（发酵工程专业论文）海洋微生物产胞外多糖菌株筛选及发酵条件研究.pdf

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l o g y 、g l u c o s ee n g i n e e r i n g ，p e o p l e h a v er e c o g n i z e dt h a t p o l y s a c c h a r i d e sh a v ei m p o r t a n tf u n c t i o ni nb i o l o g i c a l m a r i n e m i c r o o r g a n i s mc a l la l w a y sp r o d u c es p e c i a lp r o d u c t sw h a ti sd i f f e r e n tf r o ml a n dd u et om a r i n e e c o e n v i r o n m e n t sh i 【g hs a l t 、h i g hp r e s s u r e 、l o wt e m p e r a t u r ea n ds p e c i a li l l u m i n a t i o n a t p r e s e n t ，m a r i n em i c r o o r g a n i s m sh a v er e c e i v em u c hc o n c e r nb e c a u s eo ft h e i rs t a b l es t r u c t u r e a n df u n c t i o n 、i n e x p e n s i v e p r i c ea n ds h o r tp r o d u c t i o nc y c l e i n t h i s p a p e r ，m a r i n e m i c r o o r g a n i s mt h a tc a np r o d u c ee x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e sw e r es c r e e n e df r o mm a r i n e s o i l ，m a r i n ea l g a ea n ds e aw a t e r t h e i rg r o w t hc h a r a c t e r s ，f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r e r e s e a r c h e d ，a n ds t r a i n sa l s oh a v eb e e np r e l i m i n a r yi d e n t i f i e d i nt h i s p a p e r ，13 9 s t r a i n st h a tc a n p r o d u c ee x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e sw e r e s c r e e n e d t w oo ft h e mw e r eh i g hy i e l d ，s od e n o m i n a t et h e ms - 10 、s - 12 t h e i rc u l t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s 、c e l lm o r p h o l o g y 、p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sw e r ea n a l y s e d a n ds t u d i e d b a s e do ni d e n t i f i c a t i o n ，t h es t r a i ns - 1 0i ss t e a d yb a c i l l u sa n ds - 1 2i sb a c i l l u s i nt h i sa r t i c l e ，t h eg r o w t hc h a r a c t e ro fs t r a i ns - 10a n ds t r a i ns 一12c a nb es t u d i e db y m e a s u r i n gb i o m a s s t h e i ri n i t i a lp hv a l u eo fm e d i u mw e r ep h 7 0a n dp h 6 0r e s p e c t i v e l y ， t o l e r a n c eo fs a l i n i t yw e r e4 a n d3 t h e yc o u l dp r o d u c ee x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e sw e l l i nt h es e a w a t e rm e d i u m ；t h r o u g hd e t e r m i n i n ge x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d ec o n t e n t b y p h e n o l s u l f u r i ca c i dm e t h o d ，b e t t e rc u l t u r ec o n d i t i o no fm a r i n em i c r o o r g a n i s ms t r a i ns - 10a n d s 一12w h a tp r o d u c ee x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e sr e s p e c t i v e l y w e r e ：t e m p e r a t u r e3 0 * ( 2 、 l i q u i d i n s t a l l e d3 0 m l l o o m l 、i n o c u l a t eq u a n t i t y1 0 、s h a k i n gs p e e d1 2 0 r m i n ；t e m p e r a t u r e 3 0 、l i q u i d i n s t a l l e d4 0 m l l o o m l 、i n o c u l a t eq u a n t i t y1 0 、s h a k i n gs p e e d1 4 0 r m i n u n d e r t h e s ec o n d i t i o n s ，t h ey i e l do fe x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e sw e r e5 6 4 9 m g 10 0 m la n d 4 4 5 5 m g 10 0 m l ，r e s p e c t i v e l y ；r a wp o l y s a c c h a r i d e sy i e l dw e r e5 8 1 a n d5 4 2 ， r e s p e c t i v e l y m o l e c u l a rw e i g h tw e r ep r e l i m i n a r ym e a s u r e db yu s i n gv i s c o s i m e t r y ，t h e yw e r e 1 4 1 6 7 d a 、2 3 5 4 8 d a ，r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：m a r ir eb a c t e riu m ，e x t r a c ei iuia fp o iy s a c c h a rid e s ，f e r m e n t a tio n c o n d i t i o n 日录 目录 第一章文献综述1 1 1 糖的简介2 1 2 多糖的化学组成及结构2 1 3 多糖的提取、分离和纯化3 1 3 1 多糖的一般分离步骤3 1 3 2 多糖的提取方法4 1 3 3 多糖的分离5 1 - 3 4 多糖的纯化5 1 4 多糖含量的测定6 1 4 1 根据糖的还原性测定多糖的含量6 1 4 2 将糖转变成糖醛衍生物后测定多糖含量7 1 5 多糖的发酵调控7 1 6 微生物多糖与分类8 1 7 多糖的生物活性9 1 7 1 多糖在微生物生存过程中的作用9 1 7 2 多糖免疫调节作用9 1 7 3 多糖对肿瘤的影响l o 1 7 4 多糖的扰凝血作用1 0 1 7 5 多糖的降血糖、血脂作用1 0 1 7 6 多糖和肾上腺皮质激素的关系1 1 1 7 7 多糖的阻抗放射性元素和毒素吸收的作用l l 1 8 微生物多糖食品添加剂的性能及作用1 l 1 8 1 黄原胶l l 1 8 1 1 黄原胶的性能1 1 1 8 1 2 黄原胶在食品工业上的应用1 2 1 8 2 结冷胶12 七j 录 1 8 2 1 结冷胶的性能1 2 1 8 2 2 结冷胶在食品工业上的应用1 3 1 8 3 短根霉多糖1 3 1 8 3 1 短根霉多糖的性能1 3 1 8 3 2 短根霉多糖在食品工业上的应用1 3 1 9 海洋生物活性多糖1 3 1 9 1 海洋生物活性多糖的生理调节功能14 1 9 2 海洋生物活性多糖及海洋微生物多糖研究现状1 5 1 9 2 1 海洋细菌多糖1 6 1 9 2 2 海洋微藻多糖1 6 1 1 0 海洋生物多样性的保护1 7 1 1 1 展望1 8 第二章材料与方法19 2 1 实验材料0 1 000 0000 1 9 2 1 1 主要仪器与设备1 9 2 1 2 主要材料1 9 2 1 3 培养基2 0 2 2 实验方法2 l 2 2 1 海洋微生物的分析方法2 1 2 2 1 1 测定方法2 1 2 2 1 2 标准曲线的绘制0 000 0q ooodd 2 1 2 2 2 海洋微生物胞外多糖产生菌株的筛选方法2 3 2 2 3 海洋微生物产胞外多糖遗传稳定性的研究方法2 3 2 2 4 菌株鉴定方法2 3 2 2 5 海洋细菌产胞外多糖发酵条件的优化方法2 4 2 2 5 1 培养基的确定2 4 2 2 5 2 碳源的确定2 4 2 2 5 3 氮源的确定2 5 2 2 5 4 碳氮比的确定2 5 2 2 5 5 接种量的确定2 5 2 2 5 6 培养基装量的确定2 5 i v 2 2 5 7 菌龄的确定2 6 2 2 5 8 温度的确定2 6 2 2 5 9 转速的确定2 6 2 2 6 海洋微生物生长特性研究方法2 6 2 2 6 1n a c l 浓度的确定2 6 2 2 6 2 培养基初始p h 的确定2 7 2 2 6 3 淡水培养基对海洋细菌生长及代谢的影响2 7 2 2 6 4 海水培养基对海洋细菌生长及代谢的影响2 7 2 2 7 较佳发酵条件实验方法2 7 2 2 8 胞外多糖分子量的初步测定方法2 7 2 2 9 胞外多糖的初步提取2 8 2 2 1 0 粗多糖得率的计算方法2 8 第三章结果与讨论2 9 3 1 海洋细菌胞外多糖产生菌株的筛选2 9 3 2 海洋细菌产胞外多糖的遗传稳定性2 9 3 3 产糖菌株的分类鉴定3 0 3 3 1 海洋细菌胞外多糖产生菌株的筛选3 0 3 3 2 菌株的培养特征3 2 3 3 3 菌株部分生理生化特征3 3 3 4 海洋细菌产胞外多糖发酵条件的优化3 6 3 4 1 培养基对海洋细菌产胞外多糖的影响3 6 3 4 2 碳源对海洋细菌产胞外多糖的影响3 7 3 4 3 氮源对海洋细菌产胞外多糖的影响3 8 3 4 4 碳氮比对海洋细菌产胞外多糖的影响4 0 3 4 5 接种量对海洋细菌产胞外多糖的影响4 1 3 4 6 培养基装量对海洋细菌产胞外多糖的影响4 2 3 4 7 菌龄对海洋细菌产胞外多糖的影响4 3 3 4 8 温度对海洋细菌产胞外多糖的影响4 4 3 4 9 转速对海洋细菌产胞外多糖的影响4 5 3 5 海洋细菌生长特性研究4 7 3 5 1n a c l 浓度对海洋细菌生长的影响4 7 v 日录 3 5 2 培养基初始p h 值对海洋细菌生长的影响4 8 3 5 3 淡水培养基对海洋细菌生长及代谢的影响4 9 3 5 4 海水培养基对海洋细菌生长及代谢的影响5 l 3 6 海洋细菌较佳发酵条件实验5 2 3 7 海洋细菌胞外多糖分子量的初步测定5 3 3 8 海洋细菌胞外多糖的初步提取5 4 第四章结论5 6 参考文献5 7 致谢6 1 v i 第一章义献综述 第一章文献综述 浩瀚的海洋约三亿六千多万平方公罩，占整个地球表面的7 1 ；地球上的生物资源 8 0 生存在海洋罩。海洋不仅是人类获取食物的重要来源，也是人类取之不尽的天然宝 库。因此，近代化学家、药物学家对海洋生物的研究寄予很大的期望，希望从辽阔的海 洋中能寻找到具有价值的生物。 海洋微生物，严格意义上是指生活在海洋环境的寡营养和低温条件下的微生物【2 1 。由 于高盐度、高压力、低温和特殊的光照等复杂的海洋生态环境，使海洋微生物产生不同 于陆地来源的特殊产物【3 】，特别是海洋生物附生微生物，由于空间、营养、光线等方面的 竞争关系，能产生许多具有工业和药用价值的天然产物【4 5 】。 海洋生物是天然药物的宝库，多数海洋生物能够产生一些粘性物质或多糖类聚合 物。与蛋白质、脂肪、核酸等其他生物大分子相比，糖类具有更强的亲水性。这表明， 海洋生物通过合成多糖类物质，以保持体内生命活动所需要的自由水分，来适应海洋这 个特殊的环境【6 】。 生物大分子是生命的基础，生命过程中的许多复杂变化和调控作用都是它的杰作。 几十年来关于海洋微生物中的大分子化合物的研究文献可称得上是连篇累牍，尤其在 核酸和生物酶方面。与之相反，关于多糖的研究一直处于蛋白质和核酸的光环之下。但 是，近年来糖在生物体内功能不断被揭示，不论多糖还是连接在蛋白上的寡糖链对生命 都是至关重要的。 微生物胞外多糖是近2 0 年来陆续丌发的发酵新产品。因其具有独特的物化性质，已 作为乳化剂、增稠剂、稳定剂、胶凝剂、成膜剂、悬浮剂和润滑剂等应用于石油、化工、 食品和制药等多个领域【7 1 。 现在世界上己研究和开发的微生物多糖有2 0 多种，已大量投产的微生物多糖主要有 黄原胶( x a n t h a ng u m ) ，结冷胶( g e l l a ng u m ) ， 右旋糖酐( d e x t r a n ) ，小核菌葡聚糖 ( s c l e r o g l u c a n ) ，短梗霉多糖( p o l l u l a n ) 和热凝多糖( c u r d l a n ) 【8 】。黄原胶，又称汉生 胶，是由黄单胞菌利用碳水化合物而产生的一种胞外多糖，具有耐酸碱，耐盐，耐酶 解的能力。结冷胶是由革兰氏阴性菌s p h i n g o m o n a sp a u c i m o b i l i 鲤有氧发酵所产生的 细胞外多糖胶原凝胶剂。由于它具有良好的热稳定性、热可逆性、耐酸碱等优良特性， 第章文献综述 使它逐步取代其他类多糖在工业中的应用【9 j 。它是继黄原胶之后又一能广泛应用于工业 上的、通过微生物发酵方法生产得到的多糖胶原凝胶剂。 现代科学已表明，一切重要的生命活动过程都有糖的参与。糖链犹如细胞和大分子 表面的触须，捕捉细胞之间、细胞与各种分子之问及分子之间相互作用的各种信息，同 时它们又像是细胞和生物大分子的手脚，联系着细胞与细胞之间及细胞与外界的能量和 物质传递，决定着大分子与细胞及与其他分子之间的相互作用，这使得糖在预防和治疗 包括癌症在内的多种疾病有巨大的应用潜力。目前多糖类物质的研究已成为继蛋白质、 核酸之后的另一个分子生物学、医学以及食品科学等领域的研究热点【1 0 】。 因此可以预见，有关糖的研究将成为未来生命科学的中心研究课题之一。 1 1 糖的简介 糖类物质广泛分布于动植物及微生物中，是自然界最丰富的一类天然有机化合物， 在生物体的代谢中起着重要作用【l 。糖是q 碳原子上带有羟基的多羟基醛或多羟基酮， 或能水解生成这样的化合物的物质。多糖( p o l y s a c c h a r i d e s ) 是由多个单糖分子缩合而 成的缩合物，是一种生物高分子化合物。可分为四类：单糖、二糖、寡聚糖( 含3 个以 上的单糖) 和多糖。糖分子中一般都含有几个不对称原子，所以大都具有旋光性。多糖 ( p o l y a s c c h a r i d e ) 是天然化合物中最大族之一，它是有机体能量的主要来源【1 2 l 。多糖是由 许多单糖分子，通过苷键连接而成的多于2 0 个糖基的糖链。 1 2 多糖的化学组成及结构 多糖( p o l y a s c c h a r i d e ) 是天然化合物中最大族之一，它是有机体能量的主要来源。多 糖是由许多单糖分子，通过苷键连接而成的多于2 0 个糖基的糖链。由于连接方式不同， 可以形成直链多糖、叉链多糖，有时也可以形成环状的多糖。多糖的组成因所含单糖的 种类、比例及其它原子基团的多少和位置而异，因组成所含苷键的类型，苷键的比例以 及与此相关的支链程度等有所不同。 多糖的结构分析较蛋白质结构分析复杂。这是因为组成多糖的单糖品种繁多，而且 即使只有一种单糖，其连接方式也不同及可能有分枝( 蛋白质没有分枝) ，所以多糖的结 构可分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构【1 3 l 。 系到多糖分子中主链的构象，不涉及到侧链的空间排布【1 4 】。在多糖链中，糖环的几何形 状几乎是硬性的，各个单糖钱基绕糖苷键旋转而相对定位，由此决定多糖的整体构象。 三级结构：多糖链一级结构的重复顺序，由于糖单位的羟基、羧基、氨基以及硫酸 基之问的非共价相互作用，导致有序的二级结构空问有规则而粗大的构象，即是多糖链 的三级结构。 四级结构：多糖的四级结构是指多聚链问非共价键结合形成的聚集体。多糖链的聚 集作用可在相同的分子问进行，也可在不同的多糖链间进行。 多糖的结构形态是各个单糖残基在空间相对定位的综合，解析这些定位对于理解多 糖的生物学功能有极其深刻的意义。如：粘多糖系由氨基己糖及己糖醛糖或半乳糖交替 结合而形成的长链分子。粘多糖化学组成和结构主要以双糖单位( d o m i n a n td i s a c c h a r i d e u n i t ) 代表。每种粘多糖分别由氨基葡萄糖、氨基半乳糖之一和葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸 之一通过不同的糖苷键( 不同位置及异构体构型) 连接而成。在氨基己糖或己糖醛酸上的 氨基或羟基上分别连有乙酰基、硫酸基。粘多糖重复双糖单位中的糖基均为d 型吡哺糖， 惟艾杜糖醛酸为l 型【巧】。 1 3 多糖的提取、分离和纯化 1 3 1 多糖的一般分离步骤 ( 1 ) 细胞内多糖的分离步骤【2 1 广一脱脂广一脱蛋白 i l i l 植物体粉碎一一热水提取一一过滤一一滤液浓缩一一醇沉 l 浓缩干燥一一分部收集一一沈脱一一上柱分离一一透析 ( 2 ) 细胞壁多糖的分离步骤 细胞壁一一碱化提取一一脱脂一一多聚半乳糖醛酸酶处理一一透析 l 浓缩干燥一一分部收集一一洗脱一一上柱分离 适用于多糖与蛋白质问结合型转化，早期用稀碱提取动物中的黏多糖。碱可分解肽键 并且通过p 消除反应除去多糖中0 一连接肽键。但一般需在较低的温度下进行，以防止破 坏糖苷键及水解多糖链上的基团，如硫酸酯基、磷酸酯基等。 3 酶解方法 酶法是通过酶反应将原料组织分解，加速有效成分的释放和提取，选择适宜条件将 影响提取的杂质分解去除，促进某些极性低的脂溶性成分转化成糖苷类易溶于水的成分， 降低提取的难度。o u r d i a b o u z i d 等人【1 6 j 用酶能够专一地水解酚类化合物和多糖之间的酯 键。h a u k eh i l z 等人1 1 7 】应用酶分离得到更多的果胶多糖。这种方法具有条件温和、易去 除杂质、回收率高和节约能耗等优点，因此，酶法提取的应用前景十分广阔。由于酶具 有专一性和选择性的特点，应用时多采用复合酶。需要注意的是一组酶之间的协同关系、 底物、抑制剂和酶的浓度，还要注意酶解设备与工艺参数，如粉碎、粉碎设备、p h 、温 度和时间等1 1 8 j 。 4 笫一帚义| i j c 综述 1 3 3 多糖的分离 多糖粗提物含杂质较多，主要为氨基酸肽、蛋白质以及极性大的小分子和色素。 1 蛋白质和多糖的分离 几乎所有的动物多糖都与蛋白质相连。多糖与蛋白质的结合不是物理或离子结合， 而是共价结合。通常用s e v a g 法，三氟或三氯乙烷法和三氯乙酸法除去。前两种方法多 用于微生物的提取，后一种方法多用于植物多糖的提取。但这3 种方法均不适用于糖肽， 因为糖肽会沉淀出来【1 5 】。 2 色素和多糖的分离 多糖中的色素多为酚类化合物，通常在碱性条件下，以过氧化氢氧化法脱色。 3 小的极性分子可通过透析法除去 1 3 4 多糖的纯化【1 9 1 粗多糖是分子质量极不均匀的混合物，需要进行分级和纯化。纯化的方法有很多， 常用的有分步沉淀法、金属离子洛合法、离子交换层析法、凝胶过滤法等。现在亲和色 谱技术及制备型高效液相色谱已应用于糖的分离 1 分步沉淀法 分步沉淀法包括有机溶剂分步沉淀法和盐析法 有机溶剂分步沉淀法是利用多糖具有较强的极性及在不同浓度的有机溶剂( 常用醇 或酮) 中溶解度的差异，使不同分子量的多糖沉淀出来的方法。一般况来，不同多糖所 含的极性基团及分子量也不同，分子量小的溶解度大，分枝多的较直链的水溶性好。 目前看来，乙醇是应用最广泛的分步沉淀剂，简单方便，成本低。 盐析法是根据不同多糖在不同盐溶液中溶解度不同的性质，加入盐析剂使多糖逐步 沉淀出来。常用的盐析剂有氯化钠、氯化钾、氯化铵、钡盐或锌盐( 用于硫酸皮肤素) 、 乙酸钾等。 2 金属离子洛合法 金属离子洛合法是根据多糖与金属离子形成洛合物沉淀分离出多糖。常用的试剂有 斐林试剂、c u c l 2 、b a ( o h ) 2 和乙酸铅等。所得的沉淀需经水充分洗涤后，用5 无机酸 乙醇溶液或硫化氢分解。 3 离子交换层析法 第一章义献综述 离子交换层析法适用于分离各种酸、中性多糖和黏多糖。常用的树脂为 d e a e s e p h a d e x 、d e a 纤维素和e c t e o l a 纤维素等。 p h = 6 时，中性多糖不被吸附，酸性多糖则很容易被吸附在交换剂上。然后利用不同 浓度的缓冲剂进行洗脱，使酸性多糖依次沈脱下来，达到沈脱的目的。另外，通过柱层 析，许多杂质被牢牢吸附在柱上端，可以达到纯化多糖的目的。 4 凝胶过滤法 凝胶过滤法又称分子层析，此类层析的固相载体或介质是一些多孔性或网状结构体， 并且具有分子筛效应。当含有不同大小分子的混合物流经这一介质时，能将混合物中的 各组分按分子大小进行分离，从而达到把分子大小不同的物质分开。 其效果较好的有葡聚糖凝胶( s e p h a d e x ) 、聚丙烯酰胺凝胶( b i o g e l p ) 、琼脂糖凝胶 ( s e p h a r o s e ) 等。 1 4 多糖含量的测定【2 0 】 由于还原糖都含有自由醛基( 如葡萄糖) 或酮基( 如果糖) ，在碱性溶液中还原糖能 将某些金属离子( c u 2 + 、h 9 2 + 、a g + 等) 或某些试剂还原，而糖本身氧化成各种羟酸类 化合物；另外糖或多糖用强酸处理脱水生成糠醛或其衍生物，这些化合物再与酚类或胺 类化合物作用，生成有特殊颜色的物质。以上两点特性常成为测定糖含量的各种方法的 依据。实际工作、实验中，可根据被测材料的种类、要求、条件等，选择其中一种或几 种，但无论采用哪种方法，都应考虑重复性好、操作简单、特异性好、灵敏度高又经济 的方法。 1 4 1 根据糖的还原性测定多糖含量 3 ，5 二硝基水杨酸( d n s ) 比色法 在碱性溶液中，3 ，5 二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成红棕色氨基化合物，在 一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成比例关系，利用比色法可测定样品中的含 糖量 s o m o g y i n e l s o n 法 还原糖将铜试剂还原生成氧化亚铜，在浓硫酸存在下与砷钼酸生成蓝色溶液，在 5 6 0 n m 下的光密度与还原糖浓度成比例关系。 6 第章文献综述 2 c u 2 + + 还原糖专c u 2 0 c u 2 0 + h 2 s 0 4 寸c u + 2 c u + + m 0 0 4 2 + s 0 4 2 - - - 2 c u 2 + + 蓝色溶液 1 4 2 将糖转变成糖醛衍生物后测定多糖含量 地农酚( o r c o n 0 1 ) 硫酸法 糖经无机酸处理脱水产生糠醛( 戊糖) 或糠醛衍生物( 如羟甲基糠醛) ( 己糖) ，生 成物能与酚类化合物缩合成有色物质。 通常使用的无机酸为硫酸，常用的酚为仅苯酚、地衣酚、间苯二酚等。 戊糖的测定( 地衣酚法) 戊糖与氯化高铁盐溶液或硫酸铁铵盐溶液一起加热，与地衣酚试剂反应，形成蓝绿 色溶液，用比色法定量测定戊糖含量。 0 苯酚硫酸法 苯酚硫酸试剂可与游离的寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸( 或甲苯衍生物) 起显 色反应，己糖在4 9 0 n m 处( 戊糖及糖醛酸在4 8 0 n m ) 有最大吸收，吸收值与糖含量呈 线性关系。并且此法简单，快速，灵敏，重复性好，对每种糖仅需制作一条标准曲线， 颜色持久。 葸酮硫酸法 糖类遇浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物，可与葸酮试剂缩合产生颜色物质，反应后 溶液呈蓝绿色，于6 2 0 n m 处有最大吸收，显色与多糖含量呈线性关系【2 1 1 。 1 5 多糖的发酵调控【2 2 1 多糖的来源虽然很广泛，但是，多糖的大批量生产主要还是通过微生物的发酵作用 来进行。各种理化因素都会影响菌的生长速度、生物量的多少及代谢特征等，同样，多 糖的产生也会受到许多因素的影响，除了营养物质之外，其它环境因素也是相当重要的。 从培养基中c n 的角度来讲，n 含量高，有利于菌丝的生长，菌丝得率就高；而c 含量高 时，应该更有利于多糖的积累，如：培养基中c 小比高，有利于荚膜细菌形成荚膜多糖。 p h 也是影响多糖合成的基本因素。李平作等i 2 3 】在研究灵芝产胞外多糖的过程中发现， 灵芝产胞外多糖的最适初始p h i 5 5 ，并且，如果在发酵过程中采用流加碱的办法控制 7 一 第一章文献综述 p h 在4 0 时，灵芝胞外多糖的产量最高。同时，还可以通过培养基碳氮源的选择来控制 p h ，如：以红薯粉为碳源时，具有较强的p h 缓冲能力，可以便p h 下降缓慢；同样，有 机氮也对p h 具有较强缓冲能力。氧对多糖的合成有较显著的促进作用，李绍兰等的研究 发现，罗伦隐球酵母在装液量少、通气量大时，胞外多糖的产量要高，这说明氧对多糖 的产生是很重要的。另外，有研究发现，食用菌多糖的单糖组成还与培养基的组成有关 系，特别是碳素养料的组成，例如：杨晓彤等在液体发酵生产灵芝菌丝体多糖的过程中 发现，以含有甘露糖丰富的原料做培养基时，其菌丝体多糖的单糖组成中甘露糖含量要 高，如以含有丰富的木糖的蔗渣做培养基原料时，则菌丝体多糖中含木糖要高，这似乎 可以通过改变培养基成分来人工导向合成相应的多糖。 1 6 微生物多糖与分类 微生物多糖是研究最为广泛的一类多糖。 ( 1 ) 按形态学上的分类，把微生物多糖分为三种类型：细胞壁多糖，位于细胞壁层； 细胞内多糖，位于原生质层内侧或作为原生质膜的组分；细胞外多糖，位于细胞壁外， 即介于细胞与细胞之间1 2 4 1 。胞外多糖是由微生物大量产生的多糖，易与菌体分离，可通 过深层发酵实现工业化生产。微生物胞外多糖通常指某些微生物发酵产生的一类水溶性 胶1 2 副，是一种长链，高分子质量聚合物。一般微生物多糖是以淀粉水解为碳源发酵生产， 也可直接利用可溶性淀粉经微生物酶作用制得。据d e e v e l e i g h 统计，已经发现4 9 属 7 6 种微生物产生胞外多糖，但真正有应用价值并已进行或接近工业化生产的仅十几种。 到目前为止，已大量投产的微生物胞外多糖主要有黄原胶( x a n t h a ng u m ) 、结冷胶 ( g e l l a n g u m ) 、小核菌葡聚糖( s c l e e r o g l u c a n ) 、短梗霉多糖( p u l l u l a n ) 、热凝多糖( c u r d l a n ) 垒奎【8 l 寸o ( 2 ) 按其来源，把微生物多糖分为三种类型：动物多糖，植物多糖，微生物多糖。 动物多糖来自动物结缔组织基质和细胞间质，可以说是脊椎动物组织胞外空间的特 征性组分。动物多糖是由氨基已糖及已糖醛酸( 或半乳糖) 交替结合而形成的长链分子， 是一类杂多糖。在这些线型长链分子上分布着在组成上和数量上不同的酸性基因，其中 多数含硫酸基，有粘稠性，因而称酸性粘多糖或粘多糖。粘多糖在溶液中以离子存在， 共有与荷电的离子或成份( 包括大分子成分) 相互作用的能力，所以又称聚阴离子。动物 多糖包括糖原( g l y c o g a n ) ，甲壳素( c h i t i n ) ，肝素( h e p a r i n ) ，硫酸软骨素( c h o n d r o i t i ns u l f a t e ) ， 第。帝文献综述 透明质胶( h y a l u r o n i ca c i d ) ，硫酸角质素( k e r a t a ns u l f a t e ) ，酸性粘多糖( a c i d m u c o p y l y s a c c h a r i d e ) 或糖胺聚糖【1 2 1 。 植物多糖来源于植物的树皮、根部、叶片、种子和花朵。从各种中草药和其他植物 中都可提取分离出多糖。植物多糖包括淀粉( s t a r c h ) ，纤维素( c e n u l o s e ) ，果聚糖( c t a l l s ) ， 半纤维素( h e m i c e l l u l o s e ) ，树胶( g u m ) ，粘液质( m u c i l a g e ) ，粘胶质( p e c t i cs u b s t a n c e ) ，卡拉 胶( c a r a g e c n a n s ) 及其它葡聚糖。其中包括黄芪多糖、当归多糖、党参多糖、刺五加多糖、 红花多糖、九里香多糖、紫松果菊多糖。 ( 3 ) 习惯上把细菌和真菌( 包括霉菌和酵母) 来源的多糖成为微生物多糖，和动物多 糖和植物多糖相比，微生物多糖具有与动、植物多糖相似的性质，而其质量和产量不受 自然条件的影响。目前国内外从高等真菌，担子菌中得到的多糖已有二、三百种，其中 含有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、岩藻糖5 种单糖的杂多糖也有5 0 余种。香菇多 糖，木耳多糖，灵芝多糖，茯苓多糖，酵母糖母，裂皱多糖，短根霉多糖都属于微生物 多槲2 6 l 。 1 7 多糖的生物活性 1 7 1 多糖在微生物生存过程中的作用 多糖在微生物的生存过程中主要有以下几方面作用：细胞内存在的内多糖主要是 作为能源储存物质存在的；胞壁多糖主要是n _ 乙酞葡萄糖胺和n 一乙酞胞壁酸以d 一1 ， 4 糖昔键链接的多糖，它的作用主要是作为骨架维持细菌菌体的固有形态；荚膜和黏 液多糖的生理功能，主要是防护作用，一些动物致病菌的荚膜还可保护它们免受宿主白 细胞的吞噬，贮存养料，保持适当水分，吸收金属离子，并可能抑制溶菌酶和防御噬菌 体作用等【27 。它的结构和功能较为多样，将是今后多糖研究的重点。 1 7 2 多糖免疫调节作用 多糖对免疫系统具有促进作用。k i t a z a w a 等人从保加利亚乳杆菌o l l l 0 7 3 r j 中分 离出来的胞外脂多糖具有增加巨噬细胞的作用；从青春双歧杆菌a t c c l 5 7 0 3 培养物的 上清液中分离得到的胞外物质，能诱导鼠干细胞的脾变活性，从胞外物质中分离得到的 e p s ，显示出较高的淋巴细增殖应答内部促进作用【2 8 ，2 9 1 。 9 第一葶文献综述 1 7 3 多糖对肿瘤的影响 阎莉萍、洪葵1 3 0 】曾在文章中提到海洋微生物能够合成抗肿瘤活性物质。目自仃认为多 糖抗肿瘤的机制可能有以下几方面： 影响血液供应，鉴于细菌素能引起肿瘤细胞出血性坏死，曾经设想多糖的抗肿瘤作用 可能影响肿瘤细胞的血液供应。 对细胞体积和空胞化的影响，多糖分子，其活化的部分扩散回到腹膜腔以内以直接影 响肿瘤细胞。 多精分子或其中一部分可以刺激一种器官或组织( 如肾上腺和网状内皮系统) ，再分泌 一种物质作用于肿瘤细胞。 细胞膜接触抑制功能，d e a e - 右旋糖苷，对于腹水肿瘤细胞，在体内和体外试验表明 有抑制效应。a b r o s e 早年研究表明，肿瘤表面具有强的负电荷，d e a e - 右旋糖苷可能 结合这些电荷，使细胞表面部分被“中和”，有利于细胞与细胞间的接触，接受信号以 停止分裂。因此推断多糖的负电荷与抗肿瘤活性有关。 1 7 4 多糖的扰凝血作用 众所周知，肝素可抑制蛋白酶原转化为凝血酶，有抗凝血作用；此外，其他多糖， 如从褐藻掌状昆布中提取的昆命多糖对豚鼠血液的研究证明，该多糖的硫酸衍生物有肝 素样作用；由l ，4 一聚一1 3 一d 一甘露糖醛和l 一古罗糖酸组成的藻酸，硫酸化后也具有抗凝 血作用。海带多糖除抗肿瘤作用外，在体内外均有抗凝血作用，抗凝活性7 i u m g 。 1 7 5 多糖的降血糖、血脂作用 k w a n g w o n 等人从人参( p a n a xg i n s e n g ) 中提取的5 种多糖( p a n a x a n ) a ，b ，c ，d ， e 给正常小鼠注射，可产生随剂量加大而增强的降血糖作用，其中a 和b 也可使四氧嘧 啶糖尿病小鼠血糖下降。t a k a h a s h i 等从知母提得4 种多糖也有同样的效果，其中的知母 多糖b 的作用可以维持2 4h 左右。类肝素结构多糖和肝素相似，能促进脂蛋白酶释放， 使血液中大分子的脂质分解成小分子，因而对血脂过多引起的血清浑浊有澄清作用，也 能明显降低血胆固醇。硫酸软骨素a ( c h o u d r o r i i ns u i f a t ea ) 也能使血液澄清，临床能较 好的降低高血脂患者血清胆固醇、甘油三醋的上升，降低冠心病患者的发病率和死亡率。 顾学裘等报道，海带多糖多次灌喂高血脂鸡能明显抑制其血清总胆固醇、甘油三醋的上 l o 第一帝义献综述 升，并能减少其主动脉粥样斑块的形成和发展。 1 7 6 多糖和肾上腺皮质激素的关系 o h n on 自光假单胞杆菌( p s e u d m o n a sf l u o r e s e t e n s ) 菌体提得的一种复合多糖 促皮质糖( t t g ) ，具有类似肾上腺皮质激素的功能，且有促皮质激素的作用网。另有报 道称巴拿巴门氏菌( s a h n o n e l a p a n a m a ) 菌体提得的多糖也有上述效果。 1 7 7 多糖的阻抗放射性元素和毒素吸收的作用 s k o r y n a 报道，藻酸钠能显