（发酵工程专业论文）水溶性功能红曲粉的制备、稳定性及应用研究.pdf

摘要 摘要 含莫纳可林k ( m o n a c o l i nk ) 的红曲产品具有明显的抑制胆固酵合成和降血脂的功 效。目前市场上的降脂红曲产品类型主要是固态发酵方法生产的功能性红曲米粉，除了 含有降脂功效的m o n a c o l i nk 之外，还含有大量的残余淀粉，由于其水溶性差，无法直 接添加到液态食品中使用，因此常用红曲粉胶囊作为保健品或药品的终端产品形式，这 很大程度上限制了功能性红曲的使用范围。目前市场上对功能性红曲产品的需求不断增 加。本课题以功能性红曲米为原料，制备水溶性功能红曲产品，并对这一产品中的主要 功能性成分m o n a c o l i n k 在液体中的稳定性和水溶性功能红曲的应用进行了研究。 本文以红曲菌9 9 0 8 作为生产菌株，研究了其固态发酵工艺条件。通过单因素和正 交实验确定最优发酵条件如下：培养基配方：基质装料量8 0g l ( 大米与小米比例7 ：3 ) ； 1 0 0g 物料中，初始加水量7 0m l ，葡萄糖和玉米浆添加量分别为1 0g 和4g ；拌料水初 始p h 值3 。发酵工艺条件：采用1l 三角瓶，接种量o 4 0m l g ( 以物料质量计) 、温度 为先3 0 培养4d 后2 6 培养、发酵时间2 0d ，所产功能性红曲米中m o n a c o l i nk 含量 可达5 1 0 0m 眺g ，比优化前m o n a c o l i nk 产量提高了一倍，且红曲米中未检测出桔霉素， 达到工业化生产要求。 为制备水溶性功能红曲产品，对功能性红曲米的浸提工艺进行了详细研究，确定了 最优提取条件：6 0 乙醇总用量1 5m u g 于6 0 下分三次浸提红曲米，总浸提时间6 0 m i n ，红曲米中m o n a c o l i nk 提取率最高达9 0 。6 。同时研究了多罐组逆流浸提工艺在提 取红曲米m o n a c o l i nk 中的应用，研究表明采用三罐组逆流浸提工艺，在相同工艺参数 下与单罐三次提取相比，可节省1 3 的提取时间，少用3 7 1 的加热水蒸汽用量，提取 率提高了1 2 。 研究了红曲m o n a c o l i nk 在水溶液中的稳定性，实验发现红曲m o n a c o l i nk 在水溶 液中的热稳定性较好，1 0 0 下处理6 0m i n ，其水溶液中m o n a c o l i nk 损失5 左右，酸 型m o n a c o l i nk 所占比例基本无变化。酸性环境下，酸型m o n a c o l i nk 易向内酯型转化， 使水溶液中红曲m o n a c o l i nk 的溶解度下降，同时对溶液中m o n a c o l i nk 有破坏作用。 p h 值位于6 0 。7 0 时，溶液中的m o n a c o l i nk 含量及类型较稳定。长时间的光照可促进 水溶液中m o n a c o l i nk 的降解。食盐、氨基酸、维生素c ( v c ) 均可降低红曲m o n a c o l i nk 的溶解度，但对水溶液中酸型m o n a c o l i nk 所占比例影响甚微。适当的蔗糖浓度可提高 红曲m o n a c o l i nk 在水溶液中的溶解度，但对m o n a c o l i nk 结构转化无作用。 使用水溶性功能红曲粉制备红曲饮料醋和红曲酒，实验结果表明红曲饮料醋热稳定 性不好，1 0 0 下加热3 0r a i n ，溶液中m o n a c o l i nk 损失率可达4 6 3 ，酸型m o n a c o l i nk 所占比例基本无变化。醋液酸度对醋液中m o n a c o l i nk 的稳定性有影响，选用酸度5 0 l 以下的饮料醋较好。长时间光照可促进溶液中m o n a c o l i nk 的降解。红曲酒在长时间的 存放和光照条件下，溶液中m o n a c o l i nk 含量及酸型m o n a c o l i nk 所占比例几乎无变化， 稳定性较好。 关键词：红曲菌：功能性红曲：稳定性；浸提；水溶性；m o n a c o l i nk a b s t r a c t a b s t r a c t t h ef u n c t i o n a lr e dr i c e ( f r r ) c o n t a i n i n gm o n a c o l i nkc o u l di n h i b i tt h es y n t h e s i so f c h o l e s t e r o la n dr e d u c eb l o o dl i p i ds i g n i f i c a n t l y t h ef r r p r o d u c e db yt h et r a d i t i o n a ls o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o nc o n t a i n sn o tn o l ym o n a c o l i nk b u tal a r g ea m o u n to fs t a r c h f p rc a p s u l e s a r eu s u a l l yt h ee n dp r o d u c t so fh e a l t h c a r ea n dm e d i c a ld r u g sd u et ot h ef a c tt h a tf r rc a nn o t b ea d d e di n t ot h el i q u i df o o dw i t ht h ep o o rs o l u b i l i t y , t h u st h ea p p l i c a t i o n so ff r ra r e l i m i t e d t h ed e m a n df o rw a t e r - s o l u b l ef r ri s i n c r e a s i n gi nt h em a r k e tc u r r e n t l y i nt h i s d i s s e r t a t i o n ，t h ep r o c e s so fp r e p a r i n gw a t e r - s o l u b l ef 剐rp r o d u c t sf r o mf 剐rp o w d e rw a s d e v e l o p e d a sm o n a c o l i nk i st h em a i nf u n c t i o n a lc o m p o n a n to fw a t e r s o l u b l ef r rp r o d u c t s t h es t a b i l i t yo fm o n a c o l i nki nw a t e ra n dt h ea p p l i c a t i o no ft h i sp r o d u c tw e r ei n v e s t i g a t e di n t h i ss t u d y m o n a s c u ss p 9 9 0 8w a su s e da st h ef r r p r o d u c i n gs t r a i n a n dt h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t o n sw e r ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m a lp r o c e s sp a r a m e t e r sb yt h eo n e v a r i a b l e a t a - t i m e e x p e r i m e n ta n do r t h o g o n a le x p e r i m e n ta r ea st h ef o l l o w i n g ：t h ec u l t u r em e d i u mw a s c o m p o s e do f 8 0gc e r e a li na1le r e l e n m e y e rf l a s k ( t h er a t i oo fr i c et om i l l e ti s7 ：3 ) ，a d d w a t e r5 6m l ，a n dt h ep ho ft h ew a t e ri s3 0 g l u c o s eo f0 10g g ，c 0 1 t is t e e po f0 0 4g g ，t h e f e r m e n t a t i o np r o c e s s ：w i t ha ni n o c u l u m nt oa1le r l e n m e y e rf l a s ko f0 4 0m l g t h ec u l t u r e w a sf e r m e n t e da t3 0 。cf o r4d a y sa n dt h e nw a sc u l t u r e da t2 6 f o r2 0d a y sm o r e t h e c o n c e n to fm o n a c o l i nki nt h ef r rc o u l dr e a c h5 0 0 0m g & g ，i n c r e a s e db y2 - f o l d sc o m p a r e d t ot h ep r e v i o u sr e s u l tb e f o r eo p t i m i z a t i o n a n dt h er e q u i r e m e n to fi n d u s t r i l i z a t i o nw a s a c h i e v e d m o r e o v e r ，n oc i t r i n i nw a sd e t e c t e di nt h ep r o d u c e df r rb yt h ea b o v eo p t i m i z e d c u l t u r ep r o c e s s t op r e p a r ew a t e rs o l u b l ef r r t h ee x t r a c t i o nt e c h n i q u eo ff r rw a ss t u d i e di nd e t a i la n d t h eo p t i m a le x t r a c t i o np r o c e s sw a so b t a i n e d f r rp o w d e rw a se x t r a c t e da t6 0 f o rt o t a lt i m e o f 6 0m i nw i t he t h a n o l ( 6 0 ) f o rt h r e et i m e s ，i nat o t a lr a t i oo f15m l g t h er e c o v e r yr a t eo f m o n a c o l i nkc o u l d r e a c ha sh i g ha s9 0 6 m e a n w h i l e m u l t i r e a c t o rc o u n t e r c u r r e n t e x t r a c t i o nt e c h n i q u ei nm o n a c o l i nke x t r a c t i o nw a sa l s op e r f o r m e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t w i t ht h r e er e a c t o rc o u n t e r c u r r e n te x t r a c t i o nt e c h n i q u e t h ee x t r a c t i o nt i m ew a sr e d u c e db y1 3 ， t h es t e a ma m o u n tw a sr e d u c e db y3 7 1 ，a n dt h er e c o v e r yr a t ew a si n c r e a s e db y1 2 ， c o m p a r e dw i t ht h es i n g l er e a c t o rt e c h n i q u e ( e x t r a c t i o n e db yt h r e et i m e s ) ，u s i n gs a m ep r o c e s s p a r a m e t e r s t h es t a b i l i t yo fm o n a c o l i nki nl i q u i d s o l u b l ef u n c t i o n a lr e dy e a s tr i c ew a ss t u d i e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h et h e r m a ls t a b i l i t yo fm o n a c o l i nki nw a t e r - s o l u b l ef r rw a sv e r y g o o d 。t h ec o n c e n t r a t i o no fm o n a c o l i nk i nw a t e ri u s td e g r a d e db ya r o u n d5 a t10 0 f o r6 0 m i n t h ep o r p o r t i o no fa c i df o r mm o n a c o l i nki nw a t e ri sa l m o s tu n c h a n g e d a c i df o r m m o n a c o l i nkw a sc o n v e r t e dt o1 a c t o mf o r mm o n a c o l i nki nt h ea c i d i ce n v i r o n m e n t ，a n d m o n a c o l i nki nw a t e rc a nb ed e s t r u c t e ds ot h a tt h ec o n c e n t r a t i o no fm o n a c o l i nkd e c r e a s e d a l s o 。t h ec o n t e n ta n dt y p e so fm o n a c o l i nki nw a t e rw e r ec o m p a r a t i v e l ys t a b l ew h e nt h ep h r a n g ew a s6 0 7 0 t h em o n a c o l i nk i nw a t e ri ss l i g h t l yd e s t r u c t e dw h e ne x p o s u r et ol i g h tf o r al o n g t i m e t h es o l u b i l i t yo fm o n a c o l i nki nw a t e rc a nb ed e g r a d e db yv i t a m i nc ，s a l to r a m i n oa c i d 。w h i c hh a dl i r l ei n f l u e n c eo nt h er a t i oo fa c i df o r mm o n a c o l i nki nw a t e r t h e l i 江南火学硕士学位论文 s u c r o s ew i t hap r o p e rc o n c e n t r a t i o nc o u l di n c r e a s et h es o l u b i l i t yo fm o n a c o l i nk ，h o w e v e r , h a dn oe f f e c to nt h es t r u c t u r et r a n s f o r m a t i o no fm o n a c o l i nk t h ew a t e rs o l u b l ef r rw a su s e dt op r e p a r ef u n c t i o n a lv i n e g a rb e v e r a g e sa n dm o n a s c u s w i n e t h et h e r m a ls t a b i l i t yo fm o n a c o l i nki nv i n e g a rb e v e r a g e si sp o o r t h ec o n c e n t r a t i o no f m o n a c o l i n ki nv i n e g a rb e v e r a g ed e c r e a s e db y4 6 。3 w h e nh e a t e da t10 0 f o r3 0r a i n t h e r e w e r ef e wc h a n g e so ft h er a t i oo fa c i df o r mm o n a c o l i nk a c i d i ce n v i r o n m e n th a di n f l u e n c e s o nt h es t a b i l i t yo fm o n a c o l i nki nv i n e g a rb e v e r a g e s ，a n dab e t t e rs t a b i l i t yi nv i n e g a r b e v e r a g e sw a so b s e r v e dw i t hi t sa c i d i t yl o w e rt h a n5 0e g l t h em o n a c o l i nki nv i n e g a r b e v e r a g e sc o u l db ed e g r a d e db yi l l u m i n a t i o nf o ral o n g t i m e w i t hal o n g - t i m eo fs t o r a g ea n d i l l u m i n a t i o n t h ec o n c e n t r a t i o no fm o n a c o l i nka n dt h er a t i oo fa c i df o r mm o n a c o l i nkw e r e a l m o s tu n c h a n g e d ，a n dt h es t a b i l i t yw a sb e t t e r k e y w o r d s ：m o n a s c u s ；f u n c t i o n a lr e dr i c e ；s t a b i l i t y ；e x t r a c t ；w a t e r - s o l u b l e ；m o n a c o l i nk i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签 名：毯烃 日期： 迎幽坐： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 导师签名： 日 期： 第一章前言 第一章前言 1 1 红曲及其活性物质研究概况 红曲也称“丹曲”，一直被认为是具有药用和食用双重功效的产品。传统的红曲是 指以大米为原料，接种红曲菌经固态发酵而成的红曲米。目前红曲的定义有所外延，广 义的红曲是指以红曲菌为菌种，发酵( 包括固态发酵和液体发酵) 而制成的各类产品的总 称。红曲的应用在我国有着很长的历史，红曲烹调食物的最早记载见于五代陶谷的清 异录：“有赐绯羊，其法以红曲煮肉，紧卷，石镇，深入酒骨腌透，切如纸薄袄，乃 进”，这也是红曲色素应用于食品方面的最早记录。明代李时珍在本草纲目中记述 了红曲在中医学中的应用：“红曲主治消食活血，健脾燥胃，治赤白痢，下水谷。酿酒， 破血行药势，杀破血行药势，杀山岚瘴气，治打扑伤损 ，“治女人血气痛及产后恶露 不尽，擂酒饮之良”【l j 。现代科学研究报告表明，红曲菌能产生多种次级代谢产物，主 要是红曲色素、m o n a e o l i nk ；此外红曲米中还含有麦角固醇、葡萄糖胺、1 ，一氨基丁酸 ( g a b a ) 等多种生理活性物质。正是这些生理活性物质赋予了红曲具有降血脂、降血压、 抗氧化、抗菌、抗疲劳、预防老年痴呆等多重功效，并使其具有很高的商业价值，j 4 j 。 红曲菌是腐生真菌，生长的最适p h 值为3 5 5 0 ，嗜酸，尤嗜乳酸，故常出现在乳酸 自然发酵的基质中。它能以多种糖、醇类物质和一些酸类物质为碳源，能利用各种氮源， 因此其生活能力非常强。有关红曲菌属的分类目前有多种不同的方法。张纪忠和俞大级 等采用的分类系统是将红曲菌属归于真菌界( t h ef u n g i ) 、真菌f ( e u m y c o t a ) 、子囊菌亚 门( a s c o m y c o t i n a ) 、不整子囊菌纲( p l e c t o m y h c e t e s ) 、散囊菌目( e u r t o t i a l e s ) 、红曲科 ( m o n a s c a c e a e ) 。目前己有人采用分子分类学方法对红曲菌进行分类，这可作为红曲菌真 菌系统分类的客观而有效的手段之一i 气6 | 。 1 2 降脂功能性红曲研究进展 红曲既是传统发酵食品( 如红曲色素) ，又是传统的发酵中药。本草纲目指出，红 曲具有消食活血，健脾燥胃的功效。1 9 7 9 年远藤章从红曲菌m o n a s c u sr u b e r 的发酵代谢 产物中发现了m o n a c o l i nk ，m o n a c o l i nk 是甲基二羟基戊酸的结构类似物，甲基二羟基 戊酸( 甲羟戊酸) 的合成是胆固醇合成的关键反应或限速反应【2 】，因而m o n a c o l i nk 是胆固 醇生物合成代谢途径中的一种限速酶( h m g c o a r e d u c t a s e ) 的抑制剂。故m o n a c o l i nk 有 很强的降低胆固醇的作用，具有降低低密度脂蛋i 刍( l d l ) ，提升高密度脂蛋白( h d l ) 的 作用，从而能调节人体内异常血脂。1 9 8 0 年美国的a l b e r t s 等人也从土曲霉( a s p e r g i l l s t e r r e u s ) 发酵液中发现了洛伐它汀( l o v a s t a t i n ，m e v i n o l i n ) ，研究表明洛伐它汀和红曲中的 m o n a c o l i nk 是同一种物质【7 】o 除了含有m o n a c o l i nk 外，红曲色素是红曲产品中含量最 高的成分。红曲色素现已明确有6 种基本分子结构，且都具有一定的生理活性，以橙色 素的生理活性最强。橙色素是红曲中一种主要的抑菌物质，能够抑制革兰氏阳性菌以及 大肠杆菌。国内最近对降脂红曲中所含有的其它生理活性物质研究较深入的一篇报道表 明【8 】，红曲中粗脂肪含量为2 0 5 7 5 2 0 6m e g g ，其中油酸占3 8 6 9 、亚油酸占3 2 2 1 、 棕榈酸占1 5 4 4 、硬脂酸占7 5 1 2 ，红曲中麦角甾醇的含量为0 7 3 6 6 0 9 5 4 3m e g g ，红 江南火学硕士学位论文 曲中磷脂酰胆碱的含量为0 7 5 1 3 - 1 5 6 7m g g ，红曲中总黄酮的含量为1 0 2 6 - 1 3 6 2m g g 。 国内外大量的临床治疗效果表明降脂红曲具有明显的降胆固酵和降血脂的功效【9 】。功能 性红曲中生理活性组分很多，国内外学者已对其药理价值进行研究【1 0 , 1 1 , 1 2 】，运用现代生 物技术、化学方法对其进行了提取、分离、分析和鉴定，其功能成分有的已被确认，如 现已证明葡萄糖胺、1 ，氨基丁酸具有降血压作用，有的其作用机理目前尚不明确，有待 于进一步研究。 1 2 1 降脂功能性红曲主要活性物质m o n a e o l i nk 的结构及理化性质 m o n a c o l i nk 的主要结构为氢化萘母核、b 羟6 内酯环和2 甲基丁酸。根据母核上 两处支链结构的不同，可以形成多种m o n a c o l i n 类物质( 图1 1 ) 。 o m l 2 3 6 a m 几一2 3 6 b ( c o m p a c t i n ) m l 2 3 6 c m o n a c o l i nj m o n a c o l i nk ( m e v i n o l i n ，l o v a s t a t i n ) m o n a c o l i nl r 1 = h r l = h r i = h r 1 = c h 3 r i = c h 3 r l - c h 3 r 2 = o h 8 r 2 = o 厂 c 鸭 h 筘 i 乙= h r 2 = o h 0 r 2 。o p c 鸭 r 2 = h ”3 c 图1 1m o n a c o l i nk 及其结构类似物的结构图 f i g 1 1f i g 1 1t h es t r u c t u r eo f m o n a c o l i nka n dr e l a t e dc o m p o u n d s m e v i n o l i n m e v i n o l i n i ca c i d ( 内酯型m o n a c o f i nk)(i殴型monacolin k ) 图1 - 2m o n a c o l i nk 的两种结构类型 f i g 1 - 2t w oc o n v e r s i o ns t r u c t u r e so fm o n a c o l i nk m o n a c o l i nk 有酸型和内酯型两种结构形态，如图1 2 所示。在常态下是透明的针 状结晶；酸型m o n a c o l i nk 有一定水溶性；内酯型m o n a c o l i nk 不易溶于水：两者均易 溶于甲醇，乙醇，丙酮，氯仿和苯；分子式：c 2 4 h 3 6 0 5 ( 内酯型) ；分子量4 0 4 5 5 。 1 2 2 降脂红曲m o n a c o l i nk 的降胆固醇药理及特点 胆固醇是动物体内最重要的固醇，通常以游离或酯化的形式存在于动物组织或体液 之中，血清中的胆固醇水平过高可引起动脉硬化和冠心病。人体胆固醇7 0 8 0 是由体 内生化合成的。3 一羟基3 一甲基戊二酰基辅酶a 还原酶( h m g c o ar e d u c t a s e ) 是控制体内 胆固醇合成速度的关键酶，胆固醇生物合成途径【1 3 j 见图1 3 。 2 第一章前言 m o n a c o l i nk 作为h m g c o a 还原酶竞争性抑制剂，因此可以有效减少或阻断内源 性胆固醇的合成。m o n a c o l i nk 有内酯型和酸型两种结构，化学合成和土曲霉生产的洛 伐他汀药物为内酯型m o n a c o l i nk ，需要在体内水解成相应的酸型结构而发挥药效，由 于需要消耗体内的羟基酯酶，长期使用会增加肝肾负担，常见副作用有腹痛、恶心、呕 吐等症状。天然红曲中的m o n a c o l i nk 多为酸型，其空间结构与体内h m g c o a 更为接 近，无需水解，直接发挥抑制体内胆固醇合成的作用，其活性较内酯型高约一倍。临床 试验表明，当血液中m o n a c o l i nk 的浓度达到0 0 0 1 - - , 0 0 0 5j _ t g m l 时【9 1 ，体内胆固醇合成 就会受阻。天然降脂红曲已被作为天然药物中抑制胆固醇合成和降血脂的首先药物，备 受瞩目。 a c e t y lc o a + a c o t o a c e t y lc o a h m gc o a ( 乙酰辅薛a + 乙鬣乙靛辅酶a ) 叶 ( 3 羟3 甲基戊二鬣辅醇a ) m o v a i o n a t e ， ge r a n y l p ps o p e n t e n y l p p ，一一一 l f a r n e s y i - p p , ) s 嚣e ( 鲨烯) ( 甲弪戊啕、 m e v a l 。a 。e p p f i g 1 - 3 。1 a eb i o s y n t h e s i sp a t h w a yo fc h o l e s t e r o l 1 3 降脂功能性红曲的生产及应用现况 目前，降脂功能性红曲的生产仍然采用以谷物为原料的固态发酵生产方法，而采用 液态深层发酵法的工业化生产尚未有报道。以固态发酵法生产所得的全部发酵产物均可 入药，这样不仅可以省去提取过程，并且发酵产物中所含有的多种有益组分协同作用更 有助于全面治疗。但固态发酵法生产存在生产不均一，稳定性差，自动化低等缺点。降 脂红曲的生产原料来源广泛，大米、小米、小麦或玉米均可用于生产降脂红曲。这些虽 然都是谷物原料，但这些原料的组成仍然有差别，这些差别也造成了降脂红曲中各种代 谢产物相对含量的不同。红曲生产菌株按国际惯例可分为丛毛红曲菌( m p i l o s u ss a t o ) ， 红色红曲菌( m r u b b e rv a t lt i e g h e m ) ，紫色红曲菌( m p u r p u r e u sw e n t ) ，上述三种菌均可用 于降脂红曲生产，但不同的微生物其代谢产物显然是有差别的。由于生产原料的差别、 生产菌种的区别、微生物代谢产物的多样性及生产技术的不同，造成国内降脂类红曲产 品质量良莠不齐。所以从生产的角度来看，应从生产菌种，生产方法和生产原料方面加 以规范。 降脂功能性红曲类产品具有良好的降脂功效，与西药他汀类、传统中成药、鱼油类、 亚麻酸类成为目前常用的调节血脂产品。西药他汀类产品是目前治疗心脑血管疾病疗效 最确切，起效果最快的产品，然而却无法避免其存在的巨大毒副作用。传统中成药、鱼 油类、亚麻酸类产品对心脑血管疾病的预防有很好的作用，但在治疗方面起效缓慢，使 江南人学硕士学位论文 其在临床上使用具有一定局限性。功能性红曲类产品与西药他汀类相比，其所含的天然 洛伐他汀更具安全性，与传统中成药、鱼油类、亚麻酸类相比，在治疗效果上更胜一筹， 起效迅速。同时功能性红曲以谷物为原料，生产成本低，使其产品更容易让广大消费者 接受。目前我国已进入老龄化社会，统计数据显示这些老人中8 8 以上患有不同程度的 心脑血管疾病，同时随着人类社会生活水平地普遍提高，高血脂和高血压的发病率也呈 逐年上升趋势，因此降脂红曲这一产品有望为解决高血脂和高血压疾病作出巨大的贡 献。 中国目前是降脂红曲药品、保健品及降脂红曲原料的生产大国，国内已形成了年产 数千吨这类产品的生产规模。这类产品大致分为功能性红曲原料，降脂红曲( 保健食品) 和降脂红曲药品三类。国内有北京与成都两家公司分别推出了以降脂红曲为主要原料的 “血脂康与“脂必妥”两种降血脂药物，并获得极大成功。除降脂红曲药品在国内有 较大的市场份额外，少量的保健用降脂红曲也正不断发展；同时，国内还有一些企业生 产并向国外大量出口降脂红曲原料( 称为功能性红曲米粉或降脂红曲米粉) 。反观国外， 降脂红曲类保健品开发利用如火如荼，如美国n c ( n u t r a c e u t i c a lc o r p o r a t i o n ) 公司，已利 用功能性红曲开发出4 8 种保健品及药品，并获得巨大的商业利益【l4 1 。因此大力开发利 用功能性红曲产品刻不容缓。功能性红曲味苦，目前保健和医药类红曲的产品形式是不 能完全溶于水的粉末状，故终端产品只能制成胶囊形式【l 引，这就大大限制了功能性红曲 的应用范围。但国外有的开发商己开始在液态食品( 如速溶咖啡、豆奶粉及饮料) 中加入 功能性红曲产品，因此急需开发水溶性能良好的功能性红曲产品，国内外对此研究甚少， 功能性红曲的功效性成分在溶液状态下会呈现如何的变化规律也缺乏系统的研究。 1 4 立题意义及研究思路 本课题是国家科技支撑计划项目功能性食品的研制和开发，与江苏恒顺集团合 作的子课题“功能性醋生产的关键技术研究”的一部分。该集团希望将醋产品与功能性 红曲产品结合起来开发功能性红曲醋产品，目前生产的“红曲醋胶囊 保健产品，是一 种半固态的终端产品。本课题研究打算开发种液态状的功能性红曲醋产品。但功能性 红曲液态产品的开发在国内外还处于前期研发阶段，有必要开展有关的基础性研究工 作，以解决红曲的功能性成分m o n a c o l i nk 在液态终端产品中的稳定性及功效。 功能性红曲米中除了含有降脂功效的m o n a c o l i nk 之外，还含有大量的残余淀粉， 由于其水溶性差，不能直接添加到液态食品中使用，因此常用红曲粉胶囊作为保健品或 药品的终端产品形式，从而限制了功能性红曲的使用范围，因此有必要开发一种具有良 好水溶性的功能性红曲产品，同时对红曲m o n a c o l i n k 在水溶液中的稳定性进行研究， 以确保利用该产品开发的相关降脂红曲保健食品及药品质量稳定，从而扩大降脂红曲的 使用范围。根据以上考虑，确定本课题的主要研究思路如下：首先采用红曲菌固态发酵 工艺，利用紫色红曲菌株9 9 0 8 不产桔霉素的优点【i 引，通过实验优化生产工艺条件，生 产m o n a c o l i nk 含量较高的降脂功能性红曲米；其次以功能性红曲米为原料，研究制备 水溶性功能红曲产品所需的工艺；最后研究水溶性功能红曲中m o n a c o l i nk 在水溶液中 的稳定性，并开发相关的降脂红曲保健产品。通过开展上述工作，以为将来降脂功能性 4 第一章前言 红曲产品的开发使用提供理论基础。 1 5 论文主要研究内容 1 红曲菌9 9 0 8 固态发酵生产功能性红曲米的发酵条件研究； 2 水溶性功能红曲制备工艺的研究； 3 功能性红曲中m o n a c o l i nk 在水溶液中的稳定性研究； 4 降脂功能性红曲保健饮料醋与保健酒产品的开发初探。 江南大学硕士学位论文 第二章红曲菌9 9 0 8 固态发酵生产红曲米的发酵条件研究 2 1 前言 目前，功能性红曲米的生产主要以固态发酵方式为主。本实验室保存的一株紫色红 曲菌9 9 0 8 ( m o n a s c u sp u r p u r e u s9 9 0 8 ) ，是一株适合固态发酵且不产桔霉素的菌种17 1 。本 课题开始前，该菌种生产的功能性红曲米 m o n a c o l i nk 含量为2 3 0 0m g k g 左右，且各批 次间不稳定。为此，对该菌种的固态发酵条件进行研究以其提高功能性红曲米中的 m o n a c o l i nk 含量。 2 2 材料与方法 2 2 1 茵种 紫色红曲菌9 9 0 8 ( m o n a s c u s p u r p u r e u s9 9 0 8 ) ，本实验室保存。 2 2 2 实验仪器 h p11 0 0 高效液相色谱仪( 美国a g i l e n t 公司) ；t h z c 恒温振荡培养箱( 江苏太仓实验 设备厂) ；s p x 一2 5 0 c 型恒温恒湿培养箱( 上海博讯实业有限公司) ；水分天平。 2 2 3 培养基 ( 1 ) p d a 琼脂斜面培养基：2 0 0g 土豆去皮，切块，加水煮沸3 0m i n ，纱布过滤，滤液 中加入2 0g 葡萄糖，2 0g 琼脂，融化后加水至1 0 0 0m l ，分装后于1 2 1 灭菌2 0m i n 。放 置斜面。 ( 2 ) 种子培养基( g l ) ：葡萄糖4 0 ，蛋白胨2 0 ，n a n 0 32 ，m g s 0 4 7 h 2 01 0 ， k h 2 p 0 4 。3 h 2 01 0 ，z n s 0 4o 0 2 ，p h5 5 。 ( 3 ) 固态发酵培养基：称取1 0 0g 大米加入拌料水( p h = 4 ) 8 5m l 装于1l 三角瓶中，于 1 2 1 灭菌2 0m i n 。 2 2 4 培养方法 孢子悬浮液的制备：取斜面菌种一支，加入适量无菌水和少量玻璃珠，充分振荡后 用无菌滤纸过滤，再以血球计数板计数，使孢子浓度达到1 0 6 个m l 。 红曲菌种子培养：2 5 0m l 三角瓶装液量3 5m l ，接种量：孢子悬浮液2m l 。3 2 c 往复式摇床，1 0 0r m i n 振荡培养4 8h 左右。 固态发酵一般培养方法：将种子液接入固态培养基中，接种量为3 5m l 。将接种后 的米饭堆积在瓶的一角，3 2 。c 培养，经3d 左右，待大部分米饭上长满菌丝时，将米粒 扣散摊平，2 6 。c 培养1 5d 左右。发酵结束后5 0 。c 烘干。 2 2 5m o n a c o l i nk 测定及计算方法 m o n a c o l i nk 测定及计算方法参照朱华【l8 】等人方法并作如下修改，样品处理：准确 称取0 5g 样品于5 0m l 比色管，用7 0 乙醇定容，放置5 0 。c 水浴锅中浸提1h ，将提 取液经0 ，4 5p a n 滤膜过滤后用h p l c 测定。色谱条件如下：色谱柱：a g i l e n tz o r b a x s b c ls ( 5 m ，2 5 0m m x 4 6m m ) ；流动相；v ( 乙腈) ：v ( 水) = 5 5 ：4 5 ( 磷酸调p h = 2 。5 ) ；柱温： 2 8 。c ；流速：1 0m l m i n ；紫外检测器波长为2 3 8i l l t i 。 6 第二章红曲菌9 9 0 8 固态发酵生产红曲米的发酵条件研究 计算方法：样品中m o n a c o l i nk 含量应折算成绝干产品的含量，水分天平测定烘干 后样品含水量平均为4 2 。计算方程：c = c l ( 1 + 0 0 4 2 ) ，c 为样品( 干基) 中m o n a c o l i nk 总含量( 单位：m g k g ) ；c l 为h p l c 法所测定样品m o n a c o l i nk 总含量。 2 2 6 桔霉素测定方法 样品预处理按陈蕴【l9 】等的方法，处理完将上清液全部移入具塞试管后，搅匀、微滤、 直接进行h p l c 分析。 仪器：h p11 0 0 高效液相色谱仪；色谱柱：a g i l e n tz o r b a xs b c l s ( 5 r t m ，2 5 0m i n x 4 6 m m ) ，检测器：荧光检测器：( k x - 3 3 1 0n l t l ，k m = 5 0 0 0i m ) ：进样量：5 此；温度：2 8 。c ： 流速：1 0m l m i n ；流动相：v ( 乙腈) ：v ( 水) = 3 5 ：6 5 ( 磷酸调p h = 2 5 ) 。 2 3 结果与讨论 降脂功能性红曲的生产过程中可产生多种代谢产物，除己明确具有降脂功效的 m o n a e o l i nk 之外，其他活性物质是否具有此相同功效或起协同降脂作用的研究未见报 导，因此本文选用红曲米中的m o n a c o l i nk 总含量作为唯一指标研究不同条件对其产量 的影响。 2 3 1 不同原料对m o n a c o l i nk 产量的影响 功能性红曲的生产原料来源广泛，如大米、小米、小麦或玉米均可用于生产降脂红 曲 8 】。固态发酵培养基除了提供微生物正常代谢所需的营养，还作为细胞的固定物，会 影响微生物发酵过程的传质、传热、传气等，因此发酵底物的选择对固态发酵中微生物 的生长及为重要。为获得最适基础培养基，我们选用小米、大米为单一或混合为不同基 础培养基在一般条件下进行发酵实验。 j 詈 面 也 点 暮 = bc 不同原料 图2 - 1 不同原料对m o n a c o l i nk 产量的影响 ( a ：大米培养基；b - 小米培养基；c ：大米：小米= 5 ：5 ：d ：大米：小米= 7 ：3 ) f i g 2 - 1e f f e c to fg r a i n so nt h ep r o d u c t i o no fm o n a c o l i nk ( a ：r i c em e d i u m ；b ：m i l l e tm e d i u m ；c ：r i c e ：m i u e t = 5 ：5 ；d ：r i c e ：m i l l e t - = 7 ：3 ) 由实验结果( 图