（发酵工程专业论文）提高节杆菌（arthrobacter+x7）产黄嘌呤氧化酶水平的研究.pdf

摘要 摘要 黄嘌呤氧化酶( x a n t h i n eo x i d a s e ，x o d ，e c l 1 3 2 ) 是嘌呤代谢途径的关键酶，主要催 化次黄嘌呤氧化生成黄嘌呤，进一步氧化黄嘌呤生成尿酸。黄嘌呤氧化酶广泛存在于各 种生物体的组织和细胞中，产黄嘌呤氧化酶的微生物主要有细菌、链霉菌和假单胞菌。 黄嘌呤氧化酶在临床上可用于制备免疫抗体、肿瘤抑制剂和细胞缺血性再灌注损伤等疾 病的检测。 本论文采用物理与化学复合诱变手段处理出发菌株a r t h r o b a c t e rx 7 ，获得一株高产 菌株m 3 ，产酶水平是出发菌株的2 0 7 倍，发酵周期较出发菌株缩短了约4h 。此菌株 产的黄嘌呤氧化酶为胞内诱导酶，需要经诱导物诱导合成。以产酶水平和生产成本为标 准，比较了几种化合物对a r t h r o b a c t e rm 3 的诱导产酶的效果，并确定了最佳诱导物为 次黄嘌呤。对次黄嘌呤诱导效应的研究发现，在发酵前期加入3g l 的次黄嘌呤对产黄 嘌呤氧化酶的诱导效果最好。与黄嘌呤诱导相比，以次黄嘌呤诱导a r t h r o b a c t e rm 3 ，黄 嘌呤氧化酶产酶水平提高了7 0 6 。 为了进一步提高菌株m 3 的产酶能力，在确定选用次黄嘌呤为诱导剂的基础上，对 相应的产酶培养基组分和培养条件进行了优化。优化后，此菌株产黄嘌呤氧化酶水平可 达4 5 9 8 7u l ，细胞浓度可至8 8 7 l 。与出发菌株a r t h r o b a c t e rx 7 相比，菌株m 3 单位菌 体产酶量提高了1 3 1 倍。菌株m 3 的产酶水平比国内所报道的最高水平【3 8 】6 3 8u 几提高了 6 2 倍。 关键词：黄嘌呤氧化酶，节杆菌，复合诱变，次黄嘌呤，产酶条件优化 a b s t r a c t a b s t r a c t x a n t h i n eo x i d a s e ( x o d ，e c1 1 3 2 ) i sak e ye n z y m ei nt h ec a t a b o l i s mo fp u r i n e sp a t h w a y , w h i c hm a i n l yc a t a l y z e st h ec o n v e r s i o no fh y p o x a n t h i n ea n dx a n t h i n et ox a n t h i n ea n d u r i ca c i d r e s p e c t i v e l y i ti sa l s oac o m p l e x m o l y b d o f l a v o e n z y m et h a te x i s t si na sa na v a i l a b l e o x i d o r e d u c t a s ei na l lk i n d so fo r g a n i s m s m i c r o o r g a n i s m ，w h i c hp r o d u c e dx a n t h i n eo x i d a s e ， m a i n l yw e r eb a c t e r i u m ，s t r e p t o m y c e t ea n dp s e u d o m o n a s x a n t h i n eo x i d a s eh a sb e e nu s e da s c l i n i c a la g e n tf o ra n t i t u m o ra n dr e p e r f u s i o ni n ju n ， am u t a n tm 3w a so b t a i n e d 谢也k g hx a n t h i n eo x i d a s ea c t i v i t yb yt r e a t i n ga r t h r o b a c t e r x 7 、析t hp h y s i c a la n dc h e m i c a lc o m u t a g e n e s i s x a n t h i n eo x i d a s ea c t i v i t yo fm 3w a s2 0 7 t i m e sa st h a to f a r t h r o b a c t e rx 7 n l ei n c u b a t i o np e r i o do fm 3w a ss h o r t e n e db y4h o u r s a s a ni n t r a c e l l u l a ri n d u c e de n z y m e ，x a n t h i n eo x i d a s ec o u l db ei n d u c e db yd i f f e r e n tc o m p o u n d s b a s e du p o nt h ex a n t h i n eo x i d a s ea c t i v i t ya n dt h ep r o d u c t i o nc o s t ，s e v e r a ls a m p l e so f c h e m i c a l sw e r et e s t e dt o c o m p a r et h e i ri n d u c i n g e f f e c t so na r t h r o b a c t e rm 3 ，a n d h y p o x a n t h i n ew a sf o u n dt o b et h eo p t i m a li n d u c e r 砀es t u d yo fh y p o x a n t h i n ei n d u c e d c o n d i t i o n ，i n d i c a t e dt h ex a n t h i n eo x i d a s ea c t i v i t yo fm u t a n tm 3w o u l db et h eh i g h e s tw h e n3 g lh y p o x a n t h i n ew a sa d d e dt ot h ec u l t u r ei nt h ep r o p h a s eo ft h ef e r m e n t a t i o n c o m p a r e d w i t hx a n t h i n ei n d u e i n ge f f e c t ，x a n t h i n eo x i d a s ea c t i v i t yo fa r t h r o b a c t e rm 3 ，i n d u c e dw i t h h y p o x a n t h i n e w e r ei n c r e a s e db y7 0 6 u s i n gh y p o x a n t h i n ea si n d u c e r , t h em e d i u r nc o m p o n e m sf o rx a n t h i n eo x i d a s ep r o d u c t i o n a n dc u l t u r ec o n d i t i o nw e r ef u r t h e ro p t i m i z e d ，i no r d e rt oi m p r o v et h ex a n t h i n eo x i d a s e a c t i v i t yo fs t r a i nm 3 刀把o p t i m i z a t i o no fc u l t u r em e d i u mc o m p o n e n t sa n df l a s kc u l t u r e c o n d i t i o nr e s u l t e dt h ex a n t h i n eo x i d a s ey i e l da n dd r yc e l lw e i g h to fc e l l sr e a c h e dt o4 5 9 8 7 u la n d8 8 7e g lr e s p e c t i v e l y t h ex a n t h i n eo x i d a s ep r o d u c t i o no fc e l lu n i tf r o ma r t h r o b a c t e r m 3w a s13 1t i m e sh i g h e rt h a nt h a to fa r t h r o b a c t e rx 7 x a n t h i n eo x i d a s ey i e l do fs t r a i nm 3 w a s6 2t i m e sh i g h e rt h a nt h eh i g h e s t 1 e v e lf r o mt h ed o m e s t i cr e p o r t k e y w o r d s ：x a n t h i n eo x i d a s e ，a r t h r o b a c t e r ，d u a l m u t a t i o n , h y p o x a n t h i n e ，o p t i m i z a t i o no f e n z y m ep r o d u c t i o nc o n d i t i o n s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是拳人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注争致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 逾 日 期：盘避至三! 宣 、 ， 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件乖磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：l 导师签名： e l 期： 弓矽f f 7 第一章绪论 第一章绪论 1 1 概述 黄嘌呤氧化酶( x a n t h i n eo x i d a s e ，e c l 1 3 2 ，x o d ) ，是一种氧化还原酶，在嘌呤代谢 途径起关键作用，能催化黄嘌呤、次黄嘌呤生成尿酸。黄嘌呤氧化酶在催化多种不同底 物的氧化时，除了生成产物尿酸之外，还形成超氧自由基和过氧化氢，其在生物机体中 具有重要生理功能。因此黄嘌呤氧化酶与缺血性再灌注损伤、痛风、高尿酸血症、风湿 性关节炎、心肌梗塞、肝炎等疾病密切相关【l - 9 ，而在临床上倍受关注。目前正被开发 成一种具有较高附加值的医学检验用酶，应用于检测血清无机磷、血清超氧化物歧化酶 活力、细胞损伤后胞外次黄嘌呤和黄嘌呤水平以及次黄嘌呤核苷( 肌苷) 、鸟嘌呤、鸟 苷、鸟嘌呤酶和核苷磷酸化酶的活性等。且在核苷类药物的合成中起到促进生物转化的 作用，可大量应用于提高5 甲基尿苷、胸腺嘧啶核苷、病毒唑等的合成生产中。由于黄 嘌呤氧化酶催化生成的尿酸具有抗氧化作用，超氧自由基和过氧化物具有杀伤细胞的作 用，因此还可作为抗氧化剂、抑菌剂和抗肿瘤制剂等。另据报道，该酶对于降解亚硝基 盐、三硝基苯甲硝胺等土壤和地下水污染物有重要作用。正是由于黄嘌呤氧化酶在临床 诊断和医药工业上的应用价值，人们对各种生物来源的黄嘌呤氧化酶进行了广泛和深入 的研究。 1 2 黄嘌呤氧化酶研究背景 国外已对人类、哺乳动物、植物、昆虫、禽类、果蝇、真菌等多种真核生物和少数 几种细菌合成的黄嘌呤氧化酶进行研究，主要集中于黄嘌呤氧化酶在各物种中的分布及 活力调节：人类和哺乳动物黄嘌呤氧化酶与疾病的关系；某些黄嘌呤氧化酶分离纯化、 酶学特性、基因克隆与蛋白质结构分析；黄嘌呤氧化酶在多领域的应用等等。国内研究 者大多关注来源于人类、鼠类、鸡、牛等的肝脏、心脏、乳腺和牛奶中黄嘌呤氧化酶。 主要研究其代谢产物尿酸、氧自由基与各类疾病的相关性；重点开拓牛奶黄嘌呤氧化酶 在医学检验和核苷类药物生物转化中的应用。但在酶分子结构、性质与基因克隆等基础 理论研究工作还是相对落后，尤其针对细菌黄嘌呤氧化酶的研究报道鲜少。 1 2 1 黄嘌呤氧化酶的来源与结构性质 1 2 1 1 动物组织中的黄嘌呤氧化酶 黄嘌呤氧化酶广泛存在于哺乳动物的组织中，尤其是牛乳及小牛的肝脏中。黄嘌呤 氧化酶是一种氧化还原酶类，可以把黄嘌呤、次黄嘌呤氧化成尿酸；把脂肪族、芳香族 醛氧化成羧酸；还能氧化嘧啶类、嘌呤类、蝶啶类物质及n a d p h 。牛乳中的黄嘌呤氧 化酶含量较高且很容易纯化，已经成功应用聚苯胺膜从牛乳中吸附并分离出了黄嘌呤氧 化酶【1 0 】。牛乳中黄嘌呤氧化酶分子量约为3 0 0k d a ，大约由1 3 3 0 个氨基酸组成。它的氨 基酸序列在哺乳动物之间有高度同源性，可达9 0 ，在哺乳动物与禽类之间也有7 0 的 同源性，而与果蝇之间的同源性只有5 2 【l 。 江南大学硕士学位论文 已报道的牛奶和鼠 “1 黄嘌呤氧化酶分子的三维空间结构，见图1 1 和图l 一2 ，可知： 在蛋白质一级氨基酸结构上，从n 端到c 端，依次是两个铁硫聚簇结构域、f a d 结构域 和m o 中心结构域。b 折叠片状的 2 f e 2 s 1 区域与f a d 结构域之间由螺旋环连接，f a d 结 构域由b 折叠片和a 螺旋构成；f a d 结构域与m o 中心亚基也是由螺旋环连接，m o 中心结 构域同样由b 折叠片和a 螺旋组成。 圉1 1 牛奶黄嘌呤氧化酶的分子结构 f i g1 1m o l e c u l a rs 眦n 】驿o f t h ex o dd i m e rd i v l d e di n t ot h et h r e em a j o rd o m a i n sa n dt w oc o n n e c t i n g l o o p st h et w om o r l o l e r sh a v es y m m e l a 口m l a t e dd o m a i n si nt h e c o l o r si nl i g h t e rs h a d e sf o rm e m o n o m e ro n t h e l e l ta n d i nd a r k e rs h a d e s f o r t h e m o n o m e ro n t h er i g h tf r o m n t o c t e r m i n 雌t h ed o m a i n s m ：i r o ns u l f u r - c e n t e rd o m a i n ( r e s i d u e s3 - 1 6 5 ；r e d ) ，md o m a i n ( r e s i d u e s2 2 6 - 5 3 l ；g r e e n ) ，a n dm o - m d o m a i n ( r e s i d u e s5 9 0 - 1 ，3 3 l ；b l u e ) ml o o pc o n n e c t i n gt h ei r o ns u l f u rd o m a i nw i t ht i l ef a dd o m a i n ( r e s i d u e s1 9 2 - 2 2 5 ) l ss h o w ni ny e l l o w , t h eo n ec o n n e c t i n gt h ef a dd o m a i nw i t ht h em o - md o m a i n ( r e s i d u e s5 3 7 - 5 8 9 ) i s i nb r o w ma n d t h e na n d c t e r m i n ia r e l a b e l e dt h ef a dc o f a e t o r , t h e t w o i r o ns u l f u r c e n t e r s t h e t o o l v b d o p t e r i nc o f a e t o r , a n d t h es a l i c y l a t e a l s oa r e i n c l u ( t e d 圉1 - 2 鼠黄嘻吟氧化酶的分子结构 f 1 91 - 2 “b b o n a l a g r a mo f o v e r a l l d i m e r i c5 t i - l l g t l f f l o f r a t x o dt h e t h t e r d o m a m l o o p ( a l a 5 2 9 a l 一1 ) i s s h o w n i n m a g e n t a t h e c - t e r m i n a l l o o p ( l e u l 3 1 5 l i e 1 i ss h o v r a i no l a b 口f a da n ds a l i c y l a t ea r es h o w n s t i c k m o d e l sf e s a r es h o w n s p a c e - f i l l i n g m o d e l s 第一苹绪论 黄嘌呤氧化酶是一种非特异性的酶，很多化合物都可做其底物( 电子供体) 。而底物 类型不同其氧化速度也有很大差异，次黄嘌呤、黄嘌呤是其最佳底物，见表1 1 【i4 。当 有嘌呤存在时，催化反应表现为底物的羟基化，而醛则被氧化成羧酸。黄嘌呤氧化酶对 电子受体也无特异性，很多物质如亚甲基蓝、2 ，仁二氰靛酚、氯化三苯基四唑、硫酸二 甲酯、细胞色素c 和氰铁酸盐等均可做其电子受体。 表1 1 牛乳中黄嘌呤氧化酶的底物特异性 t a b 1 1s p e c i f i c i t yo fx a n t h i n eo 虹d a s ef r o mc o wm i l k 1 2 1 2 微生物中的黄嘌呤氧化酶 文献报道细菌【1 5 1 、链霉菌n 6 1 、假单孢菌【1 7 】等产黄嘌呤氧化酶，并且这些微生物将 嘌呤物代谢分解生成尿酸，见表1 - 2 。 表1 2 产黄嘌呤氧化酶的微生物 t a b 1 - 2m i c r o o r g a n i s mp r o d u c i n gx a n t h i n eo m d a s e 细菌黄嘌呤氧化酶的蛋白质核心成分与牛奶黄嘌呤氧化酶和人、大鼠、小鼠、鸡、 牛和果蝇的黄嘌呤氧化酶相似陋2 2 1 。细菌黄嘌呤氧化酶分别由q 与d 两个基因编码三个结 构域，其 2 f e - 2 s 和f a d 结合域位于小亚基即a 亚基，由a 编码，而钼蝶呤结合域位于 大亚基即b 亚基，由p 编码。不同细菌来源的黄嘌呤氧化酶所含a 、b 亚基数目不等，如 0 【p 】、 江南大学硕士学位论文 邮 等形式，故相对分子质量差异较大a 节杆菌黄嘌呤氧化酶 2 3 1 的a 、b 亚基均属于( a + b ) 型蛋白。x o d a 肽链中具有【2 f e 2 s 结合位点和f a d 结合域；x o d b 肽链中含有钼蝶呤结合域及醛氧化酶黄嘌呤脱氢酶特有 的a f o 锤头结合域。 图1 3 黄嘌呤氧化酶基因推导蛋白的空间结构预测分析 f i g 1 33 dp r o t e i ns “u c n ep r e d l c t l o n f r o mg e n o m i c d n ao f x 绷t h l n eo x l d a s es u b u n i t am a d b x o dh y p o t h e t l c f o r m sa n ( a 1 3 h h e t e r o t e m n e rm x o d a s u b u n i t sa r ed r a w n i n l i g h t g r e e n m d l i g h tb l u e a n d t h e x o d bs u b m i t s i nd a r kg r e e na n dd a r kb l u et h e na n dc t e r m i n io f e a c hs u b u n i ta r e l a b e l e d i n t h u b - r e s p c c t l v ec o l o r sw l t hna n dct h e 旺f e - 2 s 1a n df a dc o f a c t o r so f x o d aa n dt h em o c oo f x o d b a r es h o w n “s p a c e f i l l i n g m o d e l si n o h e t e r o d i m e r t h ec o f a c t o r sa r ec o l o rc o d e d w i t h m ef e i ng r a y 卸d t h e m o m g m e n 文献报道【2 4 节杆菌黄嘌呤氧化酶具有相对底物专一性，次黄嘌呤、6 ，8 一二羟基嘌呤、 2 羟基嘌呤和别嘌呤醇作为反应底物时相对反应速度( 以黄嘌呤的反应速度为1 0 0 ) 分 别为2 7 、5 8 、2 3 和5 ，以黄嘌岭为底物时k m = l3 1 0 4 m o l l 。 1 , 2 2 黄嘌呤氧化酶的生轴擘曲能 首先，黄嘌呤氧化酶参与机体内核酸的分解代谢。经黄嘌呤氧化酶的作用，细胞代 谢分解核酸、其他嘌呤类化合物以及食物中的嘌呤而生成人体的屎酸。其次，黄嘌呤氧 化酶还与铁的代谢密切相关，它催化肝脏铁蛋白中铁的释放，加速铁进入血浆，并且能 使释放出的二价铁离子迅速地被氧化为三价铁离子，与b 球蛋白结合成运铁蛋白，使铁 顺利地运送到肝脏、骨髓和其他细胞内以供利用 2 0 lo 最后，黄嘌呤氧化酶还参与机体解 毒功能，可以使体内形成的有毒醛化合物氧化，解除其对机体毒害作用。 黄嘌岭氧化酶的生物学功能是氧化含多个氮原子的杂环，参与生物异源物质f 药物、 致癌物、杀虫剂等1 的降解代谢阱】；有效氧化脂溶性芳香族化台物，防止芳香族化合物 的中毒；激活抗肿瘤和抗高血压药物及激活食品、饮料、化妆品中偶氮着色剂的毒性。 在毒理学和药理学上具有重要的作用。由黄嘌岭氧化酶催化还原氧分子产生的氧自由基 和h 2 0 2 ，参与如缺血性机体损伤、酒精肝中毒等。因为0 2 。对许多细胞具有细胞毒性。 第一苹绪论 1 2 3 黄嘌呤氧化酶的应用 黄嘌呤氧化酶在催化次黄嘌呤和黄嘌呤氧化生成尿酸的代谢过程中，同时还产生具 有重要生理功能的氧自由基或超氧化物。其与痛风、高尿酸血症、缺血性再灌注损伤、 风湿性关节炎、心肌梗塞、肝炎等疾病密切相关，而倍受注目。目前黄嘌呤氧化酶已被 开发成具有较高附加值的商业用酶，用来生产黄嘌呤氧化酶抗体和临床检验试剂盒，应 用于检测血清无机磷、血清超氧化物歧化酶活力、细胞损伤后胞外次黄嘌呤和黄嘌呤水 平以及次黄嘌呤核苷( 肌苷) 、鸟嘌呤、鸟苷、鸟嘌呤酶和核苷磷酸化酶的活性等。且在 核苷类药物的合成中起到促进生物转化的作用，而大量应用于提高5 甲基尿苷、胸腺嘧 啶核苷、病毒唑等的酶法合成生产中。由于黄嘌呤氧化酶催化生成的尿酸具有抗氧化作 用，以及产物超氧自由基和过氧化物具有杀伤细胞的作用，因此还可作为抗氧化剂、抑 菌剂和抗肿瘤制剂等。另外，该酶对于降解亚硝基盐、三硝基苯甲硝胺等土壤和地下水 污染物也具有重要作用。因此开发和研究黄嘌呤氧化酶具有重要理论意义和广阔的应用 前景。 1 2 3 1 黄嘌呤氧化酶在检测方面的应用 黄嘌呤氧化酶是一种具有广泛应用领域的重要的商业用酶，主要用于黄嘌呤、次黄 嘌呤、次黄嘌呤核苷( 肌苷) 的检测，及辅助检测鸟嘌呤和鸟苷；也应用于测定鸟嘌呤酶 和核苷磷酸化酶的活性【2 2 ，2 6 1 。黄嘌呤氧化酶还被广泛应用于血清无机磷 2 7 之8 1 和超氧化物 歧化酶s o d 2 9 - 3 1 活力的检测，因而是一种重要的生化试剂。 随着鱼的腐烂度增加，其体内次黄嘌呤的含量也增加。通过测定次黄嘌呤的变化， 从而确定鱼的新鲜度p 2 1 。 1 2 3 2 黄嘌呤氧化酶在医药方面的应用 黄嘌呤氧化酶在生理上具有复杂的作用，其还原分子氧，产生氧自由基、超氧负离 子和过氧化氢，杀伤肿瘤细胞，参与炎症免疫应答，在胃肠道可以起到消除感染，抑制 细菌生长的作用【2 9 j 。 黄嘌呤氧化酶活性异常增高是原发性或继发性高尿酸血症和痛风的最后关键环节， 黄嘌呤氧化酶抑制剂的研究成为抗高尿酸血症和痛风药良好的靶点1 33 | 。酶法合成病毒唑 反应过程中添加黄嘌呤氧化酶，可以提高病毒唑的转化率【3 训。 1 3 课题的研究意义及内容 目前国内外所使用的黄嘌呤氧化酶，主要从牛奶中获取。来源单一，生产成本高， 而且黄嘌呤氧化酶的含量和质量受不同产地、不同种类奶牛的影响，限制了其应用。虽 然从上个世纪6 0 年代起，国外已开始致力于开发细菌来源的黄嘌呤氧化酶，但迄今为 止仍存在许多诸如产酶菌种来源不多、酶产量偏低、纯化难度高、基因与结构的研究不 全面等问题有待解决。并且造成不同来源的黄嘌呤氧化酶差异的规律性尚未阐明。国内 未曾有利用细菌发酵法工业化生产黄嘌呤氧化酶。用微生物发酵法可以连续大批量生产 黄嘌呤氧化酶，工业化前景比较广阔。 本实验室对于微生物产黄嘌呤氧化酶已经做了部分研究。在确定黄嘌呤氧化酶的筛 5 江南大学硕士学位论文 选方法和检测方法的基础上，实验室人员从土壤中筛选出一株产黄嘌呤氧化酶的野生菌 株( a r t h r o b a c t e rx l 2 6 ) 并对该菌株进行1 6sr r n a 序列分析鉴定，结果确定该菌应属于节 杆菌属( a r t h r o b a c t e r ) ；对该菌株产黄嘌呤氧化酶的发酵条件和提取条件做了初步的摸索 并对黄嘌呤氧化酶的基因结构进行了研究；为了改善野生菌株的产酶性能，通过氮离子 束诱变彳厂历加6 口c 招rx l 2 6 选育出一株正突变株( a r t h r o b a c t e rx t ) 。然而，这些方面的研究 主要着重于节杆菌产黄嘌呤氧化酶的理论性研究，a r t h r o b a c t e rx 7 的产酶水平虽较野生 株有所提高，但是其水平远远低于工业化应用的标准。本课题主要为进一步提高节杆菌 产黄嘌呤氧化酶的水平开展研究。 目的是采用复合诱变手段改变黄嘌呤氧化酶产生菌( a r t h r o b a c t e rx 7 ) 产酶的遗传性 能，对诱变高产菌株的诱导条件和发酵条件进行优化，以进一步提高菌体细胞量和产黄 嘌呤氧化酶水平，为工业化生产黄嘌呤氧化酶奠定基础。本文主要研究内容如下： ( 1 ) 以物理复合化学诱变手段，处理节杆菌出发株( a r t h r o b a c t e rx t ) ，筛选黄嘌呤氧 化酶的高产突变株，并对所筛的高产菌株和出发菌株形态特征和产酶遗传稳定性进行比 较。 ( 2 ) 考察几种化合物对高产菌株产酶的诱导作用，选出最佳诱导物。单因素实验确 定此诱导物的最适添加浓度和最适添加时间；分析代谢产物对高产菌株产黄嘌呤氧化酶 的影响。 ( 3 ) 在确定诱导物的前提下，优化此菌株的摇瓶发酵工艺条件，确定高产菌株黄嘌 呤氧化酶生成的最佳培养基组成，以及有利于增加细胞浓度和产酶的发酵条件，并对诱 导及发酵条件优化前后的菌株产酶规律进行比较。 第二章复合诱变提高节杆菌产黄嘌呤氧化酶活力 2 1 引言 第二章复合诱变提高节杆菌产黄嘌呤氧化酶活力 节杆菌( a r t h r o b a c t e rx l 2 6 ) 为本实验室自筛保藏菌株，本实验室研究人员曾经采用 氮离子束诱变方法处理，选育到一株变异菌株a r t h r o b a c t e rx 7 ，此菌株单位菌体产黄嘌 呤氧化酶量为3 6 6 7u g 。本实验以a r t h r o b a c t e rx 7 为出发菌株，采用物理与化学复合 诱变育种的方法，进一步提高产黄嘌呤氧化酶活力。选择超声波辅助亚硝基胍同时处理 节杆菌的理由如下： 超声波具有很强的生物学效应，其机理很复杂，主要就是空化作用，是指在超声波 作用下，存在于液体中的微小气泡( 汽泡或空穴) 所发生的一系列动力学过程：振荡、扩 大、收缩乃至崩溃 3 5 1 。空化泡绝热收缩至崩溃瞬间，泡内可呈现5 0 0 0 以上的高温和 几千个大气压，并伴有强大的冲击波或射流等，这足可以改变细胞的壁膜结构，使细胞 内外发生物质交换，甚至是发生突变【3 6 】。用超声波联合亚硝基胍( n t g ) 诱变处理，能够 促进n t g 进入到菌体细胞内；另外，超声波的振荡作用能够促进菌体d n a 双链的解旋， 使n t g 直接作用于暴露的碱基部分，诱发d n a 变异。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验材料 2 2 1 1 菌种来源 菌枇l r t h r o b a c t e rx 7 ，由本实验室选育和保藏。 2 2 1 2 主要仪器 h 6 6 m c 型超声仪无锡超声设备有限公司 h p l 1 0 0 高效液相色谱仪c 1 8 ，2 0 0m l l ，5l a i n a g i l e n t 公司高效液相色谱仪 t g l 1 6 型高速离心机上海医用仪器分析厂 c f 7 0 2 高速冷冻离心机日本日立公司 2 2 1 3 主要试剂 黄嘌呤上海双向西巴斯科技发展有限公司 辣根过氧化物酶上海双向西巴斯科技发展有限公司 亚硝基胍( n t g ) f l u k a 其它试剂均为分析纯。 2 2 1 4 培养基 种子培养基( g l ) ：n a c l5 ，蛋白胨1 0 ，牛肉膏5 ，调p h 至7 2 。 初筛培养基( g l ) ：k h 2 p 0 46 8 ，k 2 h p 0 48 7 ，m g s 0 4 7 h 2 00 2 ，c a c l 2o 0 1 ，x a n t h i n e 1 ，y e a s te x t r a c t0 1 ，调p h 至7 2 。 发酵基本培养基：n a c l5g l ，( n i - 1 4 ) 2 s 0 4 2g l ，i c a c l 21 m i ，i ，葡萄糖1 0g l ， m g s 0 4 7 h 2 00 2e d l ，y e a s te x t r a c tlg l ，黄嘌呤( 7 0 2r e t o o l l ) 2 5i n l l ，调p h 至8 0 。 7 江南大学硕士学位论文 2 2 2 实验方法 2 2 2 1 黄嘌呤氧化酶活力测定 黄嘌呤氧化酶活力的测定方法参照文献【3 7 1 的方法。此方法原理为：黄嘌呤氧化酶在 催化黄嘌呤氧化的反应过程中，每氧化1m o l 黄嘌呤，将消耗1m 0 1 分子氧和水，产生 1m o l 尿酸和1m o l 过氧化氢。过氧化氢再经过氧化物酶作用分解，可使4 氨基安替比 林与苯酚形成亚醌类呈红色的化合物，其在5 0 6n l t l 下有最大吸收峰。在5 0 6n l t l 测定该 显色化合物的吸光度，即可推算出黄嘌呤氧化酶的酶活。 2 2 2 2 茵体浓度的测定 菌体浓度用比色法( 护6 0 0n l t l ) 和绝对干重法测定 3 8 1 。菌体在种子培养基培养，取1 m l 发酵液，用蒸馏水稀释至5m l ，以蒸馏水为空白，在6 0 0n l t l 下测其吸光度，8 0 0 0r p m 离心1 0m i n ，弃去上清，烘干至恒重，测菌体干重。以o d 6 0 0 横坐标，菌体干重为纵坐 标，绘制曲线。 2 2 2 3 黄嘌呤测定 s a r 1 0 1 e - o r e 2 c o n e n t ：玎l 口 图2 1 黄嘌呤全波长扫描 f i g 2 1w a v e l e n g t hs c a n n i n go f x a n t h i n e 通过紫外扫描仪全波长扫描发现黄嘌呤( 简写x a n ) 在2 7 0 2 8 0n r n 有最大吸收峰如图 2 1 所示，因此选择在2 7 3n l t l 下用h p l c 法测定黄嘌呤不同浓度下对应吸收峰面积，以x a n 浓度为横坐标、吸收峰面积为纵坐标绘制标准曲线。色谱条件：a g i l l e n th p l l 0 0 色谱仪， c i s 色谱柱( 2 5 0 x 5m m o l l ) ；3 2g l 、p h7 5 的n h 4 h 2 p 0 4 ( 含1 0 甲醇) 为流动相，检测波 长2 7 3n n l 。 2 2 2 4 诱变处理条件与步骤 出发菌株生长曲线的绘制： 配制液体种子培养基8 0 0m l 分装于1 6 瓶2 5 0n 也三角瓶中，分别接种一环固体培养基 第二章复合诱变提高节杆菌产黄嘌呤氧化酶活力 中菌落于其中，3 0 培养。每4h 测定一次两瓶菌体细胞浓度，取平均值，测定8 次，绘 制菌体生长曲线。 出发菌株活化处理： 出发菌株经完全培养基连续两次平皿活化，接种至液体完全培养基，培养至对数生 长期，5 0 0 0r p m ，离心1 0m i l l ，收集菌体，用无菌的p h6 0 的磷酸钾缓冲液稀释至原体 积，振荡，同条件离心，重复2 次，制成单细胞菌悬液。 诱变步骤： 超声波作为物理诱变剂，是辅助的诱变手段，化学诱变剂亚硝基胍( n t g ) 为主要诱 变手段，需要考察菌浓度，处理时间、温度相同的条件下，超声波、n t g 、超声波辅助 n t g 对菌种致死率的影响，以选择使致死率较强的诱变处理方案。 1 ) 超声波诱变处理出发菌株：取活化处理后的菌悬液2 0m l ，平均分装于1 0 只无菌 的5m l 塑料离心管内，1 只作对照，另9 只采用超声波( 2 0 0w ，5 0k h z ) 处理，每次超声 照射5m i n ，中间停lm i n 。分别间隔处理1 、2 、3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 次，处理后，稀释 涂布于种子培养基中，3 0 ，培养2 4h ，计数，计算致死率。 2 ) n t g 诱变处理出发菌株：取活化处理后的菌悬液2 0m l ，平均分装于1 0 只无菌的 5m l 塑料离心管内，1 只作对照，另9 只采用n t g ( 1m g m l ) 处理，在诱变处理5r n i n 、1 0 m i n 、1 5m i l l 、2 0m i n 、2 5m i n 、3 0m i n 、3 5 m i n 、4 0m i n 、4 5m i n 时，分别取出一只塑料 离心管，取0 5m l 菌悬液，稀释1 0 0 倍，终止诱变，再稀释至适当浓度后涂平板，3 0 ， 2 4h 培养，待形成明显菌落后计数，计算致死率。 3 ) 复合诱变处理出发菌株：取1 0 只无菌的5m l 塑料离心管，各分装已活化处理后 的菌悬液2m l 。1 只作对照，另9 只诱变处理，诱变条件为：冰水浴中，超声( 2 0 0w ，5 0 k h z ) ，每次5m a n ，间歇1m i n ，辅助n t g ( 1m g m l ) 诱变处理菌悬液，超声间歇处理l 、2 、 3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 次。每次超声照射后，取出1 只离心管并取管内已诱变处理的菌悬 液o 5m l ，稀释1 0 0 倍，终止诱变，再稀释至适当浓度后涂平板，对照与处理菌按相同 稀释度涂布种子培养基中，3 0 ，2 4h 培养，待形成明显菌落后计数，计算致死率。 高产菌株的筛选 诱变处理后的菌液，稀释至1 0 由浓度，取0 2m l 涂布于筛选培养基，3 0 、4 8h 培养，观察透明圈的大小，挑选透明圈较大的菌落进一步摇瓶复筛，选出产酶较高的突 变菌株，发酵验证后，保藏及分析菌种。 2 2 2 5 茵体培养 接一环斜面培养基上的菌体于装有5 0m l 种子培养基的2 5 0m l 三角瓶内，3 0 、 2 0 0r p m 培养2 4h ，再以8 接种量接于发酵培养基( 5 0 0m l 三角瓶装液量为1 0 0m l ) ， 3 0 、2 0 0r p m 摇瓶发酵。 2 3 结果与讨论 以微生物的自然变异作为基础的生产选种的几率不很高，因为这种变异率太小，一 个基因的自然突变频率仅1 0 一1 0 d o 左右。为了加大其变异频率，可采用物理和化学因素 9 江南大学硕士学位论文 促进诱发突变。这种以诱发突变为手段的育种称为诱变育种，是迄今为止国内外提高菌 种产量、性能的主要手段。 实验室前期研究表明，超声波复合亚硝基胍诱变手段能有效提高胆固醇氧化酶的产 酶量，因此本实验采用此方法处理节杆菌a r t h r o b a c t e rx 7 ，以期提高黄嘌呤氧化酶的产 酶量。实验内容主要包括：首先确定了黄嘌呤和菌体浓度的检测标准和初筛方法的可行 性；其次，以致死率为依据选定了诱变处理的时间；再次，初筛出高产突变株并验证其 遗传稳定性；最后对突变株与出发株的发酵特性进行对比。 2 3 1 黄嘌呤检测的标准曲线的绘制 为了考察发酵液中黄嘌呤的浓度，按2 2 2 3 的色谱条件作了黄嘌呤浓度与吸收峰面 积的关系曲线( 如图2 2 ) ，作为衡量发酵液中黄嘌呤含量的标准。 2 5 0 0 0 茎2 0 0 0 0 量 1 5 0 0 0 鼻仝 饕 q 基1 0 0 0 0 擎5 0 0 0 窨s 0 oo 4 0 8 1 2 l ，6 22 4 黄嘌呤唧o l l 1 图2 2 黄嘌呤浓度与吸收峰面积关系曲线 f i g 2 - 2r e l a t i o nb e t w e e nx a n t h i n ec o n c e n t r a t i o na n da b s o r ba r e a 如上图所示，标准曲线为：y = 9 9 8 0 3 x 1 4 1 2 ，r 2 = 0 9 9 8 8 ，y - 吸收峰面积m a u * s ， x m m o l l 黄嘌呤，线性范围0 2 2m m o l l 黄嘌呤。将发酵液在8 0 0 0r p m 离心1 0r a i n ，检测 上清液在2 7 3m 的吸收峰面积，根据标准曲线可求出上清液中黄嘌呤浓度。 2 3 2 检测茵体浓度的标准曲线的测定 菌体浓度是衡量菌体细胞生长好坏的直观标准。由于细菌悬液的浓度与浊度成正 比，因此可以分光光度计测定菌悬液的光密度( o d 6 0 0 ) 来推知菌液的浓度。按照2 2 2 2 的方法测了光密度( o d 6 0 0 ) 与菌体浓度的标准曲线，如图2 3 所示。 从图2 3 可得，光密度与菌体浓度与标准曲线为y = 2 3 1 4 4 x + 0 0 0 1 ( r = o 9 9 9 1 ) ， x o d 6 0 0 ，y - 菌体浓度( e g l ) 。 第二章复合诱变提高节杆菌产黄嘌呤氧化酶活力 3 ，、2 5 2 刨1 5 蠖 蕊 l 粗0 5 o o0 20 4o 60 8 l1 2 o d 6 0 0 图2 3 茵体浓度与o d 6 0 0 的关系曲线 f i g 2 - 3r e l a t i o nb e t w e e nt h ec e l lc o n c e n 仃m i o na n dt h eo d 6 0 0v a l u e 2 3 3 黄嘌呤氧化酶在发酵液中的分布 将节杆菌x 7 发酵液离心，发现发酵上清液部分几乎测不出活性，将菌体部分用p h 7 8 的t r i s h c i 缓冲液洗涤三次，将洗涤的菌体超声破碎，离心，在无细胞提取液中检 测到较强的酶活。在菌体对数生长后期( 2 0h ) 向发酵液中补加青霉素至1 0 0 0u m l 继续 培养8h 以促使细胞裂解，再离心得到的上清液中也检测到黄嘌呤氧化酶活力( 表2 1 ) 。 这些现象说明，x 7 菌株产生的黄嘌呤氧化酶可能是胞内酶。这与国外多数有关黄嘌呤 氧化酶的报道【2 4 l 致。 表2 1 节杆菌x 7 黄嘌呤氧化酶在发酵液中的分布 t a b 2 1c u l t u r el o c a t i o no f a ，t h r o b a c t e rx 7x a n t h i n eo x i d a s e 符号说明：一无黄嘌呤氧化酶活力；+ 较强的黄嘌呤氧化酶活力；+ + 强黄嘌呤氧化酶活力 2 3 4 透明圈法初筛高产菌株的可行性 高效液相色谱仪检测发现在发酵上清液中的黄嘌呤随着发酵时间的延长而减少，黄 嘌呤逐渐被菌体利用耗尽。发酵结束后，用显微镜镜检菌体细胞，发现细胞完整。从 x 7 完整细胞对底物的转化情况看到，即使该菌的黄嘌呤氧化酶为胞内酶，细胞对于底 物或产物的通透性没有明显障碍。 筛选培养基中所用的黄嘌呤是以固态形式存在于培养基中，其消耗方式主要有两方 面：一方面，菌体周围的部分黄嘌呤作为碳源，被菌体生长所吸收利用。另一方面，显 微镜镜检发现，菌落在筛选培养基上生长三天后，有部分菌体细胞死亡自溶。细胞自溶 后，释放出的胞内物质中含有黄嘌呤氧化酶，分解了菌体周围的部分黄嘌呤。固体黄嘌 呤被消耗的地方，培养基由混浊转为透明。单个细胞产酶水平越高，细胞自溶后释放的 黄嘌呤氧化酶越多，利用黄嘌呤越彻底，因黄嘌呤分解而形成的透明圈就越大。因此透 江南大学硕士