（环境科学专业论文）鲫鱼多氯联苯暴露的细胞凋亡效应与机制研究.pdf

浙江大学硕i ：学位论文 鲫鱼多氧联苯暴露的细胞凋r 效戍吁机制研究 a b s t r a c t p o l y c h l o r i n a t e db i p h c n y l s ( p c b s ) a r eo n eo ft h em o s tu b i q u i t o u sa n dp e r s i s t e n t o r g a n i cp o l l u t a n t s i nt h i ss t u d y , t h ee c o l o g i c a lh e a l t hr i s ko fp c b si nl o wd o s e sw a s s t u d i e di nc u r c i a nc a r p m o r p h o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lt e c h n i q u e sw e r eu s e dt o a s s e s st o x i ce f f e c t so fl o wd o s e so fp c b 7 7 ，p c b l l 8a n dp c b l 5 3o nl y m o c y t e a p o p t o s i sr a t e nv i t r o t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) d o s e - d e p e n d e n ta p o p t o s i si n d u c e db yp c b s a p o p t o s i sw a sd i s t i n g u i s h e db yc o n d e n s a t i o no fn u c l e a rc h r o m a t i o na n dd n a l a d d e r s ，a f t e r2he x p o s u r et op c b 7 7 ，p c b l l 8a n dp c b l 5 3a t1n m o l l ，1 0n r n o l l , 5 0a m o l la n d1 0 0n m o l l ，r e s p e c t i v e l y a p o p t o t i cr a t e si n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n g p c bc o n c e n t r a t i o n s t h e s er e s u l t ss h o wt h a ta p o p t o s i sr a t e sa r ed o s e - d e p e n d e n tf o r e u r c i a nc a r p l y m p h n c y t e st h a ta r ee x p o s e dt op c b sa t1 1 0 0n m o l l w ef u r t h e r c o n f l r m e dt h a tt h er a t e so fa p o p t o s i sc a nb eu s e da sam o r es e n s i t i v ea n dt i m e e f f i c i e n tm e t h o dt oe v a l u a t et h et o x i ce f f e c t so fl o n g - t e r me x p o s u r eo fe n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t si nl o wd o s e s ( 2 ) t h ep r o b a b l em o l e c u l a rt o x i c o l o g yp a t h w a yt h a tr e g u l a t e sp c b i n d u c e d l y m p h o c y t ea p o p t o s i s l o wd o s e ，加v i t r o ，e x p o s u r eo fc u r i a nc a r pt op c b 7 7 ，p c b l l 8a n dp c b l 5 3 ， s h o w e de v i d e n c eo fl y m p h o c y t e sa p o p t o s i sv i ai n c r e a s e dl e v e l so fi n t r a e e l l u l a r e0 2 a n dh 2 0 2 ，i nat i m e - d o s ed e p e n d e n tm a n n e r f r o mt h e s er e s u l t s ，w ed e d u c e dt h a t o x i d a t i v es t r e s sd e t e r m i n e st h ea p o p t o s i so f c u d a nc a r pl y m p h o c y t e s k e y w o r d s ：a p o p t o s i s ；p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s ；l y m p h o c y t e s n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝江盘堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 一虢轴彳蝴 柚7 r 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解迸姿太堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝鎏盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 鸦哞 签字闩期：3 伽件吕月了同 学位论文作者毕业后去向：上粥辞 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 签字f 慨砷年f 月 电话： 邮编： 浙江大学硬士学位论文 一鱼多氯联苯暴露的细胞凋亡效应与机制研究 第一章多氯联苯的水生态毒理学研究进展 多氯联苯( 简称p c b s ) 是一类以联苯为原料在金属催化剂作用下，高温氯 化生成的氯代芳烃，1 8 8 1 年由德国人首次在实验室合成。根据氯原子取代个数 和取代位置的不同共有2 0 9 种同系物。由于p c b s 具有许多优良的物理化学性质， 如极高的化学稳定性、高不燃性、高绝缘性和高粘性等，使其曾经广泛应用于各 种生产领域( h a l l g r e ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 但是由于p c b s 不易降解，且在环境中的降 解性有赖于联苯的氯化程度，因而随着p c b s 的不断应用，其在环境中的积累量 不断增加。1 9 6 6 年瑞典科学家j o n s o ns ( 1 9 6 6 ) 首次提出多氯联苯具有在食物 链中生物蓄积和富集的能力，并且容易长期储存在哺乳动物的脂肪组织内的研究 结论后。各国开始关注多氯联苯问题。自1 9 6 8 年日本发生了米糠油中毒事件后， 多氯联苯引发的生态健康风险问题才引起人们的广泛注意。 1 1 水体环境中多氯联苯的污染特征 多氯联苯引起的环境问题是影响人类生存与健康的重大问题。水体中p c b s 是多途径污染的综合结果。p c b s 随大气颗粒物的沉降及含p c b s 土壤在流失过程 中向河道汇集是水体中p c b s 的两大主要来源。对于多氯联苯这类憎水性有机物 而言，其在水体环境中的归宿和生物利用率主要受溶解性有机质和颗粒状有机物 的影响( b u r h a r d , 2 0 0 0 ；s c h w a r z e n b a c h e t a l ，2 0 0 3 ) 。由于p c b s 的蒸汽压很低，很 难从水体中蒸发，其黏度和密度均较大，难溶于水且具有亲脂性，易被悬浮颗粒 吸附而携入水底( j o s e p h i n e e t a l ，2 0 0 5 ) ，因此底泥沉积物被认为是p c b s 在水体 中的主要归宿，而在一定条件下，蓄积在沉积物中的污染物能通过再悬浮作用再 次进入水体，造成水体的二次污染和水生生物的毒害。r a j e n d r a n 等( 2 0 0 5 ) 研 究发现孟加拉海湾沉积物中总p c b s 最高浓度达到6 5 7 0 p g g 干重，而水中最高浓度 为4 4 5 8 n g l ，沉积物中含量要高出水中含量。 通常p c b s 同类物在水体中的分布会因氯取代数的不同所引起的物理化学性 质的差异而不同。p c b s 的水溶性随着氯取代个数的增加而减d 、( s h i u a n d m a c k a y , 1 9 8 6 ) ，单一氯取代的p c b s 的溶解度为6 m m o f l ，而八氯联苯水中溶解度仅为 o 0 0 7 m m o l l ，因此当水体受到p c b s 的污染后，低氯取代的p c b s 更倾向于在水 体中迁移，而高氯取代的p c b s 则更倾向于在低泥中分布，并更易被水生植物与 浙江大学硕士学位论文 一鱼多氯联苯暴露的细胞凋亡效应与机制研究 动物所富集。因此在具有类似商品组成的p c b s 进入水体后，p c b s 同类物可能 根据其这一特性在不同介质中分布，造成水中p c b s 同类物的分布和原来的同类 物分布有相当的不同。另一方面，相同氯取代个数的多氯联苯同系物，其溶解度 氯也会随着取代位置的不同而不同( s a w n e y , 1 9 8 6 ) 。 1 2 多氯联苯对鱼类的生态毒理学研究 由于环境中的p c b s 会通过降雨、地表径流等进入自然水体，因此含多氯联 苯的水体鱼类人体健康风险成为多氯联苯产生危害的另一个可能途径。 1 2 i 多氯联苯在鱼体内的累积 多氯联苯极容易在水生生物体内累积( n i m i ic ta 1 ，1 9 8 3 ) 。m a 曲i n s e n 等 ( 1 9 9 1 ) 对格罗马河河口内及附近的鱼类检测发现，比目鱼( e p i n e p h e l u s a w o a r a ) 和鳕鱼( g a d o u sm a c r o c e p h a l u s ) 体内均含有p c b 2 8 ，5 2 ，1 0 1 ，1 1 8 ，1 5 3 ，1 3 8 ， 1 8 0 ，1 7 0 及2 0 9 ：并且比目鱼体内p c b s 含量为1 0 5 0 n g g ，而鳕鱼体内p c b s 含 量为3 6 1 n g g ，两者体内蓄积量相差高达三倍。m a r i a ( 2 0 0 2 ) 等人研究发现鱼类 中产卵前的o l i g o s a r c u j e n y n s i ( - - 种低脂鱼) 在卵巢中p c b 含量最高为1 3 5 7 n g g ， 其次肝和肌肉分别为4 2 o n g g 和2 9 3 n g g ，肝和肌肉中主要以四氯、五氯和六氯 苯为主而卵巢中则以五氯、六氯和七氯苯为主；产卵期后的雄性鲶鱼的肠系膜脂 肪中p c b 浓度最高为7 3 0 6 n g g ，而产卵期前雌性鲶鱼卵巢中p c b 含量要远高于 产卵期后，雌性鲶鱼的肝脏和肌肉中主要以四氯、五氯和六氯苯同系物为主而雄 性鱼的肝脏和肌肉中则以五氯、六氯和七氯为主。研究表明两类鱼种中产卵期前 的雌性鱼肌肉中p c b 含量均最高，同时鲶鱼肌肉内的含量高出o l i g o s a r c u j e n y n s i 的两倍。k u r t ( 2 0 0 3 ) 对南极的三种鱼类进行p o p s 监测时发现了p c b l 5 3 ，p c b l 3 8 和p c b l 8 0 的存在，它们在鱼体内的浓度要比北半球的海鱼类低两至三个数量 级；同时在南极的鱼类体内低氯代的p c b s 浓度有所增加，而在瑞典的水体和 g r e a tl a k e s 中高氯代的p c b s 浓度则显著下降( h u e s t i sc ta 1 ，1 9 9 6 ；b i g n e r te ta 1 ， 1 9 9 8 ) ，因而推测p c b s 在全球的分配仍未达到一个稳定的状态。研究中发现鳄 头冰鱼( c h a m p s o c e p h a l u sg u n n a r i ) 体内三种p c b s 的浓度在1 9 8 7 年和1 9 9 6 年 问并无显著增加；而鲭( g o b i o n o t o t h e n g i b b e r i f r o n s ) 和黑鳍自鲑( c h a e n o c e p h a l u s a c e r a t u s ) 体内p c b l 5 3 和p c b l 8 0 在两个时间段增加了近两倍。m o n o s s o n 等 2 浙江大学硕士学位论文 舅鱼多氯联苯暴露的细胞凋亡效应与机制研究 ( 2 0 0 3 ) 人对h u d s o n 河口的p i e r m o n tm a r s h 点位和i o n am a r s h 点位以及n e w a r k 海湾的r o a n o k ey a c h tc l u b 湾点位的底鳍( f u n d u l u sh e t e r o l i t u s ) 进行监测，发现 n e w a r k 、p i e r m o n t 和i o n a 三处底鳍肝脏中的p c b 总浓度相似，约为1 6 0 0 n g g 湿重；在n e w a r k 处的底鳍其性腺内的p c b 浓度约为3 2 5 0n g g 湿重，远远低于 i o n a 处( 约5 0 0 0n g g 湿重) 。在i o n a 和p i e r m o n t 处的底鳍其性腺内的p c b 浓度 相当于肝脏中的两倍，而n e w a r k 处其性腺内的p c b 浓度则与肝脏中的相似。 在国内，铁晓威等( 2 0 0 5 ) 人对浙江省部分地区淡水鱼种多氯联苯污染水平 进行调查研究，研究发现鲫鱼、鲢鱼组织中存在p c b 2 8 、p c b 5 2 、p c b l 0 1 、 p c b l 3 8 、p c b l 5 3 、p c b l 8 0 六种同系物，总浓度范围分别为1 5 0 1 7 5 7 p g g 湿重 和4 8 5 2 4 p g g 湿重。结果表明鲫鱼对不同氯代的p c b 的富集相对较一致，而鲢 鱼对p c b 的富集则主要集中在低氯代。研究认为鲫鱼和鲢鱼污染水平的不同可 能来源于其取食性不同，鲢鱼属于草食性而鲫鱼属于杂食性，因此鲫鱼的食物在 食物链中经过的途径要更长，由于食物链中的生物富集及放大作用而导致其污染 水平较高；另一个影响因素则可能和其在水中为中下层水性有关，由于高氯代 p c b 在底泥中的含量较高，因而处于中下层的鲫鱼在高氯代的p c b 污染水平要 比鲢鱼大得多。 一直以来都有争论，p c b s 对鱼类的累积效应究竟是受生物放大作用影响大 还是生物浓缩作用影响大( b r u g g e m a n e ta 1 ，1 9 8 1 ；t h o m a n n , 1 9 8 1 ；1 9 8 9 ；s h a wa n d c o n n e l ，1 9 8 6 ；r a s m u s s e ne ta 1 ，1 9 9 0 ) 。理论模型研究认为鱼类主要是通过鳃吸 收浓缩水中的p c b s 而非通过食物链摄取吸收即受生物浓缩作用影响大，然而由 于该结论的主要依据是实验室的实验模拟结果( b m g g e m a ne ta 1 ，1 9 8 1 ) ，所以 存在某些真实性差异，例如在实验研究时没有考虑水中有机物的作用，它能够减 小生物浓缩作用( c a r l b e r g e ta 1 ，1 9 8 6 ；l a r s s o ne ta 1 ，1 9 9 2 ) 已有大量的模拟实 验研究生物放大作用的影响( t h o m a n n , 1 9 8 1 ；1 9 8 9 ；t h o m a n na n dc o n n o l l y ， 1 9 8 4 ) ，而部分研究证明鱼类体p q p c b 的累积主要是通过生物放大途径( o l i v e r a n dn i i m i , 1 9 8 8 ；h i l la n dn a p o l i t a n o ，1 9 9 7 ；z a r a n k oc ta 1 ，1 9 9 7 ) r a s m u s s e n 等 ( 1 9 9 0 ) 人的研究就证明了湖泊鲑鱼( c o r e g o n u su s s u r i e m i s ) 体内p c b 的浓度与 食物链的长度有关，随着每一营养级的升高，p c b 的累积就上升3 5 倍。r i c h a r d 等( 2 0 0 1 ) 人采用两种不同的方式喂食含有p c b 的鱼饵和将鱼饲养在含有 浙江大学硕士学位论文鲫鱼多氯联苯暴露的细胞捅亡效应与机制研究 p c b 的水体中，以研究p c b 究竟是以那种方式为主在翻车鱼( l e p o m i s g i b b o s 船) 体内进行累积，并将两者的结果进行对比，实验结果表明通过向翻车鱼喂食含有 相同p c b 含量的不同类鱼饵，七日后鱼体内的p c b 含量为3 4 4 - 3 7 8ug g 脂质；而 将鱼放在含有p c b 的水中饲养7 日后，鱼体内p c b 含量为7 8l i 纠旨质，两者累积 结果相差将近5 倍。研究还发现氯取代相对较少的a r o c l o r l 0 1 6 在鱼体内的含量要 远高于氯取代较多的a r o c l o r l 2 5 4 。此实验结果进一步证实了多氯联苯是通过生 物放大作用蓄积在鱼体内。 1 2 2 多氯联苯在鱼体内的毒效应 多氯联苯能够在水中长期存在而难以去除( s i n k l o n c na n dp a a s i v i r t a , 2 0 0 0 ) ， 因而长期暴露于含有低剂量多氯联苯的水环境中会对水生生物产生潜在的健康 危害，造成慢性毒效应( k a r le ta 1 。2 0 0 1 ) 。 研究表明水环境中多氯联苯对鱼类的毒性作用较为明显，能够产生急慢性毒 及生殖系统毒效应。m c l a n c o n ( 1 9 8 9 ) 将含 t 4 c p c b 的玉米油注入虹鳟鱼 ( o n c o r h y n c h u sm y k i s s ) 体内，测定发现：注射3 天后，虹鳟鱼肝和肌肉p c b 浓度在2 5 0 n g g 时，机体未出现明显异常现象；而在3 0 0 n g g 浓度或更高时，肝 和肌肉的肝微粒体单氧酶活性增高。戴树桂( 1 9 9 0 ) 研究表明黑头鲦鱼与p c b s 接触3 0 d ，其半致死剂量为3 3 p g l 1 习志群等( 1 9 9 4 ) 人研究多氯联苯对鲫鱼 血液电解质的影响，发现在浓度( 1 3 0 、0 1 3 、0 0 1 3 ，0 0 0 1 3 “g l ) 和受试时间 ( 2 4 h 、4 8 h 、9 6 h 、1 2 0 h ) 两种情况下，鲫鱼受到p c b s 污染后，其血清钠要比 正常水平偏高，血清钾比正常水平偏低，血清中钾、钠离子的平衡受到了很大程 度的破坏，结果表明在此浓度下多氯联苯对鲫鱼的生理和病理变化会产生很大的 潜在影响。张凤君等( 2 0 0 1 ) 人研究发现斑马鱼( b r a c h y d a n i or e r i o ) 暴露于p c b s 质量浓度为5 0 1 t g l 水中2 8 d ，虽呈现出明显的中毒特征，但未出现死亡个体。 聂湘平等( 2 0 0 4 ) 人研究表明a r o c l o r l 2 5 4 对斑马鱼急性毒性不明显，其对斑马 鱼存活影响最大无影响浓度( n o e c ) 为0 4 0 9 9 l 一，最低有影响浓度( l o e c ) 为2 0 1 1 9 l 一，作用3 0 d 斑马鱼半致死剂量为5 0 9 t t g l 1 。不同浓度的a r o e l o r l 2 5 4 作用3 0 d 后，斑马鱼的组织结构发生明显变化，其中a r o c l o r l 2 5 4 浓度大于2 p , g l - l 时，斑马鱼鳃组织呼吸上皮细胞结构产生损伤；高浓度5 0 p g l 1 a r o c l o r l 2 5 4 对斑 马鱼肝脏细胞结构产生明显损害。肝脏细胞结构表现出异常，肝细胞核变形萎缩， 4 浙江大学硕士学位论文鲫鱼多氯联苯暴露的细胞凋亡效应与机制研究 并有大量脂褐素沉积。 多氯联苯对生物体表现出雌激素活性( s h i m u k e ，1 9 9 8 ) ，属环境激素类物质。 环境激素类物质可干扰血液中激素正常水平的维持，从而对水生生物特别是鱼类 的繁殖产生影响( k i m e 。1 9 9 5 ) 。野外暴露实验和室内模拟实验已表明鱼卵能够 通过父母体传递或直接吸收而富集氯化物，并直接对幼鱼的成长起毒害作用 ( t h o m a s , 1 9 8 9 ；v a ne ta 1 ，1 9 9 2 ；n o a a , 1 9 9 9 ) 。一些鱼种母体暴露于p c b 混合物 ( a r o c l o r l 2 5 或者单个同系物能够改变性别及卵母细胞的生长，降低幼鱼的存 活率或者抑制幼鱼的生长和发育( s h a r pa n dt h o m a s ，1 9 9 1 ；m o n o s s o nc ta 1 ， 1 9 9 4 ) 。o l s s o n 等( 1 9 9 9 ) 人研究表明，p c b 6 0 、p c b l 9 0 、p c b l 0 4 虽没有降低 鱼的繁殖力，但它们却增加了胚胎和幼体的死亡率；p c b l 0 4 和p c b l 9 0 处理过 的鱼均产生颅面畸形，而且经p c b l 0 4 处理的雌性鱼脊粒前凸，同时雄性鱼和雌 性鱼都产生脊柱侧凸。吴伟等( 2 0 0 6 ) 人研究发现鲫鱼在4 个浓度组( o 、1 0 、 2 0 、5 0 、8 0 鹇几) p c b s 中暴露5 - 1 5 d ，各试验组鲫鱼肝脏e r o d 酶活性与对 照组相比，分别上升1 8 2 - 2 9 7 、2 5 7 3 7 o 、4 2 2 - 5 2 4 和8 9 0 - 7 5 2 ， 呈现出明显的剂量效应关系；同时受试鲫鱼血清中1 7e 雌二醇含量也随试验浓 度增大而升高，呈现出一定的剂量效应关系，结果表明p c b s 对鱼类具有环境 雌激素效应。 1 3 多氯联苯的细胞毒效应 细胞凋亡是细胞主动死亡的过程，这个过程对消除机体内老化细胞及具有潜 在性异常生长的细胞，以及保持机体处于稳态起着重要的作用。体内细胞凋亡调 控机制发生紊乱可引起动物和人体发生多种疾病。形态学检测和生物化学检测表 明p c b s 可以诱导多种细胞发生凋亡。y o o 等( 1 9 9 7 ) 人发现a r o c l o r l 2 5 4 能够 促使脾细胞发生细胞凋亡作用。这些结果具有非常重要的现实意义，因为p c b 同系物被广泛应用于工业生产，并且污染环境。而肾脏细胞凋亡所引起的细胞损 伤是发生急慢性肾脏疾病的因素之一( s c h u m e re ta 1 ，1 9 9 2 ；g o b ea n da x e l s e n , 1 9 8 7 ；o r i t ze ta 1 。1 9 9 7 ) 。然而，a r o c l o r s 是一类p c b 同系物的混合物，因此混 合物中不同的成分对细胞生长的抑制和细胞凋亡能力会产生不同的作用。有研究 发现，不同的p c b 同系物即复合物中含有平面结构或不含有平面结构的都会使 细胞发生改变，如改变细胞膜的流动性( l o p e z - a p a d c i oe ta 1 ，1 9 9 7 ) 并从细胞 浙江大学硕士学位论文鲫鱼多氯联苯暴露的细胞凋亡效应与机制研究 内的磷脂释放花生四烯酸( s a 7 n c h c zc ta 1 ，1 9 9 7 ) 这两个结果都与细胞凋亡过 程相关( j o u r d h e u i le ta 1 ，1 9 9 6 ；r i z z oe ta 1 。1 9 9 9 ) 因此，确定p c b 混合物中 单个成分对细胞的毒性影响具有重要意义j c s u sa d o l f o ( 2 0 0 3 ) 等发现 3 0 p m - 1 0 0 肛m p c b l 5 3 和p c b 7 7 均能引起神经细胞凋亡。p c b 7 7 和p c b l 5 3 都能 够抑制神经细胞生长同时在l o o p m 浓度下p c b 7 7 和p c b l 5 3 能够显著增加细胞 内乳酸脱氢酶的释放，两种实验结果呈明显的时间浓度效应关系。p e d r ol p e 7 r c z - r c y e s ( 2 0 0 1 ) 等发现p c b 7 7 和p c b l 5 3 能诱导小鼠肾小管细胞凋亡， 3 0 r t m 1 0 0 i _ t m 浓度下均能检测到d n al a d d e r 。s l i m ( 2 0 0 0 ) 等研究发现猪的肺部 血管内皮细胞经3 4 p mp c b 7 7 诱导会发生凋亡k u m - j o os h i n ( 2 0 0 0 ) 等发现 2 0 州p c b l 0 4 能够引起人体的u 9 3 7 单核细胞发生细胞凋亡。p c b l 2 6 ( h o de ta 1 。 1 9 9 7 a ；h o de ta 1 ，1 9 9 7 b ) 能够引起氧化胁迫。m a s u m ii k e d a ( 2 0 0 0 ) 研究发现 p c b l 2 6 处理过的小鼠中，谷胱甘肽过氧化物酶氧化还原系统功能以及过氧化氢 酶降低( h o dc ta 1 ，1 9 9 7 9h o de ta 1 ，1 9 9 7 b ；a d y o s h ie ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 先前有人证明p c b s 能引起内皮细胞的活化作用及损伤并导致血管内皮组织 功能紊乱。y o n gw o ol e e ( 2 0 0 3 ) 等人在此研究基础上研究发现了p c b l 0 4 诱导 人类毛细血管内皮细胞发生凋亡的现象。研究发现用p c b l 0 4 处理的毛细胞管内 皮细胞其细胞生存能力有明显降低，这种降低呈时间剂量关系。但是当加入 z v a d - f m k ，一种c a s p a s e 抑制剂时，毛细血管内皮细胞内的d n a 裂解则明显减 少。e l g r e g o r a s z c z u k ( 2 0 0 3 ) 等研究p c b l 2 6 和p c b l 5 3 对不同大小的滤泡中 膜细胞及粒层细胞的毒性影响时发现，在小滤泡中，两种p c b s 对膜细胞的三种 观察参数即凋亡小体数量、类固醇分泌量和e a s p a s c - 3 没有任何影响，而在粒层 细胞中表现出凋亡小体数量增加，类固醇分泌和c a s p a s e 3 活性无影响：在中等 大小的滤泡中，两种p c b s 同时减少膜细胞和粒层细胞凋亡小体数量而对类固醇 分泌和c a s p a s e 3 活性无影响；在大滤泡中凋亡小体数量和c a s p a s e 3 活性与粒层 细胞的雌二醇分泌量呈正相关，而与膜细胞的睾丸激素分泌量呈负相关。 大量的研究表明在众多能够反映多氯联苯引起的不利健康影响的组织器官 中，免疫系统是最为敏感的指示系统之一( w i e r d ae ta 1 ，1 9 8 1 ；d a v i sa n ds a f e ， 1 9 8 9 ；t r y p h o n a sc ta 1 ，1 9 8 9 ；k e r k v l i e te ta 1 ，1 9 9 0 a ) 。目前有一些有关多氯联苯对 鲑鱼免疫系统的暴露效应研究，但是研究主要集中在b 细胞的功能影响方面； 6 浙江大学硕士学位论文鲫鱼多氯联苯暴露的细胞凋亡效应与机制研究 此外也有对p c b s 体外暴露t 细胞的敏感性的研究( m i l l e r e t a l ，2 0 0 2 ；s w e e te t a l ， 1 9 9 8 ) ，尚未见多氯联苯对鱼类免疫系统的细胞凋亡研究报道。细胞凋亡是细胞 在基因调控下的一种主动性的死亡过程，对于健康机体的维持、神经系统的正常 发育、免疫系统正常功能的维持等方面起着重要作用( g r e e na n dr e e d , 1 9 9 8 ) 。 因此研究持久性有机污染物多氯联苯诱导细胞的凋亡对于机体内环境的稳定、免 疫系统功能的健全具有重要意义 1 4 多氯联苯的细胞分子毒理学机制 1 4 1 体外诱导的分子毒理学机制研究 研究发现一系列环境污染物都能够诱导多种类型的细胞发生凋亡( r i s s o - d e e ta 1 。2 0 0 4 ) ，并且许多因素参与细胞凋亡过程的调节。p c b s 诱导细胞凋亡的机 制非常复杂，至今没有明确的解释。n a + k + - a t f a s e 在鱼类的水盐调节中具有重 要作用( 卢建民等，2 0 0 1 ) 。k o c h 等( 1 9 7 2 ) 使用浸浴法将宽头鲤鱼( p i m e p h a l e s p r o m e l a s ) 分别放在含有a r o e l o r l 2 4 2 和1 2 5 4 的水中饲养4 个月，结果表明脑、 肾和肝组织的m 9 2 + a t p a s e 和n a + k + a t p a s e 活性对p c b s 胁追呈现一定抑制作 用。有研究表明用三氯联苯对草鱼腮n a + k + - a t p a s e 活性影响的实验也发现了明 显的抑制作用( 徐立红等，1 9 8 7 ) 推测p c b s 对其损伤的机理可能是活性氧的 直接作用，造成了酶活性部位某些最基本氨基酸氧化，从而使酶活性降低。多氯 联苯会对超氧化物歧化酶( s o d ) 的活性产生影响。方展强等( 2 0 0 4 ) 同样使用 浸浴法以0 、2 、5 0ug l 三个多氯联苯浓度为剑尾鱼( x i p h o p h o r u sh e l l e r i ) 染毒， 定量测定了7 2 h 内肝、腮及卵巢组织中的s o d 的活性变化。在最初染毒的1 2 h 内，s o d 活性略有上升，但随暴露时间延长，浓度增加，肝和卵巢的s o d 活性 均呈下降趋势。此外，结果还显示肝组织的s o d 活性较高于卵巢的s o d 活性， 表明不同器官组织的s o d 活性对p c b s 胁迫的敏感性存在一定的差异。 1 4 2 体内诱导的分子毒理学机制研究 有研究指出c j u nn - t e r m i n a lk i n a s e ( j n k ) 活性与细胞凋亡有着直接关系。 j n k 是一类具有调节作用的信号酶，它很容易被一些环境污染物激活( b a s ua n d k o l e s m d q1 9 9 8 ) 。过氧化作用可能潜在的控制肿【调节酶发出信号的过程 ( t i n h e re ta 1 。1 9 9 8 ) 一旦j n k 酶被激活，j n k 酶便调节c - j u n 的磷酸化作用以 7 浙江大学硕士学位论文一鱼多氯联苯暴露的细胞凋亡效应与机制研究 及它的转录因素，之后激活一些特殊的e a s p a s e 酶，最终引起细胞凋亡。i l s l i m ( 2 0 0 0 ) 研究发现p c b 7 7 能够刺激血管内皮细胞发生过氧化作用，这种刺激作用 是通过肿s a p k 酶反映的。同时还发现p c b 7 7 调节反应能够通过细胞内的谷胱 胺酸进行调控。若将血管内皮细胞经过谷胱胺酸抑制剂处理后，由p c b 弓i 起的 j n k s a p k 酶活性会进一步提高。有观察发现p c b 7 7 或四氯二苯并二恶英 ( t c d d ) 与细胞芳烃受体结合后会促使细胞发生过氧化作用，并且激活细胞色 素p 4 5 0i a 以及其他相关基因的活性( a l s h a r i fe ta 1 ，1 9 9 4 ；t o b o r e ke ta 1 ，1 9 9 5 a ； h e n n i n ge ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 一些氧化还原响应转录因素，如c r e b ，a p 1 。n f kb ，s 似n 在细胞凋 亡的分子信号层叠中起关键作用( m a f i aa n ds t e p h e n , 2 0 0 4 ；k a t y n s k ie ta 1 ，2 0 0 3 ； b u t t k ea n ds a n d s t r o m , 1 9 9 4 ；h a w k i ne ta 1 ，1 9 9 8 ；l e ee ta 1 ，2 0 0 5 ；s a n c e a ue ta 1 ， 2 0 0 0 ；s o m e r se ta 1 ，1 9 9 9 ；w e l s h , 1 9 9 6 ；z h a oe ta 1 ，1 9 9 7 ) 。y o n gw o ol e e ( 2 0 0 3 ) 的研究发现人类毛细血管暴露于p c b l 0 4 中，p c b l 0 4 并没有激活a p 1 ，n f x b 以及s 似n 而是选择性的激活c i 遇b 蛋白质绑定活性并诱导细胞凋亡。c r e b 家族的转录因素属于亮氨酸链属蛋白质，一些蛋白质激酶包括蛋白质激酶a ，活 性有丝分裂原蛋白质激酶( m a p k s ) 和c a 2 + 蛋白质激酶在特定剂量下能使c r e b 磷酸化。c r e b 的磷酸化作用能够促使构象的改变即转录因素从无活性至有活性 的转变并且能够通过影响c r e b 的能力提高转录功能以使不同激活剂如c r e b 绑定蛋白质发生二聚化( g o n z a l e z e ta 1 ，1 9 9 1 ；k w o ke ta 1 ，1 9 9 4 ) c r e b 转录因 素既有抗凋亡作用又有促凋亡作用。c r e b 的抗凋亡作用在一些不同的细胞和组 织中都有发现，它的机制包括抗凋亡基因的上调节如b c l 2 和蛋白质激酶b a k t ( m a f i aa n ds t e p h e n , 2 0 0 4 ；b u t t k ea n ds a n d s t r o m ，1 9 9 4 ；h a w k i ne ta 1 ，1 9 9 8 ； s o m e r se ca 1 ，1 9 9 9 ) ，这说明c r e b 以及相关的蛋白质在一些不同类型的细胞中 可作为生存因素。另一方面，越来越多的研究证明c r e b 的促凋亡作用。例如， 已证实由m a p k s 调停的c r e b 磷酸化作用在交互白细胞素1b 诱导的小鼠产胰 岛素r i n m s f 细胞凋亡中起非常重要的作用( l e ee ta 1 ，2 0 0 5 ；w e l s h , 1 9 9 6 ) 。在 p c b l 0 4 处理人类毛细血管时也有发现相似的作用。因此，显见c 砌狙的活性作 用以及是促进凋亡还是抑制凋亡主要与诱导细胞凋亡的刺激物以及特殊的细胞 类型有关。 浙江大学硕士学位论文舅鱼多氯联苯暴露的细胞凋亡效应与机制研究 有研究发现巨噬细胞的凋亡能够通过外部半小叶的胞浆膜的磷脂酰丝氨酸 浓度增加而被调节。一些研究也证实细胞凋亡中包含脂质信号通道( s e a t t e r e t a l ， 1 9 9 7 ；m a t h i a sa n dk o l s n i c k , 1 9 9 3 ) 。花生四烯酸引起凋亡的机制与产生自由基无 关( r i z z oe ta 1 。1 9 9 9 ；f i n s t a de ta 1 ，1 9 9 4 ；c a oe ta 1 ，2 0 0 0 ) 人的嗜中性粒细胞也 容易受到花生四烯酸的影响而发生凋亡( k o l l e r e ta 1 ，1 9 9 7 ) 另外，空间结构的 p c b s 能够增加肾脏细胞( f e m a 7 n d e zs a n t i a g oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 和神经细胞磷脂酶a 2 活性( s h i ne ta 1 。2 0 0 2 b ) ，最近的研究同样发现空间结构p c b 同系物通过磷脂酶 a 2 调节c a 2 + 流量而引起细胞凋亡( s h i ne t a l ，2 0 0 2 b ) 。而且，空间结构p c b s 进入 神经细胞中蛋白质激酶c 仍有活性( k o d a v a n t ia n d f i l s o n , 1 9 9 7 ；y a n ga n d k o d a v a n t i , 2 0 0 1 ) 并且这种酶均参与细胞增殖和细胞凋亡 目前已证实存在一些与细胞凋亡相关的不同的信号途径和机制。m a s u m i i k e d a ( m a s u m ie ta 1 。2 0 0 0 ) 的研究则发现p c b l 2 6 处理小鼠肝脏细胞时2 7 - k d a 蛋 白质表现出显著的抑制作用。最近亦有报道碳脱水酶在抵制过氧化氢诱导的细 胞凋亡中有重要作用( r fi s a n e ne ta 1 ，1 9 9 9 ) 研究表明细胞内活性氧类物质 ( j e a ne ta 1 。1 9 9 8 ) 和脂质过氧化物质( p e n t i k a i n e ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 参与了p c b s 诱 导的细胞凋亡。o z a k i ( 2 0 0 0 ) 认为氧化应激与细胞凋亡存在着十分密切的关系。 有现象表明活性氧类能够广泛引起细胞系统的凋亡现象，并且氧化胁迫在一些病 理紊乱状态起着重要的作用( r e u s c ha n dk l e m m , 2 0 0 2 ；r i c c i oe ta 1 ，1 9 9 9 ) l e e ( 2 0 0 1 ) 等发现氧化胁迫是p c b 5 2 产生对神经细胞凋亡损伤的主要途径。有报道 p c b s 会影响线粒体的呼吸作用( n i s h i h a r ae ta 1 ，1 9 9 2 ；n a r a s i m h a ae ta 1 ，1 9 9 1 ) ， 因此认为这可能是诱导细胞凋亡的机制之一。 虽然多氯联苯的毒理学己得到了广泛的研究，但迄今为止，对其在分子水平 上的致毒机理的研究还很少，特别是对于p c b s 诱导细胞凋亡的机理研究还很有 限，随着分子生物学技术的发展，这一领域将成为研究的热点。 1 5 国内水环境中多氯联苯的残留问题 我国自1 9 6 5 年开始生产p c b s ，主要包括三氯联苯和五氯联苯，到2 0 世纪8 0 年代初全部停产时我国生产的p c b s 总量累计近万吨，此外，2 0 世纪5 0 年代7 0 年 代，我国在未被通知的情况下，曾从比利时、法国、德、日本等国进口含有多 氯联苯的电力电容器、动力变压器等，目前这些设备多数已经报废，致使我国 9 浙江大学硕士学位论文鱼多氯联苯暴露的细胞凋亡效应与机制研究 p c b s 污染物的存有量在2x1 0 4 t 左右( 余刚等。2 0 0 5 ) 。环境中的p c b s 会通过各 种途径进入水体，从而造成水环境的污染。 国内研究人员对我国不同环境介质开展的调查和研究表明( 韩刚和下静。 2 0 0 5 ；z h o uc ta 1 ，2 0 0 0 ；y m ge ta 1 ，2 0 0 5 ；张祖麟等，2 0 0 2 ；沈韫芬等，2 0 0 4 ；王子 健等，2 0 0 5 ；王毅等，1 9 9 9 ；习志群等，1 9 9 8 ；蒋新等，2 0 0 0 ；张俊增等，1 9 9 9 ) ，很 多地区的水体中都存在着不同程度的p c b s 污染( 如图1 ) 。 图1 1 我国部分水体中多氯联苯分布状况 f i g 1 1d i s t r i b u t i o no f p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l si nd o m e s t i cw a t e r s 由图l 可见“三河三湖”流域受到了不同程度的p c b s 污染。淮河流域( 信 阳段、蚌埠段、淮南段、阜阳段) 污染比较严重；海河流域污染程度存在较大差 异，其中部分水域污染比较严重；辽河流域水体中则没有检出。在“三湖”中， 目前没有滇池和巢湖的报道，但太湖的p c b s 污染相当严重，已经达到了6 3 1 n g l 。 长江、黄河和珠江三大河口三角洲地区的p c b s 污染已经受到重视，黄河口地区 东营市1 9 9 7 年1 9 9 8 年各水域中的p c b s 均小于5 0 n g k g ，从三大河口地区的污 染状况看，珠江三角洲最严重，黄河三角洲最轻，长江口地区介于两者之间( 张 祖麟等，2 0 0 0 ) 。武汉东湖水体中p c b s 检出率 9 0 ，含量为o 0 0 2 一1 1 2 n g l ( 陈 满荣等，2 0 0 4 ) 。 张祖麟等( 2 0 0 0 ) 对我国闽江口表层水中、间隙水和沉