（食品科学专业论文）淀粉清糖液酒精真空发酵技术研究.pdf

西华大学硕士毕业论文 淀粉清糖液酒精真空发酵技术研究 食品科学专业 研究生张驰松指导教师袁永俊 摘要 淀粉糖的制备方法通常包括酸法、酶法、酸酶法或酶酸法等，其中酶法 所制备的淀粉糖纯度最高、杂质含量最少。利用酶法将淀粉原料先制备成淀 粉糖，有利于淀粉原料的综合利用，有利于缩短发酵周期、有利于实现清洁 生产。利用清糖液进行真空发酵，有利于提高酒精发酵强度。 本文对双酶法淀粉清糖液制备技术进行了较为系统的研究，以残留淀粉 量作为考核淀粉水解情况的指标，以可溶性淀粉为底物，对弘淀粉酶的酶学 性质进行了研究，在此基础上，以玉米粉为原料，以d e 值和糊化度为考核 指标，在单因素实验的基础上，通过正交实验，确定了口淀粉酶对玉米粉浆 的液化条件。考虑到液化醪d e 值的高低对糖化的最终出糖有影响，以d e 值 作为考核指标，以不同液化时间所得到的不同d e 值的液化醪为原料，在单 因素实验的基础上，通过正交实验确定了糖化酶对液化醪的糖化条件。采用 真空过滤手段对糖化醪进行过滤，以过滤速率为考核指标，对真空过滤条件 进行了初步探讨，得到了可用于真空发酵的淀粉清糖液。在制备淀粉清糖液 的同时，以发酵残糖和细胞生物量为考核指标，采用合成培养基对酒精的真 空发酵条件进行了较为系统地探讨，初步确定了发酵条件，进一步对淀粉清 糖液的真空发酵条件进行了探讨。 研究结果如下： lq 淀粉酶液化的最佳工艺条件是：原料的粉碎细度1 0 0 目，料水比 = 1 ：2 5 ，液化温度8 5 c ，液化时间6 0 m i n ，液化p h 值5 8 ，酶用量o 5 1 0 0 9 原料。 2 以上述条件下a 淀粉酶对原料液化后的液化醪为糖化原料，糖化酶对 液化醪的最佳糖化工艺条件是：糖化时间2 4 h ，糖化温度6 0 。c ，糖化p h 值 4 6 ，糖化酶用量2 4 0 u g 原料。淀粉最终糖化率为9 8 2 3 。 3 糖化醪真空过滤的合适条件是；以硅藻土为助滤剂，用量为悬浮液的 2 ，过滤真空度为0 0 5 m p a 。 l 西华大学硕士毕业论文 4 清糖液真空发酵的合适条件是：发酵温度3 5 。c ，发酵p h5 0 ，静止发 酵时间6 小时，真空发酵时间2 4 小时，真空度o ，0 8 6 m p a ，初糖浓度2 1 。 发酵结束，残糖浓度低于2 。 关键词双酶法淀粉清糖液真空发酵 2 西华大学硕士毕业论文 c o r ns t a r c hs o u r c el i q u i dg l u c o s ef o rv a c u u m f e r m e n t a t i o n 、 f o o ds c i e n c e c a n d i d a t e z h a n gc h i s o n g a d v i s o ry u a ny o n g d u n a b s t r a c t t h em e t h o d sf o rp r e p a r a t i o nf o rl i q u i dg l u c o s ec o n t a i n sa c i dm e t h o da n d e n z y m em e t h o da n da c i d - e n z y m em e t h o do re n z y n l e - a c i dm e t h o de e t a n dl i q u i d g l u c o s ep r e p a r e dw i t he n z y m em e t h o dh a sg o o dq u a n l i t yw i t hh i g l lp u r i t ya n d l i t t l ei m p u r i t y t h ea l z y m em e t h o d sf o rp r e p a r a t i o nf o rl i q u i dg l u c o s ea r e f a v o r a b l ef o rm u l t i p u r p o s eu s eo fs t a r c hm a t e r i a l ，a n df a v o r a b l ef o rs h o r t e n i n g i n c u b a t i o nt i m e ，a n df a v o r a b l ef o rc l e a n i n gp r o d u c i n g a tl a s ti no r d e rt oi m p r o v e f e r m e n t a t i o ns t r e n g t h ，v a c u u l nf e r m e n t a t i o ni su s e d 1 1 1 i sr e s e a r c hw a sd e s i g n e dt og e tt h eo p i t i m i z a t i o nf o rp r e p r a t i o no fl i q u i d g l u c o s eu s i n g d o u b l e - e n z y m a t i c ”m e t h o d s ，a n dg e tt h eo p i t i m i z t i o nf o rv a c u u m f e r m a n t a t i o nb a s e do nt h el i q u i dg l u c o s e o t h e r w i s e ，t e c h n o l o g c i a tc o n d i t i o n so f s a c e r i f i c a t i o ni sn e e d e dt om a k ei te a s yt of i l t e rt 0s e p a r a t et h el i q u i dg l u c o s ea n d t h ep e r f e c tf i l t e r i n gc o n d i t o ui sn e e d e dt of i n do u t v a c u u mf e r m e n t a t i o nt e c h n i c a l c o n d i t i o ns h o u l db ec o m f i r mt oo p t i m i z et h el i q u i dg l u c o s ev a c u 啪f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n t h er u s u l t so f1 1 - a m y l a s ea c t i v i t ya n dt h er a t eo fg e l a t i n i z a t i o na n dt h e v a l u l eo fd e ( d e x t r o s ee q u i v a l e n c e ) i s a d o p t e d t o g e tt h eo p i t i m i z t i o n o f g e l a t i n i z a t i o n w i t ht h e o r t h o g o n a le x p e r i m e n t , a n d t oa c h i e v e dt h e h j 勘 d e ( d e x t r o s ee q u i v a l e n c e ) a n dl o wv i s c o c i t yo fl i q u i dg l u c o s e t h er a t eo f s a c c r i i f i c a t i o ni sa d o p t e d0g e tt h eo p i t i m i z t i o nf o rm a l t o g e n i ca m y l a s er a t e t i v et o p h ，t e m p e r a t u r e ，e e t b u tt h ea m o u n to fa m y l a s ea n dt i m eo fs a c c r i f a c a t i o nt o i n f l u e n t t h er e s u l to f r a t eo f s a c c r i f f i c u t i o nm u t u a l l y , a n di ti sn e c c e r a r yt oa n a l y s i s t h ec m r c n e ta m o u n to fa m y l a s ea n dt i m eo fs a c c r i f a c a t i o n i ti sr e p o r t e dt h a tt h e t i m eo fg e l a t i n i z a t i o na l s oi n f l u e n c et h er e s u l ta n da m o u n to fa m y l a s ea n dt i m eo f s a c e r i f a c a t i o na n dt i m eo fg e l a t i n i z a t i o ni st h e f a c t o ru s i n gl 3 4o r t h o g o n a l e x p e r i m e n tt og e tt h eh eo p i t i m i z t i o nf o rs a c c r i f i c a t i e n t h ev e l o c i t yo ff i l t r a t i o n , a n da d d i n gc e l a t o mt os y r u pa n dr i s et h ep r e s s u r et oi m p r o v ef i l t e r t i o n ，t h ea m o u u t 3 两华大学硕士毕业论文 o fa n d d i n ge e l a t o ma n dt h eb e s tp r e s s u r ea r ei n v e s t i g a t e d t h er e s i d u a ls u g e ra n d t h ea m o u n to fy e a s tc e l li s a d o p t e d ，a n dv a c u u ml e v e l ，p h ，t e m p e r a t u r ea n d c o n c e n t r a t i o no fs u g e ra r ei n v e s t i g a t e dt og e tt h e o p i t i m i z t i o n f o rv a c u u m f e r n m t a t i o n p a r tc o n v e r t i o n a lf e r m e n t a t i o ni sc o n s i d e r e dt ob eg o o dt ov a c u u m f e r n m e t i o n t h er e s i d u a ls u g e ri s a d o p t e dt oi n v e s tt h et i m eo fc o n v e n t i o n a l f e r m e n t a t i o n ，c o n c e n t r a t i o no fs t a r c hs l u r r ya n df e r m e n t a t i o nt i m et og e tt h e o p i t i m i z t i o nf o rl i q u i dg l u c o s ev a c u u mf e r m e n t a t i o n t h er e s u l to f t h i ss t u a y 嬲f o l l o w s ： 1 弧eo p i t i m i z t i o nf o ra - a m y l a s e ：1 h et e c h n i c a lc o n d i t i o n sf o rg e l a t i n i z a t i o n a sf o l l o w s ：t e m p e r a t u r e ：8 5 4 c ，t i m eo f g e l a t i n i z a t i o n ：6 0 m i n ，t h ea m o u n to f a d d i n g a a m y l a s eo 5 9 1 0 0 9 ，p h 5 8 ，m a t e r i a lt ow a t e r o f s t a r c hl ：2 5 2t h e o p i t i m i z t i o n f o rs a c c r i f i c a t i o n ：t _ l et e c h n i c a lc o n d i t i o n sf o r s a c c r i f i c a t i o na sf o l l o w s ：s a c c r i f i c a t i o nt i m e ：2 4 h ，t e m p e r a t u r e ：6 0 。c ，p h 4 6 ，t h e a m o u n to f a d d i n ga m y l a s e2 4 0 u g ，a n dt h er a t eo f s a c c r i f i c a t i o na r r i v e da t9 8 2 3 3t h eo p i t i m i z t i o nf o rf i l t e r a t i o n ：t h ea m o u n to fa n d d i n gc e l a t o mi s2 a n dt h eb e s tp r e s s u r ei s0 0 5 m p a 4t h eo p i t i m i z t i o nf o rv a c u u mf e r m e n t a t i o n ：t h eo p i t i m i z t i o nf o rv a c u u m f e r m e n t a t i o n ：v a c u u ml e v e lo ，0 8 6 m p a , p h 5 0 t e m p e r a t u r e 3 5 a n dc o n c e n t r a t i o n o fs y r u p2 1 a n dt h eo p i t i m i z t i o nf o rl i q u i dg l u c o s ev a c u u n qf e r m e n t a t i o n ：t h e t i m eo fc o n v e n t i o n a lf e r m e n t a t i o n6 h ，c o n c e n t r a t i o no fs t a r c hs l u r r y2 1 a n d f e r m e n t a t i o nt i m e2 4 h k e y w o r d s ：d o u b l e e 1 1 z y m em e t h o d ，p e l l u c i ds t a r c hs y r u p ，v a c u u m f e r m e n t a t i o n 4 西华大学硕士毕业论文 作者在读期间科研成果简介 张驰松，袁永俊，王健糖化过程中a 一淀粉酶酶解动力学的研究 j 酿酒， 2 0 0 7 ，3 ( 2 ) 3 6 - 3 9 张驰松，袁永俊，王健酒精高强度发酵的研究进展 j 四川食品与发酵， 2 0 0 6 ( 1 1 ) 王健，袁永俊，张驰松纤维素发酵产酒精研究进展 j ，中国酿造，2 0 0 6 ( 6 ) 万国福，车振明，王燕，华婧，张驰松南瓜果胶的提取方法 j 食品研究与开发， 2 0 0 5 ，( 0 4 ) 申明 本人申明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西华大学或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在西华大学读书期间在导师指导下取得的，论文 成果归西华大学所有，特此申明。 誓嘉萎耋霉竺簇芗裹2 荔翩群：袱穸诃月护 西华大学硕士毕业论文 第1 章文献综述 1 酒精发酵的研究历史 我国早在4 0 0 0 多年前，就有酿酒的记载( 战国策记载夏禹公元前2 3 世 纪时夷狄作酒) 。但糖变酒的过程，直到上世纪才搞清楚。1 8 9 7 年，h a n s b u c h n e r 和e d u a r db u c h n e r 弟兄发现【l 】，酵母汁可以把蔗糖变成酒精，证明了 发酵可以在活细胞外进行。1 9 0 5 年a r t h u rh a r d e n 和w i l l i a my o u n g 1 1 把酵母 汁加入葡萄糖中，发现发酵过程中无机磷盐逐渐消失，只有不断的补充无机 磷酸盐才能使发酵速度不降低，因此推断发酵跟无机磷酸将糖磷酸化有关。 后来他们分离出1 ，6 二磷酸果糖，证实了这一观点。他们还发现，将酵母汁 透析或者加热到5 0 后，就会失去发酵能力。当加热失活的酵母汁和透析失 活的酵母汁混合后又恢复了发酵能力。由此证明发酵活性取决于两类物质； 一类是热不稳定性的，不可透析的组分称之为酿酶，一类是热稳定性的，可 透析的组分称之为辅酶，还有金属离子。1 9 4 0 年，酵解的全过程被了解。g u s t a r e m b d e n 和o t t om e y e r h o f f l 】等人发现肌肉中也存在着与发酵十分相似的不需 氧的分解葡萄糖并产生能量的过程，他们称之为酵解过程。 2 酒精发酵的生化机理 酵母菌为异养型微生物，它们能够以糖类物质为能源和碳源，在有氧或 厌氧条件下进行糖的代谢。在有氧条件下，酵母通过呼吸作用，将糖最终代 谢生成二氧化碳和水，同时产生大量a t p ，用于细胞物质的生物合成( s o p 生 产过程) ；在厌氧条件下，酵母通过酵解( e m p ) 作用，将糖降解成分子量比较 小的中间代谢产物，用作氢原子作电子的供体与受体，主要生成酒精和少量 甘油及有机酸等。以葡萄糖作碳源时，酵母酒精发酵的总方程式为： c 6 i - i t z 0 6 + 2 a d p + 2 p i 2 c 2 h s o h + 2 a t p + 2c 0 2 + 2 h 2 0 从上述反应式可以计算出葡萄糖转化为酒精的理论得率系数为o 5 1 l ，相 应二氧化碳的得率系数为0 4 8 9 。在实际生产过程一般在酒精发酵过程伴随一 1 西华大学硕士毕业论文 些副产物的生成，产物酒精的实际收率可以达到理论值的9 0 9 3 ，即实际得 率系数为0 4 6 0 0 4 7 5 3 。 3 酒精在国民经济中的地位 酒精广泛地应用于国民经济的许多部门，在食品工业中，酒精是配制各 类白酒、果酒、葡萄酒、露酒、药酒和生产食用醋酸及食用香精的主要原料 4 】； 在化学工业中，它是许多化工产品不可缺少的基础原料和溶剂，利用酒精可 以制造合成橡胶、聚氯乙烯、聚苯乙烯、乙二醇等氯乙醇、二氯乙烷和乙基 苯等大量化工产品；在油漆和化妆品生产中酒精也是不可缺少的溶剂；此外， 染料生产、国防工业等其他工业部门也需要大量的酒精【扪。 酒精工业与农业也有十分密切的联系。酒精工业从农业获得原料，农业 需要酒精来制备农药，此外，酒精工业的下脚料一酒糟经过适当的处理后是 良好的饲料或肥料。酒精生产是农业原料深度加工和综合利用的一条重要途 径【6 1 。 1 9 7 3 年以后，世界上接连发生了两次石油危机，严重地影响了西方国家 的石油供应。代用燃料的研究得到了广泛地重视。酒精作为一种可能的潜在 能源而身价百倍。在汽油中添加5 - 2 0 无水酒精而成的汽油醇( g a s o h 0 1 ) 应运而 生。另外，酒精还可以作为抗爆剂添加到汽油中，以代替四乙基铅，这样做 可以减轻汽油燃烧废气对空气的污染【7 】。1 9 8 2 年美国有2 6 9 百万升酒精用作 燃料。目前巴西有2 0 0 万辆汽车是用酒精作燃料的【1 1 。 综上所述，酒精是一种重要的发酵产品，广泛应用于医药、化工、食品 等领域。近年来，由于石油等一次性矿质资源的加速消耗以及环境污染的日 益加剧，酒精作为安全、洁净的燃料及汽油添加剂已经倍受关注。随着国民 经济的加速发展，酒精的需求量将呈不断上升的趋势。 4 酒精生产技术的现状及研究动态 我国酒精生产常用的原料为玉米和木薯，在我国成功加入w t o 后的今 2 西华大学硕士毕业论文 天，以玉米为原料生产酒精无疑是解决玉米出路的一条重要路子。无论是玉 米原料还是木薯原料，都属于淀粉质原料，目前我国淀粉质原料酒精的生产 工艺大致包括：( 1 ) 、工艺一：高温连续蒸煮、真空冷却连续糖化、发酵( 间 歇式、半连续式和连续式) 、连续蒸馏( 粗馏、精馏) ；( 2 ) 、工艺二：低温蒸 煮、真空冷却连续糖化、发酵( 间歇式、半连续式) 、连续蒸馏( 租馏、精馏) ； ( 3 ) 、工艺三：生料糖化、间歇发酵、连续蒸馏( 粗馏、精馏) 等。其中工 艺一和工艺二淀粉出酒率相当，应用最为广泛，工艺三由于糖化时间长，染 菌等问题难以有效解决，除了在白酒生产中有所应用外，在酒精生产中还未 得到成功的应用i s 。无论是工艺一还是工艺二，日前均存在如下缺陷：第一、 酒糟量十分大而成为处理难题，尽管研究了多种办法进行酒糟处理，结果并 不理想，给环境造成很大的污染；第二、由于纤维素等原料要占用一定的设 备空间，使得蒸煮、糖化、发酵设备的生产能力降低而蒸馏设备的操作负荷 增加；第三、发酵液中数量巨大的酵母细胞不能得到综合利用；第四、不能 实现原料的资源最大化。 提高发酵强度、缩短发酵周期、降低生产能耗、降低生产成本、实现清 洁生产等都是完善酒精生产工艺的研究方向。围绕这些研究方向，出现了许 多具有苗头的新技术。 4 1 在蒸煮方面 出现了挤压膨化技术，该技术的应用可以节省蒸煮设备，同时淀粉的糊化 率较高，生成的还原糖少，糖的损耗小，糊化时间大幅度缩短，有利于后续 工序的糖化操作，淀粉出酒率较高【2 0 】，另外经挤压膨化的原料，经高温 ( 2 5 0 c ) 、高压( 4 m p a ) 灭菌，使得在糖化发酵过程中染菌的可能性减小。该法 最大的缺陷是膨化机很容易堵塞，严重影响生产的顺利进行，致使该法在应 用推广方面迄今难以有所作为。鉴于工艺二的淀粉糊化率不高或糊化时间较 长、有染菌可能等缺陷，导致了耐高温a 淀粉酶的研制和成功应用。如果生 料糖化能够有效解决糖化时间和染菌问题，将是在节能方面十分有前途的工 艺【2 6 】。 3 西华大学硕士毕业论文 4 2 在糖化方面 在普遍使用黑曲糖化酶的情况下，液曲酒母在桂平糖厂得到了很好的应 用，发酵周期得以缩短，同时还实现了连续2 0 0 天以上连续生产不染菌的发 酵成绩【6 j 。真空冷却连续糖化工艺取代了传统的混合冷却连续糖化工艺，目 前正在研究的糖化型酵母如能取得实质性进展，将有可能在酒精生产中免除 糖化过程，实现快速的边糖化边发酵过程【1 9 】。 4 3 在蒸馏方面 经典的酒精生产工艺中为了能够生产普通级食用酒精，通常采用三塔蒸 馏，能耗约占生产总能耗的6 0 ，能耗很高。为了能够降低能耗，有人将粗 馏塔的酒糟用来预热发酵醪，精馏塔的提馏水用来预热调浆水，使得整个生 产系统的能耗得以大幅度降低。目前利用热泵技术实施的差压蒸馏或多效蒸 馏使得该工序的能耗大大降低【1 1 】。 4 4 发酵方面 菌种的选育取得了长足的进步，目前生产上使用的酵母菌种通常都具有繁 殖速度快、发酵平静、耐酒精能力强等特点，连续发酵在生产上也获得成功。 目前的研究主要集中于如何有效提高发酵强度，以有效降低生产成本 旧。 4 4 1 浓醪发酵 浓醪发酵技术可以在不改变现有的生产设备的基础上有效提高发酵强度。 但浓醪发酵要求生产菌种必须具有耐高酒精浓度和高渗透压能力，以现有的生 产菌种进行浓醪发酵虽有效果，但提升空间有限 2 3 】。李志军 2 3 】等使用安琪耐 高温酿酒高活性干酵母，以玉米为原料生产酒精，通过在发酵过程中添加复合 酶，采用边糖化边发酵工艺，从三角瓶小试，到5 m 3 罐的中试，均取得了一定 效果，残还原糖为0 2 1 ，酒精份达到1 3 6 ( v v ) 。同时证明了在稀醪条件下 适当提高发酵温度可加快酵母的产酒，但在浓醪情况下，提高温度会增加酒精 对酵母的毒性，导致出酒率下降。肖冬光 2 4 1 等以玉米粉为原料，a y 1 5 为发酵 菌种，在浓醪发酵条件下，对添加氮源、糖化工艺和发酵条件进行了研究。结 4 西华大学硕士毕业论文 果表明，在酒精发酵过程中添加适量氮源，可明显提高酵母细胞的数量和发酵 能力，缩短发酵周期1 2h ；优化的糖化工艺为糖化酶用量1 5 0u g 原料，糖化时 间6 0 m i n ；最适的发酵条件为初始p h 值5 0 ，发酵温度3 3 c 。刘代武瞄1 等采用 安琪耐高温酒精活性干酵母，以玉米为原料进行浓醪发酵最适工艺条件的研 究，结果表明，双酶液化法，添加糖化酶1 8 0u g 原料，p h 4 5 5 0 ，酵母接种 量0 1 5 ，适当添加无机盐和营养盐，发酵7 0 h ，最终发酵酒度达到1 4 7 ( v v ) ， 残糖0 9 2 ，残还原糖0 2 ，淀粉利用率8 4 9 的良好效果。吴天祥【2 6 j 等以玉 米为颞料，耐高温耐商酒精度的活性于酵母为发酵剂进行浓醪酒精发酵实验， 对糖化发酵工艺过程中酒精度、总糖、还原糖、酸度以及c 0 2 失重等指标的过 程变化进行了研究，并利用一株嗜酸乳酸杆菌，以酒糟为基质进行酒糟混合料 的乳酸发酵实验，结果表明，玉米原料经酒精浓醪发酵6 0h 后，玉米发酵醪中 酒精体积分数达1 2 8 ，残总糖质量分数为3 4 6 ，残还原糖质量分数为0 1 9 ， 淀粉利用率8 9 8 8 以上。t h o m a s 等研究用一淀粉酶，于9 5 9 7 液化6 0 r a i n ， 用混合型活性干酵母在2 0 c 发酵4 d ，可产酒1 7 1 ( v v ) 以上。高英杰【2 ”等以玉 米为原料，淀粉含量6 2 5 ，用安琪牌耐高温活性干酵母作发酵剂，发酵时间 缩短了1 2h ，为4 8h ，提高设备利用率2 0 ；淀粉出酒率达5 3 6 ，比以前提 高1 7 ，吨酒精节粮9 4 k g ，节水1 2 m 3 。 4 4 2 解除代谢产物抑制 在酒精发酵过程中，研究表明发酵醪中酒精度达到3 ( v v ) 后，酵母的生 长和酵母的活性将受到明显的抑制，致使发酵速度降低，发酵强度降低。采 用合适的手段从发酵液中移出代谢产物酒精将大大提高发酵速度和发酵 强度，这是酒精发酵非常有前途的工艺技术。目前研究的移出代谢产物以解 除代谢产物抑制的手段大致有： ( 1 ) 真空发酵 a r a m a l i n g h a m 和g r c y s e w s k i 率先提出真空发酵。其依据是：在发酵 过程中保持发酵罐内一定的真空度，使发酵罐中的发酵液处于沸腾状态，发 酵过程中生成的酒精被蒸发出来，这样就达到了解除代谢产物抑制的目的。 a r a m a l i n g 舻1 采用一个工作体积为3 l 的发酵罐，并通过分凝器、总 凝器和收集器、真空泵相连组成的发酵系统进行实验，在3 0 c ，0 0 0 4 m p a 5 西华大学硕士毕业论文 下，定期喷入氧气，采用细胞循环提高反应器内细胞的浓度，不断排出发酵 液中积累的挥发性组分以保持酵母细胞的活力，实验结果表明：真空状态并 没有给酵母细胞的发酵活力带来不良影响，真空发酵和常规发酵时，酵母的 最大比生长速率相同，真空发酵酵母的对数期比常规发酵延长2 小时，反应 器内最终细胞浓度接近常压发酵的1 5 倍，糖液浓度比常规发酵高3 倍而发酵 时间仅为常规发酵的1 3 ，设备利用率得到有效提高，废水的排放有效减少。 缺点是能耗较大，设备真空操作负荷大，操作费用高。 g r c y s e w s k i 4 8 1 改进了a r a m a l i n g h a m 的方法，使用合成培养基3 5 、 0 0 0 7 m p a ，通过一个细胞沉降器实现酵母细胞的循环以获得高浓度的细胞。 其研究结果表明： 真空发酵能解除酒精的抑制。当反应器内的酒精浓度由4 6 降到1 o 时，单位酵母细胞产酒精活力由o 5 8 9 酒精值细胞h 增加到0 8 9 酒精g 细胞h 。 能直接快速发酵高浓度糖液，得到1 6 2 0 的酒精，减少了蒸馏的 操作费用和蒸馏废水的排放量。 t k g h o s e m 】采用了外循环真空发酵系统，即发酵采用常压间歇方式，另 加一套闪蒸器以移去酒精。当发酵罐内酒精浓度达到2 2 2 3 9 l 时，开启闪蒸 器，闪蒸器的工作压力为0 0 1 1 m p a ，发酵液则在发酵罐与闪蒸器间循环，酒 精在闪蒸器内被快速蒸出，达到了解除酒精抑制的目的。 清华大学王泽云【4 7 】等设计新的真空发酵系统使得真空细胞循环技术得以 实现。 ( 2 ) 萃取发酵 为了原位解除产物酒精的抑制，人们又提出了萃取发酵，最初的形式就是 将萃取剂直接加入发酵系统中。m m i n i e r t e 4 8 研究指出醇类的碳链为2 1 2 之 内时会抑制细胞的生长，大于此范围，对于细胞无害。并成功利用十二醇作为 萃取剂进行萃取发酵。m a s a t o s h i t 【4 8 】测试了几种萃取剂对于酒精的分配系数和 对细胞的毒性，发现对酒精萃取能力强的溶剂都对细胞生长有抑制。为了降低 萃取溶剂对细胞的毒性，m a s a t o s h i 【4 8 】利用中空纤维膜把溶剂与发酵液隔开， 通过膜的渗透进行萃取，酒精的生产能力达到4 8g m l 。p c h a s t e n t 删s 设计 了新的渗透装置，中间用萃取剂作为液膜隔开，一面通入发酵液进行萃取，另 面通入气体( 或水溶液) 进行反萃取，大大降低萃取剂的用量。 6 西华大学硕士毕业论文 ( 3 ) 气提发酵 利用气提的方法，同样可以解除产物对细胞的抑制。w a l l s 5 5 利用c 0 2 对 发酵液进行气提，使发酵产生的乙醇被c 0 2 带走，减少甚至消除了乙醇对于酵 母的抑制，使细胞活性增强，提高了乙醇发酵产率，另外细胞活性增强又促进 细胞密度增加，提高了乙醇体积产率，促进底物的充分利用。h w a i s h e n l 5 6 首 先从理论上对乙醇气提过程进行了较为详细的研究。沈文豪对气提发酵系统的 多重定态现象进行了探讨，秦庆军采用了载气蒸馏。d o m i n g u e z 【5 s l 设计了带侧 臂的气升循环式发酵罐，提高了气提发酵的效率。t a y l o r i 删为了避免气提发酵 过程中，气体压缩机高能量的消耗，提出循环发酵醪通过气提塔，进行了中试 实验，并对其动力学进行了研究。有人在实验室利用发酵罐与一填料柱藕联， 以蒸汽汽提发酵液中的酒精，可以使进糖浓度高达6 0 0 9 l ，收集5 0 ( v ，v ) 浓度 的酒精【4 ”。 ( 4 ) 吸附剂吸附法 采用对酵母细胞无吸附作用的疏水性硅沸石或大网格树脂为吸附剂，在发 酵罐外进行吸附，岑沛霖等应用活性炭进行了吸附实验研究删。 ( 5 ) 膜分离法 在有合适的分离膜的条件下，乙醇发酵与膜分离耦合也是解除代谢产物 抑制的有效手段。目前实验室主要研究的工艺有三种【5 0 】：渗透汽化细胞 循环发酵、中空纤维膜细胞固定发酵、超滤细胞循环发酵。其中以 渗透汽化法研究最多，该法通过渗透汽化膜选择性地移走代谢产物乙醇 并完全截留酵母细胞使乙醇的产率和浓度有显著的提高，降低了生产成本， 简化了后处理工艺。 4 4 3 固定化细胞发酵 用载体将细胞固定的细胞固定化技术可使细胞浓度增加，不会导致细胞 流失，产物易于从发酵液中分离，固定化细胞可以多次重复使用，从而减少 细胞增殖所消耗的糖份，既节省了细胞增殖培养的时间，又能有效提高发酵 液中的细胞密度，从而提高发酵强度，同时还能提高底物的转化率 6 0 l 。 对于酒精发酵而言，发酵罐中酵母的数量直接影响发酵速度，采用细胞固 定化技术可以有效提高发酵液中的酵母细胞的密度，从而提高发酵速度和发酵 7 西华大学硕士毕业论文 强度。常用的固定化方法有：吸附、包埋、交联等，可用的固定载体多种多样， 如海藻酸钠、琼脂、果胶、p v a 、活性炭、纤维素、中空纤维膜、陶瓷膜等。 还可利用某些酵母自身的絮凝能力，实现无载体固定化发酵【删。 4 5 清洁生产方面 由于现有的酒精生产技术均是连皮带渣的整体原料利用，因而发酵醪蒸 馏后留下大量的酒糟是不可避免的。酒糟的处理一直是各个酒精生产企业非 常头痛的事情，特别是在我国环保意识加强的前提下，酒精生产企业实现清 洁生产势在必行【2 5 】。 为了实现清洁生产的目标和要求，酒精生产企业不得不高成本进行酒糟 的处理，例如目前国内各酒精厂家引进的全蒸发浓缩技术( d d g s ) ，先进行酒 糟液的国液分离，滤液一部分回用酒精生产，另一部分蒸发浓缩后与固形物 混合干燥制得固体颗粒饲料。目前开发的浓醪发酵工艺技术虽然减少了生产 过程废糟液的排放总量，降低酒精精馏操作过程的能耗，但也不能解决根本 闯题【2 “。如果采用清糖液发酵，则完全有可能真正实现清洁生产，实现零摊 放的目标，但遗憾的是这方面却鲜有报道。 5 本谋题的研究内容 综上所述，鉴于国内酒精实际生产所用的淀粉质原料是玉米和薯干的实 际情况，本课题选用玉米作为研究用原料，采用双酶糖化工艺，使淀粉质原 料转化为可发酵的淀粉糖，进而通过过滤制备淀粉清糖液，用清糖液进行酒 精发酵，相应的制糖后的残渣有利于今后进步开发利用。由于采用清糖液 发酵，有利于缩短发酵周期，有利于酵母细胞的回收和综合利用，有利于减 少生产中的用水量，有利于实现清洁生产。在清糖液发酵工艺中，弓l 入真空 发酵工艺，既有利于提高发酵强度，还有利于简化蒸馏工艺。 西华大学硕士毕业论文 第2 章淀粉清糖液的制各 1 材料和方法 1 1 材料和试剂 1 1 1 材料 玉米粉( 淀粉含量为6 3 5 ) q 淀粉酶( 酶活力为4 0 0 0 u g ) 糖化酶( 酶活力为5 2 0 0 0 u g ) 市售 来源于枯草杆菌( b a c s u b t i l i s ) 北京奥博星生物技术有限公司 黑曲霉菌株a s 3 4 3 0 9 ( u v 一1 1 ) 北京奥博星生物技术有限公司 1 1 2 试剂 ( 1 ) 青霉素贮存液 5 0 m g m l ( 溶于水过滤除菌) ，储存于一2 0 2 2 ；工作浓度为5 0i lg m l ( 2 ) 稀碘液 称取l g 碘，4 9 碘化钾，置入研钵中，加入少量的水研磨至碘完全溶解， 用水稀释至1 0 0 m l 。 ( 3 ) 硫代硫酸钠标准溶液 称取2 5 9 硫代硫酸钠，0 2 9 碳酸钠，溶于1 0 0 0 毫升新鲜煮沸并冷却的水 中，贮存于棕色瓶中，放置7 1 0 天后标定。 ( 4 ) p h4 6 乙酸一乙酸钠缓冲溶液 2 m 乙酸溶液与2 m 乙酸钠溶液等体积混合。 ( 5 ) 斐林试剂甲液 称取1 5 克硫酸铜，0 0 5 克亚甲基蓝，用水溶解并稀释到1 0 0 0 毫升。 ( 6 ) 斐林试剂乙液 称取5 0 克酒石酸钾钠，5 4 克氢氧化钠，用水溶解并稀释到1 0 0 0 毫升。 ( 7 0 1 葡萄糖标准溶液 准确称取l 克无水葡萄糖( 预先于1 0 0 - 1 0 5 2 2 烘干) ，用水稀释，加入5 9 西华大学硕士毕业论文 毫升浓盐酸，用水定容到1 0 0 0 m l 。 ( 8 ) 0 5 酚酞指示剂 ( 9 ) 0 1 m o l ln a o h 溶液 称取氢氧化钠4 9 ，稀释到1 0 0 0 m l 。用邻苯二甲酸滴定。 ( 1 0 ) 3 ，5 一二硝基水杨酸 1 2 主要仪器 分样筛( 2 0 、6 0 、1 0 0 目) 删一s 4 数显恒温水浴锅 冷冻离心机( c e n t r i f u g e5 8 1 0 r ) w f j 7 2 0 0 型可见分光光度计 高速万能粉碎机 p h s 一2 5 型酸度计 循环水多用真空泵 架盘药物天平 冰箱 电热恒温培养箱( d 四一9 0 8 2 ) 上虞市道墟化验仪器设备厂 江苏省金坛市医疗仪器厂 德国e p p e n d o r f 公司 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 天津市泰斯特仪器有限公司 成都市方舟科技开发公司 郑州市杜甫仪器厂 北京医用天平厂 青岛海尔股份有限公司 上海齐欣科学仪器有限公司 1 3 方法 1 3 1 分析方法 ( 1 ) 还原糖的测定：斐林试剂法嘲 ( 2 ) a 一淀粉酶的酶活力测定：麦芽糖标准曲线酶活力测定法瞄1 ( 3 ) 淀粉总含量的测定：酸水解法” ( 4 ) 糖化酶的酶活力测定：硫代硫酸钠法”4 1 ( 5 ) 糊化率的测定：碘呈色分析法“1 经糊化后的试样取样后，马上冻存到冰箱冰冻室内，在试样完全冰冻后， 保存备用。 通过对冻干处理的糊化试样使得其糊化状态固定下来。然后将经过冻 干处理的糊化试样( 0 0 4 9 ) 溶解在5 0 m l o 5 m 的k o h 中处理1 5 m i n ，经过处理 1 0 西华大学硕士毕业论文 的溶解液再离心除去不溶性物质。离心后的上清液取i m l 用0 0 1 7 m h c 9 m l 中和，再在处理液中加入0 i m l 的碘一碘化钾溶液，在6 0 0 r i m 下测定其吸光 值( a 。) 另在经过处理后的样品，用0 4 m k o h 处理试样，确保试样中的直链 淀粉完全溶解，处理试样再用0 0 4 5 mh c i 中和。添加0 i m l 碘碘化钾试 剂，6 0 0 r i m 条件下测定吸光值( a 2 ) 糊化度= a , a 2 x1 0 0 1 3 2 实验方法 ( 1 ) 工艺流程 玉米粉调浆a 一淀粉酶液化糖化酶糖化 j 清糖液+ 一糖化醪过滤 ( 2 ) 玉米淀粉糊化条件的探讨 n 淀粉酶酶学性质的探讨 称取一定数量的可溶性淀粉，加入一定数量的水配制成淀粉乳液，通过 单因索实验，探讨温度、p h 值、q 淀粉酶浓度、液化时间、c a c l 2 添加等因 索对淀粉酶活性及对淀粉水解的影响。 玉米淀粉糊化条件的探讨 在a 淀粉酶酶学性质探讨的基础上，称取一定数量的玉米粉，按照实验 设定的条件调制成不同浓度的粉浆，通过单因素实验，探讨温度、p h 值、q 淀粉酶浓度、液化时间、c a c l 2 添加等因素对玉米淀粉糊化的影响，进而通 过正交实验确定玉米淀粉糊化的最佳条件。 ( 3 ) 玉米淀粉糊化醪糖化条件的探讨 以玉米糊化醪为原料，通过单因素实验，探讨糊化度、糖化酶用量、糖 化时间对糖化效果的影响，进而通过正交实验确定玉米糊化醪糖化的最佳条 件。 ( 4 ) 糖化醪过滤条件的探讨 在温度一定的条件下，影响糖化醪过滤的主要因素有过滤压力、滤饼结 构等，通过单因素实验分别探讨过滤压力和滤饼结构对过滤的影响。 1 1 西华大学硕士毕业论文 2 结果与讨论 2 1o 【淀粉酶酶学性质的探讨 试验中采用的a 淀粉酶活力来源于枯草芽孢杆菌系。以后均采用此酶。 酶活均采用麦芽糖标准曲线酶活力( 眦h a s e ) 测定法【6 5 】。 2 1 ，l 湿度对a 淀粉酶活力和对淀粉水解的影响 准确称取2 9 可溶性淀粉，加水溶解并定容至2 0 0 m l ，添加0 2 c a c l 。， 调p h 值6 5 ，酶浓度1 4 l ，置于恒温振荡器中，振荡速率4 0 r m i n ，振荡时 间3 0 r a i n ，当温度从3 0 开始，每隔5 c 进行一次实验，直至升温至7 5 时， n 淀粉酶活力的变化和淀粉水解情况如图1 和图2 所示。 乏 踣 g i 矍 t e m p e r a t u r e ( ) f i g 1t h ee 珏b c to f t e m p e r a t u r e o l lt h er e s i d u a le l l z y l l l ea c t i v i t y 图1 温度淀粉酶在作用可溶性淀粉时对酶活力的影响 f2一。13x3+一， 02 04 06 0 t e m p e r a t u r e ( ) f i g 2t h ee f f e c to f t e m p e r a t u r eo l lt h es o l u b l es t a r c hh y d r o l y s i sp r o c e s s 图2 湿度对可溶性淀粉水解情况的影响 ( 注：淀粉水解情况以残余淀粉量表示) 1 2 加 o 2 o 8 6 4 2 o 8$，话ah2_ip审鲁 西华大学硕士毕业论文 由图1 可以发现，当可溶性淀粉浓度为l o g i 时，随着温度的升高残余 酶活力逐渐降低，当温度从3 0 ( 2