（发酵工程专业论文）丙丁清液发酵及废液循环利用工艺的研究.pdf

河北科技大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发 表或撰写过的作品或成果。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：。南衲孢 指导教师签名： 驯衅彳日 吻一 飞j 厂 扣晦n - 铲 河北科技大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权河北科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 口保密，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 口不保密。 ( 请在以上方框内打“4 ”) 学位论文作者签名： 南两丽 驯啤夕日 指导教师签名： 畛。 伊 圳萨n 广 j 摘要 摘要 清液发酵即通过对发酵原料进行综合加工以达到提前除渣的目的，将除渣后的 清糖液用以发酵，或直接通过发酵将原料充分利用从而使发酵液澄清。采用清液发 酵具有诸多优点，如污染小于带渣发酵；便于发酵新技术的应用；改善装置运行状 况；发酵液可循环利用，从而实现节能减排等，同时发酵废液中残留的少量可发酵 性糖及营养物质可被循环利用。目前，清液发酵已应用于乙醇工业化生产，但在丙 酮、丁醇生产中还未见报道。本试验以丙酮丁醇梭菌8 0 0 8 、8 0 1 2 ( c i c c ) 为菌种，进 行了丙酮丁醇清液发酵的研究。论文主要研究内容及结果如下： 1 ) 对丙酮丁醇清液发酵进行了初步研究。首先采用以葡萄糖为碳源的半合成培 养基进行丙丁清液发酵，溶剂产量最高仅为8 4 3 9 9 l ，且有大量的残糖未被利用，试 验结果不理想。然后分别以红糖溶液、白糖溶液进行发酵，结果表明红糖较白糖利 用率高，溶剂产量为1 4 5 0 9 l ，原因是红糖含有更为丰富的营养成分，更适于微生物 生长利用。但比玉米粉发酵的溶剂产量仍有较大差距。最终采用玉米粉浸泡液添加 葡萄糖为碳源进行发酵，得到溶剂产量可达2 0 8 1 9 l ，发酵效果良好。 2 ) 以玉米淀粉为碳源进行了丙丁清液发酵的研究。试验中发现，以5 0 r a l 容量 瓶发酵，分别在未抽真空与抽真空条件下，溶剂产量相差不大，因此可省去抽真空 操作，简化试验过程。结果表明，采用玉米粉浸泡液添加玉米淀粉发酵良好，溶剂 产量可达到2 1 6 3 9 l ，最适玉米粉浸泡浓度为2 0 0 9 l ，玉米淀粉醪液浓度为7 ，0 【 淀粉酶添加量为0 1 ，发酵周期为7 2 h ，糊化时间为4 5 m i n 。 3 ) 清液发酵完成后，进行了发酵废液循环利用的研究。将发酵废液与玉米粉浸 出液按不同体积比混合后进行丙丁发酵，结果发现，随着发酵废液含量的增加，溶 剂产量逐渐降低。当采用发酵废液发酵时，溶剂产量由未添加发酵废液时的2 1 6 3g l 降至0 9 6 9 l ，抑制作用明显。维持发酵废液与玉米浸出液的比例不变，调节初始的 p h 值为6 0 ，溶剂产量仍然较低，有待进一步研究。 4 ) 本试验研究了以玉米淀粉为碳源，酸根离子对丙酮丁醇清液发酵的影响。结 果表明：s 0 3 2 - 抑制作用明显，且随浓度的增加，抑制作用增强。s 0 4 2 ，c 1 。，c o ，2 ， a c ，p 0 4 3 。相对应的钠盐、铵盐浓度在o 2 1 0 l ( w v ) 范围内发酵正常，其中溶 剂产量最高达到2 2 0 9 l 。s 0 4 厶，c 1 。对应盐质量浓度增加到2 0 9 l 时，溶剂产量有 所下降。在不同质量浓度下，分别将几种钠盐、铵盐混合添加到培养基中，研究其 对发酵的影响。结果发现，未添加亚硫酸盐的发酵正常，添加亚硫酸盐的发酵出现 异常，溶剂产量很低，仅为1 8 0 6 9 l ，同样说明s 0 3 对丙酮丁醇发酵的强抑制作用。 关键词酸根离子；丙酮丁醇发酵；清液；玉米淀粉；浸泡液；废液循环 i 河北科技大学硕士学位论文 _ _ = = ；= ；= j 目目j ；= = j # 目l g i 自= = = ；目 = = = = ；目自；= ；目i 目= = = = = = _ _ _ i _ 自= 自目= 目：= = = ：= ；= a _ ：= a bs t r a c t i nc l e a rl i q u i df e r m e n t a t i o n , r a wm a t e r i a l sw e r e p r o c e s s e ds y n t h e t i c a l l yi no r d e rt o r e m o v et h er e s i d u eb e f o r e h a n d ，t h e nt h e s u g a rs o l u t i o nw a su s e dt of e r m e n t a t e ，o rt h e n u t r i e n t sw a sc o m p l e t e l yu t i l i z e da n dt h ef e r m e n t a t i o nl i q u i dw a sc l e a r c u r r e n t l y ，c l e a r l i q u i df e r m e n t a t i o nh a sb e e na p p l i e di n d u s t r i a lp r o d u c t i o no fe t h a n o l ，b u tt h e r ea r ef e w r e p o r t so nc l e a rl i q u i df e r m e n t a t i o no fa c e t o n e - b u t a n 0 1 i nt h i sw o r k ，a c e t o n e - b u t a n o lc l e a r l i q u i df e r m e n t a t i o nw a si n v e s t i g a t e du s i n gc l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m ( 8 0 0 8 ，8 012 c i c c ) t h ec o n t e n to ft h j sw o r ka n dr e s u l t sa r ea sf o l l o w i n g ： 1 ) a c e t o n e - b u t a n o lc l e a rl i q u i df e r m e n t a t i o nw a ss t u d i e dp r e l i m i n a r y f i r s t l y n l e f e r m e n t a t i o nw a sc a r r i e do u tw i t ht h es e m i s y n t h e t i cm e d i u mi nw h i c hg l u c o s ea sc a r b o n s o u r c e ，t l l eh i g h e s ts o l v e n ty i e l dw a so n l y8 4 3g l ，a n dm u c hr e s i d u a ls u g a rw a sn o tb e i n g u s e d ，t h er e s u l t sw e r en o ts a t i s f i e d t h e n 也es o l u t i o no fb r o w ns u g a ra n dw h i t es u g a rw e r e u s e dt o f e r m e n t a t e ，b r o w ns u g a rg o th i g h e ru t i l i z a t i o n , s o l v e n tp r o d u c t i o nw a s1 4 5 0 g l ，t h a ti sb e c a u s eb r o w ns u g a rc o n t a i n sm o r en u t r i e n t s , b u ti tw a sm u c hl o w e rt h a nw i t h c o r na sr a wm a t e r i a l s f i n a l l y , w h e nc u l t u r em e d i u mc o n s i s t e do fc o m s o a k i n gs o l u t i o n a n d g l u c o s e ，t h es o l v e n ty i e l dw a su pt o2 0 81e g l ，廿l ef e r m e n t a t i o nw a sg o o d 2 ) w i t ht h ec o ms t a r c ha sac a r b o ns o u r c e ，f e r m e n t a t i o n sw e r ec a r r i e do u t i nt h e e x p e r i m e n t ，w h e nt h ef e r m e n t a t i o nw a sc a r r i e do u tu s i n g5 0 m lv o l u m e t r i cf l a s k t h e s o l v e n ty i e l db e t w e e nv a c u u ma n dw i t h o u tv a c u u mw a sa l m o s tt h es a m e ，t h e r e f o r e m e v a c u u mo p e r a t i o nw a se l i m i n a t e dt os i m p l i f yt h e p r o c e s so ft h ef e r m e n t a t i o n t h er e s u l t s s h o w e dt h a t ，t h ef e r m e n t a t i o nw a sg o o dw i t hc o m s o a k i n gs o l u t i o na d d i n gc o ms t a r c h t h e s o l v e n ty i e l dw a su pt o21 6 3g l ，t h e a p p r o p r i a t ec o ms o a k i n gc o n c e n t r a t i o nw a s 2 0 0 9 l ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o nw a s7 、a a m y l a s ea d d i n ga m o u n tw a so 1 、f e r m e n t a t i o n p e r i o dw a s7 2 h 、c o o k i n gt i m ew a s4 5 m i n 3 ) a f t e rc l e a rl i q u i df e r m e n t a t i o n ，r e c y c l i n go fw a s t el i q u i dw a ss t u d i e d 1 1 1 e f e r m e n t a t i o nw a s t ea n dc o r ns o a k i n gs o l u t i o nw a sm i x t u r e da td i f f e r e n tv o l u m er a t i o t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t ，w i t ht h ec o n t e n to ft h ef e r m e n t a t i o nw a s t el i q u i di n c r e a s e d ，s o l v e n t y i e l dd e c r e a s e d w h e nt h ef e r m e n t a t i o nw a sc a r r i e do u tu s i n gw a s t el i q u i d ，s o l v e n ty i e l d d e c r e a s e df r o m21 6 3 lt oo 9 6 e g l ，t l er o l eo fr e s t r a i nw a sp r o m i n e n t m a i n t a i nt h e f e r m e n t a t i o nw a s t ea n dc o r ns o a k i n gs o l u t i o na tt h es a m ev o l u m e r a t i o ，a d j u s t i n gt h ei n i t i a l p ht o6 0 ，t h es o l v e n ty i e l dw a s s t i l ll o w ，i tn e e ds t u d yf u r t h e r 4 ) t h ep a p e rs t u d i e dt h ee f f e c t o fa c i di o no na c e t o n e b u t a n o l c l e a r l i q u i d f e r m e n t a t i o nw h i c hw i t ht o ms t a r c ha sc a r b o ns o u r c e t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：s 0 1 2 h a s i i t h es t r o n 2 e s ti n h i b i t o r ya c t i o n ， a n di te n h a n c ew i t ht h ei o nc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d ln e 向m 饥t a t i o ni sn o n n a lw h e nt h ec o n c e n t r a t i o n t h a tc o r r e s p o n d i n gs o d i u ms a l t ，锄m o n l u m s a l to f s 0 4 2 ，c 1 ，c 0 3 2 。，a c 。，p 0 4 3 i si nt h er a n g eo f 0 2 9 l 1 o g l ，t h eh i g h e s ty i e l l i s 删e v e dt o2 2 0 91g l ，w h e nt h ec o n c e n t r a t i o nt h a tc o r r e s p o n d i n gs a l t o fs 0 4 小，c 1 。 i i l c r e a s et o2 0 9 l ，t h es o l v e n ty i e l di sd e c l i n es l i g h t l y s e v e r a lk i n d ss a l tw e r em i x e d a n d a ( 1 d e dt ot h em e d i u ma td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s ，t h ef e r m e n t a t i o nw h i c h t h e r el sn o t s u l f i t ew a sn o 册a l ，o nt h ec o n t r a r y ，i tw a s a b e r r a n t ，t h es o l v e n tp r o d u c t i o nw a s l o w ，t t l e m i n i m 啪w a so n l y1 8 0 6 9 l ，s i m i l a r l ys h o w e dt h a ts 0 3 p h a ss t r o n gi n h i b i t o r ya c t l o no n t h ef e r m e n t a t i o n k e yw o r d s a c i di o n ，a c e t o n e b u t a n o lf e r m e n t a t i o n ，c l e a rl i q u i d ，c o r ns t a r c h ，h x i v i u m ， w a s t el i q u i dc i r c u l a t i o n i i i 河北科技大学硕士学位论文 目录 摘要。_ i a b s t r a c t i i 目录一i v 第1 章绪论1 1 1 引言1 1 2 发酵法和化学合成法生产丙酮、丁醇2 1 2 1 微生物发酵法2 1 2 2 丙酮一丁醇发酵代谢途径2 1 2 3 影响微生物发酵的因素3 1 2 4 化工合成法4 1 3 清液发酵介绍5 1 3 1 清液发酵在酒精发酵工艺上的应用5 1 3 2 酒精生产中采用清液发酵的优点5 1 4 国内外研究现状分析6 1 4 1 丙酮丁醇发酵研究现状6 1 4 2 清液发酵研究现状9 1 5 本课题研究内容及意义1 0 1 5 1 研究内容1 0 1 5 2 研究意义1 1 第2 章丙酮丁醇梭菌特性及丙丁清液发酵初步研究1 2 2 1 实验材料。1 5 2 1 1 菌种一j 1 5 2 1 2 主要仪器1 5 2 1 3 主要试剂1 6 2 1 4 培养基配制1 6 2 2 实验方法1 6 2 2 1 菌种活化1 6 2 2 2 菌种形态观察1 7 2 2 3 生物量的测定1 7 2 2 4 还原糖含量测定1 7 2 2 5 总糖含量测定1 9 2 2 6 凯氏定氮测定氮含量1 9 目录 2 2 7 发酵产物检测2 0 2 2 8 p h 测定2 2 2 2 9 菌种计数2 2 2 3 实验结果与分析2 2 2 3 1菌种形态特征2 2 2 3 2 种子生长曲线2 4 2 3 3 配制半合成培养基进行清液发酵量法测定2 4 2 3 4 采用白糖、红糖溶液进行清液发酵2 5 2 3 5 采用玉米粉浸泡液以葡萄糖为碳源进行丙丁发酵2 5 2 4 本章小结2 7 第3 章以淀粉为原料的丙丁清液发酵及废液循环利用2 9 3 1 实验材料2 9 3 1 1 菌种2 9 3 1 2 主要仪器3 0 3 1 3 原料与试剂3 0 3 1 4 培养基配制3 0 3 2 实验方法3 0 3 2 1 种子的培养方法3 0 3 2 2 发酵醪液的配制3 0 3 2 3丙酮丁醇发酵方法3 1 3 2 4 分析方法3 1 3 3 实验结果与分析3 3 3 3 1 发酵工艺流程3 3 3 3 2 发酵前后现象3 3 3 3 3发酵期菌体生长曲线3 5 3 3 4以玉米淀粉为原料进行丙酮丁醇发酵3 6 3 3 5以玉米淀粉为原料添加玉米浆进行丙丁发酵3 7 3 3 6 采用玉米粉浸泡液以玉米淀粉为原料进行丙丁发酵3 7 3 3 7q 淀粉酶添加量梯度试验3 8 3 3 8 发酵过程对厌氧环境的要求3 9 3 3 9 较适宜糊化时间的确定4 0 3 3 1 0 较适宜发酵周期的确定4 1 3 3 1 1发酵废液的循环利用4 2 v 河北科技大学硕士学位论文 3 3 1 2 异常发酵的症状及原因4 3 3 4 本章小结4 4 第4 章酸根离子对丙酮丁醇发酵的影响4 6 ，4 一实验材料4 6 4 1 1 主要仪器4 6 4 1 2 原料与试剂- 4 6 4 1 3 培养基配制4 7 4 2 实验方法4 7 4 2 1 种子的培养方法4 7 4 2 2 发酵醪液的配制4 7 4 2 3 丙酮丁醇发酵方法4 8 4 2 4 分析方法4 8 4 3 实验结果与分析4 8 4 3 1 工艺流程4 8 4 3 2 添加几种常见酸根离子的钠盐对发酵产量的影响4 8 4 3 3 添加几种常见酸根离子的铵盐对发酵产量的影响4 9 4 3 4 几种钠盐和铵盐分别混合在不同浓度下对发酵产量的影响5 0 4 3 5 各钠盐在不同质量浓度下的淀粉转化率5 1 4 4 本章小结5 2 结论5 4 参考文献5 6 攻读硕士期间所发表的论文6 0 致 射? 6 1 v i 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1引言 丙酮、丁醇发酵是一个复杂的生物化学变化过程。发酵所产生的丙酮、丁醇以 及少量的乙醇统称为丙丁总溶剂，工业生产的最终目的就是要生成溶剂。总溶剂是 重要的基本有机化工原料，是生物制造化工产品的经典生产过程，除直接用作溶剂 外，还具有许多用途【l 】。丁醇可用来制造邻苯二甲酸酯类、脂肪族二元酯类和磷酸酯 类塑料增塑荆：合成有机原料丁醛、丁酸、丁胺和乳酸丁酯等：作油脂、药物( 如抗 菌素、激素和维生素) 及香料萃取剂，以及多种农药的中间体等；在油漆生产中作环 氧清漆、硝基漆的稀释剂和醇酸树脂漆的添加剂。丁醇还是一种重要的具有极大潜 力的新型生物燃料，无论是燃烧值还是辛烷值丁醇都与汽油接近。同时，丁醇可按 高比例与汽油进行混合作为燃料，而不需要对汽车进行改装；比使用汽油与乙醇的 混合燃料更实惠。丁醇的低蒸汽压力和疏水性，使得丁醇的运输依靠现有的汽油输 送管道及分销渠道成为可能，这充分表明丁醇是理想的汽油替代燃料。丙酮可作为 生产塑料、涂料、医药、农药等的基本原料，可用于生产甲基丙烯酸酯、双酚a 、甲 基异丁基酮、醋酸纤维、溶解乙炔、乙酰丙酮、二丙酮醇等，其系列产品多达6 0 余 种。乙醇在能源、动力、医药、农药、塑料、日用化学品、橡胶、涂料、染料等生 产领域应用颇多【2 捌。 随着近年来下游工业的发展，丙酮和丁醇的市场需求直线上升。据了解，2 0 0 5 年以来每年我国丙酮、丁醇消费量均超过t s o 万t ，但生产能力仅为3 0 万t 左右，预计 2 0 1 0 年，我国丙酮的总消费量将达到约9 0 万t ，丁醇需求量将达7 5 万t ，还需要大量进 口。迄今为止，丙酮、丁醇、乙醇可通过生物发酵法和化工合成法生产【4 】。发酵法一 般采用丙酮丁醇梭菌( c o s t r y d i u m a c e t o b u t y y c u m ) ，在厌氧条件下利用淀粉或糖分 等发酵，经发酵制得丁醇、丙酮及乙醇的混合物，通常的比例为6 ：3 ：1 ，然后经过蒸 馏后处理从发酵液中将溶剂提取出来【5 】。 上世纪7 0 年代后期石油化工业的迅猛发展，发酵法逐渐被淘汰。而近年来由于石 油价格的上涨，特别是最近的石油价格波动，更加强了人们石油能源危机的意识。 石油短缺问题已经成为制约我国经济发展的主要因素，我国石油资源安全的问题日 益突出。进而采用微生物发酵法生产丙酮、丁醇的技术重新显示出其优势【6 1 。 中国“十一五”规划中明确要求，到2 0 1 0 年单位产值能耗降低2 0 ，这意味着 我国发展模式要进行根本性的转变【7 1 。节约和合理利用能源，降低能源消耗，提高能 源利用效率，既是我国缓解能源供应紧张的重要措施，更是提升经济增长质量、创 新发展模式的重要手段。为此，我国必须在能源结构上进行换代转型，发展新型能 河北科技大学硕士学位论文 源。而丙酮丁醇发酵作为转化生物质化学品和燃料的重要手段将在我国能源战略和 能源安全领域扮演越来越重要的作用【8 】。 1 2 发酵法和化学合成法生产丙酮、丁醇 1 2 1 微生物发酵法 丙酮丁醇发酵一般采用丙酮丁醇梭茵，在厌氧条件下利用淀粉或糖分等发酵生 成丁醇、丙酮和少量乙醇等溶剂，通常的质量比例为6 ：3 ：1 ，然后经过蒸馏处理从发 酵液中将溶剂提取出来。以干玉米计算，丙酮与正丁醇的收率为2 6 5 t 9 1 。 微生物发酵法根据原料的不同可分为： 淀粉质原料发酵：淀粉质原料有谷物和薯类。谷物类中主要有玉米、稻米、大 麦、小麦、高粱等；薯类中有甘薯、马铃薯、木薯等。玉米中含有合适的碳水化合 物和蛋白质、无机盐等，不必添加任何其它成分即可生产丙酮丁醇【1 0 】。 糖蜜发酵：糖蜜是制糖工业的副产物，我国每年的产量很大，利用它来制造丙 酮、丁醇不仅原料成本低，而且对原料的综合利用有重要意义。采用糖蜜发酵产生 的溶剂比例改变，丁醇含量增高，乙醇产量减少，产品的经济价值提高【l i 1 2 1 。 稻草发酵：以纤维物质为原料进行丙酮丁醇发酵研究，从本世纪三十年代以来， 国外陆续都有报道。纤维素酶、半纤维素酶的研究进展，促使人们考虑采用设备简 单、反应条件温和、糖化收率高的酶法糖化纤维物质，并利用所得的糖进行丙酮丁 醇发酵。目前在稻草水解液还原糖浓度为4 2 8 时，总溶剂为1 2 8 l ，溶剂组成： 丁醇：丙酮：乙醇= 6 5 8 ：2 3 8 ：1 0 4 ，溶剂生成率为2 9 9 【1 3 】。 1 2 2 丙酮丁醇发酵代谢途径 丙酮丁醇梭菌生物代谢途径主要有两部分组成：产酸阶段和溶剂转化阶段。产 酸阶段发酵产物主要是乙酸、丁酸、h 2 、c 0 2 等，在这个阶段酸度上升，溶剂产生很 少。溶剂转化阶段：在这个过程中，丁酸和乙酸被还原，丁酸还原成丁醇，乙酸还 原成丙酮，其主要特征表现为酸度迅速下降，同时伴有h 2 与c 0 2 气体的产生【1 4 1 。 由淀粉类原料发酵生成丙酮、丁醇总的反应式为： 9 5 c 6 h 1 2 0 6 - - * 6 0 c h 3 ( c h 2 ) 3 0 h + 3 0 c h 3 c o c h 3 + 1 0 c z h s o h + 2 2 0 c 0 2 + 1 2 0 h 2 + 3 0 h 2 0 2 第l 章绪论 图1 i 丙酮丁醇发酵代谢途径 f i g 1 - 1a b ef e r m e n t a t i o np a t h w a y so fc l o s t r i d i u m a c e t o b u t y l i u m 1 2 3 影响丙酮丁醇发酵的因素 影响丙酮丁醇发酵条件包括营养因子和限制因子两个方面。营养因子主要包括 碳源、氮源、无机元素和各种金属离子等。限制因子包括生物素和对氨基苯甲酸。 发酵醪中碳源、氮源的含量和比例决定细胞中酶系的组成和活力，影响最终的发酵 溶剂产率；微量的营养成分如无机盐和维生素等的供应状同样影响细胞的代谢能力 1 5 1 o 3 河北科技人学硕十学位论文 1 2 3 1碳源对丙酮丁醇发酵的影响 碳源是丙酮丁醇发酵最重要的营养物质，是发酵终产物的碳骨架，丙酮丁醇梭 菌细胞的能量通过三梭酸循环进行碳骨架转换和a t p ，a d p 的传递。在以葡萄糖为 碳源的合成培养基发酵时，发酵初期葡萄糖浓度对丙酮丁醇梭菌发酵活力的影响很 大，试验表明葡萄糖浓度在5 1 0g l 时，只生成乙酸和丁酸；当葡萄糖浓度达到 2 0g l 时有产酸和酸转化为溶剂两个过程；葡萄糖浓度在4 0 - 8 0 l 时产酸及产溶 剂两个阶段更明显，发酵结束后乙酸、丁酸含量很少【1 6 】。 1 2 3 2 氦源对丙酮丁醇发酵的影响 氮源也是丙酮丁醇发酵的重要原料，其含量直接关系到丙酮丁醇梭菌的合成代 谢。氮源不足导致葡萄糖通透酶的加速运转，糖通透能力降低后会降低发酵速率， 导致发酵终止或不彻底，这是碳源充足而氮源缺乏导致残糖较多的原因。氮源与碳 源的平缓型利用方式不同，几乎全部的氮源是在发酵初期或菌体生长启动之前被输 送和吸收的。在丙酮丁醇发酵中，在生长因子生物素和对氨基苯甲酸充足的条件下 添加不同氮源对发酵的影响：豆粕 蛋白胨 硫酸铵 谷氨酸钠【l 刀。 1 2 3 3 金属离子对丙酮丁醇发酵的影响 丙酮丁醇梭菌的生长需要金属元素，特别是m 孑+ 、f e 2 + 、m n 2 + 、z d + 和k + 等。 金属离子是丙酮丁醇发酵过程中各种重要酶的激活剂或辅助因子，如葡萄糖激酶， 磷酸果糖激酶需要m f + 或其它二价金属离子激活。金属离子的水平对保持细胞抵抗 溶剂毒性也有重要作用【1 8 】。 镁离子：镁离子是e m p 、t c a 途径重要的酶激活剂，如果没有镁离子存在，细 胞生长受限制，有溶剂产生，但是产量很低；适宜的镁离子浓度在5 0 - 2 0 0m g l ， 菌体生长最好，溶剂产量更高。当镁离子浓度超过3 5 0 - 5 0 0m g l 时菌体生长良好， 但是溶剂产量有所降低。 亚铁离子：细胞生长需要亚铁离子，是电子呼吸传递链的重要成员之一。当亚 铁离子浓度只有1m g l 时，菌体生长良好，溶剂产量正常；浓度在1 - - 5 0m g l 对发 酵没有明显的影响；当缺乏亚铁离子时，菌体生长缓慢，溶剂产率降低。 锰离子：锰离子浓度在0 - 2 0m g l 时对溶剂产量没有明显的影响，浓度过高时， 原料转化率会降低。 钾离子：一般浓度在5 0 0 7 5 0 m g l ，是某些酶的辅因子，用来维持电位差和渗 透压【1 9 1 。 1 2 4 化工合成法 用合成法制造丙酮有下列方法：用稀酒精催化制得丙酮；石油气中的丙烯制成 异丙醇再经氧化脱氢制的丙酮；用丙烯与苯制成异丙苯，再氧化制得丙酮及苯酚。 4 第1 章绪论 用合成法制造丁醇有下列方法： 丁醇等。 乙醇合成主要采用乙烯水合法： 是乙烯催化直接水合法。 乙醛缩合加氢；丙烯羰化加氧；乙烯直接合成 一种是以硫酸为吸收剂的间接水合法；另一种 采用化工合成法，需以化工产品作原料，或是要高温或高压等条件，所以较为 复杂【2 0 2 1 1 。 1 3 清液发酵介绍 近年来，随着粮价的上涨及饲料业的发展，人们逐渐认识到提高原料的综合利 用率是提高生产经济效益的有效途径。采用清液发酵，对原料进行综合加工，糖化 液提前除渣，用于生产微生物饲料；辅助于把发酵液中的营养物质回收利用，进行 再生产。不仅提高了原料的利用率，降低了生产成本，而且节约了水资源和能源， 是提高经济效益的有效途径【2 2 】。 1 3 1 清液发酵在酒精发酵工艺上的应用 传统的酒精发酵一般采取带渣发酵【2 3 “】，一直以来，发酵产业的污水处理始终 是个头疼的问题，有机物含量高，成分复杂，尤其是酒糟的利用更为困难，原料的 利用不充分，污水处理的成本高，一直制约着酒精产业的发展。采取原料提前除渣，誊一 清液发酵生产酒精，是解决淀粉质原料酒精发酵污水处理难题的方案之一【2 5 】。有研 究表明用上述方法生产的微生物饲料具有良好的经济效益，原料利用率可提高3 ， 水利用率提高5 0 ，而且污水处理成本大大降低，能源利用率也得到提高，1 t 玉米平。 均提高经济效益6 0 元。大大优化了酒精的发酵生产，原料、水、能源得到全方位充 分的利用，是酒精生产提高经济效益的新途型2 6 1 。 1 3 2 酒精生产中采用清液发酵的优点 ( a ) 清液发酵便于发酵新技术的采用 近年来，酒精高强度连续发酵技术研究已取得许多中试成果，如细胞循环发酵， 悬浮床或固定化细胞发酵，发酵与分离耦合的发酵技术等，但是这些成果在淀粉质 原料生产酒精工艺中不能直接广泛应用的原因除技术本身的因素外，主要是料液带 渣的原因，料液带渣会使固定化细胞活性很快降低，使细胞循环技术无法采用。 m ) 清液发酵便于提纯操作单元的合理配置 由于发酵液中无固形物，不存在堵塔问题，提糟塔可以选用更高效的塔坂；塔 釜加热也可采用间接加热方式，使废醪量减少，便于进一步浓缩干燥或全回流拌料 等处理；节能的差压精馏技术可以更方便地应用。 ( c ) 清液发酵改善了装置运行状况 5 河北科技大学硕+ 学位论文 采用清液发酵后，设备的堵塞情况大大减少，因而停工检修次数减少；仪器的 检测控制更为可靠，操作更为稳定；同时，设备的磨损减轻，使用寿命延长。另外， 带渣发酵时为了调节和稳定流量必须选用的庞大的可调速往复泵也可以用普通泵替 代。 “ ( d ) 清液发酵便于生产线实现不同产品之间的调整 目前，与酒精生产相近的行业，如有机酸、氨基酸、甘油等均为清液发酵。在 市场经济下，生产线能适时地调整产品对经营者参与市场竞争无疑是有好处的，带 渣发酵生产酒精，生产线与上述产品生产的兼容性差，而酒精生产采用清液发酵在 这一点上有其特有的优势。 ( f ) 清液发酵污染小于带渣发酵 淀粉质原料酒精清液发酵中，固液分离提前，使得残渣的浸泡时间大大缩短， 溶进糖液中且对发酵无用的成份减少，以污水形式跑掉的有价成份减少【2 7 ，2 8 2 9 1 。 总之，清液发酵法制酒精可以降低醪液的粘稠度，简化生产过程，缩短发酵周 期，便于采用低温蒸煮、连续发酵，特别是废液回用等先进工艺，具有良好的应用 前景。丙酮丁醇发酵与酒精发酵过程接近，基于酒精清液发酵的上述诸多优点，可 考虑丙酮丁醇的清液发酵。 1 4 国内外研究现状分析 1 4 1 丙酮丁醇发酵研究现状 2 0 0 4 年以来石油价格持续攀升，2 0 0 7 年国际原油价格每桶逼近1 0 0 美元，通过石 油获得丙酮、丁醇的成本大幅提高，从而采用发酵法生产丙酮、丁醇重新显示出其 优势。2 0 0 4 年河南天冠企业集团公司下属的上海天之冠可再生能源有限公司和中国 科学院上海生命科学研究院正式签订了丙酮丁醇发酵技术合作项目。2 0 0 7 年6 月由联 通实业、上由房地产公司等公司投资8 0 0 0 万美元兴建了江苏联海生物科技有限公司， 设计年产2 0 万吨正丁醇、1 0 万吨丙酮，一期工程于2 0 0 8 年6 月竣工，同时国内其它溶 剂生产厂家也在恢复生产。 我国生产丙酮、丁醇已有四十多年的历史。绝大多数厂家采用以玉米或谷物为 原料进行发酵。经过多年的工业实践和不断探索，已实现连续发酵生产，而且其生 产工艺水平、各项技术经济指标在国际上已处于领先地位【3 0 】。丙酮丁醇发酵一度衰 落，其原因除了石化工业的迅速发展外，还有该工艺自身的弱点。产物中的丁醇对 细胞的毒性限制了最终的总溶剂浓度，导致提取成本较高，污水处理困难。难以与 化学合成法相竞争，所以菌种改良的目标就是要选育高丁醇耐受性、高丁醇比例的 高产菌种，以期能够在一定程度上降低生产成本。山西大学颜叙秀【3 l 】采用紫外线诱 变处理，筛选到代谢产物提高、稳定性好的菌种，总溶剂比出发菌株提高了约3 6 。 6 第1 章绪论 上海植物生理研究所张益菜等 3 2 】用亚硝基胍和甲基磺酸乙酯先后处理菌种，筛选到 高丁醇比例的丙酮丁醇梭菌，百吨发酵罐试验中，丁醇比例达到7 1 9 ，比原始菌株 高1 0 左右。a n i l o u s 等【33 】用亚硝基胍做诱变剂，以葡萄糖的类似物2 脱氧葡萄糖作 为抗代谢阻遏物筛选得到有很高淀粉酶活性的c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u mb a10 1 ，其 间歇发酵得到丁醇含量可以达到1 9w l ，比出发菌株要提高约1 0 0 。另外，传统的 丙酮丁醇发酵主要以间歇发酵和蒸馏提取的方式进行，目前，其较低的产物浓度导 致后续分离提取费用高，占总成本的大部分，所以开发低能耗的发酵与提取工艺对 增强丙酮丁醇发酵的经济竞争力是至关重要的【3 4 】。一些发酵工艺，如全蒸发发酵， 连续发酵，高密度发酵，固定化细胞连续发酵等方面的技术攻关，为采用发酵法生 产丙酮丁醇的工厂提供了技术支持【3 5 】。 1 4 1 1 丙酮丁醇发酵新菌种选育 ( a ) 高丁醇耐受性菌种的选育 由于丁醇对细胞的毒性产生抑制作用，发酵液中丁醇的含量很难达到较高的浓 度，这大大影响了溶剂的产率。提高菌种对丁醇的耐受性，是丙丁间歇发酵提高溶 剂产率的先决条件。然而，由于丁醇对细胞毒性的复杂性，筛选耐丁醇的高产菌难 度极高。z h o u 等【3 6 j 报道，细胞自溶素活性的降低可以增加细胞对丁醇的耐受性。他 们用氯霉素处理菌种，使得自溶素的活性降低了4 0 ，丁醇的产量提高了3 0 。作者 认为，采用原生质体融合是一种提高菌种对丁醇耐受性的好方法，将高耐受丁醇的 菌和丙丁菌进行融合，理论上可能筛选到高丁醇耐受性的高产菌种【3 7 1 。 ( b ) 高丁醇比例菌种的选育 一般丙酮丁醇发酵中，产物丁醇、丙酮、乙醇的比例大概为6 ：3 ：1 ，而实际上需 要的是更高比例有更广泛用途的丁醇。随着基因工程及代谢工程的发展，人们可以 在现有的研究基础上进一步阐明代谢过程的限速酶，解除代谢过程中可能存在的产 物抑制或者中间产物的抑制，从而使得丙酮丁醇发酵高效快速的进行。强化丁醇生 产中的关键酶，如乙酰乙酰c o a 转移酶、丁醛脱氢酶等，加强丁醇的生成代谢，是 提高丁醇比例的较好方法。另外，通过对乙醛脱氢酶基因的敲出，切断乙醇生成代 谢，减少乙酰c o a 的消耗，是提高丁醇比例的间接途径【3 8 】。 1 4 1 2 丙丁发酵新工艺的研究及优化 ( a ) 固定化细胞技术 吸附法：选择新鲜的玉米芯洗净，粉碎烘干，高温1 2 0 0 c ，灭菌2 h ，投到对数生 长期发酵液中，自然吸附数小时后，经无菌水洗涤，即可制得玉米芯固定化细胞载 体，可直接用于发酵。 包埋交联法：以p v a 为基体，另外加入一定比例的凝固剂、交联剂等几种物质， 分别为甘油、硅藻土、硫酸镁、硫酸铵、硼砂、磷酸二氢钾、顺丁烯二酸酐、水以 河北科技大学硕士学位论文 及菌悬液等，按一定的比例和添加顺序，冷冻、切块制成一种高分子化合材料。试 验证明，该材料从强度、柔性、细胞的通透性等方面考虑为良好的载体【3 9 1 。 与传统发酵法相比，具有以下优点：反应速度快，产率高；可在高稀释度的情况 下操作而不致产生流失现象；可降低很多粮耗和能耗；不需要庞大的发酵罐设备，应 用生化反应器，使设备投资大大减少；工艺先进，便于采用现代化科学管理，控制方 便【柏1 。 ( b ) 二步发酵法 连续培养能有效的降低丁醇的毒性。采用这一技术能使微生物的产酸和溶剂生 成两个阶段分别在两个发酵罐中完成。第一个阶段高密度细胞培养，产酸，细胞的 生长主要产生于第一阶段；第二阶段连续添加新鲜的细胞以提高生产过程的寿命， 连续发酵最大的优点是溶剂浓度高达2 0 l 的时间长达3 0 天，培养中未发现菌种有 任何退化，产率比较稳刘4 1 ，4 2 1 。 ( c ) 萃取发酵 正常的丙酮丁醇发酵，当发酵醪中丁醇的含量达到5g l 时，发酵就会受到影响， 达到1 0g l 时，丙酮丁醇菌的生长就受到抑制。丁醇是抑制发酵的主要因素，萃取发 酵是采用萃取和发酵相耦合的方法，利用萃取剂或萃取设备将代谢