（食品科学专业论文）角蛋白酶生产菌株选育、发酵与分离纯化研究.pdf

浙江大学博士学位论文 摘要 摘要 本文分离到了一株产角蛋白酶的枯草芽孢杆菌，诱变育种得到了具有良好羽毛降解能力和较 高产酶活力的菌株k d - n 2 ；分别以羽毛和人发为底物对k i n 2 的产酶培养基、培养条件、发酵动 力学进行了研究，探讨了以羽毛为底物发酵所得角蛋白酶的分离纯化、酶学性质，研究了角蛋白 的降解过程及机理，最后对角蛋白酶脱毛效果进行了实验。主要研究结果如下： ( 1 ) 从养殖场采集的样品中分离到一株具有羽毛降解能力的菌株，经形态学、生理生化和 分子特征鉴定为枯草芽孢杆菌。通过亚硝基胍诱变得到一株酶活性提高1 5 倍的突变株k d - n 2 ， 该突变株最适生长温度和p h 值分别为2 8 0 c 和6 6 ，其发酵所得粗酶液的最适作用温度为5 0 。c ， p h 值为8 0 。确定了以可溶性角蛋白和天青角蛋白作为底物的酶活性测定方法。 ( 2 ) 比较了羽毛、蚕丝、羊毛、人发等底物诱导产角蛋白酶的效果，发酵2 4 h 时最佳底物 为1 0g l 羽毛。初始p h 值7 5 8 0 ，培养温度2 3 0 c ，接种量为2 - 5 ，种龄1 6 h 时有利于产酶。 正交实验确定了以羽毛为唯一底物时的培养基组成 9 2 丝氮酸蛋白醇 弗氏链霉菌蛋白酶 “3 0 l l2丝氮酸蛋白酶 烟曲霉45 9 0 密旋链霉菌d s m4 0 5 3 0 3 04 0 - 7 57 - 1 08 5丝氨酸蛋白酶 地在芽孢杆菌p w d i 3 3 5 07 57 , 2 5丝氨酸蛋白酶 白色念珠菌40 3 7 4 0 天冬氨酸蛋白酶 海岛闪光杆菌a w - i 2 0 0 ，亚基9 7 1 0 09 0丝氨酸蛋白酶 热带念珠菌 4 23 7 4 59 微孢长囊头孢霉菌 3 0 3 3 5 08 - 91 1 ，8丝氟酸蛋白酶 犬小孢子苗 3 1 5 5 59 0p m s f 抑制 石膏样小孢子菌 1 6 ，3 3 7 9 丝氨酸蛋白酶 短帚霉40-45 4 07 8需还原剂 许兰毛癣菌 3 85 0 5 5 p m s f 抑制 须癣毛癣菌48 9 4 f e 、f c 2 + 增强活性 栖土曲霉 3 9 5 08 0c a z 、甲醛抑制 b a c i l l u s p s e u d o f i r m u s a l - 8 9 2 4 6 0 0 1 1 0 c a 2 + 存在时7 0 c n e s t e r n t o n i a m a l - 2 0 2 37 01 0p h 7 5 1 1 ，5 活性高 黄白链霉菌k l m 1 5 4 0 - 7 06 0 - 9 5p m s f 抑制 短小芽孢杆菌f h 9 5 5 8 , 0 c h r y s e o b a c t e r i u ms pk r 6 5 57 5 纯白高温放线菌 3 0 7 08 6 e d t a 、h 矿抑制 m i c r o b a c t e n u ms p 髟 7 0 p m s f 抑制 坐皮肤球菌p i 3 0柏7 14 6p m s f 抑制 坐皮肤球菌p 2 5 05 0 7 52 7p h 6 5 - 8 5 稳定 t h e r m o v i o l a c e u ss d g 4 05 58p m s f 抑制 须癣毛癣菌e r i n a c e i 变种 3 8 5 05 5e d t a 抻钼 l y ；o b a c t e r n c i m b9 4 9 7 1 4 8 5 0c a 2 + 、b 矿+ 激活 米曲霉a s p e r g i l l u so r y z a e 6 05 08 对还原剂抗性好 i v o c a r d i o t t s i , rs p t o a - 1 1 9 16 01 2 5 i n ，丝氨酸蛋白尊 墨竺! 璺竺! 翌! 竺一 ! ! 一 一 6 浙江大学博士学位论文 第一章文献综述 1 5 角蛋白酶降解角蛋白的机理研究 微生物降解角蛋白的机理至今还未完全阐明，对不同的菌种研究过程中提出了一些假设和验 证性的实验，目前一种观点认为角蛋白酶是必须的。而降解过程又可以分为三个步骤，即变性作 用、水解作用和转氨基作用( 谭盈盈等，2 0 0 1 ) 变性作用指稳定角蛋白的双硫键被破坏后，角蛋白丧失不溶性和抗酶解能力的过程。水解作 用是指只有当角蛋白变性后角蛋白才能水解，完成水解过程的是多肽酶，涂国全在研究链霉菌降 解角蛋白机理过程中即提出肽酶的水解作用( 涂国全等，1 9 9 8 ) 。而转氨基作用是角蛋白( 如羊 毛) 降解为可溶性多肽和氨基酸，经脱氨基作用产生氨，同时伴随着培养液的p h 逐渐升高的现象， k u n e r t 认为该现象是微生物以蛋白质为基质生长的一种典型削减氮源的方法( k u n e r t e t a ，1 9 8 9 ) 在对不同来源微生物降解角蛋白的研究中发现降解过程中生成的产物存在定的差异，因而 降解机理也各不相同，据此提出了几种不同的理论，即物理压力理论、膜电位理论、复合酶理论 和无机变性理论。 物理压力理论认为蛋白最初水解是因为真菌菌丝的压力作用。随着菌丝的生长和延长，底物 受到外来压力而可能有助于肽键切割活性位点的暴露，之后，结合酶解作用对底物进行降解，菌 丝生长和降解是偶联的过程( m a l v i y ae ta ，1 9 9 2 ) 。 膜电位理论i 由b o c k l e 等提出，认为不溶性角蛋白的降解可能由细胞表面的膜结合氧还原体系 完成。或由分泌的可溶性还原成分完成( b o c l d e & m u l l e r , 1 9 9 7 ) 。该理论认为角蛋白的降解可能伴 随着二硫键的还原或角蛋白表面结构的改变，而使蛋白酶得以继续水解角蛋白 复合酶理论是在对弗氏链霉菌研究中提出的，涂国全等通过对弗氏链霉菌s - 2 2 1 产角蛋白酶 的研究认为该菌产一种复合酶，由二硫键还原酶和多肽水解酶构成，前者还原二硫键后伴随着多 肽的后续水解 无机变性理论由k e n 提出。有研究表明培养基中的角蛋白己降解一半时还未检测到酶活性， 说明存在非酶水解过程( m a l v i y a e t 口f ，1 9 9 2 ) 。因而k u n e r t 认为对角蛋白的降解除物理压力以外，微 生物降解角蛋白是其分泌的亚硫酸盐作用的结果，随后蛋白酶进一步降解角蛋白( k u n e r t e t a l ， 1 9 8 9 ) 上述四理论的提出均是针对角蛋白的变性方式，即胱氨酸二硫键如何降解 物理压力理论和无机变性理论多适用于丝状真菌，膜电位理论可以解释需要微生物细胞紧密 接触不溶性角蛋白的系统如何还原二硫键，而复合酶理论来自产生复合酶的弗氏链霉菌，对其他 菌株的适用性还需进一步试验。 另外，在降解机理上，o n i f a d e 归纳为机械分解( m e c h a n i c a lk e r a t i n o l y s i s ) 、硫化分解 ( s u l p h i t o l y s i s ) 和蛋白分解( p r o t e o l y s i s ) 三种方式( o n i f a d e ，1 9 9 8 ) 。在机械分解过程中，菌丝的 机械作用参与了角蛋白的降解，虽然有研究表明机械作用先于酶解，而菌丝本身分泌蛋白酶使得 降解过程可能为菌丝机械作用和酶解作用同时进行或相互促进的过程 硫化分解的提出也是因为羽毛粉等角蛋白中胱氨酸含量较高，微生物利用角蛋白时水解为半 胱氨酸，而具有还原性的亚硫酸盐为微生物产生，该过程同无机变性理论原理一致。反应如下式 所示： 7 浙江大学博士学位论文 第一章文献综述 c y s - s - s c y s + h s 0 3 + c y s - s h + c y s s s 0 3 。 k u n e r t 认为，毛癣菌和非毛癣菌分别代谢游离或结合形式的半胱氨酸作为硫和氮的来源。真 菌利用胱氨酸形成无机硫和其他中间代谢物，过多的硫形成硫酸盐和亚硫酸盐，p h 由中性变为碱 性。这与上述转氨过程导致发酵液p h 上升是否相关还需要探讨。 蛋白分解主要为肽键裂解，不同来源的酶及反应体系离子浓度、p h 、温度等因素的影响使蛋 白酶的分解效果存在差异，另外也存在其他蛋白酶对角蛋白的降解现象，这又增加了阐明酶解机 理的难度。 由以上各点可知，角蛋白的降解机理未完全明确，不同微生物降解方式存在差异。而蛋白质 的变性是关键步骤，伴随着二硫键的断裂、含硫化合物的逐步氧化，角蛋白在蛋白酶作用下逐渐 水解为氨基酸。机理还需进一步探讨。 1 6 角蛋白酶的生物工程研究 生物技术在酶制剂生产中具有重要的作用，已经有多种酶制剂应用于工业生产。角蛋白酶的 相关研究虽然主要集中在菌种分离、酶的纯化和酶学性质等方面，近年关于角蛋白酶的编码基因、 异源表达和发酵优化的研究也日渐增多。 1 6 1角蛋白酶的编码基因和氨基酸序列 角蛋白酶的编码基因的研究包括来自地衣芽孢杆菌p w d - i 基因k e r a ( l i ne t a l ，1 9 9 5 ) ，嗜热厌 氧菌闪光杆菌n s 基因( k l u s k e n se t a 。2 0 0 2 ) ，诺卡氏放线菌t o a 1 的n a p a 基因( m i t s u i k ie t a l ， 2 0 0 4 ) 、真菌发癣菌( t r i c h o p h t o n 叩9 5 ) 角蛋白酶基因k e r b ( 姚斌等。2 0 0 3 ) 、须癣毛癣菌 ( t h c h o p h y t o n m e n t a g r o p h y t e s ) 角蛋白酶编码基因( 赵小冬，2 0 0 4 ) 和来自烟曲霉角蛋白酶基因 ( n o r o n h a e t a 2 0 0 2 ) 等。 在以上各组研究中，以地衣芽孢杆菌p w d - i 的角蛋白酶基因l c e r a 研究最为透彻，该基因由 1 4 5 7 b p 核苷酸组成，编码包括前蛋白原、蛋白原、成熟蛋白、5 非编码区及3 7 非编码区。编码区 1 1 3 7 个核苷酸编码3 7 9 个氨基酸。k e r a 具有2 个潜在的启动子序列( 椰a t - ) ，位于1 2 3 1 2 8 和 1 4 1 1 4 6b p 处。一潜在的核糖体结合位点位于5 7 转录起始点8 个核苷酸处，转录终止密码子t a 位 于3 7 端的2 2 个核苷酸处。最初产生的多肽为前蛋白原，经信号肽酶剪切形成蛋白原，再进一步剪 切成成熟蛋白，由2 7 4 个氨基酸残基组成。该成熟的角蛋白酶具有保守的催化三联体活性位点， p i = i a s p 3 2 、h i s 6 3 和s e r 2 3 0 组成。 k e r b 基因来自真菌发癣菌，全长1 4 3 4 个核苷酸，编码4 7 7 个氨基酸，其n 一端的2 5 个氨基 酸为信号肽，切割位点在+ 2 5 位的g l y 之后，该基因为一新的角蛋白酶基因。 f l s 基因是来自嗜热厌氧菌闪光杆菌编码f e r v i d o l y s i n 的一段d n a 序列，其长度为2 1 0 3b p ，编 码6 9 9 个氨基酸的蛋白，与丝氨酸蛋白酶枯草杆菌蛋白酶家族相似性很高。该基因两侧具有顺式 作用元件如s d 序列和1 3 个核苷酸的反向重复序列。在该基因中未发现明显的启动子区域，但含有 潜在的2 1 个氨基酸的信号肽。信号肽下游为1 2 8 氨基酸的前肽序列，该序列含一保守的疏水残基。 f l s 基因编码成熟蛋白含有的催化三联体为a s p 4 1 、h i s 7 9 和s e r ”，在其序列中含两个半胱氨酸残基， 其中一个因处于信号肽位置而可能不参与二硫键的形成。该基因编码f e r v i d o l y s i n 前体和成熟蛋白 8 浙江大学博士学位论文 第章文献综述 的分子量分别为7 5 和5 8k d a 。 n a p a 基因由1 1 5 2 b p 组成，编码3 8 4 个氨基酸，成熟酶蛋白由蛋白原编码序列在t y r ( - 1 ) 和a l a ( + 1 ) 处断裂产生，由1 8 8 个氨基酸组成，分子量1 9 1k d a 。该基因中潜在的核糖体结合 位点a g - g a g a 位于转录起始位点a 1 g 上游9 个碱基处，终止位点位于转录终止密码子t g a 下 游5 2 个核苷酸处。n a p a 序列具有放线菌的基因特征，g + c 含量7 1 ，使用g 或c 作为第三个 密码子的趋向达9 1 氨基酸序列分析表明其与来自链霉菌的蛋白酶有3 8 5 7 的同源性，而与 来自细菌的角蛋白酶同源性较低，为1 6 1 7 。 部分已研究的角蛋白酶和已知枯草杆菌蛋白酶的序列如表1 2 所示。 1 6 2 角蛋白酶的表达 在角蛋白酶的表达研究中，k e r a 基因研究最多涉及大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母三类表 达系统，并且还通过突变技术获得了一种可产角蛋白酶的无孢子突变体，产酶量可以达到原始菌 株的水平( w a n g e t a l 。2 0 0 5 ) l i n 等将k e r a 基因转入蛋白酶缺陷的b s u b l i l z s 菌株d b l 0 4 中，转化子f d b - 3 、f d b 一1 0 8 和 f d b - 2 9 可以在含羽毛的培养基和l b 培养基分泌角蛋白酶，而原始菌株在l b 培养基中培养无角 蛋白酶活性。转化子f d b 2 9 的角蛋白酶产量是原始菌株的3 5 倍，推测是因在其启动子p k c r 上 结合了营养型启动子p 4 3 而增强k e x a 基因的表达所致( l i n e t a l ，1 9 9 7 ) 。 粱斌等把编码地衣芽孢杆菌l - 2 5 的角蛋白酶基因k e r b ( 与上文k e r b 基因来源不同) 克隆到载 g i = p u b l 8 4 3 质粒上。转化到蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌d b l 0 4 中表达，转化子f d 8 可分泌角蛋 白酶，在含1 0m g m l 卡那霉素的羽毛培养基上生长，并对偶氮角蛋白底物具有酶活性( 粱斌， 2 0 0 3 r ) p o r r e s 等把编码地衣芽孢杆菌p w d - i 角蛋白酶基因( k e r a ) 和前欣的1 2l 击d n a 片段克隆后 转化入巴斯德毕赤酵母x 3 3 中表达。转化子p p i c z a a - k e r a 在甲醇诱导后可产生重组酶，1 4 4 h 后产 量为1 2 4 m g l 。重组的角蛋白酶为糖基化酶，与天然地衣芽孢杆菌角蛋白酶的性质相似( p o r r e s e t 以2 0 0 2 ) d e s c a m p s 等在巴斯德毕赤酵母k m 7 1 h q b 表达重组的角蛋白酶r s u b 3 ，重组酶与天然角蛋白 酶性质一致。分子量为3 1 5 k d a ，n 端氨基酸序列与天然酶均为a l t t q ，产量为1 5 0 m g m l 。该天 然酶被认为黝i c r o s p o r u mc a n i s 的致病因子，并具有用作疫苗的潜力。该研究对于特殊细胞的免 疫反应和制作疫苗具有重要意义( d e s c a m p se ta l ，2 0 0 3 ) n o r o n h a 等纯化了烟曲霉产生的角蛋白酶，将其e d n a 在p i c h i ap a s t o r i s 中进行了表达，重 组菌株具有酪蛋白、偶氮角蛋白和角蛋白的酶解活性。重组酶具有与原始菌株相同的分子量，重 组菌株在7 2 小时培养期间内蛋白酶活性和偶氮角蛋白酶活性持续增加。5 1 0 u 的重组酶可以在2 4 小时内水解1 0 的角蛋白粉( n o r o n h a e t a l ，2 0 0 2 ) 。 为增加角蛋白酶的生产，w a n g 等构造了含染色体中含有多个角蛋白酶编码基因且稳定的地 衣芽孢杆菌( w a n ge t a l ，2 0 0 4 ) 。研究过程中w a n g 等构建了带有k e r a 和p 4 3 启动子+ k e r a 基因 的整合型质粒并转入地衣芽孢杆菌t 3 9 9 d 和枯草芽孢杆菌d b l 0 4 。在t 3 9 9 d 中，多拷贝的k c r a 基因整合入染色体，并通过s o u t h e r nb l o t 测定了其拷贝数当k c r a 基因为3 - 5 个时酶产量较高， 超过5 个使角蛋白酶的分泌减少。而在d b l 0 4 中，k e r a 基因克隆入质粒而非整合入染色体。强 组成型的启动子p 4 3 不仅增加d b l 0 4 菌的角蛋白酶产量，也提高t 3 9 9 d 菌株的角蛋白酶产量。 9 表1 2 一些角蛋白酶来源和发酵条件( g u p t a & r a m n a n i , 2 0 0 5 ) f e r v i d o b o c t e r i u m p e n n a v o r 刚 l j c 眺r o s f a l b p 3 8 i n p l m 拍 b a c i l l u j a 目嘟 b a c i l l u s 印，f k2 8 t h e r m c c m a e r o b a c t e r k e r a t i n o p h i l s p n o v b n c i l l u af i c h c n i f o r m i s k 5 0 8 x a n t h o m o n a am a l t o p h i l a p o a - i f e r v i d o b a c t e r i u m 热泉 6 3 7 0静置4 8 h 羽毛 土壤 7 5 4 0 7 5 家禽废物 土壤 5 - 9 “ 7 7 5 g e b t h e r m a l6 8 熟泉 腐烂羽毛 7 4 0 4 0 3 0 3 71 5 0 7 0静置 4 51 8 0 家禽废物 7 3 02 0 0 9 6 h 3 6 h羽毛 5 5 7 2 h i o d 内 7 0 4 d 8 4 h 7 2 h 6 0 h 3d 9 6 h 羽毛 羽毛 ( 粉) 羽毛 羊毛 羽毛 7 2 h羽毛 g 曲n l i 埘 7 7 0静置48h 羽毛 热泉48h b a c i l l u 艰f k 4 6 b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sr g i m i c r o b a c t e r i u m a r b o r e s c e n jk r l 0 b a c i l l u sl i c h e n i f r o m i s b a c i l l u s s u b t i l i s a t c c 6 6 3 3 b a c i l l u ss u b t i l i ss 1 4 工业废物 s 土壤 堆肥 9 工业家禽废 7 物 土壤 7 牛毛，皮肤废7 5 2 5 3 0 3 7 3 7 1 3 0 1 8 0 2 5 0 2 5 0 3 01 8 0 2 5 d 4 8 - 6 0 h 4 d 4 8 h 7 2 h 5 d ，d 8 5 7 2 h 2 4 h 3 6 h 7 2 h 角粉 羽毛 羽毛 羽毛 羽毛 羽毛 羽毛 牛毛 当将构建的菌株培养于大豆或羽毛培养基中时，角蛋白酶的活性稳定且提高约4 6 倍 浙江大学博士学位论文第一章文献综述 最近，w a n g 等使用重叠延伸p c r 法( g e n e s o e i n g ) 构建了缺陷的s p o 肋c 基因，该基因编码 芽孢形成必须的s i g m a 因子，当切除地衣芽孢杆菌染色体中了2 5 6 b p 序列时形成了无芽孢突变体 w b g ，该突变体具有原始菌株相当的角蛋白酶活性( w a n g e t a l 2 0 0 5 ) 。 1 6 3 角蛋白酶的发酵研究 1 ) 角蛋白酶发酵条件的研究 产生角蛋白酶的微生物主要包括细菌、真菌和放线菌类，在利用角蛋白底物发酵生产角蛋白 酶的过程中，发酵条件对结果有着一定的影响，主要表现在发酵培养基的起始p h 值和培养温度， 对多数的微生物而言，发酵的起始州多为6 到9 之间，在发酵过程中随着羽毛等角蛋白类物质的降 解，培养基基质p h 会逐渐生高，碱性环境在多数情况下对产生角蛋白酶是有利的；而发酵温度一 般控制在2 8 到5 0 0 c 之间，少数嗜热微生物发酵温度控制在7 0 0 c 左右。如t h e r m o a n a e r o b a c t e r 和 f e r v i d o b a c t e r i u ms p 等。 在角蛋白酶的培养方式上，多数细菌类微生物为液体深层发酵，少数嗜热的细菌( f r i e d r i c h & a n t r a n i k i a n , 1 9 9 6 ；r i s s i n & a n t t a n i k i a a , 2 0 0 1 ；n a x ae t a , ，2 0 0 2 ) 和真菌( s i n g he t a l ，1 9 9 9 ) 采用 静置培养的方式，固体发酵技术也在近期用于链霉菌s t r e p t o m y c e ss p 5 9 4 产蛋白酶和角蛋白酶的 研究中( d e a z e r e d o e t a l ，2 0 0 6 ) 。液体静置培养和固体发酵培养的菌株多数对于天然类的角蛋白 质如羽毛等具有直接的利用和降解能力，液体深层发酵方法和静置培养需要高温灭菌后接入菌体 进行培养。以上各培养方法为好氧培养方法，另外也有厌氧发酵产角蛋白酶和发酵产氨基酸的报 道( w i l l i a m se t c d 1 9 9 0 ) 2 ) 角蛋白酶发酵培养基组成的优化 角蛋白酶基本上为诱导酶，在角蛋白类底物为难一碳和氮源时可以由多种微生物产生。其中 可以诱导微生物产酶的底物包括羽毛、羽毛粉、羊毛、角、毛发等，如表1 3 所示。其他碳源和氮 源类物资对角蛋白酶的发酵具有一定的影响。在多数蛋白酶的发酵研究中，葡萄糖对蛋白酶类的 生产具有代谢抑制作用。同样，对角蛋白酶的合成也有同样的作用( s a n t o s e t 以，1 9 9 6 ；i g n a t o v a e t a l ，1 9 9 9 ；m o h a m e d i n , 1 9 9 9 ；s i n g h1 9 9 9 ；w a n g & s h i h1 9 9 9 ；g e s s e s s ee ta 。2 0 0 3 ；t h y se ta 1 。2 0 0 4 ) 在角蛋白酶的发酵培养基优化研究中。数学统计方法如p b 试验结合响应面分析方法对培养 基和培养条件的优化也有报道，使酶活性在一定程度上有所提高。a n b u 等以b o x b e h n k e n 实验 设计对s c o p u l a r i o p s i sb r e v i c a u l i s 产角蛋白酶培养基及条件进行了优化，得到适合产酶培养基组 成、温度和p h 等参数( a n b u 甜a l ，2 0 0 5 ) 。 r a n m a n i 等使用p b 实验设计筛选了8 个影响地衣芽孢杆菌r g l 产角蛋白酶的因素，并通过 中心组合实验得到了产酶的最佳培养基组成、培养时间和培养温度，结果该菌产酶活性提高了3 5 倍( r a n m a n ie t a ，2 0 0 4 ) 。 在角蛋白酶的发酵研究中，w a n g 等对原始地衣芽孢杆菌p w d - i 和重组枯草芽孢杆菌f d b 2 9 的最佳发酵过程进行了研究( w a n g 甜a l 。1 9 9 9 ) 。两者角蛋白酶均可由蛋白物质诱导，而被糖类 物质抑制。发酵过程中6 - 1 0 小时的种龄对于p w d - i 后续发酵产酶很关键，而f d b - 2 9 对种龄不 敏感。培养过程中发酵液p h 由7 0 上升到8 5 p w d - l 生长最适温度为5 0 。c ，两菌株产酶最适温 度均为3 7 0 c ，最佳溶氧水平对两者分别为1 0 f f l 2 0 。当在5 0 * c 培养p w i ) ! 菌体8 小时后， 转移到3 7 。c 发酵使酶产量提高了1 0 倍。在发酵条件分别优化后，p w d - l 比f d b - 2 9 菌株的终产 酶水平高4 0 。因而重组酶活性还有待提高。 塑堑盔竺堡主兰垡堡塞笙二童兰墼堡堕 由以上研究可知，基因工程技术构建菌株及合理的发酵条件在提高角蛋白酶活性和产量中具 有重要作用，并将迸一步发挥潜力。 1 6 4 角蛋白酶的固定化 固定化技术具有提高酶的稳定性，拓宽酶的利用范围且利于回收等优点，因而研究较多。在 对地衣芽孢杆菌p w d - i 所产的角蛋白酶的研究中发现该酶具有自身水解特性，为保持其活性， l i n 等曾把角蛋白酶固定在玻璃珠上。固定的角蛋白酶在保持蛋白水解活性的同时其稳定性和耐 酸能力均有提高，在5 0 1 2 持续7 天的反应中仍保留原有酶活性的4 0 。但是该方法因为成本高而 不适合规模化应用( l i ne ta 1 ，1 9 9 6 ) 。w a n g 等在枯草杆菌和大肠杆菌两类表达系统中通过融合表 达角蛋白酶链霉素抗生素蛋白而对角蛋白进行了固定化研究( w a n ge t a l , 2 0 0 2 ) ，在枯草芽孢杆 菌表达系统中，融合蛋白分泌至胞外而于培养基中固定化；大肠杆菌表达系统因形成胞内包涵体 而需要额外的分离和再生过程。两种表达系统产生的融合蛋白均可在生物素化的基质上一步提纯 和固定化，纯化效率为2 4 - 2 8 ，酶的稳定性增强。 1 7 角蛋白酶的应用研究 角蛋白酶( k e r a t i n a s e ) 为一种可以特异性降解角蛋白的酶类，由真菌、放线菌和细菌等多种 微生物产生。角蛋白酶在食品、医药、饲料、精化和制革等工业中广泛应用，具有嫩化肉类、生 产高级营养品、免疫制剂和饲料添加剂以及美容、软化皮革等作用，并可导致疯牛病和人类克雅 氏症的p r i o n 蛋白( p r p 8 构象) 的降解，更使其成为研究热点，应用和研究价值巨大，具体包括 以下主要方面。 1 7 1 饲料 在饲科方面的应用主要是羽毛类角蛋白。羽毛含有超过9 0 的蛋白质，囡二硫键等存在而不 易在自然界降解。另一方面每年世界范围内几百万吨的废弃羽毛可导致环境的危害，蛋白质资源 也存在浪费问题。特别是我国蛋白资源不足，加工利用更有实际意义。 近年的高温高压加工羽毛为饲料存在一些必需氨基酸破坏，产品消化率低，高耗能和产品质 量不稳定等因素( w a n g & p a r s o n s ，1 9 9 7 ) ，采用微生物即其角蛋白酶降解羽毛可以避免上述问题 ( o n i f a d e e t a l ，1 9 9 8 ) 基于地衣芽孢杆菌p w d - i 的研究，s h i h 等开发了可以作为饲料用的羽毛 降解物，含有部分降解的羽毛、水解后的蛋白质、肽类物质和已杀灭的菌体，该降解物可以作为 饲料添加剂用于鸡饲料中，具有代替豆饼粉而作为廉价蛋白饲料的价值( s h i h e t a l ，1 9 9 0 ；w i l l i a m s 甜a 1 1 9 9 1 ) ；另外向羽毛粉里添加粗酶可以改变角蛋白的结构，提高家禽和消化率( l e e e t a l ， 1 9 9 1 ) g - r a n z z i o t i n 等以h b r i os p 菌株k r 2 及其培养上清液分别处理6 0 9 和l o g 羽毛以获得羽毛降解物， 前者体外消化率相对豆粕较低，高于羽毛粉和天然羽毛，后者具有酪素和豆粕相当的体外消化率； 通过对蛋白效率比( p r o t e i ne f f i c i e n c yr a t i o ) 和蛋白生物价的估计，证明了两种羽毛降解产物的工 业饲用价值( g r a z z i o t i n e t a l ，2 0 0 5 ) 。 角蛋白酶在饲料工业的应用一方面可以作为粗酶加入羽毛粉中，另外可以通过发酵后含有菌 体、羽毛和可溶性的蛋白、肽和氨基酸的混合产物用作饲料。另一方面，有些菌体具有很好的羽 毛降解能力，但可能因是致病菌而使其应用受到限制，可以功过基因克隆的方法将优良的蛋白酶 基因克隆并异源表达以获得可工业饲用的角蛋白酶，生物工程技术和手段可以发挥较大的作用。 1 2 塑婆盔兰竖圭堂鱼丝奎塑二童塞熊堡蕉 v e r s a z y m e ”作为角蛋白酶的商标已实现了商品化。 1 7 2 肥料 用于肥料的角质蛋白也主要为羽毛类角蛋白，羽毛中含有1 5 的氮源，廉价易得，用于有机 农业的缓释氮源( h a d a s & k a u t s k y , 1 9 9 4 ) ，在有机农业中使用一方面可以促进植物生长，同时改 善和丰富土壤中的微生物种类和数量。 1 7 3 洗涤剂行业 碱性蛋白酶广泛的应用于洗涤剂行业，随着对产品需求，角蛋白酶因某些特殊的性质在该行 业也有一定的应用。该类酶可以特异降解角蛋白类物质，部分酶可耐受去污剂，同时存在一些极 端环境微生物具有产角蛋白酶的能力。该类酶在高低温下均具有较高的活性，另外，产酶底物廉 价。角蛋白酶类在洗涤剂行业的应用还需深入。 1 7 4 皮革行业 皮革加工中会用到如硫化钠，石灰等化学物质进行脱毛，该过程对环境污染较大，同时会产 生很多的固体废弃物等，增加生物需氧量、化学需氧量等。酶法脱毛代替传统的脱毛方法可以一 定程度上避免上述问题，有报道采用蛋白酶、脂酶和糖化酶的混合酶脱毛具有很好的效果 ( d a y a n a d a ne t a l ，2 0 0 3 ；s a r a v a n a b h a v a ne t a l ，2 0 0 4 ；t h a n i k a i v e l a ne t 以，2 0 0 4 ) 。最近研发了一些 角蛋白酶可以应用于皮革工业，该类酶具有比较广泛的底物降解能力，对胶原蛋白类蛋白无活性， 因而可以应用于皮革类物质的脱毛，在脱毛过程中，角蛋白酶可以选择性的降解毛囊等中的角质蛋 白，脱除毛发而不破坏皮革的弹性，该研究中枯草芽孢杆菌s 1 4 角蛋白酶的使用具有良好脱毛效 果而不需使用亚硫酸钠( m a c e d o e t a l 。2 0 0 5 ) 。 1 7 5 医疗行业 角质层的主要成分为角蛋白和胶原蛋白等，结构稳定，不易降解。随着皮肤疾病的研究，人 们逐渐发现部分真菌类物质产生的角蛋白酶具有渗透皮肤的作用，因而在外用药物中添加角蛋白 酶可以促进药物吸收，提高疗效。有研究发现角蛋白酶能改善皮肤外用药物在硬蛋白中的通透性 达到治疗皮肤病如甲癣的目的。对角蛋白酶的研究，对揭开皮肤真菌感染的分子机制有重要作用， 同时该类酶在伤口去痴、上皮再生和祛除皮肤多余角质及在化妆品深层护理等方面都有一定价值 ( n i c k e r s o r i 1 9 6 3 ) p r i o n 蛋白具有不少于两种的构象p r p c 和p r i ，s c ，性质各异，后者可导致疯牛病和人类克雅氏症， 其结构和羽毛角蛋白类似，均含有b - 片层结构，因而可能用角蛋白酶来降解p r i o n 蛋白。l a n g e v e v e l d 等以得了疯牛病和瘙痒病的动物脑干组织匀浆为材料，试验了地衣芽孢杆菌p w d - 1 所产的角蛋白 酶降解p r i o r i 蛋白( p e p s 。) 的条件，结果表明在有去垢剂存在、经1 0 0 c 以上加热预处理的条件下， 角蛋白酶可使p e p s c 分解，并认为有可能将此法开发成为医用和实验室器具的消毒方法 ( l a n g e v e v e l de la l ，2 0 0 3 ) 1 7 6 其它应用 角蛋白酶的其他可利用方面如食品行业用于肉类嫩化，蚕丝脱胶生产保健食品等；美容产品 中用于脱毛，促进上皮再生等方面( 吴小伦等。2 0 0 0 。另外角蛋白酶用于家禽废料的酶解可生产 可燃料气体( b r u t t l c h i d a , 1 9 9 9 ) ，用于丝和羊毛的纤维改造( r i s s e n a n u l m i k i a n , 2 0 0 1 ) 等 方面。 1 3 浙江大学博士学位论文 第一章文献综述 1 8 展望 生物技术在酶制剂工业发展中具有重要的作用，很多商业化生产的酶制剂均为基因工程菌株 所产。通过菌种选育和发酵生产可以得到具有高产酶活性的菌株及产品，已经报道的角蛋白酶表 达菌株活性相对天然菌株并未完全具有明显的优势，在基因改造和载体选择方面还需进一步研 究，以提高角蛋白酶的产量和活性。 羽毛作为禽类等所产废弃物，合理利用具有重要意义。发酵产酶可以用于皮革、化妆品等工 业，发酵产物亦可以作为饲料添加剂或饲料代用品，其营养价值水平也可以进一步提高，生物工 程技术在获得高活力酶产品和发酵产物方面具有一定的潜力，并可以从以下角度开展相关的工 作： 1 8 1 羽毛的降解 结合物理、化学和微生物处理的方法使羽毛降解尽可能完全。多数微生物特别是细菌在利用 羽毛时需要高温蒸煮过程，或者需要以碱类物质处理，破坏天然羽毛结构，但物理方法的能耗和 化学方法的污染问题需要尽量减少，结合生物方法并找到合适的切入点还需研究，并可能阐明角 蛋白的降解机理。 羽毛降解可得到氨基酸类物质，天然羽毛粉中部分氨基酸如蛋氨酸和赖氨酸含量比较少，在 以羽毛降解物作饲用产品时，可能存在氨基酸不平衡等问题，可以通过筛选具有分泌此类氨基酸 的微生物，其在降解羽毛过程中使氨基酸得以平衡。 1 8 2 角蛋白酶的获得 粗制酶和纯化的角蛋白酶可以应用于其他工业。要获得高酶活性和产量的角蛋白酶可以通过 发酵工程的手段达到。而前提是安全、高产量的微生物菌株，这可以通过原始菌株、诱变、基因 工程的手段获得，对于高角蛋白酶活性的致病性微生物采用外源表达技术更加具有意义。发酵条 件的优化、角蛋白酶的纯化和后期辅助因子、保护剂的添加将更有益于角蛋白酶的应用 1 8 3 角蛋白酶生产及其应用途径展望 角蛋白酶为诱导酶，羽毛等底物的降解和角蛋白酶的生产为一同步过程，酶活性的高低对其 实际应用有重要影响，可以从以下方法得到高活性的角蛋白酶并拓宽其应用。 筛选高产酶活性的微生物菌株。目前部分微生物降解羽毛尚需一定的前处理，筛选能够快速、 直接利用天然羽毛的微生物菌株更具应用性，对现存菌株进行诱变筛选提高其酶活性也是有效的 方法。 基因工程手段表达具有应用潜力的角蛋白酶基因。部分产角蛋白酶的真菌酶活性较高，因具 有致病性而不宜直接用于发酵生产，可通过基因工程手段表达该类基因以规模化生产角蛋白酶。 酶工程方法获得适合工业应用酶学性质的角蛋白酶。部分角蛋白酶的酶学性质不适于工业应 用，为提高酶的热、酸碱稳定性，拓宽其应用范围，可以通过基因改造等手段改变酶的性质。另 外固定化技术也具有一定的应用价值； 发酵工程手段优化培养基组成和发酵条件以提高酶活性。通过培养基和培养条件的优化可得 到最大降解率的发酵产物，另外调节发酵时间可以控制降解肽段的组成并得到纯化的角蛋白酶； 结合其他微生物共发酵方法弥补发酵产物的不足。羽毛降解产物可用于饲料工业，如同其他 糖质原料如纤维素、淀粉质材料等农业下脚料并用于饲料生产，有望获得高蛋白和碳水化合物的 1 4 塑婆盔兰堡主堂垡堡奎 箜= 童塞鲢堡垄 饲用产品，该过程可以通过共发酵等方法实现； 研究角蛋白酶理化性质并拓宽其应用途径。角蛋白酶具有易降解等问题，通过对其理化性质 的研究并添加辅助因子和保护剂等方法可以延长其使用寿命，另外通过对角蛋白酶的纯化可用作 抗原，研究皮肤类真菌的致病机理，从而治疗相关疾病。 1 8 4 总结 目前角蛋白酶的研究主要集中在菌种筛选、酶学性质等方面，基因工程手段研究正日渐开展， 大规模生产应用未见报道。已经报道的角蛋白酶表达菌株活性相对天然菌株并未完全具有明显的 优势，因而在菌种筛选、基因改造和载体选择方面还需进一步研究，以提高角蛋白酶的产量和活 性，更好的应用于工业生产 1 9 选题依据及主要研究内容 1 9 1 选题依据 我国畜禽饲养与加工业发达，每年产生大量富含角蛋白类物质羽毛，同时我国饲用蛋白质资 源不足，如能对羽毛等角蛋白类物质加以利用，既可以避免环境污染又可以补充饲用蛋白资源的 不足。传统高压降解和酸碱水解过程会导致一定氨基酸的破坏，利用微生物进行降解的方法可以 弥补该不足。以羽毛等角蛋白质为底物发酵可得角蛋白酶，该酶可应用在家禽饲养、制革等方面， 因而利用废弃物进行角蛋白酶的生产并探讨其应用途径具有重要意义。 1 9 2 主要研究内容 筛选具有降解羽毛效果的微生物，用物理或化学方法对获得的菌株进行诱变育种以提高菌种 降解角蛋白的效果和产角蛋白酶的能力，研究该菌种降解利用角蛋白发酵生产角蛋白酶的工艺条 件和产酶过程并获得足量角蛋白酶。通过对所产角蛋白酶的纯化研究角蛋白酶的酶学性质、体外 降解羽毛的能力及对角蛋白类底物的降解机理，最后对产角蛋白酶的应用途径和能力进行探讨。 1 9 3 研究技术路线 菌种筛选与鉴定 i 菌株产酶能力提高 羽毛为底物发酵培养基与条件优化人发为底物发酵培养基与条件优化 j 发酵动力学研究 酶的分离纯化和酶学性质研究角蛋白降解与酶的应用研究 浙江大学博士学位论文第二章产角蛋白酶菌种的选育、鉴定和酶活性测定方法的确立 第二章产角蛋白酶菌种的选育、鉴定和酶活性测定方法的确立 0 引言 产角蛋白酶的微生物来源广泛，有真菌( e i - n a g h y 甜a ，1 9 9 8 ；g r a d i a re la 1 ，2 0 0 0 ) ，细菌 ( w i l l i a m se la ，1 9 9 0 ；r i f f e lda ，2 0 0 3 ；m a n c z i n g e re ta l 。2 0 0 3 ；e l - r e f a ie t 以，2 0 0 5 ) 和放线菌 ( i g n a t o v a 甜a l 1 9 9 9 ；g u s h t e r o v a 甜a ，2 0 0 5 ) 等多种，研究报道的产酶菌株大多来自自然界和一 些菌种保藏中心，取样场所主要为家禽养殖场，动物皮毛和一些极端环境，后者可得到特异性的 酶产品。研究较为充分的角蛋白酶为地衣芽孢杆菌p w d - i ，其筛选自废物消解罐。本实验从畜禽 养殖场的土壤中分离到了一株角蛋白酶产生菌，对其进行了菌种鉴定和诱变育种及酶活测定方法 的研究。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 菌种 分离自采集的土壤和羽毛中，命名为k d - i 1 1 2 主要试剂 天青角蛋白( s i g m a - a l d r i c h ) ，酪蛋白( s i g m a - a l d r i c h ) t r i s 、硼酸、e d t a 、琼脂糖等为分 析纯试剂( 上海生工) ；n t g ( 华东医药公司) ；其他常规试剂均为国产分析纯； 模板( b a c i l l u s s u b l i t i s 基因组d n a ) ，提取自分离菌株k d - i ；引物为枯草芽孢杆菌( n a t t o ) 通用引物5 - g c g t g c c t a a t a c a t c - c a a g 一3 ，5 - a a g g t i a c c t c a c c g a c t t c 一3 ，由上海生物 工程公司合成；d n t p 、d n a m a r k e r ，琼脂糖，b 型小量d n a 片段快速胶回收试剂盒等试剂为北 京博大泰克生物基因技术有限责任公司产品； a p ic h b5 0 试剂条。法国酶里埃公司产品； 羽毛粉( 神农牧业公司) ，羽毛采自家禽屠宰点，自来水清洗后6 0 。c 烘干至恒重，使用前剪 为约l e n a 长 1 1 3 主要仪器与设备 手提式压力蒸汽灭菌锅 上海医用核子仪器厂 s a m i o u sb s 2 0 0 s 电子天平北京赛多利斯天平有限公司 l r h - 2 5 0 生化培养箱上海一恒科技有限公司 移液枪( 1 0 i i l 、2 0 l 、2 0 0 山、1m l ) g i l s o n 紫外可见分光光度计u v 2 1 0 2尤尼科( 上海) 仪器有限公司 s a t o r i u sp b l 0 酸度计北京赛多利斯天平有限公司 辐射装置 浙江大学核农所 q y c 2 1 0 2 摇床 上海福玛实验设备有限公司 光学显微镜b h - 2o l y m p u s 公司 1 6 堑望蟹博士学僮论文 第二章产角蛋白酶菌种的选育、鉴定和酶活性测定方法的确立 电子显微镜x l 3 0 e s e m 电泳仪( 电泳槽) t g l - 1 6 b 离心机 g e n e a m pp c rs y s t e m9 7 0 0 z f 紫外分析仪 常规玻璃仪器 荷兰p h i l i p s 公司 上海天能公司 上海安亭科学仪器厂 a p p l i e db i o s y s t e m s 上海嘉鹏科技有限公司 国产 1 2 培养基 1 2 1 初筛选培养基( g ，l ) ：羽毛1 0 ，k 2 h p 0 4 1 4 ，k h 2 p 0 4o 7 ，n a c l 0 5 ，m g s o , 0 1 ，琼胎 2 0 ，p h7 0 。 1 2 2 诱变筛选培养基( g 九) ：酪蛋白( 脱脂牛奶) 1 0 ，k 2 h i 0 41 4 ，k h 2 p 0 40 7 ，n a c l0 5 ， m g s o , 0 1 p h 7 0 1 2 3 种子培养基( g 以) ；牛肉青3 ，蛋白胨1 0 ，n a c l5 。p h7 2 ，琼脂2 0 。用于菌种保藏。 1 2 4 液体发酵培养基( g