（计算机应用技术专业论文）玉米DNA指纹图谱库的分析与设计.pdfVIP

摘要 d n a 指纹技术的出现，给种质鉴定带来了革命性的变化，由于它直接反映d n a 水 平上的差异，具有高度的专一性和特异性，不同物种、同一物种不同品种所得d n a 指 纹各异，就像人类的指纹一样，成为当今先进的种质鉴定技术。 玉米是我国重要的粮食作物，也是我省主要的农作物之一。农民在购买玉米种子时， 从玉米种子的外在形态上无法准确判断其品种类型和质量优劣，从而造成经济损失。因 此，准确识别和鉴定玉米种子对发展我省的经济和关注农民生产都有着极其重要的意 义。吉林省科技厅已于2 0 0 6 年启动了玉米d n a 指纹数据库建立的研究项目。 本文基于目i j 此领域研究的难点问题，阐述了聚丙烯酰氨凝胶电泳实验的方法，讨 论了其操作方便，重复性好，谱带清晰容易辨认等的优点。介绍了凝胶电泳图像分析中 分子量的计算方法和实现过程。在此基础上，探讨了分子量计算的原理及必备参数的获 取，分析了参数的获取途径及原则提出了凝胶电泳分子量测定方法以及泳道及条带坐标 的确定算法的实现。针对实验数据进行研究，设计了一个玉米种子d n a 指纹图谱库系 统，并给出了相应的编码方案。 本文的算法实现利用v i s u a lc h 、m a t l a b 混合编程。v i s u a lc + + 用于图形界面( g u i ) 的设计与实现，m a t l a b 用于图形处理。采用m i c r o s o f ts o ls e r v e r2 0 0 0 数据库开发技术。 关键字：d n a 指纹图谱；图像处理；凝胶电泳图像；分子量的计算 a b s t r a c t 1 1 1 ee m e r g i n go fd n a f i n g e r p r i n tt e c h n o l o g yh a sb r o u g h tac h a n g ef o rt h ec e r t i f i c a t i o n o fs e e dq u a l i t y s i n c et h i st e c h n o l o g yc o u l dr e f l e c tt h ed i f f e r e n c e so fd n a d i r e c t l ya n dh a s h i g hs p e c i f i c i t ya n dp e c u l i a r i t yw h i c hc o u l ds h o wt h ed n af i n g e r p r i n td i f f e r e n c e sf o r d i f f e r e n ts p e c i e sa n da l s ot h ed i f f e r e n tb r a n c h e si nt h es a m es p e c i e s ，j u s tl i k et h eh u m a n f i n g e r p r i n to fw eh u m a nb e i n g s , t h i st e c h n o l o g yh a sb e c o m et h em o s ta d v a n c e dt e c h n o l o g y f o rc e r t i f i c a t i o ns e e dq u a l i t y c a u s ec o mi so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tc e r e a lc r o p si no u r c o u n t r y t h ei d e n t i f i c a t i o na n dc e r t i f i c a t i o no f c o r ns e e dp l a y sas i g n i f i c a n tr o l ei nc o n lt r a d e t h er a i s eo fc o r np r o d u c t i o na n dt h ep r o t e c t i o no fc e r t a i ns p e c i e sp o l y p r o p y l e n ea m m o n i ag e l e l e c t r o p h o r e s i se x p e r i m e n ti se a s yt oo p e r a t ea n dw e l lt od u p l i c a t ea n di t sb a n di sq u i t ed e a r t oi d e n t i f y m a i z ei sa ni m p o r t a n tp r o v i s i o ni nc h i n a b u ti t sh a r dt oi d e n t i f yt h eq u a l i t yb yi t s a p p e a r a n c e t h e r e f o r e ，i t sq u i t em e a n i n g f u lt or e s e a r c ht h em a i z es e e d i n2 0 0 6 ，j i l i n p r o v i n c es c i e n c ea n dt e c h n o l o g yc o m m i s s i o n ( j s t c ) h a dc o m m e n c e das p e c i a lp r o j e c t ： a n a l y s i sa n dd e s i g nb a s e do nm a i z es e e d sd n af i n g e r p r i n ti m a g ed a t a b a s e o nt h eb a s i so fa n a l y z i n gt h ec h a r a c t e r i s t i c so fg e le l e c t r o p h o r e s i si m a g eo fc o r nd n a ， t h i sp a p e rd e s i g n sac o d i n gp r o g r a mf o ri m a g er e t r i e v a lc o n t r a s ta n daf e a s i b l es o l u t i o na n d i n t r o d u c e st h ec a l c u l a t i o na n dp r o c e s so f r e a l i z a t i o no f m o l e c u l a rw e i g h ti nt h ea n a l y s i so f g e l e l e c t r o p h o r e s i si m a g ea n ds h o w st h ec o r r e s p o n d i n gc a l c u l a t i o nm e t h o d s a d d i t i o n a l l y , t h i s p a p e re x p l o r e st h ec o n d i t i o no fm o l e c u l a rw e i g h tc a l c u l a t i o na n da c q u i s i t i o no fe s s e n t i a l p a r a m e t e r s ，i n t r o d u c e st h em e t h o d sa n dp r i n c i p l e st oa c q u i r et h ep a r a m e t e r sa n dg i v e so u tt h e c o d eo fm e a s u r i n gm o l e c u l a rw e i g h to fg e le l e c t r o p h o r e s i sa n dt h er e a l i z a t i o no fd e f i n i t e c a l c u l a t i o nf o rl a n ea n db a n dc 0 0 r d i n a t e s t h ec a l c u l a t i o ni n t h i sp a p e rr e a l i z e st h em i x e dp r o g r a m 、v i t hv i s u a lc + + a n dm a u a b v i s u a lc + + i su s e di nt h ed e s i g na n dr e a l i z a t i o no fg u i m a t l a bi su s e di nt h eg r a p hd i s p o s a l m i c r o s o f ts q ls e r v e r2 0 0 0d a t ab a s ei sa d o p t e di nt h i sr e s e a r c h k e yw o r d ：d n af i n g e r p r i n ti m a g ed a t a b a s e ；i m a g ep r o c e s s ；g e le l e c t r o p h o r e s i si m a g e ； c a l c u l a t i o no fm o l e c u l a rw e i g h t l l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签字：a 啦日期：旦地 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论 文的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交 学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师 范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：指导教师签名： 日期：日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 鉴 第一章引言 1 1 生物信息学的研究内容与目的 1 9 9 0 年1 0 月人类基因组计划正式启动，随着该计划的顺利实施，涌现出了海量的 生物分子数据。这些生物分子数据具有丰富的内涵。充分利用这些数据，通过数据分析， 揭示其内涵，得到对人类有用的信息，是科学家们所面临的一个严峻的挑战。生物信息 学( b i o i n f o r m a t i c s ) 就是为迎接这种挑战而发展起来的- - t - j 新型学科，它是由生物学、数 学、计算机科学相互交叉所形成的学科。 任何一门学科，研究的内容和目的决定研究的方法和手段。那么生物信息学研究的 内容、最终目的以及发展的方向是什么? 生物信息学，是一门研究生物和生物相关系统 中信息内容与信息流向的综合系统科学。它是2 0 世纪8 0 年代末随着基因组测序数据迅 速增加而逐渐兴起的一门全新的学科，是研究生命科学中各种生物信息的表达、采集、 存储、传递、检索、分析和解读的科学。生物信息学的研究内容是伴随着基因组研究而 发展的。具体地说，生物信息学是把基因组d n a 序列信息分析作为源头，找到基因组 序列中代表蛋白质和r n a 基因的编码区。同时，阐明基因组中大量存在的非编码区的 信息实质，破译隐藏在d n a 序列中的遗传语言规律。在此基础上，归纳、整理与基因 组遗传信息释放及其调控相关的转录谱和蛋白质谱的数据，从而认识生命代谢、发育、 分化、进化的规律。 在生物信息学这样一个交叉学科研究领域中，各学科的科学家们共同研究生物分子 信息的获取、管理、分析和利用。具体而言主要是利用计算机存储核酸和蛋白质序列， 研究科学的算法，编制相应的软件对序列进行分析、比较与预测，从中发现生物分子信 息组织和表达的规律，从而认识生物分子的作用，探索生命的起源和进化，进而加深对 生物世界的认识【l 】。在生物学、医学领域中利用生物分子数据及其分析结果，可以大大 提高研究和应用的科学性及效率。总而言之，生物信息学是- f - 研究生物系统中信息现 象的学科。 1 2 生物信息学数据库的产生 从2 0 世纪8 0 年代末开始，伴随着人类基因组计划( h u m a ng e n o m ep r o j e c t ，8 g p ) 的启动，生物信息学( b i o i n f o r m a t i c s ) j , 塞- - 生物学、化学、物理、数学、信息科学和计 算机科学等多学科交叉产生的新兴学科蓬勃发展，并被许多著名科学家称为2 l 世纪自 然科学的核心领域。生物信息学是计算机和网络发展及各种生物学实验数据迅猛增长形 势下发展起来的组织生物学数据，并从数据中提取新知识的- - i - 学科，它主要研究生物 系统中的信息现象、信息流及其相互作用和调控规律，是- - 1 3 理论与实践应用并重的学 科。生物信息学具有重大的学科意义。1 9 9 7 年1 2 月，中国科学院召开了以“生物信息 学”为主题的第8 7 次香山科技会议，来自海峡两岸的3 0 多位生物学、物理学、化学和 信息科学诸领域的专家学者出席会议，他们一致认为“生物信息学处在重大科学发现的 前夜”。目前，生物信息学以核酸和蛋白质等生物大分子数据库及其相关的图书、文献、 资料为主要对象，以数学、信息学、计算机科学为理论基础，以计算机、网络、应用软 件为工具，对海量生物原始数据进行存贮、管理、注释、开发和加工，使之成为具有明 确生物学意义的生物信息，并进一步通过对生物信息的查询、搜索、对比、分析，从中 获取基因编码、基因调控、核酸和蛋白质结构功能及其相互作用的知识 2 1 。在掌握大量 信息和知识的基础上，探索生命起源和生物进化，以及生物的个体发生、发育和遗传之 间的相互关系以及病变、死亡等生命科学中的重大问题，搞清它们的基本规律和时空联 系，建立类似于化学元素周期表的“生物学周期表”。生物信息学已成为整个生物学发 展的重要组成部分，在今后相当长的时期内是生物学研究的平台性、交叉性和前沿性的 学科。应用生物信息学能极大地提高研究效率，缩短研究周期。目前，各种生物数据库 的信息量f 迅猛增长，很容易使人在浩如烟海的信息中迷失方向。比如于2 0 0 3 年4 月 宣告完成的人类基因组计划测出3 0 亿个碱基对( b p ) 的核苷酸排列顺序，如果将测序的 结果打印成书，每页印40 0 0 个碱基符号，需要印7 5 00 0 0 页。如此之大的信息量，只 能用计算机的数据库来处理。因此，应用数据库技术对海量生物信息进行存储、检索和 分析已成为生物信息学的重要研究领域。现在已有很多种类的生物信息学数据库供生物 学工作者使用，并且其容量还在迅猛地增长【3 1 。 1 3 生物信息学数据库的利用方法 1 3 1 运用知识发现利用生物信息学数据库 目前的数据库系统可以高效地实现数据的录入、查询、统计等较低层次的功能，但 无法发现数据中存在的关系和规则，无法根据现有的数据预测未来的发展趋势。缺乏挖 掘数据背后隐藏的知识的手段，导致了“数据爆炸但知识贫乏”的现象。如何才能不被 信息淹没，而是从中及时发现有用的知识、提高信息利用率? 针对上述问题，人们产生 了运用相关技术从众多数据中发现联系和规律，进而挖掘出知识的相关要求。因此，在 数据库中进行知识发现的研究已成为近年来的研究热点。知识发现以前也叫做“在数据 库中发现知识”( k n o w l e d g ed i s c o v e r yi nd a t a b a s e ，k d d ) ，随着机器自学技术逐渐成熟 与实用化，由计算机自动从数据库中提取学习知识已成为可能，知识发现就和机器学习 以及数据库技术结合起来，产生了k d d 这个新的研究方向。目前广泛采纳的k d d 定 义是：“从数据中提取隐含的、以前未知的并且可能有用的知识。” 4 1 与其密切相关的概 念是数据挖掘，通常把数据挖掘看作是知识发现的一个具体步骤。按照挖掘对象的结构， 2 知识发现的研究包括对结构化数据的挖掘和对非结构化数据的挖掘。整个生物信息学研 究实际上就是知识发现，是知识发现应用到现实世界的最佳战场，是发挥其功效的最好 途径。生物科学奥秘无穷，一旦有所突破将会留芳百世。科学发现需要一定的机遇，现 在机遇就在眼前，巨大的生物学数据的积累，先进的计算机知识发现理论及方法，四通 八达的互联网等，都为从各种类型的生物信息学数据库中发现生命科学的基本规律提供 了良好的条件，因而知识发现是生物信息学研究的必由之路。 1 3 2 利用国际生物信息学数据库促进我国生物信息学的发展 科学家们普遍相信，本世纪最初的若干年是生物信息学研究取得辉煌成果的时代， 也是它创造巨大的经济效益和社会效益的时代。生物信息学的发展在国内外基本上都处 在起步阶段，所拥有的条件也大体相同1 5 1 。因此，这是我国生物学赶超国际先进水平的 个百年不遇的极好机会。生物信息学所带来的经济效益和它的商业前景是十分可观 的，在因特网上利用国际生物信息学数据库资源不断采集数据进行分析、归类与重组， 发现新线索、新现象和新规律，用以指导实验工作的设计，可避免不必要的重复1 6 1 。它 较传统的生物实验研究花费少、见效快、效益大，适合我国国情，有利于促进我国生物 信息学的发展。目前我国的许多科研人员非常重视对国际生物信息学数据库的利用以开 展自己的研究工作。很多高校和科研机构已经开展了生物信息学的研究和建立生物信息 学数据库以及开发相应的软件。这些都充分说明了我国对利用国际生物信息学数据库以 及开展生物信息学研究的重视。有理由相信，我国的生物信息学研究在2 1 世纪将取得 更大的进展。 1 4 本文主要内容 本文在研究d n a 指纹图谱应用的国内外发展现状，凝胶电泳原理特点之后，尝试 建立玉米新品种d n a 指纹库，根据凝胶电泳特点对其进行了适当的编码，提出分子量 测定、泳道及条带坐标的确定问题方法，完成分子量的计算。利用v i s u a lc + + 、m a t l a b 混合编程，采用m i c r o s o f ts o ls e r v e r2 0 0 0 数据库开发技术，并将研究成果应用到实践 中。结果表明，d n a 指纹数据库和判别标准可有效地用于玉米杂交种的亲子鉴定。 文章的内容安排如下： 第一章简要介绍了生物信息学研究内容与目的，运用数据挖掘技术利用生物信息学 数据库，运用知识发现利用生物信息学数据库，以及利用国际生物信息学数据库促进我 国生物信息学的发展。 第二章对现代信息技术在生物信息学研究中的应用及发展前景和分子标记技术进 行了介绍，对d n a 指纹技术进行了详细的说明。 第三章介绍了玉米杂交种d n a 指纹图谱国内外研究现状和发展趋势，从选用品种 材料、标记方法、s s r 引物五个方面介绍了玉米新品种d n a 指纹库建立，并进行了详 3 细描述。 第四章本章主要介绍了电泳技术的原理，简要介绍了各类电泳的特点。着重介绍了 凝胶电泳技术的特点及发展概况，分析了电泳胶片及凝胶电泳图像形成的过程，最后就 计算机图像处理与电泳分析的结合进行了论述，并对算法的实现方法进行了介绍，并对 算法实验结果进行了分析和比较。 第五章阐述建立玉米d n a 指纹图谱分析系统的设计思想。 最后总结全文，归纳工作要点，给出建议和展望。 4 第二章d n a 指纹图谱简介 2 1 现代信息技术在生物信息学研究中的应用 2 1 1 现代信息技术的应用 生物信息学的核心是生物学，是通过对各种生物信息进行分析，获取生物知识，进 而对生命的基本规律的认识。信息技术是它的研究手段，综合利用数学、信息科学、控 制科学、计算机科学等现代化手段来分析和理解数据，达到解析生命的最终目的。由此 可见，生物信息学是一门涵盖了生物学、计算机科学和物理学等学科领域的交叉学科。 1 利用计算机分析软件处理生物数据 在生物信息学研究范畴内，很重要的蛋白质组学的研究技术中，双向凝胶电泳、计 算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支 撑技术。 以计算机为基础的多种图像分析与大规模数据处理软件的问世。使得科学家处理复 杂的类似“满天星”样的蛋白质图谱并建立相应的数据库得心应手。在获得蛋白质双向 电泳凝胶后，将凝胶图像以数字化图像的形式存储下来，便于进一步用双向电泳凝胶分 析软件进行分析。完整的图像处理包括图像的采集和图像的分析两个步骤。常用的图像 采集系统有光密度扫描仪、激光光密度仪、激光诱导荧光监测器等，把凝胶上的蛋白质 点数字化。当前为了对采集的图像进行分析，已经形成了一些比较完善的图像分析系统。 2 数据库技术为生物信息学构建信息平台 数据库是信息处理的基础，而生物信息数据库则是一切生物信息学工作的出发点。 生物信息数据的飞速增长给生物信息学研究带来一系列问题。首先，日益增长的数据对 信息的采集和处理提出了空前的要求：其次，如何从已经积累的海量数据和知识出发， 从d n a 序列中识别编码蛋白质的基因，以及调控基因表达的各种信号，预测蛋白质的 功能和结构，解读生物的遗传密码，进行药物设计等，都是目前面临的巨大挑战。 3 数据仓库技术在生物数据的集成和研究决策中发挥作用 如何存储和处理海量数据? 由于技术发展的滞后，生物信息资源的有效使用率十 分低，“海量的数据，贫乏的知识”的状况严重影响了生物信息学的发展。生物信息数 据的高增长和多样性、复杂性的特点，使得获取、集成和分析不同文件格式、不同的数 据存储模式和不同数据类型的多个数据源的数据库变得越来越困难。集成大量异构的生 物信息资源，提供方便、高效地获取高质量数据信息是一个合理的构想，而实现这个任 务目标的科学方法就是充分利用数据仓库技术。 5 4 数据挖掘技术对生物学的知识发现 数据挖掘这一术语出现于1 9 8 9 年，其定义几经变动。所谓数据挖掘，就是从数据 库中抽取隐含的、以前未知的、具有潜在应用价值的信息的过程。它是从大型数据库或 数据仓库中探索海量数据之间的关系。利用各种分析工具构建数据分析模型，发现并提 取隐藏在其中的信息的一种新技术，对预测趋势和决策行为十分有用。数据挖掘与传统 分析工具不同的是数据挖掘使用的是基于发现的方法，运用模式匹配和其它算法决定数 据之间的重要联系，其任务是从数据中发现模式。 2 1 2 生物信息学利用信息技术的发展前景 生物信息学的研究进展表明，生物技术同益需要信息技术，并且越来越依赖信息技 术。现在许多信息技术手段，尤其是数据挖掘技术如何更紧密更实际地与生物信息学的 研究相结合仍然处于不断的探索之中1 7 j 。目前相对而言，理论重于实践，即理论研究比 较多。而实际运用还不足。生物信息学的发展在国内外基本上都处在起步阶段，所拥有 的条件也大体相同。那么谁能够更充分更高效更快捷地利用信息科学、控制科学、计算 机科学等高技术手段来分析和理解数据，谁就能最先发现新线索、新现象和新规律，也 是其在生物信息学研究领域取得领先地位的先决条件。生物信息学是一门非常有发展远 景的科学，现代信息技术则是它不可或缺的研究手段【科。 2 2 分子标记技术在植物遗传育种中的应用进展 近年来，分子生物技术的发展为植物育种改良提供了一种基于d n a 变异的新型遗 传标记- - d n a 分子标记。d n a 分子标记研究与应用的迅速发展为植物遗传育种注入新 的活力，并使传统育种技术发生了深刻的变化。 d n a 分子标记本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性 d n a 片段，也称为d n a 的指纹图谱。d n a 分子标记的研究始于1 9 8 0 年，现已有数十 种标记技术。与传统的遗传标记相比，d n a 分子标记有很多优点【9 】： 1 分子标记数量多，在同一基因座位上有较多的复等位基因； 2 分子标记本身无害，对重要的经济性状很少有不良效应； 3 分子标记的多态性可在个体、组织器官及细胞水平上进行检测，不受环境条件的限 制。以p c r 为基础的d n a 指纹技术大大加快了d n a 分子标记的研究和利用，广 泛应用于植物遗传育种、高密度遗传图谱的构建、基因定位和克隆、植物亲缘关系 鉴别及遗传多样性研究、分子标记辅助选择育种等领域。 2 2 1 分子标记技术原理特点 1 限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 1 9 8 0 年b o s t e i n 等首先提出了利用r f l p 标记构建遗传连锁图，而美国冷泉港实验 6 室正是利用此技术成功确定了腺病毒血清型突变体的遗传连锁图。r f l p 基本原理是利 用特定的限制性内切酶( r e s t r i c t i o ne n z y m e , r e ) 识别并切割不同生物个体的基因组 d n a ，得到大小不等的d n a 片段，所产生的d n a 片段数目和各片段的长度反映了d n a 分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同的带，再与 克隆d n a 探针进行s o u t h e r n 杂交和放射显影，即可获得反映特异性的r f l p 图谱。r f l p 所表现的是基因组d n a 在限制性内切酶消化后产生片段在长度上的差异，主要是由于 不同个体基因组d n a 序列上的变化，如碱基替换或缺失造成限制性内切酶酶切位点的 增加或丧失以及内切酶酶切位点间d n a 片段的插入、缺失或重复等【l “。但r f l p 技术 存在的缺陷，如在克隆可表现基因组d n a 多态性的探针时较为困难，阻碍着其更广泛 的应用。 2 可变数目串联重复序列( v a r i a b l en u m b e r o f t a n d e mr e p e a t s ，v n t r ) 真核生物基因组中存在着许多非编码的重复序列，1 9 8 7 年n a k a r n u r a 发现这些重复 次数不同的核心序列在生物体内的多态性水平极高。根据重复序列在d n a 分子上分布 的方式，可将其分为散布重复序列和串联重复序列。而后者又可根据重复单位大小不同 分为： 1 ) 小卫星d n a ( m i n i s a t e l i t ed n a ) ，重复单元核心序列含有6 - - 7 0 b p 且中间无间隔； 2 ) 微卫星d n a ( m i c r o s a t e l i t ed n a ) ，或称简单重复序歹u ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ， s s r ) ，重复单元核心序列为1 5 b p 。 小卫星和微卫星d n a 分布于整个基因组的不同位点，由于重复单位的大小和序列 不同以及重复次数不同从而构成丰富的长度多态性。在基因组多态性分析上可采用 v n t r 标配技术区分这些小卫星或微卫星d n a 的差异。v n t r 的基本原理与r f l p 大 致相同，只是对限制性内切酶和d n a 探针有特殊要求，即限制性内切酶的切点必须不 在重复序列中以及保证小卫星和微卫星序列的完整性。分子杂交所用的探针核昔酸序列 必须是小卫星或微卫星序列，这样通过分子杂交和放射性显影可检测到众多小卫星或微 卫星位点，从而得到个体特异性的d n a 指纹图谱。 3 随机扩增多态性d n a ( r a n d o m a m p l i f i e dp o m o r p h i s md n a ，r a p d ) 该技术是由w i l l i a m s 以p c r 为基础发展起来的一种新型分子遗传标记技术。它是 利用随机排列的寡聚脱氧核酸单链引物( 一般为8 - - 1 0 b p ) ，通过p c r 非定点地扩增染 色体组中的d n a 所获得的长度不同的多态性d n a 片段。r a p d 所使用的引物各不相 同，但对任一特定引物它在基因组d n a 序列上具有其特定的结合位点，一旦基因组在 这些区域发生d n a 片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布 发生变化，从而引起扩增产物数量和长度发生改变，表现出多态性l l 。与r a p d 标记 类似的还有任意引物p c r ( a r b i t r a r i l yp r i m e dp c ra p - p o r ) 标记和d n a 扩增指纹( d n a a m p l i f i c a t i o nf i n g e r - p r i n t i n g ，d a f ) 。 4 扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 该标记技术是由z e b e s u 和v o s 等发展的一种新的d n a 标记技术。a f l p 实际上是 r f l p 与p c r 相结合的产物，其基本原理是将基因组d n a 进行限制性内切酶酶切，然 ， 后选择特定的片段进行p c r 扩增，通常使用双链人工“接头”与“接头”相邻的酶切 片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。a f l p 标记所用的专用引物由三部分组成： 与人工接头互补的核心碱基序列；限制性内切酶识别序列：引物3 端的选择碱基序列( 1 - - 1 0 b p ) 。因此只有那些两端序列能与碱基配对的限制性酶切片段被扩增，扩增片段经 过聚丙烯酞胺凝胶电泳分离检测。该技术的优点是在不事先知道d n a 序列信息的前提 下，可以对酶切片段进行经典p c r 扩增。选择碱基包括l 1 0 个数量不等的随机核昔 酸序列可以调节a f l p 产物的条带特异性和数量，提供较多的基因组多态性信息，同时 也克服了r a p d 重复性差的问题。在实验过程中一般采用两个限制性内切酶( 一个酶 为多切点，另一个酶的切点较少) ，因此，a f l p 分析中产生的主要是由两个酶共同酶 切的片段。 5 简单序列重复( s i m p l es e q u e n c er e p e 乩s s r ) 在真核生物基因组中均存在着由l 一5 个碱基对组成的简单重复序列，又称之为微 卫星( m i e r o s a t e l l i t e ) ，如( g a ) n ，( g c c ) n 等。同一类微卫星d n a 可分布于整个基因组不 同位置上，其高度多态性主要来源于重复次数的不同或重复程度的不完全性。s s r 标记 的基本原理是，根据s s r 两端的保守序列设计引物，通过p c r 反应扩增s s r 片段。由 于核心序列串联重复数目不同，因而能够用p c r 的方法扩增出不同长度的p c r 产物， 将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。在 s s r 技术上，采用p c r 反应必须知道扩增d n a 片段两侧序列，而多数情况下并不清楚 s s r 两侧序列，这就限制了s s r 技术的应用。由z i e t k i e w i e z 等创建的i s s r ( i n t e r - s i m p l e s e q u e n c er e p e a t ) 则可以克服上述障碍。i s s r 又称锚定简单重复序y u ( a n c h o r e ds i m p l e s e q u e n c er e p e a t ，a s s r ) ，其优越性是根据植物广泛存在s s r 的特剧1 2 1 ，利用在植物基 因组中常出现的s s r 本身设计引物，无需预先克隆和测序。 6 单核甘酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p ) s n p 是指同一位点的不同等位基因之间个别核甘酸的差异或只有小的插入、缺失、 突变等，它又被称为第三代多态性标记。s n p 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异， 在人类基因组中大约1 0 0 0 b p 中s n p 会出现一次，因此可以作为基因特异性的标记。借 助于d n a 芯片技术，如果能将所有s n p 信息载入d n a 芯片，就可制造“基因组扫描 仪”，用来扫描各个个体并分析它们在基因组成上的差异。 7 差异显示技术( d i f f e r e n t i a ld i s p l a y , d d ) 差异显示是在转录水平上对基因表达的差异进行分析，即通过分析m r n a 之间的 差异来获知细胞自j 基因的表达情况。将差异显示技术与近等基因系( n e a ri s o g e n i cl i n e s ， n i i s ) 或群分法( b u l k e ds e g r e g a n t a n a l y s i s ，b s a ) 结合则可以从基因组特定区域分离出 e d n a 分子标记。差异显示分析通过引物结合位点的不同以及扩增片段长度的不同不仅 可以检测出点突变所造成的差异，而且能观察到由于插入或缺失而产生的差异。 8 2 2 2 分子标记在植物遗传改良中的应用 1 亲缘关系和遗传多样性的研究 基因型不同的品种或不同亲缘关系的物种，基因组内核苷酸序列存在差异，利用分 子标记可以检测出不同品种间的多态性，这些多态性反映了被检测材料的遗传多样性。 研究表明植物样品经过a f l p 扩增可以获得多达1 5 0 个位点特异性片段，能够充分反映 遗传多态性变化。近年来，已有大量的研究报道应用分子标记技术检测植物( 如水稻、 玉米、小麦、大豆、蔬菜等) 的多态性。利用分子标记通过相关性、聚类等数量遗传学 分析手段，还可以对不同亲缘种间的分类、遗传距离、系统发育、亲缘关系等进行研究， 从而确定亲本之间的遗传距离，并进而划分杂交优势群，提高杂种优势潜力。 2 d n a 指纹库的建立 同一物种的各个品种间存在着大量的多态性标记，如果某一品种具有区别于其他品 种的独特标记即一些特异性d n a 片段的组合就称为该品种的“指纹”。各品种的独特 的指纹片段构成物种的d n a 指纹库，它具有类似于人的指纹那样的高度个体特异性和 稳定性。d n a 指纹在植物育种中具有广泛应用，例如：( 1 ) 每个品种d n a 指纹差异可 直接提供与目标性状有关的d n a 水平的信息，避免了环境的干扰，可以大大提高杂交 育种中对亲本及后代理想单株的选择效率( 2 ) 通过检测品种是否具有该品种特有的指 纹片段，可以有效地鉴定品种纯度与真伪、新品种登记和品种知识产权保护等。 3 遗传图谱的建立和基因定位 遗传图谱是植物资源、遗传育种及分子克隆等许多应用研究的理论依据和基础。与 经典遗传作图相比，分子标记技术是构建植物遗传图谱的一种较为简便快捷的理想方 法。f a y e 仅用3 个月时间就构建了玉米的a f l p 遗传图谱，共得到1 0 3 2 个标记。在连 锁图的绘制上，各种分子标记技术结合使用可以建立起完整的高密度的分子图谱。例如 m b a 等在木薯已有的r f l p 框架图上，添加了3 6 个s s r 标记，使木薯的连锁图更加 高密。在建立起完整的高密度的分子图谱后，就可以定位感兴趣的基因。目前，研究人 员利用完整的高密度分子图谱，已把玉米、棉花、大豆等主要农作物的目标性状基因定 位在各自不同的连锁群上。 4 分子标记辅助选择( m o l e c u l a rm a r k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o n ，m a s ) 育种 植物育种中分子标记辅助选择是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记来判断 目标基因是否存在的。通过不同分子标记技术的分析可筛选出与目标基因性状紧密连锁 的d n a 片段，这样可以作为辅助育种的分子标记。应用这些分子标记进行间接选择， 将得到事半功倍的作用，因为m a s 不受植物生长发育的时期及环境的影响，如抗病育 种不需要创造选择环境进行筛选鉴定等。 2 3 小结 本章主要介绍了现代信息技术的应用以及其发展前景。介绍了分子标记技术的原理 相关的主要生物学概念及其在植物育种遗传中的应用进展。在此基础上介绍了三种 9 d n a 指纹分析的方法，包括特征谱带法、引物组合法、核心引物组合法，并对这三种 方法进行了比较论述。证实了一套固定的玉米d n a 指纹库构建的核心引物。 1 0 第三章玉米d n a 指纹图谱库建立 种子质量检测包括品种真实性和种子纯度鉴定。传统的种子鉴定采用田间小区试 验、同工酶或种子储藏蛋白电泳，这些方法不同程度地存在缺陷，难以满足种子商业化 生产、大规模质量管理和知识产权保护的技术需求。以d n a 多态性为基础的分子鉴定技 术较好地克服了传统鉴定方法的不足，已逐步用于种子质量检测。在几种分子标记中， s s r 标记技术以位点多态性高、扩增带型容易被区分、重复性好等优点开始用于玉米杂 交种子纯度鉴定。少数骨干自交系的频繁使用导致我国玉米杂交种的遗传基础渐趋狭 窄，很多杂交种的生物学特性非常接近，进而伎判别杂交种和亲本自交系之问的亲子关 系变得十分困难。目前，我国尚未建立起主要推广和被保护玉米杂交种( 包括亲本自交 系) 的d n a 指纹图谱数据库及管理方法，不能将s s r 标记技术有效地用于品种真实性鉴 定。 3 1 玉米杂交种d n a 指纹图谱国内外研究现状和发展趋势 种质鉴定是玉米自交系和杂交种利用及知识产权保护的依据，目前国内外对玉米的 种质鉴定仍然以形态鉴定为主，参考同工酶和种子贮藏蛋自电泳图谱。形态性状的表现 受环境影响较大，鉴定工作量大、周期长、受季节限制；同工酶和种子储藏蛋白多态性 不够丰富，此外同工酶存在组织和器官特异性，取材有严格的一致性要求，所以鉴定结 果不够稳定。发展高度稳定可靠并有较高区分能力的鉴定技术对玉米新品种登记和保 护、品种真伪和种子纯度检验是十分必要的。d n a 指纹技术的出现，给种质鉴定带来 了革命性的变化，由于它直接反映d n a 水平上的差异，具有高度的专一性和特异性， 不同物种、同一物种不同品种所得d n a 指纹各异，就象人类的指纹一样，成为当今最 先进的种质鉴定技术。d n a 指纹技术的发展日新月异，除以s o u t h e r n 杂交为基础的 r f l p 外，近几年已发展出了多种以p c r 为基础的新的d n a 指纹技术如r a f d 、s c a r 、 a f l p 、s s r 、i s s r 等【l 卯。美国先锋种子公司用a f l p 技术鉴定本公司选育的玉米自交 系和杂交种，建立了详细的d n a 指纹档案，我国郭景伦等用r a p d 技术对国内4 6 份 玉米骨干自交系和1 0 多个杂交种进行鉴定并建立了d n a 指纹数据库。但是这些技术 的应用价值不同：r f l p 技术多态性低，遗传信息有限，需要的d n a 模板量大，而且 操作复杂；r a p d 技术尽管具有简单易行、需d n a 量少、易于自动化、实验周期短的 优点，但对反映条件比较敏感，重复性差；a f l p 具有多态性高，稳定性好的优点，但 所需d n a 模板量大，操作步骤复杂，同时它还是专利激素后。与其它标记相比，以微 卫星序列为基础的s s r 标记显示了独特的优越性：s s r 标记数量丰富，覆盖整个基因 1 l 组，揭示的多态性高；具有复等位基因的特性，提供的信息量高：以孟德尔方式遗传： 呈共显性；每个位点出设计的引物序列决定，便于不同实验室相互交流合作开发引物， 获得的资料能够在不同的实验室重复并共享，虽然s s r 因物的开发费用相当高，但由 于其巨大的应用潜力，在一些主要农作物中s s r 引物的开发正在进行中，目前玉米上 已公开的s s r 引物序列约2 0 0 0 对，并且每隔一段时间就有新的引物增加，为该技术在 玉米指纹图谱中的应用提供了良好的条件。 d n a 指纹数据库的构件研究在人类上最为成熟，已进入了实际应用阶段。但由于 我国起步较晚，建库的标准方法及相关试剂盒均为直接采用国外标准，耗资巨大。在其 它物种上则研究的较少。 美国先锋( p i o n e e r ) 等国际种业大公司已将d n a 指纹技术应用于品种保护方面，但 还没有统一的标准。我国目前在该方面的研究可以说于国际同步，甚至处于领先水平。 中国玉米品种d n a 指纹库的构件和玉米品种d n a 指纹鉴定标准将是国际上第一个玉 米品种d n a 指纹库和第一个农业d n a 指纹方法标准。 3 2 玉米品种d n a 指纹库构建中的几个相关问题 随着育种进程的加快，玉米品种急剧增加。目前全国玉米生产上种植的杂交种有数 百个之多，每年参加各省市和国家区试的玉米新品种达数千个，新审定的品种数以百计。 而育种者们为了在短时间内培育出高产稳产品种，往往集中利用少数骨干自交系，使品 种的遗传基础趋于狭窄，从而加大了利用传统形态学区分不同玉米品种的难度。这一方 面给种子管理部门、品种保护部门以及广大的种子生产者、经营者和种植者带来诸多不 便，另一方面也给一些单位和个人以可乘之机，经常出现以甲品种充当乙品种、以未审 定品种充当审定品种或以劣品种充当畅销优质品种的现象，还有随意更换杂交种亲本改 变品种特性以及窃取他人亲本或冒用杂交组合等现象被发现。而这些用常规的形态鉴别 较难识破，在管理上造成较大漏洞。尽快构建我国玉米新品种标准d n a 指纹库，对我国 玉米种业市场的规范及玉米新品种权保护等具有重要意义。 3 2 1 选用哪些品种材料 一个好的玉米d n a 指纹图谱库应具备以下4 个特性： 1 代表性，即代表了当前国内主要玉米品种资源； 2 完备性，即收集的玉米品种尽量齐全； 3 开放性，即随着每年玉米新品种