（生物医学工程专业论文）载蛋白药物双层微球的制备和性质研究.pdf

中国医学科学院& 中国协和医科大学博士学位论文 包封率为( 7 6 4 6 + 1 5 2 ) ，载药量为( 3 1 2 8 + 1 9 1 ) 。 ( 3 ) 考察了两种微球的体外释放，进行机制探讨，并进行数学模型拟合。同 时，通过放射免疫法测定了释放介质中的胰岛素的含量，反映胰岛素的活性。 双层微球的体外释放分为快速释放相和缓慢释放相两相，分别符合零级动力学 方程模型；胰岛素的放射免疫测定结果证明胰岛素在微球制备、储存、释放过 程中活性保持良好。 关键词：壳聚糖；透明质酸钠：乳化聚合；双层微球；胰岛素；生物活性 n 中国医学科学院& 中国协和医科大学博士学位论文 a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，p r o t e i nd r u g sd e l i v e r ys y s t e m sh a v eb e e nd e v e l o p e df a s t , e s p e c i a l l yf o rl o n g a c t i n gi n j e c t a b l em i e r o s p h e r e m a d e w i 也b i o d e g r a d a b l e b i o m a t e r i a l s b e c a u s eo ft h e i rs u s t a i n e dr e l e a s ep r o p e r t y , t h o s em i c r o s p h e r e s p r e p a r a t i o nh a sb e e nah o tf i e l di np h a r m a e e u t i c s n o w , t h ea c t i v i t yo fp r o t e i ni s r e a d yt o d e n a t u r ei nt h ep r e p a r a t i o np r o c e s s ，s oh o wt oc h o o s et h ep r o p e r b i o m a t e r i a l sa n dp r e p a r a t i o nm e t h o db a s e do nt h ec h a r a c t e r i z a t i o no ft h ep r o t e i n d r u g sa n dh o w t op r e p a r eas a f e ，s t e a d ya n de f f e c t i v ep r e p a r a t i o ni sa ni m p o r t a n t c h a l l e n g e a i ma tu p p e rq u e s t i o n s ，ac h i t o s a n - l a y a l u r o n a t e ( c h s - h a ) d o u b l e - w a l l e d m i c r o s p h e r ew a sf a b r i c a t e di nt h i sw o r k n ”d e t a i l e dp r o c e s s w a sf o l l o w e d ： c h s - h ad o u b l e - w a l l e d m i c r o s p h e r e sw e 咒p r e p a r e d b y e r a u l s i f i c a t i o n - c o a c e r v a t i o nm e t h o d t r i p o l y p h o s p h a t e ( t p p ) w a st h ei o nc r o s s l i n k e r t h ei n d i v i d u a le f f e c to fp h , v o l u m e ，c o n c e n t r a t i o no fo u t e ra q u e o u sp h a s e ，a n d s u r f a c t a n t0 1 1m i c r o s p h e r e sm o r p h o l o g ya n df a b r i c a t i o nw e r et e s t e db yz e t a “) p o t e n t i a l ，s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) a n df o u r i e r - t r a n s f o r m i n f r a r e d s p e c t r o m e t r y ( f t - i r ) t p pc o n c e n t r a t i o na n dp ho f o u t e ra q u e o u sp h a s ew e r ec r u c i a l t om i c r o s p h e r e sf a b r i c a t i o n , w h e n 巾c o n c e n t r a t i o nw i l t sh i g h a rt h a n8 s p h e r i c a l a n ds m o o t hm i c r o s p h e r e sc o u l db ef o r m e d t h eo p t i m a lp nf o rm i e r o s p h e r e s f o r m a t i o nr a n g e df r o m6 , 0t o7 0 m i c r o s p h e r e sc o n t a i n i n gb o t he p a n s 0a n dt w e c n 8 0 i np r o c e s sw e r el e s ss h a p e l yc o m p a r e dw i t ht h o s ee n n t a i n i n gs p a n 8 0o n l y i na d d i t i o n , v o l u m ea n dh ac o n c e n t r a t i o no fo u t e ra q u e o u s p h a s ea l s oa f f e c t e dt h em i c r o s p h e r e s m o r p h o l o g y i n s u l i na sam o d e lp r o t e i nd r u gw a se n c a p s u l a t e di nc h s h a d o u b l e w a l l e dm i c r o p h e r sa n dt h ee n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c ya n dl o a d i n ge f f i c i e n c y w e r em e a s u r e d f u r t h e r 锄o r t h o g o n a ld e s i g nw a sa c h i e v e db a s e do i lt h o s er e s u l t s a n dt h em o s tp e r f - 瞰c o n d i t i o n sw e f ec h o s e t h r o u g ht h eo r t h o g o n a ld e s i g n , t h e c h o s e nf a c t o r sw e r e t h ev o l u m eo f t h eo u t e ra q u e o u sp h a s ew a s4 0 m l ；t h ep ho f t h e o u t e ra q u e o u sp h a s ew a s6 0 ，t h ec o n c e n t r a t i o no fh aw a so 0 2 5 ，a n dt h es t i r r i n g t i m ew a s3 1 1 ； m 中国医学科学院& 中国协和医科大学博士学位论文 t h er e l e a s ep r o f i l ei nv i t r ow a sd e t e c t e da n dm i m i c k e dw i t hm a t h e m a t i c s e q u a t i o n t h em e c h a n i s mo fr e l e a s ew a se x p o u n d e d m e a n t i m e ，i n s u l i na m o u n tw a s m e a s u r e db yr a d i o - i m m u n i t ya s s a y ( m a ) ，a n dd e t e c tt h ea c t i v i t yo fi n si nt h e p r o c e s so fm i c r o s p h e r ep r e p a r a t i o n , s t o r a g ea n dr e l e a s e t h er e l e a s ep r o f i l eh a dt w o p h a s e s ，t h ef a s tr e l e a s ep h a s ea n dt h es l o wr e l e a s ep h a s ea n dw a sa c c o r d i n gw i t ht h e f i r s tk i n e t i c se q u a t i o n r i ar e s u l t ss h o w e dt h a ti n s u l i nb i o a c t i v i t yh a sn oo b v i o u s l o s si n t h ep r o c e s so f m i c r o s p h c r ep r e p a r a t i o n , s t o r a g ea n dr e l e a s e k e y w o r 出：c h i t o s a n ；h y a l u r o n a t e ；i r i p o l y p h o s p h a t c ；e m u l s i f i c a t i o n c o a c e r v a t i o n ； d o u b l e - w a l l e dm i c r o s p h e r e ；i n s u l i n ；b i o a c t i v i t y 中国医学科学院& 中国协和医科大学博士学位论文 第一部分文献综述 1 微球制剂的现状和发展趋势 美国的w u r s t e rd e 和g r e e nb x 是微球技术的先驱。微球技术从1 9 5 7 年 提出发展至今已有近五十年历史。1 9 5 4 年，g r e e n 和s h l e i c h e r 1 首先将此技术 用于制造压敏式炭复写纸。由于具有良好的表面效应、体积效应、磁效应、生 物相容性等特性，微球逐渐拓展到了食品、农药、饲料、油墨、粘合剂、化妆 品、感光材料、纺织等众多的领域【2 ，3 。我国在研究微球技术方面起步较晚， 约在七十年代初才开始研究工作，经过3 0 多年的努力，微球的研究和应用有了 一定的提高，投入生产的有微量复写纸、心电图纸、饲料、染料，并且药物微 球、化妆品微球、农药微球等方面也已有实际应用和较深入的研究【4 】。本文重 点介绍其在药物释放领域的应用。 随着科学技术的不断发展，人们对药物制剂的要求逐渐提高。微球作为一 种新型控缓释给药体系得到了广泛应用，药物经微囊化以后，可防止其在空 气中分解，降低对人体脏器的刺激，通过缓释，可减少用药量，延长药效。药 物微球发展经历了几个阶段：第一阶段在2 0 世纪7 0 年代，研究出来的药物微 球粒径在5 m 2 衄；第二阶段在2 0 世纪8 0 年代，有1 1 0 岫的微粒和1 0 - , 1 0 0 0 n m 的毫微粒，人们发现这种毫微粒有的可以借助细胞吞噬而将药物带入细胞 内；第三代是2 0 世纪9 0 年代以后，出现了具有靶向功能的微粒，这些微粒能 进入体内特定部位使其吸收发挥药效。 现在微球已经成为当今世界上的一种发展迅速、用途广泛的新型技术。其 中，对抗生素、避孕药和麻醉药等药物的控缓释放研究较为普遍，技术也相对 成熟。微球用作蛋白、多肽及疫苗等大分子药物载体也越来越受到重视。具有 外界刺激响应能力的智能微球将成为研究热点之一，对微球的主动靶向研究也 会继续深入。随着微囊化技术的快速发展，从现有开发角度看，许多作用差的 药物、半衰期短的药物、抗生素药物、成瘾性药物均可制备成微球缓控释制剂 以适应特殊医疗应用。所以，开发性能优良的微球体系对于药剂学的发展具有 重要意义。 1 1 微球的基本概念 中国医学科学院& 中国协和医科大学博士学位论文 微囊化技术又称为微型包囊术，简称微囊化，是指利用天然的或合成的高 分子材料作为囊膜壁壳，使药物溶解和分散在高分子材料中，形成骨架型微小 球状实体，即微球，粒径一般为1 5 0 0pm 。经过微囊化技术所形成的这种微 球是多样化的，表面有光滑或者粗糙，囊膜可以是单层、双层或者是多层结构， 而囊心既可以是单核，也可以是多核的。 1 2 微球的优越性： ( 1 ) 掩盖不良味道，如鱼肝油、大蒜素等。 ( 2 ) 增加药物的稳定性。对湿度、光线及氧不稳定的药物制成微囊后， 与外界环境隔绝，提高了稳定性。如阿司匹林和b - 胡萝卜素。 ( 3 ) 缓释或控释药物，制备长效制剂，如硝酸甘油、吲哚美辛等。缓控 释给药，不仅可以避免重发给药时造成的血药浓度波动，而且可以 节省大量的药物。 ( 4 ) 使液态药物固态化可以便于应用和储存。 ( 5 ) 减少防止药物之间的配伍变化。 ( 6 ) 可制备成靶向制剂，使药物在固定部位持续、安全而稳定地发挥作 用。降低药物的毒副作用，使用药更加安全。 ( 7 ) 微球可减少药物对胃肠道的刺激，防止药物被胃酸破坏等等。 ( 8 ) 可将活细胞或生物活性物质包囊。 1 3 囊材 囊材又称包料，是用于制作微球或毫微粒所需的材料，在很大程度上决定 着微球产品的理化性质，是微球的重要部分。 。囊材的选取通常需根据产品的具体情况而定，其一般要求是：( 1 ) 材料性 能稳定；( 2 ) 具有良好的生物相容性，生物可降解，无毒副作用；( 3 ) 与药物 不起反应，不影响药物的药理作用及含量测定；( 4 ) 有一定的强度及可塑性；( 5 ) 有适宜的释放速率。 常用囊材主要分为有天然高分子材料和合成高分子化合物。天然高分子材 料如明胶、壳聚糖等，具有稳定、无毒、成膜性好的优点；合成高分子材料如 聚酯、聚炭酯、聚氨基酸等，具有无毒、成膜性好、化学稳定性高等优点。 1 4 微球制备的方法 中国医学科学院& 中国协和医科大学博士学位论文 微球制备的技术有很多，主要分为物理化学法、物理法和化学法。在实践 中应考虑药物和微球包囊材料的性质等因素来决定制备方法的选择。 1 4 1 物理化学法 主要有相分离凝聚法、液中干燥法、粉末床法等。 相分离凝聚法： 相分离凝聚法是n c r 公司于1 9 6 2 年提出的。将药物乳化分散在溶有囊材 的连续相内并混合均匀，再加入另外一种物质或溶剂，通过带相反电荷、脱水、 溶剂转换等外界物理化学因素的影响降低囊材的溶解度，从而凝聚包裹药物从 连续相中析出生成一个新相即生成微球。相分离凝聚法因囊材的性质不同而分 为水相分离法和油相分离法。 水相分离法是以水溶性高分子为囊材，在一定作用下，高分子的凝聚相从 水溶液中分离出来形成微球。 油相分离法是以聚合物有机溶剂为介质，在含有囊材的聚合物有机溶液中 加入一种对壁材为非溶剂的液体或通过降低温度引发相分离形成微球，经固化 等步骤可得到微球。其分离机制式以某种合适的有机溶剂溶解高分子囊材，加 入水溶性药物调成三种互不相溶的化学相，然后通过絮凝剂或其他方法使三相 体系中囊材的溶解度下降而凝聚分离出来实现微球化。目前，主要使用三种方 法实现油相分离，温度变化法，加入非溶剂法，加入引起相分离的聚合物。油 相分离法在医药领域中得到广泛应用，并且已经实现了商业化。 液中干燥法： 从乳液中除去分散相中的挥发性溶剂以制备微球的方法称为液中干燥法， 也称为乳化一溶剂挥发法。是将囊材的溶液乳化，存在于分散相中，与连续相 不混溶，但囊材溶液对于连续相有一定的溶解度，实现萃取过程，形成微球。 液中干燥法中最常用的是w o w 。 1 4 2 化学方法： 主要有界面聚合法、原位聚合法、聚合物快速不溶法、气相表面聚合法等。 其中界面聚合法是较常用的方法。 界面聚合法： 界面聚合法是一种较为新颖的微球制备技术，指的是处于分散相的囊心物 中国医学科学院& 中国协和医科大学博士学位论文 质与连续相的单体界面间发生聚合反应而形成微球。它对反应单体的纯度要求 不高和原料配比要求不严，反应速度快，效果好，不需要昂贵复杂的设备，可 以在常温下进行。其原理就是两个不相溶的液相在界面处或接近界面处进行聚 合反应，形成包囊材料，最后此包囊材料就包囊在囊心物质的表面上形成单个 的外形呈球状的半透性微球。该方法反应速度快且特别适合于酶制剂和微生物 细胞等具有生物活性的大分子物质的微球化。例如制备了用一般物理方法无法 达到的胰岛素微球和具有治癌功能的b 天冬酚胺酶微球。 1 4 3 物理方法： 采用物理过程机械地将囊材包裹在囊芯物上形成微球。如空气悬浮法、喷 雾干燥法、静电结合法、多孔离心法、喷雾冻凝法、静电法、真空蒸发沉积法 等。 喷雾干燥法： 喷雾干燥法是一种较早采用且很为实用的制备微球的技术方法之一。喷雾 于燥法的设备主要由旋风分离器和于燥室组成。主要工艺方法是首先将囊心物 分散在预先经过液化的囊材的溶液中进行混合均匀，然后将此混合液被专用的 雾化器雾化于热空气流中成无数个小液滴，溶解囊材的溶剂或分散介质在几秒 钟之内迅 速蒸发，从而使囊膜固化形成微球。该方法的主要特点是成本低廉及工艺简单 且易于大规模工业化生产，特别适宜子热敏性物料的干燥。目前主要用于主产 粉末状香料和粉末状的油脂等。 1 5 药用微球性能的影响因素 微球粒径、收率和包封率是评价微球性能的三个关键指标【5 】。影响微球粒 径、收率和包封率的因素很多，以乳化分散法为例，聚合物材料的浓度、分子 量及其与药物的用量比、乳化剂用量、交联剂用量和搅拌速度等均会影响微球 载药与释药性能。一般来说，增大交联剂用量会导致药物释放量和释放速度下 降，加快搅拌速度会使微球粒径变小。此外，微球的溶胀性能也是影响其释药 性能的重要因素，若干文献考察了微球溶胀性能对药物释放的影响情况【6 ，7 】。 利用微球对p h 的敏感性控制药物在适当部位以适当速率进行释放也是目前研 究热点之一 8 】。 中国医学科学院& 中国协和医科大学博士学位论文 2 双层微球 传统的单层微球在药物制剂中已经得到了非常广泛的应用，但是仍然有很 多差强人意的地方，比如单层微球的突释问题一直没有得到很好的解决，释放 方式也不能达到人的要求，单层微球大多为渐进式的缓慢长期释放，很难达到 零级释放，还有一些激素类药物也不能实现类似人体的脉冲式释放，这些都局 限着单层微球的发展。多层微球可以解决以上难题，多层微球虽然结构上比单 层微球复杂，但是可以实现零级释药和脉冲释药，还可以减少药物突释，这些 优点都是单层微球所不能替代的。 双层微球是多层微球中应用最为广泛的一种，由于双层微球是有外层的壳 结构和内核组成，所以又被称为核一壳结构微球。 2 1 双层微球的制备方法 双层微球的制备主要有两种方法，一种是两步法，即将制备好的普通单层 微球加入到另一材料的溶液中，利用一定方法，如滴入、乳化等使其表面外覆 一层外壳 9 】。另一种是一步法，即通过一次制备形成双层微球的方法。本文主 要讨论一步法，双层微球的制备方法也有多种 1 0 ，1 1 ，其中最常用的为乳化聚 合法和液中干燥法。 2 1 1 乳化聚合法 由于乳化聚合法可以通过控制聚合反应的条件来制备形态和性能各异的双 层微球，所以该方法已经成为双层微球制备和研究最多的方法。 +噩一 种子微球第二单体双层微球 ( 或混合单体) 图1 1 乳化聚合法制备双层微球示意图 f i g 1 - 1 s k e t hm a p so f p r e p a r a t i o nd o u b l e - w a u e dm i c r o s p h e r eb ye m u l s i o n - c o a c e r v a t i o n 乳化聚合法制备双层微球通常先制备出聚合物种子乳液，再加入第二单体 或者混合单体、交联剂等引发反应，使第二单体在种子乳液表面发生聚合，形 成具有核一壳结构的双层微球。其制备示意图如图1 1 所示。 2 1 2 复乳一液中干燥法 中国医学科学院& 中国协和医科大学博士学位论文 复乳一液中干燥法制备双层微球的原理同单层微球的制备相同，只是将两 种高分子材料选用适宜溶剂分别溶解，将药物均匀也分散其中，然后混合，再 分散到另一种不相混溶的溶剂中形成乳液，将此乳液加温或者长时间搅拌使其 溶剂挥发，产生相分离，使一种聚合物材料高度均匀地包裹在另一种聚合物材 料上形成双层微球。这种方法制备的微球粒径一般在2 0 - - 1 0 0 0 1 _ l m ，这种方法也 可以用来制备多层微球。 2 2 双层微球的结构形态及影响因素 采用乳液聚合法可以制备出多种形态的双层微球，常常可以得到如图1 2 所 示的几种结构形态的双层微球。影响微球形态的因素很多，主要有加料方式、 单体亲水性、引发剂、乳化剂的种类、用量，另外反应体系的p h 值、反应温度、 搅拌速度及聚合物的粘度等对双层微球的结构都有影响 1 2 ，1 3 1 。 ooo 成鬻撬疵臻摹霉譬典心溅 d 甾人缴转辕觉繁 图1 - 2 可能形成的双层微球形态示意图 f i g 1 - 2s k e t c hm a p so f c o n f o r m a t i o n so f d o u b l e w a l l e dm i e r o s p h e f e 2 2 1 加料方式 根据第二单体的加料方式，可以分为连续法、半连续法和单体平衡溶胀法。 由于这三种加料方式造成了第二单体在种子乳液的表面和内部有浓度差，因此 造成双层微球的形态有很大差异。一般来说，当第二单体的加入速度低于其聚 合速度是，易于形成核一壳结构的双层微球；单体平衡溶胀法制各时，第二单 体有充分的时间向种子乳液内部渗透，所以种子乳液内部也富含第二单体。采 用单体平衡溶胀法或连续法制备的双层微球，在核一壳之间可能发生接枝或者 相互贯穿，可改善核一壳间的相容性。 2 2 2 单体亲水性 中国医学科学院& 中国协和医科大学博士学位论文 亲水性大的单体更倾向于靠近水相进行反应，输水性单体则倾向于远离水 相，所以，当以输水性单体为内核，以亲水性单体为外壳单体进行乳化聚合， 通常能形成正常结构的核一壳双层微球；反之，以亲水性单体为内核单体，以 输水性单体为外壳单体时，在聚合过程中，输水性聚合物可能向乳液内部迁移 形成不同形态的双层微球，如雪人型、翻转型等。 2 3 双层微球在药物制剂中的应用 由于双层微球可以克服传统单层微球的缺点，能够实现更加符合人体需要 的给药方式，所以双层微球在药物制剂中的研究越来越多。 目前，双层微球多集中在合成高分子材料的应用上。天然高分子材料制备 双层微球相对较少，主要局限在海藻酸钠、壳聚糖、赖氨酸等带电荷的多糖及 蛋白质的应用，其中乳化凝聚法制备海藻酸一壳聚糖双层微球研究最早、最广 泛，其在不同p h 、不同浓度、不同搅拌速度等条件下的制备规律都研究的比较 多，也较为透彻。但是因为天然高分子普遍都是水溶性的，局限了其更加广泛 的应用。 相对于比较单一的天然高分子双层微球，合成高分子双层微球研究较多， 并且研究的范围也更加广泛。材料上有p l g a ，p l a ，p o e ，p c p h 等。其中， y i y a ny a n g 等制备了具有亲水性外壳( p l g a ) 和疏水性内核( p o e ) 的 p l g a p o e 双层微球，研究表明微球的形态是由p o e 的含量决定的，当p o e 含量 占总重量的5 0 ，6 0 ，7 0 时，双层微球才可以形成【1 4 】。该双层微球内核的p o e 降解明显快于外壳p l g a ，致使药物始终透过p l g a 层扩散出去，这样就保证了 药物比较均匀的释放速度。同时这一微球被认为可以实现两种药物的同时释放。 p e k a r e k 等也制备了同样类型的p o l y a n h y d r i d e ( 内核) p l a ( 外壳) 双层微球 1 4 ，1 6 。c o r yb e r k l a n d 制备 p l g ( d ，l - l a g t i d e - c o g l y e o l i d e ) p lp o l y ( l l a c t i d e ) 双层微球 1 7 ，外壳层厚度为2 至r j l 0 m ，实现零级释放炎痛喜康三个月。在他 们后来的研究中又制备了p c p h 为外壳p l g 为内核的双层微球，通过调节加入材 料的比例，可以控制双层微球外壳的厚度在2 p m 到几十m 的之间，实验重复性 良好，可以应用于疫苗的脉冲释放给药。 也有部分双层微球采用天然高分子材料和合成高分子材料混合制备。g e j i a n g 等制备了丙烯酰羟乙基淀粉为内核，p l g a 为外壳的双层微球，实验证明胰 中国医学科学院& 中国协和医科大学博士学位论文 岛素释放还呈现三级释放，但是突释明显减少。这种制备方法还减慢了淀粉的 降解，延缓药物释放时间。s h a o b i n gz h o u 等制备了p e l a 为外壳的海藻酸微球 1 8 ，包裹b s a ，表面光滑，有较高的包封率，第一天药物释放很少解决了药物 突释问题，是多肽，蛋白质的良好载药释药系统。此类微球兼具有天然商分子 材料和合成高分子材料的优点，与纯天然高分子材料制备的微球相比表面光滑， 形态圆，外壳降解较慢，但是内核又具有天然高分子多孔、高亲水性的优势， 使其更适合多肽、蛋白质、抗原以及小分子亲水性药物的释放。还有一些微球 内核部分是合成高分子材料，表面覆上一层天然高分子材料作为外壳，如h u a n g 制备了p l a p e gp o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) 微球，由于表面多孔，所以将微球加 入到明胶溶液中，使其表面覆明胶外壳，明显减轻了突释e 1 9 3 。用其他材料如 聚乳酸、乙基纤维素等制备的药物微球，加入到一定浓度的壳聚糖稀醋酸溶液中 根据需要使其表面覆盖不同量的壳聚糖。l i n 等研究发现，用壳聚糖包衣运载消 炎痛的聚一已内酯微球，可有效克服普通微球的“初次爆释”。此类微球不仅减 轻突释，还充分利用了天然材料的生物相容性好的优势，改善了合成材料微球 与机体的生物相容性。 现在已有研究者实现了双层微球的靶向释药，他们制备p h 敏感性外壳，在 特定p h 值部位降解，实现特殊部位的靶向给药。 由于核壳高分子微球的核、壳之间可能存在接枝、互穿或者离子键合，微 球的核壳结构化可以显著改善聚合物的物理化学性能。同时，由于双层微球在 药物释放模式上具有单层微球不可比拟的优越性，并且制备过程简单，相信伴 随着对其制备及性质的深入研究，双层微球会在医药学领域得到更加广泛的应 用。 3 壳聚糖微球的研究进展 在医学上，微球技术的早期研究大多集中在具有生物相容性的非生物降解 型高分子，如硅橡胶、丙烯酸类聚合物等方面。从6 0 年代开始，人们对微球技 术在医学领域的应用进行了大量的研究，不断有改性天然高分子、聚酯、聚磷 腈等新型可降解高分子材料被作为囊材使用，大大推动了微包囊技术的发展。 由此可见包囊材料在微球技术的发展中占有非常重要的地位。由于本实验所应 中国医学科学院& 中国协和医科大学博士学位论文 用的壳聚糖在微包囊中应用非常广泛，所以在此对其在微球中的应用作一综述。 壳聚糖( c h i t o s a n ) ，化学名为( 1 ，4 ) 2 氨基- 2 脱氧b - d 葡聚糖，是甲壳素 的脱乙酰基衍生物，一种带正电荷的直链多糖，是自然界中含量仅次于生物素 的多糖。由于壳聚糖具有生物粘附性、多种主物活性和良好的生物相容性、可 生物降解、天然无毒、不溶血，近年来国内外已有大量文献报道用壳聚糖制备 微球等递药系统。采用壳聚糖制备微球，可用于控制药物的释放，并且改善易 降解物质( 如蛋白) 的生物利用度，增强亲水性药物通过上皮层的渗透性。除了 可制备普通药物微球外，还可将激素、疫苗和活细胞微囊化。目前，壳聚糖微 球已被广泛应用于药物，大分子药物的长效释放和靶向药物制剂。 图1 - 3 甲壳素和壳聚糖的结构式 f i g1 - 3m o l e c u l a rf o r m u l ao f c h i t i na n dc h i t o s a n 3 1 壳聚糖微球制备方法 3 1 1 离子交联法 1 9 8 9 年b o d m e i e r 等首次报道了用离子交联法制备壳聚糖纳米粒的研究 【2 0 1 ，即利用壳聚糖的游离氨基与一定量的多价阴离子( 如三聚磷酸钠，t p p ) 发生分子间或分子内交联反应，从而制备壳聚糖珠球状凝胶，在成胶过程包裹 溶液中的药物就得到了载药微粒。此后，不断有人用这种离子交联法制备了粒 径从纳米级到微米级不等的壳聚糖载药微粒，可通过改变壳聚糖种类和浓度、 交联剂种类和浓度以及二者比例等因素来调节 2 1 ，2 2 】。这种交联反应可以发生 在酸性、中性和碱性溶液中。常用的阴离子交联剂可分为3 类：低分子质量阴离 中国医学科学院& 中国协和医科大学博士学位论文 子交联剂( 如焦磷酸盐、三聚磷酸盐、四聚磷酸盐等) 、疏水性阴离子交联剂( 如 藻酸盐、k2 角叉菜胶等) 和高分子质量阴离子交联剂( 辛基硫酸盐、十二烷基 硫酸盐、十六烷基硫酸盐等) 。 3 1 2 乳化离子交联法 该方法的基本操作过程是，将壳聚糖水溶液作为分散相，加入到非水连续 相( 异辛烷和乳化剂) 中形成w o 型乳剂，然后在不同的时间间隔，加入阴离 子交联剂，形成离子凝胶微球。 s h u 等 2 3 1 对乳化离子凝胶法进行了改进，采用浊度滴定法研究了3 种 阴离子化合物( 三聚磷酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐) 与壳聚糖的相互作用。结果发 现，在一定p h 范围内( 硫酸盐p 壳聚糖为p h1 0 7 5 ，柠檬酸盐p 壳聚糖为p h 4 5 7 5 ，三聚磷酸盐p 壳聚糖为p h1 9 7 5 ) ，3 种阴离子化合物与壳聚糖间 存在静电作用，这与阴离子的自然特性相关；在阴离子化合物与壳聚糖可发生静 电作用的p h 范围外，无微粒形成，且普通的乳化离子凝胶法即使在该p h 范 围内，也只能得到不规则的微粒，而改进后的方法则可得到直径为几十微米的 球形微粒，其关键步骤是凝胶的引入和壳聚糖p 凝胶乳剂的离子交联过程；硫酸 钠和柠檬酸钠交联的壳聚糖凝胶微球其表面都非常光滑，但是在三聚磷酸盐交 联的壳聚糖凝胶微球表面可观察到较大缝隙；提高搅拌速度可减小微球粒径及 其分布范围。 k i m 等 2 4 1 设计出一种含载有转化生长因子21 3 微球的多孔壳聚糖支架， 并采用三聚磷酸盐制备了载有模型蛋i ! t b s a 的微球。释放试验发现，在磷酸缓 冲液( p h 7 4 ) 中，两种蛋白可从微球中缓慢释放5 天以上，但转化生长因子2 1 3 的 释放速度远低于b s a 。观察发现含载有转化生长因子2t 3 微球的支架能显著促进 细胞增殖和细胞外基质的增加，提示此壳聚糖支架有可能被开发成治疗软骨缺 陷的植入剂。 3 1 3 化学交联法 化学交联法是壳聚糖与试剂发生化学交联，形成稳定的微球，如甲醛、戊 二醛已经得到大量应用。戊二醛交联壳聚糖微球具有粗糙的表面，g o h e l 报道， 可以利用甲苯渗透饱和的戊二醛交联即可克服这个缺点 2 5 】。m i 等制备了一种 低毒性的可注射壳聚糖微球，是采用一种来源于中药的小分子交联剂，g e n e p i n ， 即京尼平，这种交联剂制备的壳聚糖微球粒径小，形态圆，结晶度低，并且实 中国医学科学院& 中国协和医科大学博士学位论文 验证明具有更好的生物相容性和更慢的体内降解时间，适合于长效可注射微球 带0 剂 2 6 】。 c h e ns c 等也制备- j g e n e p i n 交联的壳聚糖微球，在体内释放一年多的时间 【2 7 】。 3 1 4 热交联法 o r i e n t i 等 2 8 】用柠檬酸通过热交联制备了吲哚美辛壳聚糖微球。制备壳聚 糖和柠檬酸摩尔比恒定的不同浓度的壳聚糖溶液，将其冷却到o ，再加入玉 米油，然后在1 2 0 热交联即可得到。 3 1 5 溶剂挥发法 这种方法涉及聚合物溶液和非连续相间形同2 0 w 或w o 乳剂。b o g a t a j 等 【2 9 】用液体石蜡丙酮通过溶剂蒸发法制备微球，他们将药物溶解于丙酮中，再 分散在壳聚糖溶液中，然后加入液体石蜡中乳化，搅拌，混悬微球滤过，洗涤， 干燥，再加入凝聚抑制剂硬脂酸镁即可。结果表明，在制备微球时，随着硬脂 酸镁加入量的增多平均粒径下降。k o c h i s e h 等【3 0 】用轻质矿物油、s p a n8 0 和壳 聚糖通过乳化一溶剂蒸发法制各的微球具有生物黏附性和缓释效果。l a m p r e c h t 等( 3 1 】采用复乳一溶剂蒸发法制备微球，他们将含有e u d r a g i t p - - 4 1 3 5 f 的二氯甲 烷与壳聚糖溶液乳化形成w o 乳剂，再与1 的聚乙烯醇溶液混合，强力搅拌形 成w o w 复乳，室温下搅拌至二氯甲烷蒸发即可。该微球具有结肠靶向性。 3 1 6 喷雾干燥法 f i l i p o v i c g r c i c 等 3 2 】通过喷雾干燥法及用低、中、高分子质量的壳聚糖和 羟丙甲纤维素、以不同的药物聚合物比例制备卡马西平壳聚糖微球，结果显 示，药物的包封率和释放特征依赖于制各微球的聚合物组成和药物聚合物比 例，即使用低分子质量壳聚糖制备的微球可获得最好的包封率，药物包封率低 的微球( 质量分数6 3 ) 较包封率高的微球能更好地控制药物释放。 h e 等报道了一种新型的喷雾干燥法制备微球，他们制备了多层乳化体系 ( o w o ，w o w ) 进行喷雾，发现这种方法制备的壳聚糖微球释药明显比普 通的0 ，w 乳化进行喷雾制备的微球释药缓慢。 3 1 7 壳聚糖溶液包衣法 l i n g 等 3 3 】采用天然壳聚糖和明胶对聚e 一己内酯( p c l ) - 吲哚美辛微粒 包衣，未包衣的微粒呈二级释放特征，第一相中( 前4 小时) 药物快速释放，第 中国医学科学院中国协和医科大学博士学位论文 二相中约有2 0 的药物缓慢持续释放至2 4 小时，而包衣后的微粒可有效地减少 药物释放第一相中的起始快速释放，但不影响药物释放第二相。t a k i s h i i n a 等【3 4 】 制备了乙基纤维素微粒，并采用异硫氰酸荧光系( f i t c ) 标记的壳聚糖溶液包衣。 将此包衣微粒于十二指肠内给药后，可见其在肠内缓慢移动，其中大部分在小 肠的上部和中部滞留8 小时以上，这可能是壳聚糖包衣具黏膜吸附性所致。 3 1 8 壳聚糖微球乙酰化法 采用不含表面活性剂的硅油作为分散介质，通过“油中干燥法”所制得含 有5 一f u 、替加氟( f 1 ) 和去氧氟尿苷( d f u r ) 的壳聚糖微球，具有相当大的粒径 ( 3 舻9 0 0 m ) 和载药量( 质量分数为4 2 2 ) ；将含有d f u r 的壳聚糖微球 ( d 砌t m ) 与乙酸酐进行酰化，并用壳聚糖和戊二醛进行包衣。通过小鼠皮下 植入这两种微球，检验其体内降解情况以及血浆浓度时间曲线，结果显示 d f u r - - m 表现出起始快速释放，重复乙酰化或壳聚糖包衣后在一定程度上可抑 制突释，但药物释放特征没有显著改善【3 5 】。p o r t e r o 等t 3 6 采用该法制备阿莫西 林和甲硝唑壳聚糖微球，以控制药物的释放，其乙酰化壳聚糖微球具有吸水膨 胀容量可控和酸性环境中易凝胶化的特点，进而延长包封药物的释放，其中乙 酰化的时间为关键因素，不仅可影响药物的释放，也能影响包封率和所包封抗 生素的活性。 除了上述壳聚糖微球主要的制备方法外，还有界面酰化等其他方法，应用 相对较少。 3 2 壳聚糖微球的应用 壳聚糖微球作为药物载体较其他材料制作的微球具有明显的优势：( 1 ) 壳微 糖微球表面有丰富的功能基团，可吸附或包裹二方式灵活运载不同特性药物，这 是其它微球载体所不能比拟的；( 2 ) 壳微糖微球粘附性好，用于口、鼻、胃肠等 粘膜给药，特别是投递抗原与佐剂，有其独特的优势 3 7 ；( 3 ) 壳聚糖微球表面有 丰富的多糖链，能被特异性细胞( 或组织) 所识别，可靶向投递药物至病灶部位贮 存释放 3 8 ；( 4 ) 壳聚糖分子能影响细胞间f 一肌动蛋白功能，打开细胞通道，有利 于提高药物在细胞间瞬间渗透的能力。因此，自2 0 世纪9 0 年代以来，壳聚糖微 球载体在药物新剂型中的研究，已成为该领域追踪的热点。目前，已有多种药物 应用壳聚糖作为载体制各缓控释制剂，我们对应用于壳聚糖的药物种类进行综 中国医学科学院中国协和医科大学博士学位论文 述。 现在应用壳聚糖作为载体的药物主要分为抗癌药、消炎药、心血管药、多 肽蛋白质药物、d n a 等几大类。 d e n k b a s 等 3 9 采用复乳法，用戊二醛作交联剂，制备抗肿瘤药物5 一f u 壳聚 糖微球，其微球粒径在1 0 0 2 0 0 p m ，药物可缓慢释放2 4d 以上。c h a n d y 等 4 0 用 壳聚糖包衣5 一f up l a ( 或p l g a ) 微球，用于脑胶质瘤的靶向治疗，研究发现用壳聚 糖包衣的p l a ( 或p l g a ) 微球，表面孔空率低，药物初次爆释后，以典型的二相释药， 可靶向脑胶质瘤稳定释放3 0d 以上。k y o t a n i 等 4 1 3 用壳聚糖与角质素包衣顺铂 的白蛋白微球，用于兔的肝肿瘤研究，发现肝肿瘤的生长速率仅为1 2 0 1 6 0 9 6 。 明显低于对照组的5 8 0 。 h g g a r w a l 等 4 2 用水溶液的方法制备壳聚糖消炎痛微球，探讨了影响药物 运载率、释药特性等的工艺参数。由于壳聚糖高的生物粘附特性，可有效降低药 物从关节滑液中的清除率，延长药物的作用时间。b e r t h o l d 等 4 3 用硫酸钠作沉 淀凝聚剂制得的壳聚糖微球，其吸附运载氢化可的松达3 0 5 ，其释药特性主要 由壳聚糖药物的比值决定。相关研究 4 4 得出，壳聚糖氢化可的松微球通透h t 一 2 9 8 6 细胞的能力明显高于药物溶液对照组。y a m a d a 等 4 5 采用液中干燥法制各 乙基纤维素酮洛芬微球，后用沉降法壳聚糖包衣，研究发现，经动物鼠十二指肠 给药后，壳聚糖包衣的微球有良好的粘膜粘附性，其血浆浓度低于药物粉体组的 1 3 ，比未包衣的微球对照组血药浓度更高、更稳定。 壳聚糖微球作为抗生素药物的载体，可保护其药物活性。s h a h 等 4 6 用三聚 磷酸钠为交联剂，制备壳聚糖抗生素甲哨哒唑与羟氨苄青霉素微球用于 h e l i c o b a c t e rp y l o r i 感染的胃病的靶向治疗，研究发现在摸拟的胃滚中，甲哨哒 唑可稳定2 4 h ，而羟氨苄青霉素稳定性相对较差。g i u n c h d i 等 4 7 用壳聚糖一衍 生物采用喷雾干燥法，制备氨苄青霉素微球，研究发现，苄青霉素微球可长时间 保持抗菌活性。王奎旗等 4 8 研究了采用悬浮一交联法制备法莫替丁壳聚糖微 囊的工艺。周永国等 4 9 进行了磁性壳聚糖微球的制各、表征及包封阿斯匹林 靶向给药研究。 壳聚糖微球用于投递多肽、蛋白质类和d n a 及抗原等，有其突出的优势。 f e r n a n d e z 等 5 0 采用三聚磷酸盐为凝胶剂，制备壳聚糖胰岛素微球，经兔鼻腔 中国医学科学院& 中国协和医科大学博士学位论文 给药，其血糖含量远低于溶液对照组。b i v a s - b e n i t a 等 5 1 等用壳聚糖微粒与纳 米粒，吸附运载g r a l 蛋白与g r a i - d n a ，制备微粒或纳米粒疫苗，研究发现，壳聚糖 微粒与纳米粒，吸附运载率高，均能有效保护g r a l 蛋白与d n a 被酶、酸碱介质等的 降解，便于较长时间稳定贮存。口服免疫后，g r a i 蛋白微粒疫苗组与g r a i - d n a 纳 米疫苗组，在不同免疫阶段( 前者为初次免疫，后者为再次免疫) ，均产生高的抗 g r a l 的抗体滴度，说明壳聚糖微粒或纳米粒疫苗有利于诱使针对t o x o pl a s m a g o n d i i 的粘膜免疫反应。壳聚糖微球在组织工程中，也可用于细菌培养与控释生 长因子等。j o n g 等 5 2 用乳化法交联制备t g f - b1 壳聚糖微球，将其软骨细胞一 同置入多孔的胶原一壳聚糖骨架中，体外培养3 d 后，其软骨细胞与粘多糖的量明 显高于t g f - 1 的溶液组。说明t g f l 壳聚糖微球更有利于软骨细胞的形成。 除了上述几大类药物外