（环境科学专业论文）高温菌的分离纯化及性质研究.pdf

a b s t r a c t t h e r m o p h i l e sa r ea b u n d a n ti nt h en a t u r ee n v i r o n m e n t ；t l l e ya r et h e r m o s t a b l ea n d t h e r m o p h i l i c ，a n dt h e ya l s oh a v ee x c e n l a n td e g r a d a t i o nc a p a b i l i t ya n dh i g hm e t a b o l i c e f f i e n c y ，w h i c hl e a d st ot h ew i d eu s eo ft h e i re n z y m e si ns o m ei n d u s t r i e s h o w e v e r t h e c u r r e n tr e s e a r c ho ft h e r m o p h i l e si si n a d e q u a t e i no r d e rt ob e t t e ru s et h et h e r m o p h i l e s r e s o u r c 汜a n df a c i l i t a t eb r o a d e ru t i l i z a t i o no ft h e s er e s o u r c e si nm o r ei n d u s t r i e s ，m o r e t h e r m o p h i l i e sw i t hh i g hd e g r a d a t i o nc a p a b i l i t ya r en e e d e d ab a t c ho ft h e r m o p h i l i cm i r c o b e sw e r ei s o l a t e d ，p u r i f i e da n ds c r e e n e df r o mv a r i o u s t h e r m o p h i l i cc o m p o s t s ，t h eg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c s ，d e g r a d a t i o nc a p a b i l i t y ，p h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dp r e s e r v a t i o nm e t h o dw e r es t u d i e di nt h i st h e s i s ，t h e r e s u l ti sl i s t e db e l o w ： 1 217s t r a i n so ft h e r m o p h i l e sw e r ei s o l a t e df r o mv a r i o u st h e r m o p h i l i cc o m p o s t su s i n g t h el bm e d i u ma n dn u t r i e n ta g a r ( y b ) ，o fw h i c h9 1 ( y b5 4 l b3 7 ) w e r ef r o m6 0 c ，7 1 ( y b4 2 l b2 9 ) w e r ef r o m6 5 ，a n d5 5 ( y b3 8 l b1 7 ) w e r ef r o m 2 u n d e r s t a n dt h eg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c sb yc o m p l e t i n gt h eg r o w t hc u r v eo ft h e t h e r m o p h i l e s t h er e s u l t si n d i c a t e st h a tm o s to ft h e s et h e r m o p h i l e sh a v er e l a t i v e l ys h o r t l a gp h r a s e ( 1 e s st h a n4h ) ，w h i c hi sm u c hs h o r t e rt h a nm o s tm e s o p h i l e s i na d d i t i o n ，m o s t o ft h e s et h e r m o p h i l e sh a v el o n g e re x p o n e n t i a lp h r a s e ，f o re x a m p l e ，m a n yo ft h e s e t h e r m o p h i l e sh a v ea ne x p o n e n t i a lp h a s eo fm o r et h a n18h n i sf a s tg r o w t hr a t ei sa l s o r e f l e c t e db ym a n yo v e r g r o w e dc u l t u r em e d i u mw h e nt h et h e r m o p h i l e sw e r ei s o l a t e d 3 t h ed e g r a d a t i o nc a p a b i l i t yw a ss t u d i e dt h r o u g ht h eh y d r o l y s i se x p e r i m e n to fs t a r c h ， f a t ，p r o t e i na n dc e l l u l o s e n er e s u l ts h o w s t h a tm o s tt h e r m o p h i l e sh a v es t r o n gd e g r a d a t i c n c a p a b i l i t yt os t a r c ha n df a t , s o m et h e r m o p h i l e sh a v es t r o n gd e g r a d a t i o nc a p a b i l i t yt o c e l l u l o s e 4 t h ep h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c ss t u d yo ft h e s et h e r m o p h i l e s s h o w st h a tm o s tt h e r m o p h i l e sa r er o d s h a p e d n i et h e r m o p h i l e si s o l a t e df r o m6 0 a n d 7 0 。ca r em a i n l yg r a m - p o s i t i v e ，w h i l et h o s ei s o l a t e df r o m6 5 。ca r em a i n l yg r a m - n e g a t i v e m a n yo ft h e s et h e r m o p h i l e sa r es p o r e f o m i n gb a c t e r i a , a n dc a np r o d u c eo x i d a s ea n d c a t a l a s e ，a n dh a v ep o s i t i v er e s u l td u r i n gm o t i l i t yt e s t m a j o r i t yo ft h e s et h e r m o p h i l e s 剐 a e r o b i c ，o n l yas m a l lp o r t i o na r ef a c u l t a t i v e ，a n dt h eo t h e rf e ws t r a i n sa r ea n a e r o b i c ， 5 t h es t u d yo nt h e r m o p h i l e sp r e s e r v a t i o nm e t h o ds h o w st h a t l i q u i dp a r a f f i n p r e s e r v a t i o n ，c r y o p r e s e r v a t i o n a n d f r e e z e d r y i n gp r e s e r v a t i o n m e t h o dh a v eb e t t e r p r e s e r v a t i o ne f f e c tu n d e rt h ee n v i r o n m e n to fr e f i i g e r a t e ra n d f r e e z e r s k e yw o r d s ：t h e r m o p h i l e s ；t h e r m o e n z y m e s ；i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ；g r o w t hc u r v e ； d e g r a d a t i o nc a p a b i l i t y 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在 文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名： 日期：三垒! 圣19 ：19 学位论文使用授权声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有 权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要 汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作者签名：韩i 炙；i 茛导师签名。季豸孕乏j 日期：兰里堕! 塑9日期：塑墨：! 一 第一章绪论 第一章绪论 1 1 高温菌概述 1 1 1 高温菌与极端微生物 极端微生物( e x t r e m o p h i l e s ) 是指那些能够并且偏向于在绝大多数微生物不能 够生长的极端恶劣的环境条件下栖息的一种微生物，而之前人们认为这种苛刻的环 境条件是不足以维持生命的。极端微生物包括嗜热菌( t h e r m o p h i l e s ) 、嗜冷菌 ( p s y c h r o p h i l e s ) 、嗜压菌( p i e z o p h i l e s ) 、嗜盐菌( h a l o p h i l e s ) 、嗜碱菌 ( a l k a l i p h i l e s ) 和嗜酸菌( a c i d o p h i l e s ) 等。前三种都是生长在极端恶劣的自然条件 下( 嗜热菌在高温条件下，嗜冷菌在低温条件下和嗜压菌在高压条件下) ，因此所 有在细胞内的生物分子，包括蛋白质、核酸和脂类都必须适应这些环境并且发挥正 常功能。嗜盐菌通过维持体内高浓度的盐分来应付高盐度的外部环境，只有这样细 胞内的蛋白质才能在这种苛刻的条件下继续保持活性。另一方面，嗜盐菌和嗜碱菌 则在进化过程中产生了维持细胞内中性p h 水平的策略，这样就只有表面的蛋白质 和分泌的蛋白质才暴露在外部恶劣的环境条件下( a t o m ih ，2 0 0 5 ) 。 嗜热菌( t h e r m o p h i l e s ) 也称为高温菌，是极端微生物中十分重要的一个大类， 包括有高温细菌、高温古菌和高温真菌，但至今分离出来的高温菌以高温古菌居 多。高温菌按其耐热程度的不同又可以被分成五个不同类群：耐热菌、兼性嗜热 菌、专性嗜热菌、极端嗜热菌和超嗜热菌。耐热菌最高生长温度在4 5 c 5 5 之间， 低于3 0 也能生长。兼性嗜热菌的最高生长温度在5 0 - 6 5 之间，也能在低于 3 0 条件下生长。专性嗜热菌最适生长温度在6 5 c 7 0 c ，不能在低于4 0 4 2 条 件下生长。极端嗜热菌最高生长温度高于7 0 ( 2 ，最适温度高于6 5 ，最低生长温度 高于4 0 c 。超嗜热菌( h y p e r t h e r m o p h i l e s ) 的最适生长温度8 0 c 1l o c ，最低生长温度 在5 5 左右( 董锡文等，2 0 0 5 ) 1 1 2 高温菌的生境 高温菌的研究热潮始于上世纪的六七十年代，自从美国人t h o m a sb r o c k 于1 9 6 9 年首先从美国黄石国家公园分离出第一个严格意义的水生栖热菌( t h e r m u sa q u a t i c u s ) 高温菌以来，已有超过3 0 属、8 0 种，近4 0 0 株高温菌被分离和描述。其中，绝大多数 的高温菌都是在过去二十年中发现的，并且每年所发现高温菌的数量呈逐年增多的趋 势( 郭春雷等，2 0 0 3 ) 1 第一苹绪论 高温菌的生境主要集中在陆地和海洋的高温环境。最热型的海洋环境是海底黑 烟囱( b l a c ks m o k e r ) 。黑烟囱喷出的矿液温度可高达3 5 0 c ，并含有c l - h 等有机分 子，如此环境为非生物有机合成以及各类化学反应创造了良好的条件t 有利于原始 生命的生存，因此这里存在着大量的高温苗。另外，在活动的海底山及浅海地区的 热沉积物当中都分离到了高温菌。在陆地环境中，高温菌栖息的自然环境包括有硫 磺区和火山地区的热泉。在阿拉斯加、北海和西伯利亚地下深层的热储油田当中分 离到了极端高温细苗和高温古茹，但是也不能排除这些高温菌是人们为了进行石油 勘探而人为引 的。人工环境如地热发电站、热煤废物堆、热污染河流、堆肥、热 水器等也都是高温苗的栖息地( s t e r n e r c ta l ，2 0 0 1 ) 。 s t r a i n1 2 1 是迄今为止发现的生长温度最高的生物，属于高温古苗，是从芬兰以 南约4 0 0 公里地方海底热液出口附近采集来的植物中分离出来的。当研究员把 s t r a i n1 2 1 放入1 2 1 高温的高压灭菌锅中令人惊奇的现象出现了，在如此高温 下，s t r a i n1 2 1 竞能继续生长和繁殖。它的最适生长温度为1 0 5 c - 1 0 7 ( 2 ，最高生长 温度为1 2 1 ，最低生长温度为8 5 c ，营化能自养。它利用甲酸盐作为电子供体， 三价铁离于为电子受体。在1 1 5 0 时，s t r a i n1 2 1 的世代时间大约为7h 在1 2 1 时 的世代时间约为2 4b ( k a s h e f ik ，2 0 0 4 ) 。 图1 - 1s t r a i n l 2 1 的相关性质( k a s h e f le ta l ，2 0 0 3 ) 2 烟栖火叶菌c m l o b u s f u m a r 田屉迄今人们已知耐受生长温度仅次于s t r a i n l 2 1 的 超高温苗p y r o c o c c u s f u r i o s u s 是由f i a l a 和s t e n e r 两位科学家于1 9 8 6 年分离出来的 ( f i a l aga n ds t e t t e rko 1 9 8 6 ) 。其最适生长温度超过1 0 0 c ，最高生长温度可选 1 1 3 ，在1 2 i 、i 小时高温高压条件下仍能存活，低于8 5 不能生长。 m e t h a n o p y r u s k a n d l e r i 是另外一个生长温度可达l l o 的超高温薷二者都是从海 底火山口分离到的以氢为电子供体营化能自养生活的超高温菌( 郭春雷等，2 0 0 3 ) 。 关于高温菌的晟高生长温度，根多学者认为地球上还存在比s t r a i n1 2 i 的生存 温度还要高的生物，一个得到普遍认同的观点是生命的最高温度上限可能处于 1 4 0 1 5 0 c 之间( s t e t t e r , 1 9 9 8 ) 。下图显示了最近几十年来所发现的一些典型的 高温菌，温度从低到高依次为：嗜热脂肪芽孢杆菌( b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 、 水生栖热菌( t h e r m u sa q u a t i c u s ) 、耐热嗜酸古细菌( s u 晌l o b u sa c i d o c a l d a r i u s ) 、 t h e r m o p r o t e u st e n a x 、骆蔽熟网菌( p y r o d i c t i u mo c c u l l u m ) 、延胡索酸火叶菌 ( p y r o l o b u s f u m a r i i ) 和s t r a i n1 2 1 。 1 3 0 1 2 。 d ； 1 。o i 帅 l 髓 i 7 0 l 6 0 图1 - 2 生命的最高温度在不断攀升 1 1 j 高温苗与生命起源 m a s s i o 通过对许多不同生物的最适生长温度和嗜热性索引( t h e r m o p b ij e i n d e x ：基于氮基酸更频繁地进入高温茵超高温菌的蛋白质) 的相关性进行研究 并希望通过分析得出最后普遍共同祖先( l a s tu n i v e r s a lc o m m o na n c e s t o rl u c a ) 到底是常温菌还是高温苗，通过利用最大可能性法和最大简约性法对不同的物种原 3 习到 = 三一 一 菡 第一章绪论 形的进化序列进行重建，则可把这些序列与常温菌或高温菌进行对应，从而可以得 出以下结论：( 1 ) 没有证据表明最后普遍共同祖先是常温菌，而现有研究则说明最 后普遍共同祖先是高温菌或超高温菌。( 2 ) 古菌域和细菌域的祖先应当是( 超) 高 温菌，而真核生物域的祖先则是常温菌( m a s s i m oe ta l ，2 0 0 1 ) 。 1 2 高温菌的耐热机制 微生物与其他所有的生物一样，必须适应其所生存的环境。而高温菌为何可以 在比常温菌高很多的温度条件下生长，至今仍然是一个难以完全解释的问题。 k u m a r 等( k u m a ra n dn u s s i n o v ，2 0 0 1 ) 认为，高温菌之所以可以在高温下生存，是 因为它们包含一种具有耐热性的蛋白质，这种蛋白质对高温变性与水解具有很强的 抗性。e v c r l y 等( e v e r l ya n da l b e r t o ，2 0 0 0 ) 则认为高温菌能产生一种“伴侣蛋 白”，可以使得其蛋白质在变性后重新折叠至原始状态并恢复原有功能。h e r b e r t 等 认为( h e r b e r ta n ds h a r p ，1 9 9 2 ) 高温菌的细胞膜由饱和脂肪酸组成。脂肪酸的存在 为高温菌的细胞提供了一个疏水环境，使其具有足够的刚性在高温环境下生存。d e r o s a ( d er o s ae ta l ，1 9 9 4 ) 等指出，主要由超高温菌组成的古菌，其细胞壁由脂质 和醚类物质共同构成，这比由脂肪酸所构成的细胞壁膜具有更强的耐热性。 董锡文等( 董锡文等，2 0 0 5 ) 认为高温菌的耐热机理主要可归纳为以下几个方 面：( 1 ) 绝大多数革兰氏阳性高温菌的细胞壁是由g m 及短肽构成的三维网状结 构，增加了细菌的耐热性；( 2 ) 嗜热菌细胞膜中含高比例的长链饱和脂肪酸和具有 分支链的脂肪酸，胞膜中含有甘油醚化合物；( 3 ) 呼吸链蛋白质的热稳性高； ( 4 ) 由于t r n a 的g 、c 碱基含量高，提供了较多的氢键，故其热稳性高； ( 5 ) 细胞内含大量的多聚胺； ( 6 ) 胞内蛋白质具抗热机制，如增加分子内疏水性和分子 外亲水性，共价结合等；( 7 ) 许多酶类由于蛋白质一级结构的稳定及钙离子的保 护，耐热性高：( 8 ) 专性嗜热菌株的质粒携带与抗热性相关的遗传信息。 郭春雷等( 郭春雷等。2 0 0 5 ) 通过对8 0 多种超高温菌的基因组g + c 含量，1 6 s r r n ag + c 含量进行统计分析，结果显示高温菌耐热性与基因组g + c 含量之间没有 直接关系，而与1 6 sr r n ag + c 含量之间明显存在着正相关。1 6 sr r n a1 8 螺旋的 二级结构分析显示高温菌生长温度越高，其1 6 sr r n a 热稳定性越高。 卢柏松等( 卢柏松等，1 9 9 8 ) 认为高温菌的嗜热性与其蛋白质的高度热稳定性相 关，为了研究嗜热蛋白质的热稳定性，比较高温菌和常温菌的蛋白质在氨基酸组成 4 第一章绪论 上的差别，他们收集了1 1 0 对分别来自高温菌和常温菌的同源蛋白质序列，比较两 组蛋白质各种氨基酸含量以及疏水性氨基酸组成、疏水性指数和带电氨基酸组成的 差别，结果两者在多种氨基酸含量上存在微小但统计学上显著的差别，嗜热蛋白质 比常温蛋白质平均具有更高的疏水性和带电氨基酸组成。 何致中等的研究表明( 和致中等，1 9 9 9 ) ，高温菌的细胞壁和细胞被膜可分为 1 1 种类型( 见表1 1 ) 。并认为高温菌的生长温度范围与细胞被膜类型有明显的相 关性，对这种相关性的研究会对科学界解开高温菌的耐热性之谜做出贡献。 表1 1 高温菌细胞壁和细胞被膜分类简表 t r i v e d i ( t r i v e d ie ta l ，2 0 0 6 ) 等认为高温菌之所以能够在高温环境下生存，是因 为它们采取了不同的适应机制。其中对蛋白质的稳定性起到重要作用的因素包括： 富含c g 的密码子、带电氨基酸与不带电氨基酸之间的比率、离子相互作用、氨基 酸的选择与分配、翻译后修饰和溶质积累等。然而，t r i v e d i 认为这些因素会随着高 温菌分类的不同而不同，在一个种类内部或是种类之间都是如此，比如可溶性蛋白 和膜蛋白就采用不同的耐热策略。因此，对于高温菌的蛋白质来说，并不能将哪一 种因素或是几种因素的组合归结为其通用的耐热机制。 郭春雷等( 郭春雷等，2 0 0 3 ) 认为高温菌的耐热性与组成生命体生物分子的热不 稳定性有关。生物体组成分子有两种：一种为胞内小分子物质，如n a d ， n a d p h ，a t p 等；另一种是生物大分子，主要有蛋白质，核酸及脂类。郭春雷等 5 第一章绪论 分别从蛋白质的热稳定机制、d n a 分子的热稳定机制、膜脂和小分子物质的作用等 方面对高温菌的热稳定性进行了阐述：( 1 ) 分子内的蛋白质稳定机制包括高非极性 核心、降低表面体积比、减小分子中的甘氨酸及大量的离子间相互作用等。蛋白质分 子稳定性的外在因素包括分子伴侣等；( 2 ) d n a 分子的热稳定机制包括提高胞内 k + 浓度、d n a 反向螺旋酶、组蛋白及其它d n a 结合蛋白等；( 3 ) 膜脂是嗜热菌细 胞的基本组成成分，在耐高温机制方面起重要作用，如维持膜的流动性、跨膜运 输、维持胞内物质、维持跨膜化学渗透势和膜蛋白的稳定性等作用；( 4 ) 还有一种 是代谢产物和辅酶等小分子物质，它们可以通过微环境保护、高效有序的代谢渠 道、提高催化效率等方式克服热不稳定性。 l i 等( l ie ta l ，2 0 0 5 ) 对嗜热酶的结构特点及其嗜热机理进行了研究总结，认为 酶的热稳定性包括热动力学稳定性和动力学稳定性两方面。热动力学稳定性是由酶 的稳定性自由能( a g 幽) 和解链温度( t m ) 所决定的。动力学稳定性一般通过酶 在特定温度的半寿期( h a l f l i f e ：t t f 2 ) 来表达。嗜热蛋白的稳定性自由能g s 缸b 要比 常温蛋白的高5k c a l m o l - 2 0k c a l m o l 。嗜热酶的热稳定性机制多种多样，主要取决 于具体的酶。然而，也可以确定出一些对其热稳定性起作用的共同特性，包括较热 不稳定酶拥有更多的相互作用( 如氢键、静电相互作用、疏水键、二硫键以及与特 定金属的结合等) ，以及更高级的蛋白质构象结构( 如更具刚性、更高的填充效 率、去折叠熵的减少、构象张力的释放和a 螺旋的稳定性等) 。 1 3 嗜热酶及其应用 由高温菌或超高温菌所产生的酶称作嗜热酶( t h e r m o e n z y m e s ) ，它们通常具有 热稳定性( t h e r m o s t a b l e ，在高温条件下对不可逆的失活具有抗性) 和嗜热性 ( t h e r m o p h i l i c ，如其最佳活性温度在6 0 1 2 0 ( 3 之间) 。而由常温菌所产生的酶则 称为嗜温酶( m e s o z y m e s ) ( v i e i l l ee ta l ，1 9 9 6 ) 。与嗜温酶相比较，嗜热酶具有以 下优点( 吴军林等，2 0 0 3 ；王柏婧等，2 0 0 2 ) ： 1 ) 在高温条件下很容易获得高纯度的产物。大多数嗜热酶催化反应的温度都超 过7 0 ，很少有杂菌生存，从而减少了细菌代谢物对产物的污染。 2 ) 稳定的嗜热酶能对有机溶剂和洗涤剂具有较好的抗性。例如，耐热蛋白酶能 经受表面活性剂及碱性环境的变性作用，可作为添加剂应用于家用洗涤剂。 3 ) 提高了反应速率高温条件下可以溶解更多的底物，另外，分子运动速度加 6 第一章绪论 快和酶催化能力加强都有利于提高产率。 4 ) 酶制剂的制备成本降低。因为嗜热酶的稳定性高，因而可以在室温下分离提 纯和包装运输，并且能长久地保持活性。 5 ) 对反应器冷却系统的要求标准降低并减少了能耗。由于嗜热酶有耐高温的特 性，所以生产中不需要复杂的冷却装置。一方面节省了开支，另一方面也降低了冷 却过程对环境所造成的污染。 6 ) 处理液的粘度降低。高温环境下液体粘度通常会下降，从而使剪切力及抽 运、过滤、离心费用减少。 7 ) 热传导效率与质量传导效率均得到改善。高温下，扩散效率增加且质量传递 限制因子减少。 鉴于嗜热酶的以上特性，以及近年来大量分离出来的高温菌为嗜热酶的生产创 造了有利的条件。使用最广泛的嗜热酶为淀粉工业中所用的淀粉酶。大量其他的工 业用途也都处于不同的发展阶段。在食品工业中，嗜热酶被用于氨基酸的合成。在 石油化工与造纸工业中，嗜热酶被用来去除含硫污染物、从甘油制备l 。3 丙二醇和 替代产生污染的化学试剂等。关于这方面的文献报道数量在近年来非常多。下表列 出了一些工业上常用的嗜热酶及其所催化的生物转化反应( h a k ie ta 1 2 0 0 3 ) 。 表1 2 工业上常用的嗜热酶 7 第一章绪论 嗜热酶也可以被用来作为研究高温稳定性和高温活性的模型，这将有助于蛋白 质基因工程的发展。以下是对一些具体的嗜热酶的来源、性质和其应用条件的讨 论。 1 3 1 耐热淀粉水解酶( a m y l o l y f i ce n z y m e s ) 淀粉工业是该酶制剂的最大消费者。淀粉是多种微生物用作碳源的原料。它是 葡萄糖的多聚物，有直链淀粉和支链淀粉之分。淀粉聚合物如其他的聚合物一样， 需要多种酶的作用才能够得到完全水解。这些酶包括：a 淀粉酶、葡萄淀粉酶或p 淀粉酶、异淀粉酶或支链淀粉酶( p o o n a ma n dd a l e l ，19 9 5 ) 。a 淀粉酶又称液化型淀 粉酶，这种酶可以任意分解淀粉的a 1 ，4 糖苷键，而不能分解小l ，6 糖苷键。淀粉经 该酶作用以后，粘度很快下降，液化后变为糊精，最终产物为糊精、麦芽糖和少量 葡萄糖。其余的酶的共同特点为可将淀粉水解为寡糖和单糖，故又称为糖化型淀粉 酶。据v a nd e rm a a r e l 等的报道，淀粉水解酶占了世界酶消费总量的3 0 ( v a nd e r m a a r e le ta l ，2 0 0 2 ) 。 淀粉的水解包括糊化、液化和糖化三个过程。糊化是指淀粉颗粒在水溶液中膨 胀、破裂，从而形成一种粘性悬浮液：液化是指通过a 淀粉酶的作用，使已糊化过 的淀粉液粘度降低；糖化是指通过进一步的水解，把已液化的淀粉分解为麦芽糖和 葡萄糖。糊化是通过在热水中对淀粉进行加热完成的，而淀粉只有在高温条件下才 是可溶于水的，具体的温度取决于不同来源的淀粉( r a k s h i t ，1 9 9 8 ) 。为了使淀粉的 水解过程在糊化之后马上得以进行，因此所使用的酶应该具有热较强的稳定性，从 而可以避免较长的冷却时间。 为了满足淀粉工业的需要，人们过去在分离与描述各种来自不同分离源的淀粉 水解酶方面进行过大量的尝试。下表显示了一些工业上使用的淀粉水解酶及其性 质。耐热0 t 淀粉酶很久以前就被从b a c i l l u ss u b t i l i s 、b a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n s 和 b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 中分离出来( u n d e r k o f l e r , 1 9 7 6 ) 在6 0 以上具有催化活性的 工业用b 淀粉酶也从不同的杆菌中分离出来( b r o w n ，1 9 8 7 ) 。它们可以与去分支酶 共同协作来制造纯麦芽糖浆。 8 第一章绪论 表l - 3 耐热淀粉水解酶的性质及其来源微生物 以前从不同微生物分离出来的支链淀粉酶并不能完全满足当时流行于淀粉工业 的操作方式。然而，此后不断有大量产生支链淀粉酶和d 淀粉酶的高温菌被发现 ( h a k ic ta l ，2 0 0 3 ) 。t e r m a m y l 和f u n g a m y l 是两个使用最广泛的淀粉水解酶，如今 已进入商业化阶段。它们在世界范围内被广泛使用，用以生产葡萄糖浆和拥有不同 葡萄糖当量的糖浆。从al i c h e n i f o r m i s 获得的t e r m a m y l 可以合成非均一低聚糖 ( c h i t r a d o nc ta 1 ，2 0 0 0 ) 。可溶淀粉和添加非淀粉糖的存在，可以使得通过逆向催化反 应生产低聚糖。 9 第一章绪论 淀粉工业所存在的一个担心是a 淀粉酶对钙的要求，以及草酸钙的形成可能会 阻塞工艺管道和热交换器。此外，这种积聚物在某些产品如啤酒的生产中是不能够 被接受的。它们的沉淀物可以通过减少酶对钙离子的需要和降低生产过程中的p h 值来去除。然而，某些淀粉水解酶的活性对钙的依赖性很强，尽管其依赖程度各有 不同( 表l - 4 ) 。随着蛋白质基因工程的发展，使用定点突变法产生的t e r m a m y l l c 已经显示出对钙较高的非依赖性( h a s h i d ae ta l ，2 0 0 0 ) 。 表l - 4 工业用淀粉水解酶对钙的需求 e n z y m em i c r o o r g a n i s m 垒乜巳! i ! 垒! i 壁翌 m i n i m u mc a z + t e m p e r a t u r ep hd o s a g e ( p p m ) r a n g e ( ) b a c t e r i a lm e s o p h i l i cb a c i l l u ss u b t i l i s8 0 - 8 56 0 - 7 015 0 a - a m y l a s e b a c t e r i a lt h e r m o p h i l i eb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s9 5 - 1 0 56 0 - 7 02 0 a - a m y l a s e f u n g a la - a m y l a s ea s p e r g i l l u so r y z a e 5 5 - 7 04 0 5 0 5 0 a m y l o g l u c o s i d a s ea s p e r g i l l u sn i g e r 5 5 - 6 53 5 5 00 p u l l u l a n a s eb a c i l l u sa c i d o p o l l u l i t i c u s5 5 6 53 5 - 5 00 液化淀粉的水解作用在很低p h 值的条件下进行。然而，当前采用的耐热a 淀 粉酶在低p h 环境下并不具有稳定性( c r a be ta l ，1 9 9 7 ) 。可以通过使用在糖化阶段具 有稳定性的淀粉酶，来获得一种经济的工艺。除此之外，通过使用淀粉水解酶实现 淀粉的一步水解，可以大大降低葡萄糖生产的成本。因此，由于高温环境下高温菌 的多样性( h u b e re ta l ，1 9 9 8 ) ，以及工业上具有新特性的酶对工艺操作更高的要求 ( e m m a n u e le ta 1 2 0 0 0 ) ，对科学界和工业界提出了新的挑战。 1 3 2 耐热木聚糖酶( t h e r m o s t a b l ex y l a n a s e s ) 半纤维素是地球上最丰富的有机物质之一，而木聚糖是半纤维素的主要组成成 分。其在制浆造纸工业上拥有很大的应用价值。用于生产纸浆的木材需要经过高温 和一定p h 条件的处理，这意味着酶化过程需要具有良好的热稳定性和在很广泛的 p h 值范围内具有活性的蛋白质( j a c q u e se ta l ，2 0 0 0 ) 。木聚糖酶在高温条件下能够破 坏细胞壁的结构，因此这也有利于在漂白过程中的不同阶段对木质素的去除。能够 实现这个目的的木聚糖酶应该满足以下条件：( 1 ) 缺乏纤维素酶活性以避免纤维素 的水解；( 2 ) 具有较低的分子量，从而加快其在纸浆纤维素中的扩散； ( 3 ) 最重 l o 第一章绪论 要的一点，高产量的酶必须在非常低的成本下获得( n i e h a u se ta l ，1 9 9 9 ) 。而现在所有 商业上可用的木聚糖酶只能部分满足这些要求，大多数木聚糖酶反应的最适温度为 5 0 6 0 ( 2 ，在5 5 时的半衰期为l h 。然而，也有学者报道了一些具有更高热稳定 性和最适温度为8 0 c 1 0 0 c 的木聚糖酶( m o r r i se ta l ，1 9 9 8 ) 。这些酶为牛皮纸浆漂白 过程中氯用量的减少提供了可能，从而降低了有机卤素对环境的污染。这些酶可以 分为两个类别：拥有较高分子量( 3 0k d a ) 的e x s1 0 和拥有较低分子量( 3 0k d a ) 的 e x s1 l 。其中e x1 0 类的木聚糖酶具有更高的耐热性e x sl l 类的酶则由于能够增 强牛皮纸浆的漂白效果而受到更多的欢迎( g e o r i sc ta l ，2 0 0 0 ) 。 人们以细菌和真菌为分离源分离到大量的耐热木聚糖酶( 表l - 5 ) 。据报道， b a c i l l u ss p ，s t r e p t o m y c e ss p ，t h e r m o a s c u sa u r a n t i a c u s 和f u s a r i u m p r o l i f e r a t u m 的菌株 能够产生在5 0 c 8 0 的条件下具有活性的木聚糖酶。而d i c t y o g l o m u ss p 则能够产 生最适温度为9 0 的木聚糖酶。许多t h e r m o t o g a l e ss p 的菌株能够分泌在更高温度 条件下发挥功能的耐热木聚糖酶。最近也有报道关于从t h e r m o a c t i n o m y c e s t h a l o p h i l u a 亚群c 分离出最适温度为6 5 的嗜碱无纤维素木聚糖酶，以及从 c l o s t r i d i u ma b u s o n u mc f r 7 0 2 分离出无纤维素木聚糖酶。另外也从t h e r m o t o g as p 分离出来一种能够在1 1 5 时具有活性的酶。也可以利用固态发酵来生产木聚糖 酶，由于培养时间的减少和基础培养基浓度的增加，其产量可以得到较大的改善。 从经济学的角度来看，这方面具有很大的发展潜力( p a r ke ta l ，2 0 0 2 ) 。 第一章绪论 表1 5 耐热木聚糖酶的性质及其来源微生物 制浆造纸工业是当今发展最迅速的产业之一，而耐热木聚糖酶则由于其带来的 全球环境效益而备受青睐。然而，从不同微生物所分离出来的酶的产量仍然不能完 全满足当今工业的需要。值得一提的是，现在发现的能够分泌木聚糖酶的超高温菌 数量相当少因此，对拥有高产量且具有理想特性的高温菌的探索仍然是当前的一 个主要挑战。 1 2 第一章绪论 1 3 3 耐热纤维素酶( t h e r m o s t a b l ec e l l u l a s e s ) 纤维素是世界上最丰富的天然有机物，占植物界碳含量的5 0 以上，是饲 料、燃料和化学制品的主要来源( s p a n oe ta l ，1 9 7 5 ) 。纤维素是d 一葡萄糖以p 1 ，4 糖苷 键组成的大分子多糖。纤维素化合物拥有不同类型的结合键与高度规则的晶体结 构，使其难于被水解。能够对纤维素进行水解的酶包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖 酶和p 葡聚糖酶( m a t s u ie ta l ，2 0 0 0 ) 。纤维素酶是内切葡聚糖酶，可以将纤维素分解 为低聚糖、纤维二糖和葡萄糖。外切葡聚糖酶水解纤维素中的p 1 ，4 d 糖苷键，将 纤维二糖从非还原端释放出来。另一方面，来源于高温菌的p 葡聚糖酶在制药业倍 受重视，可以将纤维二糖水解为葡萄糖。 如今，纤维素酶在工业中用于淀粉处理、动物饲料生产、果菜汁提取等食品工 业、饲料工业、造纸工业及纺织工业等。为了更好地分解不溶于水、且拥有紧密结 构的天然晶状纤维素，耐热纤维素酶应该在高温高p h 值的条件下具有很高的活 性。 从古菌中分离出来的耐热纤维素酶的来源包括乃彻c o c c i j 8f u r i o u s u s 和 p y r o c o c c u sh o r i k o s h i 。后者的最适温度为9 7 1 2 ，源于p y r o c u c c u sf u r i o u s u s 的酶的最 佳活性温度为1 0 2 1 0 5 ( 表l 6 ) 。s u l f o l o b u s 肋伽t a r i c u sm t 4 ，s u l f o l o b u s a c i d o c a l d a r i u s 和s u l f o l o b u ss h i b a t a e 也可以用来生产p 葡萄糖苷酶。此外，也从 t h e r m o t o g as p f j s s 3 - b 1 提取出一种具有更高热稳定性的纤维二糖( r u t h e r s m i t he ta l ， 1 9 9 2 ) 。 表1 - 6 耐热纤维素酶的性质及其来源微生物 1 3 第一章绪论 很明显，对纤维素的成功利用依赖于经济可行的纤维素酶生产技术的发展。举 例来说，纺织工业中棉织物的生物抛光过程要求纤维素酶在接近1 0 0 的高温下具 有稳定性( a n d oc ta l ，2 0 0 2 ) ，然而，当前使用的酶只有在5 0 - 5 5 c 的条件下才具有 活性。纤维素酶生产也被认为是木质纤维素乙醇制造中最为昂贵的环节，约占总成 本的4 0 。在食品工业中，通过酸对纤维素的降解仍然不能令人满意，结果导致糖 类物质的腐烂。最后，尽管现在已经发现不少可以分解纤维素的嗜热酶，但是它们 的许多生理学条件下的功能仍然没有被了解清楚，有待于进一步的研究。 1 3 4 耐热几丁质酶( t h e r m o a c t i v ec h i t i n a s e s ) 几丁质又名甲壳素、甲壳质，其有效成分是几丁聚糖( 壳聚糖) 。在自然界 中，几丁质存在于低等植物菌类、藻类的细胞，甲壳动物虾、蟹、昆虫的外壳，高 等植物的细胞壁等，是除纤维素以外的又一重要高分子多糖类物质。由n 一乙酰葡糖 胺通过p 1 ，4 糖苷键相连而成。脱乙酰几丁质的主要用途包括废水处理、化妆品制 造、造纸、纺织业、摄影产品、水泥、重金属螯合剂以及医学和兽医等方面的用途 ( m a j e t ie ta l ，2 0 0 0 ) 。 利用几丁质来生产脱乙酰几丁质需要在4 0 的氢氧化钠溶液中通过脱乙酰反应 来完成。这些具有高度腐蚀性的溶液非常难于控制。因此现在已经开始进行一些使 用甲壳素脱乙酰酶来完成这一转化的尝试。或许一种耐热的脱乙酰酶可以促使酶产 量和转化率的提高，并可以实现酶的回收使用。 能够对几丁质起降解作用的酶包括内切几丁质酶a 、外切几丁质酶b 和n 乙酰 葡萄糖转苷酶。然而，几丁质酶和脱乙酰酶并不能很容易地降解几丁质。x 射线衍 射的研究证据表明，几丁质具有高度的晶状结构，且不溶于水，这些性质表明几丁 质的降解对耐热性酶的需要。 高温微生物b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sx 7 u 、b a c i l l u ss p b g l1 和s t r t e p t o m y c e s t h e r m o v i o l a c e u so p c 5 2 0 是几丁质酶的主要来源。超高温厌氧古菌t h e r m o c o c c u s c