流式细胞术在白血病诊断中的应用PPT课件.ppt

流式细胞术在白血病诊断中的应用,.,一简介,FCM：集激光、电子、光电测量、计算机、荧光化学、单抗的高科技仪器。对处在快速直线流动状态中的单个细胞或生物颗粒进行多参数的、定量分析和分选的技术。分两类：台式机（临床型）大型机（cellsorting).科研用。,BDFACSVantageSE,FCM的结构,FCM的结构细胞流动室；光源；聚光系统；信号检测器；电子计算机；细胞分选装置。,光源,细胞流动室,聚光系统,信号监测器,数据的存储、显示与分析,数据的存储：listmode显示：单参数直方图(histgram);：常用于分析DNA等；双参数：二维点图等（dotplot)；等高图：(contour)三维等高图：3Dplot设门（gating):,DataAcquisition-Listmode,一定条件下，荧光强度与细胞内DNA含量成正比。只反应一个参数与细胞数量间的关系，不能显示两个独立参数与细胞的关系。,Immunofluorescence,FlowCytometrycont.Datadisplayed,GreenFluorescenceIntensity,NumberofCells,Unstainedcells,FITC-labeledcells,OneParameterHistogram,Contourplot,3Dplot:细胞多的地方，山峰高。,FCM检测常用参数内部参数散射光测定,前向角散射(forwardscatterFSC):与激光束平行的信号。与被测细胞大小有关。侧向角散射（sidescatterSSC):与激光束呈90的光信号。与细胞内结构和颗粒物质多少有关。采用FSC、SSC组合，可区分淋巴细胞、单核细胞、粒细胞等群体。,FCM常用参数外部参数荧光测量,荧光素探针标记的细胞所发荧光。荧光信号强弱、多少与细胞的抗原量、内含物多少有关。常用的荧光显色剂：FITC：PE：藻红蛋白PerCP；PI：碘化丙啶，测定DNA含量。临床常用三色荧光检测，现有四色分析。,CD45vsSSC设门,CD45为造血细胞（红系除外）的共同抗原。避免杂质细胞的沾染。,CD45:淋巴细胞单核细胞成熟粒细胞原幼细胞,在FCM分析时特别注意：,细胞的分化成熟、细胞内部结构及其分化抗原的逐渐增减是渐进过程，非突变。故同时获知一个细胞的多种参数方能正确判断细胞属性。当细胞发生克隆增殖后，可出现抗原量变、丢失和错译表达。细胞抗原的阳性率及荧光强度是同等重要的指标。,FCM可采用的标本,单个细胞，新鲜标本，抗凝保存：PB；BM；（有时BM活检标本）LN（包括FNA）；CSF；组织浸润FNA或活检标本；,急性白血病FCM分析,白血病细胞的抗原表达一定程度遵循正常细胞抗原表达的规律。白血病细胞为肿瘤性生长，可出现正常细胞表达以外的异常现象，如缺失、错译表达等。目前未发现白血病特异性抗原，须多参数分析。临床原/幼细胞群定性比定量更为重要。,抗体的选择：,常用抗体选择：核心McAbs:确定淋系或髓系（系特异性）髓系：CD33、CD13、CD14，cMPOB-cell:CD19、CD10、cCD22CD20T-cell:CD7、CD2、CD5、cCD3红系：GlyA巨核细胞：CD41、CD61非系列特异性：CD34、DR、CD45,ALpanel,CD7/CD117/CD45-protocalHLA-DR/CD13/CD45CD14/CD2/CD45CD19/CD5/CD45CD33/CD34/CD45CD20/CD10/CD45CD64,117,13,33,14,64myeloid19,10,20Blineage7,2,5TlineageDR,34immature,AML常见CD表达,正常骨髓的FCM二维点图,Diagnosis:AML-M1AntigenProfile:positive:DR,CD13,CD34,CD38;partiallypositiveforCD7,negativecCD3.,Diagnosis:Acutemyeloidleukemiawithdifferentiation(AMLM2)withfeaturesconsistentwitht(8;21)AntigenProfile:PositiveforCD33(dim),CD34,CD13,CD15CD11b(partial)withCD19.NegativeforCD56,CD10,CD2,72,female.Abonemarrowexaminationwasperformed.,Diagnosis:AML-M5AntigenProfile:PositiveforCD33,CD38,CD34,HLADR,CD4(dim),CD64,CD13,CD14,CD11bandCD15.,Diagnosis:Erythroleukemia(FABM6)AntigenProfile:BlastspositiveforCD33,CD71,CD34,CD38,CD13;,Diagnosis:Acutemegakaryoblasticleukemia(FABM7)AntigenProfile:PositiveforCD33,CD71,CD34,CD61,ALL常见CD表达,6y.Girl,Hb:100g/LWBC:10X10G/L,LC80%Plt.85X10G/L,Diagnosis:ALL,B-precursortype(commonALL)AntigenProfile:PositiveforCD71,CD19,CD10,CD22,HLADR,CD34;dimlypositiveforCD33,A15yearoldgirlwhoplayedforherhighschoolsoccerteamnotedtohavedifficultybreathingduringherworkouts.Achestx-rayrevealedalargemediastinalmass,andshewasfoundtohaveanemiaandanelevatedwhitebloodcount,Diagnosis:ALL,T-cellAntigenProfile:PositiveforCD7,CD5,CD3,CD34,CD10;partlypositiveforCD4andCD8,Diagnosis:B-PrecursorALL(commonALL)Antigenprofile:PositiveforCD19,CD10,CD34,HLADR;negativeforCD20,CD45,smIg,未分化和双标白血病,AUL：仅占1%典型的AUL：DR+，CD34+withnolineage-specificantigens.,Biphenotypicleukemia(mixed):仅有7%能严格符合此型。过度诊断是由于：未排除非白血病细胞；非特异性结合；某些抗体缺乏系特异性；特异性抗原为：BcCD22;TCD3;MMPO;,ScoringsyetemforthedefinitionofbiphenotypicAL,PointsB-淋巴T-淋巴髓系2cCD79acCD3cMPOCD22TCRabcIgMTCRrd1CD19CD2CD117CD10CD5CD13CD20CD8CD330.5TdTTdTCD14CD7,Diagnosis:Acutemixedlineageleukemiawitht(4;11)AntigenProfile:OnepopulationCD19+CD22+DR+CD20-CD10-;anotherCD33+DR+CD64+CD14+,B-LPD常见CD表达,73,woman,mildsplenomegaly,WBCnormal,withslightrelativelymphocytosis,aPBspecimenwassentforflowcytometry,Diagnosis:ChroniclymphocyticleukemiaAntigenProfile:PositiveforCD19,CD22,CD5,kappa,CD23,dimlypositiveforCD20;,MCL,Agprofile:positiveforCD19,CD5,lambda(bright),CD