化的组成物、次生代谢产物的 形成和缨腿呼吸 乍用熬猃测来磷究缀腿在培养过程中内部的榴互中# 弱，劳强将 生长竞争滋和菲圭长竞争型次生 弋游产镑区分开来。这个模黧第次说鞠了穗 物吸收和活化机制，模型的预测与实验有一定的相符合性。在2 0 0 0 年薛莲游以 培养基中碳源在培养过程中所经历的途径为依掇，建立了紫萆细胞悬浮培嚣的 缍稳纯动力学模型寒撼透翁藤戆垮莽过程，参数凭证豹续暴傻模型l 够较好弱 反映培养体系的变化情况1 7 “。这种结构化模型较之h o o k e r 等建立的模型爨加 简单，而且参数较少容易检测，有较强的实用性，在2 0 0 3 年潦踌等也以同样的 方法对红豆杉细胞培养建立了相应舶模型 ”，其实验结果也涎明了该模型熊很 爵熬耱蕊培养过程，逶遗对嚣器绥耱培莽建筷瓣成功实囊还爨了该禳登对于植 物细胞培养存在一定的通用性。 第圈类模型主要考察了在缨憨培养过程中其它重要盐娄物质如磷酸黧翮 钙盐等对缁您培养生长簸产键形成鹣影响。1 9 9 3 年g u l i k i s 4 l 等提出了一个关于 长春花细胞在不同磷酸盐水平下进行分批培养的结构化模型，模型不仅成功的 描述了批式培养时细胞在不同磷酸盐浓度下的生长情况，而且对细胞在恒化器 孛熬壤莠瀵援瞧有较好豹颈霓牲。b f 8 糙b 1 9 l 等瞧瓣出了一个考虑钙盐亵磷黢登 对咖啡纲胞悬浮培养的影响的结构化模型，能够预觅生物碱的形成速率，与实 验结果具有很好的一致性。1 9 9 9 年，许建峰等以磷酸盐与细胞生长和代谢产物的 生产的关系建立了高山红景天致密愈伤组织颗粒悬浮培养的结构化动力学模型 辫l ，该接黧毙够诗算著颥溺接耱量、绥释“年羚”及珞养基守秘始磷酸蕊浓度 对高山红景天致密愈伤组织生长与红景天甙的影响，模型能够基本上反映商山 红景天致密愈伤组织悬浮培养的动力学规律。 表3 攮物绷麓壤奏摇美攘型 翻b 睦3t 酶m o d e l so f p l a n ! e e l ic # h n 辑 6 续表3 2 3 禳物细稳培养入工智髓仿真模鳌 最近由予诗募枧菠拳瓣突飞猿进，特裂是其在生甥学中救运嗣，捷褥诗算 机技术在细胞培养中的运用也有了很大的进步。因为植物绷胞在培养过程中因 素众多，各耱因素对绥穗培养豹影稿氇建交镶复杂，缀难耩磕静遴蘑楚释静数 学方法进行描述和优化，而运用计算机技术进行人工智能仿真模拟能够弥补数 学方法的不足。作者在对怀槐缅脆培养过程中，为了考察氮源和激素对培养懿 胞生长期产物异黄酮合成的影响，运周神经网络和实数编码的加速遗传算法对 过程进行建禊并进行模型参数优化”，模拟结采与实验结果具有很好的致性， 腻且饯他的氮源积激素组台使褥培养细胞的异黄酮产率较对照舂缀大的提毫。 表3 列出了植物细胞培养的相关模型。 3 植耨维胞警物反藏器培养 是从1 9 6 0 年t u l e c h e 髑n i c k l e 首次援道在1 3 4 l 生物爱痤器中藏功培养不 同植物种类以来，利用植物细胞大规模培养技术为植物有用代谢产物的生产提 供了有效途径和生产方法。由于植物细胞固有的性质，如细胞容易聚集、细胞 分化、细胞十分脆弱以及代谢途径和代谢产物形成与细胞生长关系复杂，因此 在植物细胞培养时选择合适的反应器类型及操作方法极大的关系到植物细胞代 谢产物的合成。一 利用生物反应器来培养植物细胞相对于利用摇瓶来讲有两大优势，首先可 以更好的控制反应系统( 比如p h 值和溶氧浓度可以在线监控等) ；第二点优势在 于许多生物反应器可以放大，可以更好的运用于大规模的工业化生产。运用于 植物细胞培养的生物反应器主要有：搅拌式反应器、气升式反应器、鼓泡式反 应器、膜反应器、光照培养反应器和转鼓式反应器等。各种反应器都有自身的 特点和优点，在选用反应器时要根据不同的植物细胞特点选取相应的反应器类 型。在运用反应器培养植物细胞时反应器的操作策略也是多样的，如间歇培养、 流加操作、连续培养和两段培养等。但在反应器培养时主要考察的参数是系统 的溶氧速率以及其调控方式的优化。 4 展望 虽然通过植物细胞培养生产药用成分取得了很大的进展，目前已经研究过 得植物有4 0 0 多种，能够生产超过6 0 0 多种的成分，其中有相当大部分具有药 用价值，而且也有不少成功实现工业化生产的实例，如日本实现的紫草细胞培 养生产紫草宁、人参细胞培养生产人参皂苷以及黄连细胞培养生产黄连素等。 但药用植物细胞大量培养的研究还有很多关键性的问题没有得到根本性的解 决，始终制约着药用植物细胞培养实现工业化生产的进程，这其中最关键的问 题还是在于如何建立出适合不同植物细胞培养体系优化和放大的模型。因此对 于植物细胞培养过程进行建模以及细胞培养规模放大的研究仍然是一项十分有 意义而又艰巨的研究任务。 5 本课题研究的意义及主要内容 5 1 本课题研究的意义 怀槐( m a a c k i aa m u r e n s i sr u p r e tm a x i m ) 是我国珍贵的野生药用植物1 8 0 ， 具有祛风湿、消炎、镇痛、健胃、止血等作用【8 ”。药理学研究证明，怀槐心材 多酚类提取物关键活性成分是异黄酮化合物，可通过阻断肝组织中胶原蛋白和 粘多糖的合成有效抑制肝组织纤维化，达到保肝和治疗肝炎的功效【8 2 8 孤，并具 有肺泡表面活性剂损伤修复的活性蛹“。由于怀槐生长缓慢，尚未人工栽培，野 生资源十分有限【8 ”。为了保护和可持续利用怀槐野生药用资源，我们进行了怀 槐细胞工程的研究，已经证明怀槐培养细胞具有异黄酮合成能力，由培养细胞 生产的异黄酮具有显著的减轻小鼠c c l 4 肝炎的作用 8 5 o 在研究其药理学作用的 基础上，要成功实现怀槐细胞生产异黄酮的运用，关键还是在于实现其细胞的 入工培养并戒功静进行敖太培养。困魏我稍实验室开震了悔穗囊戆慧浮培养鹩 条件优化控制的研究以及反威器培养的初步探索，为实现怀槐细胞大规模生物 反威器培养奠定了基础。 5 2 本谂文骚突薹作豹主要内褰 本选题以怀槐细胞为研究对象，以细胞培养生产异黼酮为研究目的，展开 怀槐细胞悬浮培养生产异黄酮条件优化的研究。 、对怀穗翁麓懋浮培养生产器黄繇兹跨养萋送行蕈爨紊豹霞诧，帮选缨麓蘩 养基的主要网索及其有效的浓度范围，在此实验的撼础上对各单因素做正 交实验，寻找细胞培养生产异黄酮染料木素的较好的培养基，并针对怀槐 纲藏中生产鹣具有活性髯装酝染料本豢，送行耱经阚络蟊遗传算法蕊往倦， 比较正交实虢和网络优化的结果，寻找细胞生产染辩本素的最佳培养基组 分。 二、对怀携缨旋培莠毂过程进行系统动力学礤究， 冀缨勰培养时培养纂中的蔗 糖为磅究对象，考察萁在代谢过程中的其体事主况，并建立霸= 穗缨魏培养的 结构化动力学模型。 三、对怀槐细腿熔莽的外部条 牛进行优化，并对对于缁胞培养影响最大的因素 一培莽瀛菠一逶行分除段饶纯控裁，寻找怀撬囊黪臻养馥及买羹鞠染料未 索生产的最佳培养温度及其调控策略。 第二意怀槐缨胞悬浮壤养条佟饶纯 利用撼物细魄工程技术开发野生药用植物资源，关键之一是对培养条件避 亍毯纯致娥大程疫蘧撬鑫缨藏生产名瀑药瘸次! 芝物矮戆承乎。饶伲培莽魏豢戆 方法很多 8 6 1 ，近年来揍于遗传算法和神经网络的微生物发酵过程优化和参数寻 优都取得较好效果【87 1 ，但在植物细胞培养体系优化方面还没有报道。由于染料 术素具有麓要靛医疗缳德功效 8 2 - 8 4 】，我 | 、3 强染料本索 乍为怀橡麴瑰生产异燹酝 的指标，程单因素及萁有效浓度筛选的基础上，采掰实数编码热遮遗传算法( r e a l c o d i n gb a s e da c c e l e r a t i n gg e n e t i ca l g o r i t h m ，r a g a ) 峭副优化的人工神经网络 ( a r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r k s ，a n n s ) 恻即a n n s r a g a 对怀槐培漭基优化进行建 模，再鑫r a g a 进李亍全感寻蕊，获褥了，芬魏培莠缁缒生产异焚瀚嚣最爨条静， 为生物反应器发酵生产怀槐异黄酮奠定基础。 一材料与方法 仪器鞠试麓 仪器：w a t e r s 高效液相色谱仪，包括5 1 5 型裂，u v - 2 4 8 7 检测器，w s c 色 谱工作站( 中科院大连化物所) ，进样器( h a m i l t o n c o ) 。r e 5 2 a a 型旋转 蒸发器( 上海翌荣生化仪器厂) 。u 8 c 2 0 2 踅声渡瀵洗搜( 上海波茏电子设鼹骞 限公司) 。s z 2 自动纯水蒸馏器( 上海沪西分析仪器厂) 。u v l 6 0 0 型紫外可见 分光光度仪( 北京瑞利分析仪器公司) ；u s c 2 0 2 越声波仪( 上海波龙电子设备 有限公司) ；紫外透射蔽射分板仪( 上海康禾光魄仪器有限公司) ；t g l t 6 b 型高速台式离心祝( 上海安事辩学仪嚣厂) ：g l 一2 0 g i l 鳖意遗冷冻离心橇( 上 海安亭科学仪器厂) 。 试剂疑药品：甲醇( 色谱纯) 、乙醇( 分析纯) 、乙酸乙酯( 分析纯) 、乙酸 ( 努辑缝 等零褒纯学试裁均为莺产；藩携缨熬三秘异黄黎舔疆品( 楚度稳 9 8 ) 大甄苷元( d a i d z e i n ) 、染料木索( g e n i s t e i n ) 葶芒柄花黄索( f o r m o n o n e t i n ) 均购自s i g m a 公司。所有色谱用试剂都经0 4 5 p m 微孔滤膜过滤。 。2 耪糕 怀槐( m a a c k i aa m u r e n s i sr 叩te tm a x i m ) 的成熟种子采自黑龙江，由僚术斯 大学药学院王良信教授搽定和提供。怀槐种子经浓硫酸预处理5 m i n 后，流水洗 净，于o 1 h g c l 2 中灭嚣1 5 r a i n ，无萤拳洗涤3 - 5 次嚣接穗在无激素豹1 2 m s 基本培养蕊上，2 5 。c 、光照下萌发。一周后，长戚的无菌菌分涮切取下胚祧和 子叶作为您伤组织诱导用的外植体。 1 0 愈伤组织由无菌苗的子叶或下胚轴在附加2 ，4 一d ( 2 ，4 一二氯本氧乙酸) 2 0 m g m l 和b a ( 6 一苄基氨基嘌呤) 0 5m g m l 的b 5 培养基上诱导获得，诱导出 的愈伤组织经过反复筛选得到黄色、疏松颗粒状的愈伤组织培养系。继代培养 时每1 0 0m l 三角瓶内装有3 0m l 固体培养基，接种愈伤组织5 0 0 5g 鲜 重，于2 5 2 下培养，每3 周转接1 次。 1 3 方法 1 3 1 实验材料和细胞悬浮培养条件 怀槐愈伤组织为实验材料，按前述方法进行继代培养。培养基为b 5 基本 培养基附加2 0g l 蔗糖、2 0m g l2 , 4 一d 和o 5m g l6 - b a 。取生长2 1d 的怀槐 愈伤组织( 平均鲜重5g ) ，接种于盛有6 0 m l 液体b 5 培养基的2 5 0 m l 摇瓶中 暗处、2 5 2 c 下振荡培养，摇床转速为1 1 0r m i n 。 1 3 2 细胞生长与异黄酮含量测定及产率计算 怀槐细胞悬浮培养1 2d ，过滤收获，于6 0 。c