（食品科学与工程专业论文）葛根有效成分的提取工艺及其解酒功效的研究.pdf

摘要葛根是一种有丰富营养而且药理作用独特的药食两用资源，用途极为广泛。葛根中的异黄酮类物质作为葛根的活性成分，其药理保健功能和临床治疗作用正逐渐被人们所认识和关注。本文以葛根总异黄酮及葛根素的提取率为指标，综合考察了各种因素对葛根二种提取工艺的影响；然后以二指标综合评分法为数据分析方法，采用正交实验分别优选出二种提取工艺的最佳方案；并对葛根二种提取工艺的提取效果进行了比较，为实现工业化生产提供了理论基础。另外以小白鼠作为实验对象，对葛根异黄酮提取液的解酒功效进行了初步研究。在对溶剂回流提取工艺的研究中，以单因素实验考察了葛根原料的粒度( 粉碎度) 、浸提溶剂的种类、浓度和用量( 固液比) 、提取温度、提取时间、提取次数等各因素对葛根提取效果的影响；以葛根总异黄酮及葛根素提取率的综合评分作为指标，通过正交实验确定了溶剂回流提取葛根的优选工艺参数：在葛根原料粒度固定的前提下，溶剂为浓度8 0 的乙醇，固液比为l ：3 0 ，在7 0 水浴加热回流浸提2 h 。在对超声波辅助提取工艺的研究中，重点考察了溶剂浓度，超声时间，超声浸提温度对葛根提取效果的影响；同样以葛根总异黄酮及葛根素提取率的综合评分作为指标，通过正交实验优选了葛根超声波辅助提取工艺参数。最佳参数为：在固液比和原料粒度固定的前提下，乙醇溶剂浓度为7 0 ，超声温度为7 0 ，浸提时间3 0 m i n 。通过实验对葛根二种提取工艺优选方案的提取效果进行了比较，结果表明：超声波辅助提取工艺可以在较短时间内达到较高的提取率。与溶剂回流提取工艺相比，葛根总异黄酮的提取率提高了3 1 3 ，葛根素的提取率提高了5 9 6 ；且所用溶剂量较少。极大的节约了能耗和提高了效率。通过葛根解酒功效的初步研究，可知：在饮酒前灌胃葛根异黄酮提取液可以极显著缩短小白鼠的醉酒时间，与空白对照组相比较，从正常到醉酒时间相对延长了6 5 9 6 ，而醒酒时间相对提前了1 4 9 2 。二个指标均存在着明显的显著性差异( p o 0 1 ) 。在饮酒后灌胃葛根异黄酮提取液，与空白对照组相比较，小鼠的醒酒时间显著缩短了9 3 4 ( p o 0 5 ) 。说明葛根提取液具有显著的防醉解酒功效。在饮酒前灌胃葛根异黄酮提取液，酒后3 0 1 8 0 m i n 的时间内，灌胃葛根提取液的小鼠血液中乙醇浓度均低于空白对照组，分别在6 0 r a i n 、9 0 m i n 、1 2 0 m i n 、1 8 0 m i n 时与空白对照组相比较有极显著差异( p o 0 1 ) 。初步说明葛根提取液是通过抑制乙醇胃肠吸收和加速乙醇降解代谢以降低机体血醇浓度，从而起到解酒防醉的功效。关键词：葛根；葛根异黄酮；葛根素；提取工艺；超声波；解酒r e s e a r c ho ne x t r a c t i n gp r o c e s so fe f f e c t i v ec o n s t i t u e n tp u e r a r i aa n di t sr e l i e v i n ga l c o h o l i s mf u n c t i o na b s t r a c tp u e r a r i ai sa ni m p o r t a n tc o n s t i t u e n tf o rd r a ga n df o o ds i n c ei th a sal o to fn u t r i m e n t sa n dp a r t i c u l a rm e d i c a t i v ee f f e c t sa n dh a sb e e nw i d e l yu s e d a st h em a i na c t i v ec o m p o n e n to fp u e r a r i a ，p u e r a r i nh a sb e e np a i dm o r ea n dm o r ea t t e n t i o na n dk n o w nf o ri t sm e d i c a t i v eh e a l t hp r o t e c t i o nf u n e t i o na n dc l i n i cc u r ee r i e c t t h ee x t r a c t i o nr a t eo fs u mp u e r a r i af l a v o n ea n dp u e r a r i nh a v eb e e nu s e df o ri n d i c a t i o n ，w ei n t e g r a t es u r v e yt h ee f f e c to ff a c t o r si np r o c e s so nt w oe x t r a c t i o nc r a f t w o r k ；a n da n a l y s e db yt w of a c t o r si n t e g r a t i v eg r a d ew a y ；w i t ht h eo r t h o g o n a lt e s t ，t h eo p t i m a lo p e r a t i o np a r a m e t e r so fe x t r a c t i o np r o c e s sw e r ec h o s e n ；t h et e c h n i q u ea n dc h a r a c t e rh a v eb e e nc o m p a r e db e t w e e nt w od i s t i l l i n gp r o c e d u r e s ，a n dr e f e r e n c ew o u l db eo f f e r e dt oi n d u s t r i a le x t r a c t i o no fi s o f l a v o n ef r o mp u e r a r i nl o b a t a t h em i c ew a ss e l e c t e dt oe x p e r i m e n to b j e c ta n dr e l i e v i n ga l c o h o l i s mf u n c t i o nw a ss t u d i e db ye x t r a c t i n gs o l u t i o nf r o mp u e r a r i a t h ee f f e c to ne x t r a c t i o nr a t ef r o mp u e r a r i aw a ss t u d i e db yf a c t o r si n c l u d i n gg r a n u l a r i t y 、k i n do f s o l v e n t 、a m o u n t 、t e m p e r a t u r e 、t i m ea n dt i m e so f e x t r a c t i o nb ys i n g l ef a c t o r si ne x p e r i m e n t t h ee x t r a c t i o nr a t eo fs u mp u e r a r i ai s o f l a v o n ea n dp u e r a r i nh a v eb e e nu s e df o ri n d i c a t i o n ，t h eo p t i m a lo p e r a r i o np a r a m e t e r so fs o l v e n tr e f l u xe x t r a c t i o np r o c e s sw e r ec h o s e nb yt h eo r t h o g o n a lt e s t ：w i t ht h eg r a n u l a r i t yf i x e d ，s o l v e n te o n c e n t r a c t i o ni s8 0 a l c o h o l ，t h er a t eo fs o l i dt ol i q u i di s1 ：3 0 ，r e f l u x i n ge x t r a c t e d2 hi n7 0 cw a t e rb a t h e f f e c to fc o n c e n t r a c t i o n 、t i m e 、t e m p e r a t u r eo ne x t r a c t i o nr a t ew a ss t u d i e dm o s t l yi nu l t r a s o n i ce x t r a c t i o nr e s e a r c h ；w i t ht h ee x t r a c t i o nr a t eo fp u e r a r i ai s o f l a v o n ea n dp u e r a r i nb e e ni n d e xm a r k ，t h eo p t i m a lo p e r a r i o np a r a m e t e r so fu l t r a s o n i ce x t r a c t i o np r o c e s sw e r ec h o s e nb yt h eo n h o g o n mt e s t t h eo p t i m a lo p e r a t i o np a r a m e t e r s ：w i t ht h eg r a n u l a r i t ya n da m o u n tf i x e d ，s o l v e n tc o n c e n t r a c t i o ni s7 0 a l c o h 0 1 3 0 m i ni n7 0 u l t r a s o n i cb a t h t h ee x t r a c t i o nr a t eh a v eb e e nc o m p a r e db e t w e e nt w oo p t i m i z i n gp r o g r a mo fe x t r a c t i o np r o c e s s i n g , t h er e s u l ti n d i c a t e ：e x t r a c t i o nw i t hu l t r a s o n i ca s s i s t a r i tc o u l dr e a c hu p p e re x t r a c t i o nr a t ei ns h o r tt i m e ，c o m p a r e dt ot h es o l v e n tr e f l e xm e t h o d ，e x t r a c t i o nw i t hu l t r a s o n i cc a l li n c r e a s et h er a t eo fs u mf l a v o n ee x t r a c t i o n3 1 3 ，i n c r e a s et h er a t eo fp u e r a r i n5 9 6 ：a n di tn e e df e w e rs o l v e n t s ot h ee x t r a c t i o nw i t hu l t r a s o n i cc a ns a v et h ee n e r g ya n di n c r e a s ee f f i c i e n c y t h r o u g hs t u d y i n go i lr e l i e v i n ga l c o h o l i s mf u n c t i o nb yp u e r a r i n ，w ec a nk n o wt h a t ：i tc a r lr e d u c et h ed r u n kt i m eo ft h em i c ei n t ow h i c hf i l l e dt h ep u e r a r i nb e f o rd r i n k ，c o m p a r e dt ob l a n kc o n t r o l ，t h et i m ef r o mn o r m a lt od r u n k e n n e s sp r o l o n g e d6 5 9 6 r e l a t i v e l y , a n dt h et i m es o b e ru pa d v a n c e d1 4 9 2 r e l a t i v e l y t w oi n d i c a t i o nh a v ev i s i b l es i g n i f i c a n td i f f e r e n t ( p 0 0 1 ) c o m p a r e dt ob l a n kc o n t r o l ，i tc a l lc u td o w nt h et i m eo fd r u n kb y9 3 4 ( p 0 0 5 ) ，w h i c hf i l l e dt h ep u e r a r i ni n t ot h em i c ea f t e rd r u n k , a l lo fa b o v ec a nt e l lu st h a tt h ee x t r a c to fp u e r a r i ah a v er e l i e v i n ga l c o h o l i s mf u n c t i o na n dp r e v e n t i n gd r u n kf u n c t i o n f i l l i n gt h ep u e r a r i ni n t ot h em i c e ，t h ee t h n o lc o n c e n t r a t i o ni nb l o o do f m i c ew h i c hb ef i l l e da r ef e w e rt l l a nb l a n kc o n t r o li n3 0 - 1 8 0m i n u t e sa f t e rb e i n gd r u n k ，i t h a ss i g n i f i c a n t d i f f e r e n t ( p 1 0 m g 、蛋氨酸 7 5 4 m g 、苯丙氨酷9 6 5 m g 、苏氨a 务9 6 3 m g 、异亮氨酸 7 5 4 m g 、亮氨酿l1 5 4 m g 、缬氨酸 11 2 4 m g ，组氨酸 6 7 4 m g 。葛根的总灰分约占5 7 ，含铁、钙、磷、锌、铜、锰、硒、锗等1 0 多种人体必需的矿物质和微量元素( 胡江琴等，1 9 9 9 ；向大雄等，1 9 9 8 ；孙达峰等，2 0 0 3 ；杨明毅等，2 0 0 1 ) 。研究表明，葛根所含的异黄酮类物质是其主要的生理活性成分。目前，从葛根提取物中分离出的异黄酮类化合物有2 0 余种，其中葛根索、大豆苷元和大豆苷是主要活性成分，已广泛用于临床应用。而葛根素含量最高，是葛属植物中特有的异黄酮物质( 郑建仙，1 9 9 5 ；仲英等，1 9 9 3 ) 。1 1 3 1 葛根淀粉的研究进展葛根中富含淀粉，且这种淀粉质地洁白细腻，有独特芳香气味，具有糊化温度低、淀粉糊透明度高、粘度稳定性强等特点。淀粉中还含有少量维生素和矿物质，特别是锌、锰、硒、锗等含量要高于其他同类作物，能有效的促进儿童骨骼发育和智力增长。是营养丰富的高级淀粉，加工保健食品的优质原料( 徐明生，2 0 0 2 ) 。包光进等( 1 9 9 5 ) 对葛根淀粉流变学特性进行了研究，发现葛根淀粉其浓度增加，温度升高，非牛顿胀塑性流体表现越明显。并且酸碱度p h 值变化对其影响性很小，相对稳定。杜先锋等( 1 9 9 8 ) 为研究葛根淀粉的特性，对其分子结构进行了研究，发现直链淀粉呈结晶结构，支链淀粉是典型的无定型结构。谢定等( 2 0 0 1 ) 对葛根淀粉的力学性能进行了研究，结果表明在一定范围内随浓度的增加，葛根淀粉凝胶强度和弹性模量呈线性增加。陈丽风等( 1 9 9 9 ) 利用a 一淀粉酶和1 3 一淀粉酶对葛根淀粉进行液化，水解和糖化研究，得出的液化条件为：液化温度9 5 c 、p h 6 0 ，加入0 1 旷淀粉酶，酶解时间6 0 m i n 。糖化条件为：糖化温度6 0 ( 2 、p h 值6 0 ，加入b 一淀粉酶8 0 m l k g ，糖化时间6 0 m i n 。从而说明葛根淀粉粘度高，抗老化。杜先锋、许时婴、徐明生、吴磊燕等( 2 0 0 2 ) 分别对葛根淀粉、玉米淀粉、甘薯淀粉进行了凝胶特性、冻融性及糖、无机盐和酸碱度p h 值的影响研究。发现透明度次序为：玉米淀粉 葛根淀粉 甘薯淀粉；冻融性：玉米淀粉 甘薯淀粉 葛根淀粉：加入糖、无机盐对葛根淀粉糊化温度影响较大，随加入量的加大，糊化焓升高；随酸碱度p h 值变化，葛根淀粉的稳定性要优于玉米淀粉和甘薯淀粉。多位学者对葛根淀粉的理化性质进行了深入的研究，证实了葛根淀粉优越的加工特性，为葛根淀粉的开发和利用提供了理论上的依据。1 1 3 2 葛根化学成分的研究进展2 0 世纪5 0 年代末至6 0 年代初，日本学者柴田承二( 1 9 5 9 ) 等首先对葛根进行了系统的化学成分研究，从中分离出一些成分除了大量淀粉外，主要是异黄酮类的化合物。此后许多专家对葛根的化学成分进行了研究。2葛根异黄酮存在于最外部的木栓层下面的外部薄壁组织中，它们分别是葛根素、大豆苷元、大豆苷、芒柄花素- 7 - 葡萄糖甙、4 ，7 l - 二葡萄糖大豆甙、8 一碳一芹菜糖葡萄大豆苷、4 l 。葡萄糖葛根素、6 - 木糖葛根素、3 ，_ 甲氧基葛根素、7 一木糖一葛根素、4 ，6 - 二乙酰基一葛根素等异黄酮类化合物。还含有6 ，7 - 二甲基香豆素、胡罗h 甙、生原单宁等。其中葛根素( p u e r a r i n ) 、大豆苷元( d a i d e z i n ) 和大豆苷( d a i d z i n ) 是葛根的主要活性成分，已广泛用于临床应用，葛根的药理保健功能都离不开这些活性物质( 陈妙华等，1 9 8 5 ；孙达峰等，2 0 0 3 ) 。其结构式如图( 图i 1 ) 。葛根素( p u e r a r i n )异黄酮结构通式大豆苷元( d a i d e z i n )大豆苷( d a i d z i n )图1 一l 葛根主要化学成分结构式f i g 1 1t h es t r u c t u r a lf o r m u l ao f c h i e f c h e m i c a lc o n s t i t u t i o no f p u e r a r i a葛根的化学成分极为复杂，研究在不断的进展。日本学者野原埝红等( 1 9 8 7 ) 从日本葛根中分离出三个新骨架类型的芳香族类化合物，命名为葛甙a ( p u e r o s i d e a ) 、葛甙b ( p u e r o s i d eb ) 、葛甙c ( p u e r o s i d e c ) 。后来又从日本产葛根的甲醇提取物中，用正丁醇与水分别提取法，从中得到了总皂甙部分，水解后用凝胶过滤法，以甲醇洗脱，分得了7 种三萜类皂甙元。经质谱、核磁共振氢谱和碳谱等分析，鉴定4 个为己知成分，即槐二醇( s o p h o r a d i 0 1 ) 、1 3 - 羟基槐二醇( c a n t o n i e n s i s t r i o ) 、大豆皂甙元b ( s o y a s a p o g e n o lb ) 和大豆甙元a ( s o y a s a p o g e n o l a ) ，三个新的三萜类皂甙元，由质谱裂解产生的离子碎片说明三个化合物均具有大豆皂甙元的骨架。3 个新的三萜皂甙元为葛根皂甙元c ，a ，b ( k u d z u s a p o g e n o l c ，a ，b ) 。y u k i o 等( 1 9 8 8 ) 从野葛根中分离出两个异黄酮类化合物：t a k a s h i 等( 1 9 9 1 ) 从氯化铜处理过的野葛的根中分离出三个异黄酮类化合物：h i r a k u r a 等( 1 9 9 7 ) 也从野葛根中分离出两个异黄酮类化合物，英国学者r o n g h 等( 1 9 9 8 ) 采用高效液相色谱( h p l c ) 、光二极管阵列( p d a ) 和质谱( m s ) 等检测手段对野葛根中1 5 种异黄酮糖甙进行了鉴定。这些研究说明了葛根的化学成分极为丰富，还有待进一步的研究。1 1 4 葛根的药理保健作用的研究进展1 1 4 1 葛根的药理保健作用葛根最早记载于汉代的神农本草经，列为中品，谓主治“诸痹”。是中医常用的祛风解表药。历代本草多有记载，如本经载：“主消泻，身大热、呕吐、诸痹、起阴气，解诸毒。”别录谓：“疗伤寒、中风头痛，解肌发表，出汗，开滕理。”( 唐冰等1 9 8 9 )作为一种常用中药，葛根具有着独特的疗效。传统中药学认为，葛根味甘辛、性平，有清热解肌、生津比渴、醒酒解脾、透疹、升阳止泻之功效。主治伤寒、湿热头痛、项强、烦热消渴、泻泄、痢疾、斑疹不透、高血压、心绞痛、耳聋等病症( 曾明等，1 9 9 8 ) 。现代药理研究证明，葛根具有调节循环系统、解除痉挛、降低血糖、抗氧化、抑制肿瘤、提高免疫、改善记忆等功能，对心脑血管病、突发性耳聋、眼病、嗜酒和糖尿病等疾病有特殊的治疗作用( 郑建仙等，1 9 9 5 ) 。近年来，葛根已广泛应用于心血管系统疾病的治疗，葛根对血压有一定的调整作用，对药物所致的升压及降压反应均有抑制作用，能增加心肌对氧的利用率，但对心肌的耗氧量并无改变( 刘少鹏，1 9 8 9 ) 。葛根的酒浸膏能降低血管阻力，增加脑血流量及冠状动脉血流量，改善脑及冠脉循环，增强机体免疫能力，而且能降血糖( 禹志领等，1 9 9 7 ；何惟胜，2 0 0 0 ) 。其所含大豆黄酮苷和葛根素对抗脑垂体后叶索引起的急性心肌缺血有保护作用。葛根提取物还具有很强的雌激素作用，在泰国用葛根作为返老还童药。葛根有降血糖作用，葛根煎剂给家兔灌冒后，在第四、五小时左右可看到显著的降血糖作用( 姜秀莲等，1 9 8 9 ) 。也有的用葛根治疗传染性肝炎、解酒毒等。1 1 4 2 葛根异黄酮的药理保健作用葛根异黄酮是一种毒性极低，安全有效的药物。史纪兰等( 1 9 9 2 ) 用葛根中提取的异黄酮类化合物，进行药物的短期致突、致畸实验：a m e s 试验为阴性：染色体畸变分析未显示出遗传毒性；微核测定未显示出对靶细胞的致突活性；致畸试验对胎鼠无致畸作用；精子畸形试验说明对雄性生殖细胞无致突变作用。作为药物，葛根异黄酮主要用于心、脑血管方面的疾病的治疗。可降低血管阻力，增加脑流量，改善脑及冠脉循环，增强机体免疫能力，对脑缺血亦有保护作用；葛根异黄酮具有明显的抗自由基作用和提高血、脑组织中的s o d 活性的作用；葛根异黄酮可用于酒精中毒及酒精中毒导致肝损伤的治疗；葛根异黄酮对骨质疏松、更年期综合症有一定的疗效，己分离并测定出它含有一种与异黄酮发生有关的新型化合物葛雌激素( m i r e s t r l ) ，它具有很强的雌激素活性、降低血糖、抑菌、保肝等作用( 谷忠村等，1 9 8 8 ) 。41 1 4 3 葛根素的药理保健作用葛根素( p u e r a r i n ) 是葛根异黄酮的主要成分，英文名p u e r a r i n ，故又名普乐林。化学名称：8 - 1 3 d 一葡萄吡喃糖一4 t ，7 一二羟基异黄酮，分子量为4 1 6 。葛根素成品为白色针状结晶，熔点为1 8 7 0 c 。在甲醇中溶解，在乙醇中略溶，在水中微溶( 0 4 6 2 9 1 0 0 m l ) ，在氯仿或乙醚中不溶。水溶液为澄清无色，p h 值为3 5 5 5 。从野葛根中提取出的葛根异黄酮提取物中，葛根素约占5 0 其次是大豆苷、大豆苷元。动物实验证明葛根素能扩张冠脉，降低血压，减慢心率和心肌氧耗。对神经型颈椎病、中央性视网膜炎、神经萎缩等有较好的疗效( 雷嘉启等，1 9 8 8 ) 。葛根素的毒性试验：葛根的l d 5 0 高达7 8 3 1 k g ，在临床上葛根有的用量可达4 5 9 ，甚至用到6 0 9 也未见任何副作用，临床用量为1 5 3 0 9 天，大剂量可用到5 0 1 0 0 9 ，亦未见不良反应，所以葛根的临床使用比较安全( 雷嘉启等，1 9 8 8 ；陶忠华等，1 9 9 3 ) 。葛根素的药理作用概括来说主要有以下几方面的作用：扩张冠脉血管，改善心脏缺血区的血流和改善缺血再灌注引起的心功能损害；缩小急性心肌梗塞的范围；降血压；调节血浆内皮素及一氧化氮含量；降低儿茶酚胺含量；减慢心率和抗心率失常作用；改善心肌代谢、保护缺血心肌；抗血小板聚集作用：舒张脑血管，促进脑循环：改善微循环障碍：1 3 受体阻滞作用；改善血液流变学指标( 钟平华，1 9 9 7 ；牛晓等，1 9 9 9 ；李为厚等，2 0 0 0 ；罗伟等，2 0 0 0 ；梁碧莲，2 0 0 2 ；刘永宏，2 0 0 2 ) 。1 1 5 葛根提取工艺的研究进展葛根中主要活性成分是以葛根素、大豆苷、大豆苷元为代表的异黄酮类化合物。传统提取方法主要有：水煮法、溶剂浸出法、渗漉法等。近年来，新材料、新技术不断应用到中药提取研究中，如超临界流体萃取法、超声波提取法、半仿生提取法、旋流提取法、酶法等，这些技术仍处于研究开发阶段。目前，葛根的提取在实际生产中多采用水提、醇提工艺路线，实验设计多采用单因素设计、正交设计、均匀设计等方法优选最佳工艺条件。由于各实验使用不同地区的葛根原材料以及实验条件不同，造成优选出的工艺参数的差异较大。以下列举了目前葛根提取的几种主要的工艺。1 1 5 1 水煎煮法张爱岑等( 1 9 9 7 ) 以水煎煮法对葛根的提取进行了研究，确定了最佳的水煎煮提取工艺：取葛根原料各加1 0 倍量的水，煎煮3 次，时间分别3 、1 、o 5 h ，过滤，静置2 4 h ，取上清液置水浴上浓缩成膏状，放冷，至8 0 c 烘箱中干燥即得总黄酮干膏。此法操作简单，节省资金，但总黄酮提取率较低。1 1 5 2 碱液法根据葛根黄酮结构中酚羟基易溶于碱性溶剂的性质，应用饱和氢氧化钙水溶液，分别以8 倍量提取1 次及6 倍量提取2 次。工艺流程为：取葛根粗粉，加饱和c a ( o h ) 2 水溶液( 8 倍量、6 倍量、6 倍量) 分别以2 h 、l h 、0 5 h 提取3 次，合并提取液，调p h 值为5 ，减压浓缩后，在搅拌下浓缩液以9 5 乙醇调醇浓度达6 5 ，静置0 5 h 后过滤，回收乙醇得总黄酮( 张5永煜等，1 9 9 9 ) 。1 1 5 - 3 加热回流法加热回流法主要是取定量的经干燥粉碎的葛根粗粉，放入带有回流装置及温度计的三口圆底烧瓶内，分别用水，乙醇或其他有机溶剂( 出于药物或食品安全考虑多数情况下使用乙醇) 在一定温度下回流提取，过滤提取液，减压浓缩成膏状。李稳宏等( 1 9 9 8 ) 分别以水和6 0 乙醇作溶剂对葛根黄酮的提取进行了对比实验研究，提取时间为3 h ，然后用纱布粗滤，滤渣重新加入定量溶剂进行二次提取，再粗滤，如此反复提取3 次，合并滤液，减压过滤，弃去滤渣，滤液经真空干燥得提取物。分析得出水提法固形物提取率较高，但总黄酮含量低，且操作中固液分离很难进行，费时耗力。原因是葛根中的淀粉，纤维素及一些糖类物质在水中有一定的溶解度，造成溶液黏稠，不易分离。在醇提法中其总异黄酮的含量、出粉率均高，固液分离也比水提法容易得多。故醇提法有较大的工业生产价值。潘见等( 1 9 9 8 ) 通过六组单因素实验和四因素正交实验并结合生产实际探讨了葛根异黄酮的回流最佳浸取工艺表明：在温度8 5 ( 2 、p h 值为8 的条件下，用1 0 倍于葛根量的浓度为7 0 的乙醇，浸取两次，每次2 h ，葛根异黄酮浸取效果最好。1 1 5 4 渗漉法此法具体操作流程为：将原料加入渗漉桶，加乙醇浸泡数小时，再加乙醇进行渗漉，将所得渗漉液提抽，滤液回收乙醇并浓缩成稠膏状，后真空干燥得干浸膏。通过研究得出流速为2 m l k g m i n 的渗漉法提取的总黄酮得率最高( 赵浩如等，2 0 0 0 ) 。1 1 5 5 浸渍法取葛根4 5 9 ，加乙醇2 5 m l 作为溶剂，室温浸渍，每天振摇一次，8 d 后提取液过滤。结果异黄酮提取率低于渗漉法和加热回流法( 赵浩如等，2 0 0 0 ) 。1 1 5 6 纤维素酶法邢秀芳等( 2 0 0 1 ) 用纤维素酶提取葛根异黄酮，并与回流提取进行了比较。将药材饮片粉碎约1 c m 左右，用3 倍量水浸泡，用盐酸调p h 为4 ，加o 5 纤维素酶充分搅拌，置4 0 1 2 恒温水浴内保温1 5 h 。在纤维索酶的作用下，葛根总黄酮的收率提高。薄层层析结果显示，加酶与不加酶提取出的成分一致，说明酶解没有破坏葛根的成分。并且与不加酶回流提取相比，葛根总黄酮的提取率提高了1 3 。1 1 5 7 微波辅助萃取法微波具有穿透力强、选择性高、加热效率高等特点。微波技术的应用近年来得到很大发展，微波辅助萃取技术就是利用微波对细胞的破壁作用和加热作用，加速细胞内有效成分的快速溶出。马海乐等( 2 0 0 5 ) 对葛根渣进行微波辅助处理，考察微波作用对葛根总黄酮提取量的影响结果表明：与不施加微波辅助处理比较，施加微波辅助处理的葛根总黄酮的提取量提高5 0 以上用微波中高火挡对葛根渣辅助萃取处理l m i n 后，7 5 的乙醇浸提两次，得到的葛根总黄酮提取量比较理想。6周文斌( 2 0 0 4 ) 通过正交设计考察了微波功率、微波辐射时间、溶剂用量、乙醇的浓度等参数对提取效果的影响，以葛根中的有效成分总黄酮中的葛根素为指标，确定了微波辅助萃取葛根的最佳工艺：葛根粒度为4 0 目，在微波功率700 w ，溶剂为1 5 倍量的9 0 k , 醇中预泡1 2 h ，微波辐射作用4 0 s 。可使黄酮浸出率达9 6 以上，工作时间短，提取效率高。1 1 5 8 超声波辅助萃取法利用超声波产生的强烈振动、高加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，都可加速药物有效成分进入溶剂，从而提高提出率，缩短提取时间，并且避免高温对提出成分的影响。采用超声波法从葛根中提取总黄酮成分与冷浸法相比该方法提取速度快，容易实现产业化：而与回流法相比节省能源、所得产物总黄酮质量分数高。裴凌鹏等( 2 0 0 3 ) 采用乙醇作为溶剂对其不同浓度、不同超声时间、不同超声次数以及不同超声温度等4 个因素进行综合分析，用正交法确定了超声波方法提取总黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度7 0 ，超声波提取2 5 r a i n ，提取次数3 次，温度2 5 。1 1 5 9 超临界流体萃取法该技术利用溶剂在l 临界点上所具有的特殊效应( 气态和液态的双重优点) 来选择分离混合物组分，兼具传统溶剂萃取法和蒸馏法的双重功能，尤其对热敏性物质和不挥发性物质分离更具特色，此法在国外已广泛应用于天然植物的药用成分提取，在国内则正在迅速发展，已有部分以此法提取某些中草药中的黄酮类物质的研究，但鲜见以超临界流体萃取法对葛根中黄酮类物质的研究报告。以上综合了目前葛根提取的几种主要工艺。其中传统的加热回流法葛根有效成分提取率较高，应用最多，但回流法溶剂用量较大，成本较高，同时对其他成分的提取率相应也会提高，杂质多。渗漉法得率较回流法次之，但用渗漉法提取所用溶剂较少，在此条件下杂质的量较少，且不需加热，节省能源，缺点是用时略长。碱液法引入了其他成分，杂质量提高，且增加了工序，提取时间较长，加大了成本。纤维素酶提取是较好的方法，与回流法相比提取率有显著提高但由于各地葛根品种，质地存在差异，因此将纤维素酶广泛应用到工业生产中还需要进一步研究。超声波和微波辅助萃取法是目前新兴的提取方法，其辅助效果明显，提取率显著提高，提取时间大大降低，产业化也较易实现，可用于葛根淀粉生产后的葛渣再利用，对葛资源充分利用有极大的意义。故选择超声波和微波辅助与其他方法的联合提取工艺是工业化提取葛根有效成分的较好方法。1 2 解酒防醉方法的研究进展1 2 1 醉酒对人体的危害醉酒指的是急性乙醇中毒，因为乙醇在进入人体后将在2 3 小时内被人体全部吸收，由于过量饮酒，使乙醇在体内吸收率大于其在肝脏内氧化代谢率，因而大量的乙醇经血液循环进入人体的大脑内，作用于中枢神经系统，从而产生醉酒( 张维嘉，2 0 0 1 ) 。人在短时间大量饮酒，可致急性中毒。轻者可见烦躁多语，恶心呕吐，或失去自制。重者可见昏迷，面色苍白，呼吸缓慢，体温下降，有可能因呼吸衰竭而死亡( 刘健等，2 0 0 0 ) 。长期持续过7量饮酒，引起慢性酒精中毒，会引发多种躯体疾病，其中消化道溃疡最普遍，其次是肝脏疾病，脑血管意外，小脑共济失调和周围神经系统病变。有资料表明食道癌、肝癌发病率的升高似乎也与饮酒有关。可见，过量饮酒，对人体器官有着广泛的刺激性并产生危害性( 沈建根等，2 0 0 4 ；张若明等，2 0 0 1 ) 。另一方面，过量饮酒还会引起一系列的危害社会行为，涉及社会，家庭，治安，交通等方方面面。据统计，在我国交通肇事者中，酒后驾车者占2 0 左右。此外，由于嗜酒导致家庭破裂，酗酒导致破坏公共道德，危害社会秩序乃至犯罪的例子也是不胜枚举( 孙龙川，1 9 9 2 ) 。1 2 2 乙醇在人体的代谢乙醇在人体内由消化道吸收，主要在肝脏代谢，在生理条件下经乙醇脱氢酶( a d h ) 代谢为乙醛，再经肝细胞线粒体内的乙醛脱氢酶( a d l h ) 氧化为乙酸，进入体循环。此外，肝脏中还存在微粒体乙醇氧化酶系( m e o s ) 等代谢系统，存在于肝微粒体内。乙醇大部分经a d h 途径被氧化，但它达到饱和时，由m e o s 发挥更大作用( 戴德银，1 9 9 1 ) 。也有学者认为，低浓度乙醇经a d h 途径被氧化，长期饮酒及高浓度的乙醇则由m e o s 发挥作用( 张若明等，2 0 0 1 ) 。近年来乙醇脱氢酶也在胃肠道中被发现( o n e t ac m ，1 9 9 6 ) ，但是一般认为乙醇的分解代谢主要仍在肝脏。1 2 3 国外解酒防醉方法的研究国外学者对解酒防醉方法有广泛和深入的研究，申请了许多专利。西方国家解酒防醉是随着对乙醇在人体内的分解代谢途径的深入研究和不断了解而改善的，围绕乙醇在人体内降解的a d h ( 乙醇脱氢酶) 途径而设计合成药物配方，比如美国的一项可迅速降低乙醇含量的配方。该配方组成为：酵母乙醇脱氢酶，酵母乙醛脱氢酶，酵母甘油脱氢酶，缓冲剂k 2 h p 0 4 ，谷胱甘肽，n a d + ，二羟丙酮，蛋白酶抑制剂和胃酸抑制剂以及氧源。经口服，各成分进入血液中，不但可以迅速提高血液中的a d h ( 乙醇脱氢酶) 和a l d h ( 乙醛脱氢酶) 的浓度，还可将n a d h 再生为n a d + ，供给乙醇氧化分解之需，从而达到降低血乙醇浓度的目的( u s p a t e n t9 7 0 7 3 8 ，1 9 9 5 ) 。这些合成药物对于急性的乙醇中毒有一定的疗效，而对慢性中毒引起的脏器组织病理改变则收效甚微( 雷雨等，2 0 0 1 ) 。1 2 4 国内解酒防醉方法的研究相对于西方国家开发的解酒药以合成药物为主，而亚洲国家则侧重天然药物的研究开发。我国很多古代医术著作对解酒防醉的天然药物及方剂均有记载，明朝李时珍本草纲目中解酒药约计1 0 7 种，广泛分布于矿物药、动物药、植物药之中，在此书中记录果品具有消酒毒之功效的约3 0 种。如乌梅、梨、山楂、橘皮、橙、柚、金橘、银杏、波罗密、枳木棂、藕、芰实等( 孙卫胜等，1 9 9 8 ) 。在太平圣惠方、世医得效方、普济方、医方类聚、居家必用事类全集等书也有上百种解酒的中药方剂，常用的天然中草药为葛根、葛藤、葛花、绿小豆、枳棋子等等( 张维嘉，2 0 0 1 ) 。通过现代科学的研究证明，古代解酒8方中所用的中草药大部分确实有解酒或辅助解酒作用。对于这方面的报道很多，例如：刘忠民等( 1 9 9 6 ) 对以葛花为主的醒酒保健品“葛花露”进行研究。鼠肝乙醇代谢体外实验中，乙醇+ 葛花露组乙醇的代谢量是单纯乙醇组代谢量的1 3 倍，而且葛花能够影响乙醇在胃肠的吸收，说明葛花可以在乙醇的吸收和代谢两个环节发挥作用。现代解酒药物在总结古代解酒药物功效、性能的基础上已有了长足的发展。随着天然植化分析的不断发展，许多中草药中的有效成份已被分离，把被分离的有效成分制成不同剂型如注射剂等已方便的使用于临床。因此，在利用中草药研制解酒药的过程当中，引入天然植化分析的新思路，以其有效成份制成快捷、方便、价廉又适用于临床的新剂型，必将有广阔的发展前景。1 2 5 葛根解酒功效的研究在我国，中医用葛根解酒毒有四千多年的历史。许多医学著作均有记载，如：祖国医学千金方、药性论等传统医学典籍记载葛根“解酒毒”，“治酒醉不醒”。唐朝食疗本草指出：“葛根蒸之，消酒毒。”( 张会香等，2 0 0 1 )在古代中医理论的基础上。许多学者通过现代科学对葛根的解酒功效进行了深入研究。王庆端等( 1 9 9 8 ) 经实验表明葛根中的总黄酮成分可以提高小鼠对乙醇的耐受量，缩短小鼠大剂量乙醇中毒时翻正反射消失的时间，并缩短睡眠潜伏期，降低血中乙醇含量。张恩户( 1 9 9 5 ) 等通过实验证明用葛根醇提取物5 0 0 m g k g 的剂量，能明显缩短乙醇引起的小鼠睡眠时间。张葵等( 1 9 9 5 ) 用葛根为主料研制的醒酒饮料进行人体平行自身交叉对照实验，证实葛根汁饮料能降低乙醇在血液中的浓度。章文炽等( 1 9 9 4 ) 进行了部分人群饮用试验，受试者酒醉后用葛根1 5 9 溶解于2 0 0 m l 开水中饮用，3 0 m i n 后，症状明显减轻或消失，醒酒时间缩短5 6 7 ，其解酒作用可能与抗胆碱，解痉、增加脑血流量，改善学习记忆有关。i 3 研究内容、目的及意义1 3 1 研究内容对葛根溶剂回流提取工艺进行实验研究，探讨了葛根提取过程中主要影响因素，如原料的粒度( 粉碎度) ，浸提溶剂的种类，浓度和用量( 固液比) ，提取温度，提取时间，提取次数等对葛根总异黄酮及葛根素提取效果的影响。并以单因素实验结果为参考，设计四因素三水平的正交实验。得到葛根提取的优化生产工艺。对超声波辅助提取葛根的方法进行实验研究，考察各主要影响因素对提取效果的影响，并通过三因素三水平的正交实验得到超声波辅助提取葛根的最佳生产工艺。以上二种提取方法均以葛根总异黄酮及葛根素提取率的综合评分来作为优选的指标，所以与单指标的优选工艺相比，所得到的工艺参数结果更全面，更合理。对二种提取方法的提取效果进行比较。对葛根解酒功效进行初步的实验研究，以小白鼠作为试验对象，以小鼠醉酒后的行为学观察( 醉酒和醒酒时间) 及血乙醇浓度为指标，初步探讨葛根防醉解酒的机理，为其应用于解酒保健食品提供理论依据。91 3 2 研究目的及意义我国葛根资源十分丰富，长期以来，葛根只作为提取葛淀粉的原料加以利用，其加工方法也是十分原始的，造成资源的极大浪费。随着医药科学的发展，葛根异黄酮及葛根素的药理功能和临床治疗作用逐渐被人们所认识。合理开发和利用葛根资源已是十分迫切和需要。葛根异黄酮是医药和化工工业的稀缺原料，更是生物医药的重要原料，尤其国内国际市场需求旺盛。并且葛根是速成植物，适于大面积种植，是可以持续发展和利用的植物资源。本实验以葛根总异黄酮和葛根素的提取率及二者的综合评分作为考察提取效果的评定指标，能够更合理的优选出葛根提取的工艺参数；通过对葛根溶剂回流提取与超声波辅助提取的比较，开拓了葛根提取工业化生产新工艺的方向，提供了理论上的依据，对提高葛根资源的利用价值，获得较高的经济效益有重要的意义。近年来我国酗酒和酒精中毒者日益增多，严重影响人们身体健康和家庭、社会的稳定。因此开发有效的解酒药物及保健食品受到各国政府和人民的普遍重视。本实验对葛根解酒功效进行初步的研究，探讨其解酒防醉的机理，旨在为葛根有效成分应用于解酒保健食品提供参考依据。1 02 材料与方法2 1 实验材料与仪器设备2 1 1 实验材料和化学试剂葛根饮片葛根素标准品甲醇无水乙醇( 分析纯)重蒸去离子水血乙醇( a l e ) 定量试剂盒( 内含：a l e 干粉冲液；乙醇浓缩标准液)北京红星二锅头( 5 0 度)其他试剂均为分析纯黑龙江省药材公司中国药品生物制品鉴定所色谱纯( 美国f i s h e r 公司)哈尔滨市化工试剂厂实验室自制缓长春汇力生物技术有限公司市售2 1 2 主要设备及分析仪器f w l 0 0 型高速万能粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司药典检验筛g b 6 0 0 3 8 5 ( 2 ，3 ，4 ，5 号筛) ：浙江上虞市华丰五金仪器有限公司2 号筛：筛孔径0 3 5 m m3 号筛：筛孔径o 3 5 5 m m4 号筛：筛孔径o 2 5 m m5 号筛：筛孔径0 1 8 m m电子分析天平梅斯特托利多仪器上海有限公司电热恒温水浴锅天津市泰斯特仪器有限公司j j 一电动搅拌机常州国华电器有限公司l d 4 2 a 高速离心机北京医用离心机厂紫外可见光分光光度检测仪u 1 8 0 0北京普析通用仪器有限责任公司高效液相色谱仪美国w a t e r s 公司k q 一5 0 0 b 型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司r e 一5 2 型旋转蒸发仪上海博通经贸有限公司s h b 3 循环水多用真空泵郑州杜甫仪器厂g f d 8 0 0 型半自动生化分析仪山东高密彩虹分析仪器有限公司玻璃仪器气流烘干器河南省巩义市杜甫仪器厂玻璃器皿若干2 1 3 试验动物2 1 3 1 试验动物来源k v l 昆明小鼠，购买于长春试验动物中心。2 1 3 2 试验动物体重要求6 - 8 周龄，体重在2 5 3 0 9 ，按随机原则分组。2 1 3 3 试验动物的管理饲养室温度为2 0 c ，湿度为6 0 ，每日自然采光，注意通风良好。用瓶式自动饮水器分笼饲养，每笼1 0 只，自由饮食和饮水。供食方式：自由采食8 2 0 r a m 颗粒饲料。饮水方式采用瓶式自动饮水器，饮用水为凉开水。每天早晚各添加饲料一次。2 2 实验方法2 2 1 葛根原料的预处理取葛根饮片( 市售) 用万能粉碎机粉碎到一定程度，分别过不同筛孔孔径的药典筛待用。2 2 2 葛根总异黄酮含量的测定2 2 2 1 葛根总异黄酮标准工作曲线的绘制称取葛根素标准品( 中国药品生物制品检定所) 5 0 0 r a g 于1 0 m l 小烧