（食品科学专业论文）环境喹诺酮类药物耐药基因的检测方法及其应用.pdf

山东师范大学硕士毕业论文 摘要 抗生素从发现开始，已经被广泛使用于临床、农业生产和畜牧业等。在抗生素被广泛 使用的同时，大量的抗生素被持续不断地排放至环境当中，从而造成一系列的环境问题。 微生物的耐药性作为最为重要的问题之一已经成为环境工作者关注的热点。 本研究以北京温榆河流域水样为研究对象，调查了环境中e c o b ( 大肠杆菌) 对喹诺 酮的耐药情况。其中的工作包括革兰氏阴性菌总d n a 的耐药基因分析，耐喹诺酮e c o l i 的发生率的调查，e c o l i 耐喹诺酮能力的检测，耐药突变位点分析及e c o l i 的致病因子检 测。 在本研究中沿温榆河流域设计了1 2 个采样点，通过p c r 与琼脂糖凝胶电泳结合的方 法，检测了过夜培养后的滤膜上，革兰氏阴性菌总d n a 中对三种抗生素的耐药基因，即 抗磺胺类( s u l ，、s u li i 、s “l i e ) 、四环素类( t e t a 、t e t b 、t e t m ) 、b 内酰胺酶类( t e m ) 基因。结果表明，磺胺类、四环素类、b 内酰胺类类抗生素的耐药基因在温榆河流域被 广泛检出。其中t e t m 在所有采样点都呈阴性，而1 号、6 号、8 号、1 9 号采样点的耐药 基因有部分耐药基因未检出，包括t e t a 或s u l l 2 7 ；但其他采样点5 、1 2 、1 8 、2 0 、2 5 、2 6 号，除t e t m 外全都呈阳性；昆明湖样品位于生活区上游，属于污染较少的区域，耐药菌 检出率明显低于其他地区，但除了t e t m ，s u ，皿其他耐药菌也有检测出来。从各个采样 点耐药基因的检出状况来看，这几种抗生素的耐药基因在温榆河水体中具有一定的发生率 和普遍性，其种类并不沿水体流向而增加或减少，可能受多种环境条件的影响。 同时，本研究还以总d n a 为模板扩增出g y r a 基因中喹诺酮耐药决定区域( q r d r ) ， 其d n a 序列的测序结果用b i o e d i t 软件比对后发现，氨基酸序列只有几个无意突变位点， 并没有发现与文献报道相应的耐药突变。 根据美国临床实验室标准化协会( c l s i ，前称为n c c l s ) ，大肠杆菌抗左氧氟沙星 和加替沙星m i c 达到8u g m l 为耐药，因而我们采用了不含抗生素的平板和含8u g m l 的喹诺酮平板来培养滤膜上的e c o l i ，通过平板计数法得知，沿温榆河流域耐l e v 的e c o l i 发生率在2 3 3 1 3 之间，对g a t 耐药的发生率在0 8 一5 7 8 之间。为了进一步确认 环境中喹诺酮耐药性的发生，我们从各采样点，不同喹诺酮梯度的滤膜上随机筛选了共 1 6 1 株e c o l i 。 e c o l i 对喹诺酮类抗生素的耐药性分析包括耐药能力检测及突变位点分析两个方面。 首先，鉴定_ q z e c o l i 耐药能力，即最低抑菌浓度( m i c ) 的测定。本文采用琼脂稀释法测定 了每株菌对两种喹诺酮的m i c ，结果表明，e c o l i 对第三代喹诺酮l e v 的m i c 显著高于 山不帅范大学坝士毕业论文 对第四代喹诺酮g a t 的m i c ，有两株e c o l i 对l e v 的m i c 甚至高达1 2 8u g m l ，而e c o l i 对g a t 也已经有一定的耐药性，m i c 最高为3 2u g m l 。其次，是对不同耐药水平的e c o l i 的q r d r 突变位点的分析，针对喹诺酮作用的机理，以g y r a 基因和p a r c 基因为目标， 寻找不同突变位点对e c o l i 的耐药能力的贡献。突变位点的分析结果表明，g y r a 基因中 s 8 3 l 突变的发生具有普遍性，并且有很多发生在m i c 非常低的菌株中，而d 8 7 n 突变则 主要发生在l e v 耐药菌株中，推测是e c o l i 耐药的一个关键位点；d 8 7 y 主要发生在对 l e v 的m i c 在1 2 8u g m l 和6 4u g m l 中，表明该位点可能是e c o l i 具有很高的耐药能力 的关键因子。 耐药e c o l i 中的耐药基因及菌株作为一种环境污染，对各种人类及动物的健康都存在 威胁，而e c o l i 的致病性更加剧了这种污染的危害。e c o l i 虽然是动物体内的正常菌群， 但是部分血清型的e c o l i 也会致病，导致如泌尿道、肠道感染、腹泻、败血症等疾病。本 文采用多重p c r - 电泳的方法分析了筛选到的e c o l i 的致病性基因，结果发现1 6 1 株e c o l i 中，3 1 7 的e c o l i 含有至少一种致病因子，并且致病因子与耐药性具有相关性：在含致 病因子的e c o l i 中，耐左氧氟沙星达到8 0 揣，耐加替沙星达到5 2 9 ，很大比例的致病 性e c o l i 具有耐药性。 2 关键词：喹诺酮耐药性总d n a 最低抑菌浓度m i c 大肠杆菌致病因子 山东师范大学硕士毕业论文 a b s t r a c t a n t i b i o t i c sh a v eb e e nw i d e l yu s e di nc l i n i c a l ，a g r i c u l t u r a lp r o d u c t i o na n da n i m a lh u s b a n d r y , e t c s i n c et h e i rd i s c o v e r y w i t h i nt h ee n v i r o n m e n t a lp r o b l e m st h a ta n t i b i o t i c sh a v ei n d u c e d , r e s i s t a n tb a c t e r i ah a sb e c o m ea ni m p o r t a n tt o p i c i nt h i sw o r k , w a t e rs a m p l e so fb e i ji n gw e n y ur i v e rb a s i nw e r es a m p l e dt oi n v e s t i g a t et h e r e s i s t a n c eo fe c o l is t r a i n st oq u i n o l o n e s t h em a i nt a s k sw e r ea sf o l l o w s ：d e t e c t i n gt h e r e s i s t a n c eg e n e st ot e t r a c y c l i n e ，s u l f a n i l a m i d ea n dp - l a c t a m a s e so ft o t a ld n ai ng r a m - n e g a t i v e b a c t e r i ao nt h em e m b r a n e s ，i n v e s t i g a t i n gt h er a t e so fq u i n o l o n e - r e s i s t a n te c o l is t l d l n 5 ，t e s t i n g t h em i n i l n u n li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n s ( m i c s ) o fa l l161e c o l is t r a i n st oq u i n o l o n e s ，a n a l y s i n g t h em u t a t i o np o i n t sa n dv i r u l e n c ef a c t o r s ( v f s ) i ne c o l i a l o n gt h ew e n y u r i v e rb a s i n ，1 2s a m p l i n gp o i n t sw e r ed e s i g n e d b yp c r c o m b i n i n gw i t h a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sm e t h o d , t h er e s i s t a n c eg e n e so ft o t a ld n a i nt h eg r a m - n e g a t i v e b a c t e r i aw h i c hh a db e e no v e r n i g h tc u l t u r e do nt h em e m b r a n e sw e r ed e t e c t e d g e n e sr e s i s t a n c e t ot h r e ea n t i b i o t i c sw e r ed e t e c t e d , w h i c hw e r es u l f o n a m i d e s ( s u li ，s u l1 1 , s u l l y 7 ) ，t e t r a c y c l i n e ( t e t a ，t e t b , t e t m ) a n dp l a c t a m a s e s ( t e m ) r e s i s t a n c eg e n e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，r e s i s t a n c eg e n e st os u l f o n a m i d e s ，t e t r a c y c l i n e s 锄邮- l a c t a m a s e sh a d aw i d ed i s t r i b u t i o na l o n gw e n y ur i v e rb a s i n t h ek u n m i n gl a k es a m p l i n gp o i i l t ，w h i c h l o c a t e do nt h eu p p e rr e a c h e so fo t h e rs a m p l e sa n dw a sv e r yf a ra w a yf r o mt h el i v i n ga r e a , c o n t a i n e da l lt h eo t h e rr e s i s t a n c eg e n e se x c e p tf o rt e t b , s u l f fg e n e s s o m er e s i s t a n c eg e n e s w e r en o ta l lc o n t a i n e di n1 ，6 ，8s a m p l i n gp o i n t sa sw e l l o t h e rs a m p l i n gp o i n t s ，s u c ha s5 ，12 ， 18 ，19 ，2 0 ，2 5a n d2 6 ，h o w e v e r ，h a dp o s i t i v er e s u l t so fa l lt h er e s i s t a n c eg e n e si na d d i t i o nt o t e t m t e t mw a sn o td e t e c t e di na l lp o i n t s f r o mt h ed e t e c t i o no fr e s i s t a n c eg e n e si n a l lt h e s a m p l i n gp o i n t s ，ac o n c l u s i o nc o u l db em a d et h a tt h e s et y p e so fa n t i b i o t i cr e s i s t a n c eg e n e sw e r e u n i v e r s a l l yc o n t a i n e di nt h ew e n y ur i v e rw a t e r t h ed i s t r i b u t i o no f t h er e s i s t a n c eg e n e sd i dn o t m a n i f o l do rr e d u c ea l o n gt h ew a t e rf l o w , i n s t e a di tc a nb ei n f l u e n c e db ym a n yf a c t o r s a tt h es a m et i m e ，q u i n o l o n er e s i s t a n c e d e t e r m i n i n gr e g i o n ( q r d r ) o fg y r ag e n ei ne c o l i w e r ea m p l i f i e di nt h ep c rr e a c t i o nu s i n gt o t a ld n aa st e m p l a t e s ，a n dt h ep c rp r o d u c t i o n s w e r es e q u e n c e da n dw e r ec o m p a r e db yb i o e d i t b u tt h ea m i n oa c i ds e q u e n c e sd e d u c e dh a dn o r e s i s t a n c em u t a t i o np o i n t sc o r r e s p o n d i n gw i t ht h er e s e a r c ha l r e a d yr e p o r t e d a c c o r d i n gt oa m e r i c a ns o c i e t yo fc l i n i c a ll a b o r a t o r ys t a n d a r d si n s t i t u t e ( c l s i ，f o r m e r l y 3 山东师范大学硕士毕业论文 k n o w n 鹊n c c l s ) ，e s c h e r i c h i ac o l iw h o s em i ct ol e v o f l o x a c i n ( l e v ) o rg a t i f l o x a c i n ( g a t ) r e a c h e s8u e d m la r ed e f i n e d 舔r e s i s t a n t s o ，t h em e m b r a n e sc o n t a i n i n ge c o l iw e r ec u l t u r e do n n o n a n t i b i o t i cc o n t a i n i n gp l a t e sa n d8u g m l - q u i n o l o n ec o n t a i n i n gp l a t e ss e p a r a t e l y n u m b e r s o fe c o l is t r a i n sg r o w e do nt h ed i f f e r e n tp l a t e sw e r ec o u n t e dt og e tt h er a t e so fl e v - r e s i s t a n c e e c o l is t r a i n sa n dg a t - r e s i s t a n c ee c o l is t r a i n sa m o n gt h er i v e r t h ei n c i d e n c eo fl e v - r e s i s t a n t e c o l iw a sb e t w e e n2 3 31 3 ，w h i l et h ei n c i d e n c eo fg a t - r e s i s t a n c ee c o l is t r a j l l sw a s b e t w e e no 8 - - 5 7 8 i no r d e rt of u r t h e ra l j f j l l mt h eo c c u r r e n c eo fq u i n o l o n er e s i s t a n c ei nt h e e n v i r o n m e n t ，w es e l e c t e da n dc u l t u r e d16 1e c o l is t r a i n sf r o mm e m b r a n e so fd i f f e r e n ts a m p l i n g p o i n t sc u l t u r e do nd i f f e r e n tg r a d i e n t so fq u i n o l o n e - c o n t a i n i n gp l a t e s r e s i s t a n c ea n a l y s i so f e c o l is t r a i n st oq u i n o l o n e si n c l u d e dt w oa s p e c t s ，r e s i s t a n c ea b i l i t ya n d r e s i s t a n c em e c h a n i s m f i r s to fa l l ，t h er e s i s t a n c ea b i l i t yo fe c o l is t r a i n st oq u i n o l o n e sw e r ed e t e c t e d ，t h a ti s ，t h e m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ( m i c ) t oq u i n o l o n e s t h em i c so fe a c he c o l is t r a i n st ot w o t y p e sq u i n o l o n ea g e n t sw e r ed e t e r m i n e db ya g a rp l a t ed i l u t i o nm e t h o d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t o ft h es a m eb a c t e r i as t r a i n s ，t h em i c st ot h et h i r d - g e n e r a t i o nq u i n o l o n el e v , w a ss i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nt ot h ef o u r t h g e n e r a t i o nq u i n o l o n eg a t t h e r ew e r et w oe c o l is t r a i n sw h o s em i c s o fl e vw e r ee v e n 硒h i 曲嬲12 8u e d m l t h ee c o l is t r a i n sa l s oh a dac e r t a i na b i l i t yo f r e s i s t a n c et og a t , t h eh i g h e s tm l c so fw h i c hw a s3 2u g m l s e c o n d l y , t h em u t a t i o np o i n t si nt h eq r d r so fe c o l iw i t hd i f f e r e n tm i cl e v e l sw e r e a n a l y s e d q r d r so f g r r ag e n ea n dp a r cg e n ew e r ef o c u s e dt os e a r c hf o rt h ee f f e c to f m u t a t i o n p o i n t so nt h er e s i s t a n c ea b i l i t yo fe c o l it oq u i n o l o n e m u t a t i o na n a l y s i ss h o w e dt h a t ，$ 8 3 l m u t a t i o np o i n tp r e s e n t e du n i v e r s a l l y ，a n di tt o o kp l a c ei nb o t hl o wm i cs t r a i n sa n dh i g l lm i c s t r a i n s ，w h i l et h ed 8 7 nm u t a t i o np o i i l ta p p e a r e di nr e s i s t a n c es t r i a n s ，a n dw a sak e ym u t a t i o n p o i n tf o rr e s i s t a n c e ；d 8 7 ym u t a t i o np o i n to c c u r r e dm a i n l yi nt h ee c o l is t r a i n sw i t hm i c so f 12 8u e , m la n d6 4u e d m lt ol e v , s ow es u g g e s t e dd 8 7 ym u t a t i o np o 缸t 0b ea k e ym u t a t i o n p o i n tw h i c he n a b l ee c o l is t r a i n st oh a v eh i g hc a p a c i t yo f r e s i s t a n c e r e s i s t a n c e g e n e si ne c o l ia n dt h e r e s i s t a n tb a c t e r i as t r a i n st h e m s e l v e sa r eak i n do f e n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n , a n dt h ep a t h o g e n i ce c o i ls 1 瞳缸e x a c e r b a t e dt h et h r e a to ft h i s p o l l u t i o n n ee c o l is t r d d n sa r ean o r m a li n t e s t i n a lf l o r ai nh u m a na n do t h e ra n i m a l s ，b u ts o m e s e r o t y p e so fe c o l ic a na l s ol e a dt od i s e a s e s ，s u c h 私t h e 皿血m 巧t r a c ti n f e c t i o n ，g a s t r o - i n t e s t i n a l i n f e c t i o n s ，d i a r r h e a , s e p t i c e m i aa n ds oo n i nt h i sp a p e r , m u l t i p l e p c rm e t h o dw e r eu s e dt o 4 山东师范大学硕士毕业论文 a n a l y s i s6v i r l l l e n c eg e n e si ne c o l i t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，i n1 6 1e c o l is t r a i n s ，ar a t eo f 31 7 s t r a i n sc o n t a i n e da tl e a s to n ev i r u l e n c ef a c t o r , a n dv i r u l e n c ef a c t o r sw e r er e l e v a n tt o a n t i b i o t i cr e s i s t a n c e ：w i t h i na l le c o l is l l d j l 怂c o n t a i n i n gv i r u l e n c ef a c t o r s ，t h er a t eo fr e s i s t a n tt o l e v o f l o x a c i ns t r a i n sr e a c h e d8 0 4 ，a n dt h er a t eo f g a t i f l o x a c i n - r e s i s t a n ts t r a i n sr e a c h e d5 2 9 t h e r ew a sah i g hp r o p o r t i o no fv i r u l e n c ee c o l is l a a j n st h a tw e r er e s i s t a n tt oq u i n o l o n ea g e n t s k e yw o r d s ：q u i n o l o n ea n t i b i o t i cr e s i s t a n c eg e n e s ( a r g s ) t 0 t a ld n am i ce c o l i v n l e n c ef a c t o r s 5 山东师范大学硕士毕业论文 常用缩略语表 6 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声明的，本 栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做 的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：扒、虚 们 导师签字： 学位论文版权使用授权书 矛l 树成 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权堂撞可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：谚k 芝铀、 签字日期：2 0 09 年6 月岁日 翩婵曩；糊 签字日期：2 0 0q 。年f 7 月箩日 i 山东师范大学硕士毕业论文 1 1 抗生素概论 第一章绪论 1 9 2 9 年英国学者弗莱明( f i e m i n g ) 在研究葡萄球菌变异时首先发现了青霉素【l 】，1 9 4 0 年弗洛里( f l o r e y ) 和钱恩( c h a i n ) 成功将青霉素提取出来，并证明青霉素对金黄色葡萄 球菌及其它革兰氏阳性细菌所引起的许多严重疾病都有显著的疗效；链霉素则是由瓦克斯 曼( w a k s m a n ) 于1 9 4 4 年在链霉菌中首次发现，后来成为结核杆菌感染疾病的克星。此 后各种抗生素被陆续发现并大量生产，由此开始了抗生素时代。 由于抗生素可使9 5 以上的由细菌感染引起的疾病得到控制，因此被广泛应用于家 禽、家畜、作物等病害的防治，现已成为治疗传染性疾病的主要药物。正因为如此，在某 些领域抗生素经常被“过于广泛 地使用。2 0 0 3 年全球畅销药4 0 0 强中，抗生素销售占 了1 2 7 ，约有3 2 1 9 4 万美元【2 1 。目前所用的抗生素大多由微生物培养液中提取【l 】，部分 抗生素已能人工合成。这些抗生素在生物体内经过简单的羟基化等过程后作为活性物质被 大量排放到环境当中。由于持续的大量排放，抗生素在环境中不断积累，逐渐成为一种环 境污染。 微生物是环境中存在最广泛、作用最大的生物体，在生态系统的物质循环及能量循环 都有很重要的作用。而当环境抗生素达到一定的浓度水平下后，环境中的微生物群落结构 将会发生相应的改变，最终导致部分功能逐渐丧失甚至完全瘫痪：部分种类可能消失一， 更经常的是相应的耐药性微生物与天然存在的耐药微生物竞争并逐渐成为优势菌群。因而 对微生物的耐药性分析就迫在眉睫，而且非常有意义。 1 1 1 抗生素的定义 抗生素是微生物、植物、动物在其生命过程中产生的一类天然有机化合物，具有能在 低微浓度下选择性地抑制或杀灭他种微生物或肿瘤细胞的能力。抗生素的生产，目前主要 用微生物发酵法进行生物合成，少数抗生素如氯霉素等，亦可用化学会成方法生产。 然而随着抗生素研究工作的深入开展，对抗生素的认识亦逐渐加深。目前抗生素的作 用已超出了抗菌及抗肿瘤的范围，在杀虫、除草等方面有了新的发现。根据抗生素的这些 功用，现代抗生素的定义应为生物在其生命活动过程中产生的，或用化学、生物或生化方 7 山东师范大学硕士毕业论文 法所衍生的，在低微浓度下能选择性地抑制他种生物机能的化学物质。 1 1 2 抗生素分类 抗生素的化学结构决定了其性质、作用、用途及疗效：例如对于水溶性碱性氨基糖苷 类或多肽类抗生素，随着含氨基的增多、碱性的加强，其抗菌谱逐渐移向革兰氏阴性菌； 大环内酯类抗生素对革兰氏阳性、革兰氏阳性球菌和分枝杆菌有活性；多烯大环内酯类抗 生索对真茵有广谱活性，而对细菌一般无活性；四环素类抗生素对革兰氏阴性菌和阳性菌 都有广谱活性，而且抗生素结构上微小的改变常会引起抗菌能力的显著变化。 现在根据习惯的分类方法，将抗生素分为下列五类【3 】： ( 一) p 内酰胺类抗生素这类抗生素都包含一个四元内酰胺环和抗菌活性部分b 一内 酰胺环，包括青霉素类、头孢菌素类、青霉烯类、单环内酰胺类和b 一内酰胺酶抑制剂等。 ( 二) 氨基糖苷类抗生素氨基糖苷类抗生素含有氨基糖苷和氨基环醇结构，适用于下 呼吸道、泌尿道、肠道感染等，对革兰阴性杆菌也有良好的杀灭作用。 ( 三) 大环内酯类抗生素这类抗生素含有一个大环内酯作为配糖体，以苷键和l 3 个 分子的糖相连。其中在医疗上比较重要的有红霉素、竹桃霉素、麦迪加霉素、制霉菌素等。 主要适用于呼吸道、皮肤软组织感染，特别适用于支原体、衣原体、军团菌、幽门螺旋菌 感染，对青霉毒过敏者可选用此类抗生素。 ( 四) 四环类抗生素这类抗生素是以四并苯为母核，包括金霉素、土霉素和四环素等。 由于含四个稠合的环也称为稠环类抗生素，对革兰氏阳性菌、阴性菌、立克次体、滤过性 病毒、螺旋体属乃至原虫类都有很好的抑制作用，是一种广谱抗菌素，被大量使用于畜牧 业和人体中。 ( 五) 喹诺酮类包括环丙沙星、氧氟沙星、加替沙星、诺氟沙星、依诺沙星、培福沙 星等的喹诺酮类抗生素。抗菌谱广、抗菌作用强，其中诺氟沙星主要用于肠道与尿路感染； 依诺沙星和培福沙星可治疗全身感染，包括呼吸道、皮肤软组织、胃肠道、胆道、妇科感 染等。 1 1 3 环境中抗生素物质的来源 素。 8 水中抗生素污染来源主要有生活、医用、畜用、水产养殖业及制药工业废水等的抗生 ( 一) 医用抗生素喹诺酮类抗生素自被发现以来就一直作为对抗感染性疾病的强有 山东师范大学硕士毕业论文 力工具广泛应用于医药业。这些未经代谢的抗生素进入城市和医院污水排放系统之后，少 部分直接渗漏到地下水中造成污染，大部分经污水处理厂处理后排放汇入地表水。由于现 有的污水处理技术很难将抗生素彻底清除，因而即便处理后这部分抗生素也会污染地表 水，继而对地下水造成污染【4 j 。 ( 二) 畜用抗生素用于防治动物感染性疾病和用作促生长剂是抗生素污染的另一重 要来源。据统计，1 9 9 5 年丹麦畜牧业抗感染抗生素和促生长剂的生产量分别为4 9 吨和9 4 吨，它们绝大多数以原形被牲畜排泄物被带进土壤后渗入地下水形成污染5 1 。畜用抗生素 主要有四环素类、青霉素类、大环内酯类( 螺旋霉素和泰乐菌素) 、喹诺酮类( 卡巴多司 和奥喹多司) 、聚醚类( 莫能菌素和盐霉素) 、卑霉素、阿伏帕星、黄霉素、杆菌肽等种类。 ( 三) 水产养殖业形成的抗生素污染在现代水产养殖业中相当数量的抗生素被广泛 应用于防治鱼类疾病和促进鱼类生长。其中大量的抗生素投放到水体中后未被食用就直接 排放到环境中，其余部分被食用后又随排泄物进入水体中，最终都会造成环境抗生素污染。 据估计，水产养殖中使用的抗生素至少有7 5 会进入水体并在底泥中形成蓄积性污染网。 这部分抗生素主要包括磺胺类、氟喹诺酮类、四环素类、氯霉素、甲砜氯霉素、氟甲喹、 氟苯尼考和制霉菌素等。 ( 四) 抗生素工业废水污染抗生素制药主要包括发酵、化学合成、提取和成药四个 阶段，在制药过程所产生的废水当中通常含有多种难降解的生物毒性物质和较高浓度的活 性抗生素，它们对废水生化处理中微生物的生长有很强的抑制作用，加之生产过程中废水 排放的不连续性及浓度波动较大等特点，使抗生素生产废水很难得到有效地处理【7 】从而被 大量排放到环境当中。 ( 五) 生活废水抗生素已经成为人类的一种生活必需品，很多抗生素以原型排入环 境中，而且污水处理系统很难将其完全去耐引，有研究在污水处理厂的出水中检出多种抗 生素，如红霉素、磺胺甲恶唑等【5 1 。 1 1 4 抗生紊的杀菌作用 各种抗生素的结构不同，其作用方式也有所不刚9 1 2 】，总结而言抗生素主要通过以下 方式杀菌： ( 一) 抑制细菌细胞壁的合成：抑制细胞壁的合成会导致细菌细胞破裂死亡，以这种 方式作用的抗菌药物包括青霉素类和头孢菌素类。哺乳动物的细胞由于没有细胞壁，不受 这些药物的影响。 9 山东师范大学硕士毕业论文 ( - - ) 干扰蛋白质的合成：干扰蛋白质的合成从而阻断细胞存活所必需的酶的合成进 而杀死细菌。干扰蛋白质合成的抗生素包括福霉素类、氨基糖苷类、四环素类和氯霉素。 ( 三) 与细胞膜相互作用：一些抗菌素与细胞膜相互作用进而影响膜的渗透性最终杀 死细菌。以这种方式作用的抗生素有多粘菌素和短杆菌素。 ( 四) 抑制核酸的转录和复制：抑制核酸的功能进而阻止细胞分裂和或所需酶的合 成。以这种方式作用的抗生素包括喹诺酮类和二氯基吖啶。 ( 五) 抑制代谢途径：如磺胺类抗生素、叶酸类似物等。 1 2 喹诺酮类抗生素 2 0 世纪7 0 年代，科学家们已经很难从微生物发酵中分离出来新的抗生素，因而化学 家们求助于半合成或衍生的方法得到具有抗生素性质的新型抗生素。然而到了8 0 年代初 期，这种方法也难以合成新的抗生素。直到8 0 年代中叶萘啶酸的出现【l 】，抗生素领域才 开创了全新的喹诺酮时代，得到了进一步地发展。喹诺酮类抗生素的主要结构如图1 1 ， 它是一类广谱抗菌的人工合成类抗生素药物，具有药物动力学特征好，作用机制比较独特， 并高效低毒，微生物难于产生耐药性等优良的特点。 c o o h r 5r 】 图1 1 喹诺酮类主要结构图 f 追1 1 m a i nf l a m eo fq u i n o l o n e s 1 2 1 喹诺酮类物质的发展 从萘啶酸问世以来，已合成了数以千计的喹诺酮类化合物，其发展分为四代：第一代 以萘啶酸为代表，针对革兰氏阴性茵，主要用于治疗尿路感染，抗茵谱窄，口服吸收差， 伴有严重的不良反应，现已淘汰不用；第二代以环丙沙星为代表，与第一代相比，第二代 喹诺酮抗菌谱更广，不仅对革兰氏阴性菌有效，对革兰氏阳性菌也有活性，适用于治疗尿 路、呼吸道和肠道感染，前列腺炎等多种病症；第三代以司帕沙星为代表，氟元素的 l o 山东师范大学砍士毕业论文 引入使其与菌结合力及对菌膜通透性都有所增大，对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有 更好的杀菌效果，特别是对肺炎球菌有很好的活性；目前最新的第四代以西他沙星为代表， 抗菌谱更广且不容易产生耐药性，可谓是超广谱抗感染药物，而且他们对厌氧菌也有很好 的抗菌活性。 现在喹诺酮类，尤其是新生代喹诺酮类抗生素已成为临床治疗中呼吸道、泌尿道等很 多感染型疾病的首选药物，具有良好的发展前景【1 4 1 。加替沙星作为第四代喹诺酮，对肺 炎球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌、肺炎支原体和衣原体均有很强的抗茵活性，其抗菌 能力等于或接近于毛氟沙星( m f l x ) 和杰氟沙星( g m f x ) ，而远高于环丙沙星( c p f x ) 或左 氧氟沙星( l v f x ) ，成为临床上非常有效的杀菌剂【1 5 1 。 喹诺酮类药物使用量很大，在全球市场的消费已经达到每年5 0 亿美元，在抗菌药物 市场中仅次于头孢菌素和青霉素类，与大环内酯类相当【2 】。在当今国际市场上，能占抗生 素市场份额的1 5 左右，并继续以惊人的速度增长。1 9 8 5 年世界喹诺酮类销售额仅1 0 4 亿美元，1 9 8 8 年上升至l o 亿美元，1 9 9 2 年达到2 2 亿美元，1 9 9 6 年升至6 0 亿美元，令 业内人士刮目相看。喹诺酮类药物的迅速发展，改变了抗感染药物的市场结构。1 9 9 2 年 美国抗生素市场销售额为6 0 亿美元，其中喹诺酮类占6 5 亿美元，仅次于b 内酰胺类药 物而居第二位；1 9 9 2 年日本口服抗菌药物市场销售额4 0 0 0 亿日元，其中喹诺酮类销售额 1 4 0 0 亿日元，占3 2 5 ，已经超过b 内酰胺类药物，并至今一直占据抗感染药物的最大 份额。预计在2 0 0 0 年，世界喹诺酮类药物市场占有率可达1 8 ，年平均增长8 1 0 ， 销售额可8 0 亿美元以上【1 6 1 。 在国内市场，喹诺酮类药物与青霉素、大环内酯类药物一起占据了抗感染药物的第二 阵营，据2 0 0 3 年全国十六大城市样本医院用药2 0 0 强统计，抗菌药物金额达3 9 6 1 亿元， 占3 3 8 7 ，其中氟喹诺酮类金额为6 2 1 亿元，占抗感染药物的1 5 6 7 【2 】。 现在已上市的喹诺酮产品有几十个品种，是抗感染药物中开发最活跃的领域之一。随 着药物化学的发展，现在人们可以推测许多侧链可能具有的某种药化性质，因而可以通过 计算机优化结构及选定药物的发展方向，比如研究针对m r s a 、铜绿假单胞菌或结核杆 菌，甚至设计具有抗肿瘤作用的喹诺酮类化合物，其发展趋势将有可能超过b 内酰胺类 药物，成为2 l 世纪的抗感染药物的主要品种。国际上许多大型跨国公司，也正在大力发 展喹诺酮的研究，如p f i z e r 、s q ui b b 、b a y e r 、g l a x o 等，日本更是将喹诺酮药物作为主要 发展方向，投入大量人力物力，以保持其世界第一的地位。 m 衮师范大学硕毕业论文 1 2 2 喹诺酮类抗生素作用机制 喹诺酮类药物在细胞内的作用靶点是两种d n a 拓扑异构酶：d n a 旋转酶和拓扑异 9 0 酶l v t l l , 1 2 。d n a 旋转酶是革兰阴性菌中喹诺酮类药物作用的主要靶点而对于革兰阳 性菌，拓扑异构酶则是大多数喹诺酮类药物的第一抑制靶点。这两种酶都利用双链d n a 通路机制，而且二者与喹诺酮类药物的生化反应也很相似f ” 。 d n a 旋转酶主要是向染色体d n a 引入负的超螺旋，包括将d n a 链穿过断开的另一 条链而解开螺旋【1 ”，这对于细胞生存有重要的作用。而喹诺酮进入细胞后，能与旋转酶 结合，喹诺酮一旋转酶d n a 三元复合体一旦形成，细胞的正常复制过程遭受破坏虽终导 致死亡【1 2 , 1 9 。 a x i so fs y m m e t r y 图1 2g y r a d 3 y r a = 聚体 f i g1 2d i m e t l z e d g y r a - o y r a 位于d n a 门附近的g y r a 螺旋- 4 很可能是喹诺酮类药物与蛋白质的结合的重要位点 图1 2 ) ，也就是与喹诺酮作用相关的位点，该位点附近的氨基酸突变可导致耐药。 1 3 耐药性概述 随着抗生素的大量使用，环境中尤其是抗生素使用量很大的地区，如上述的医院废水、 畜牧业废水、抗生素生产工业废水等，其抗生素含量也随之提高，从而导致一系列的环 境问题，其中耐药微生物的产生便是最为重要的问题之一。 山东师范大学硕士毕业论文 很多对人类和动物致病的微生物，如粪肠球菌、结核分枝杆菌、假单胞杆菌等，能对 1 0 种以上的抗生素耐药，耐药基因主要可以通过遗传、自发突变和水平转移而获得或传 播【2 0 】。这其中畜牧业是耐药基因的主要来源途径之一，在美国7 0 的抗生素都应用在畜 牧业上【2 0 1 ，因而，动物的粪便中带有大量耐药基因1 2 0 , 2 1 】。 1 3 1 微生物耐药机理 由于各种抗生素的结构不同，它们对微生物的作用机理也各不相同，如前所述，包括 抑制蛋白质的合成，核酸的合成，细胞壁的合成三种主要途径，相应地微生物也产生了三 种耐药机制：修改药物的结构，药物外排和改变药物靶位点【1 0 1 。 而对喹诺酮而言，微生物耐喹诺酮类抗生素的机理主要是其靶位点的突变，使喹诺酮 结合不能结合而失则2 2 1 。 1 3 2 微生物耐喹诺酮类抗生素的机理 喹诺酮家族第一个成员萘啶酸应用于临床后，根据早期的试验已知，喹诺酮能