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苹果中多种农药残留的分析检测方法研究 吴丽华 摘要：我国加入世贸组织后，随着关税的降低，农产品出口遇到的关税壁垒 在一定程度上得以减轻，但技术壁垒却逐渐凸显出来，其中最重要的一个就是以 环保和农药残留问题为中心的各种“绿色壁垒”近年来，韩国、欧盟、同本等 国纷纷提高了对进口农产品的质量技术要求。我国是苹果生产大国，苹果中农药 残留等质量问题已严重的阻碍了我国苹果的出口。因此，研究针对苹果中更多种 类农药残留的检测方法，对于促进我国苹果安全质量，打破技术壁垒，提高国际 竞争力显得日益迫切。 本文选择了我国苹果果园监测中经常发现和进出口检测中经常检出的4 1 种 农药作为研究对象，采用基质固相分散萃取( m s p d ) 前处理，气相色谱( o c ) 和高效液相色谱( h p l c ) 进行检测，取得了满意的效果。 研究结果如下： 1 提出了同时检测1 6 种有机磷农药的最佳色谱条件。检测时间2 5 m i n ，1 6 种 农药分离效果好，线性关系良好，相关系数t 0 9 9 4 3 。 2 建立了氟罗里硅土( f l o r i s i l ) m s p d 、气相色谱一火焰光度检测器 ( g c f p d ) 测定1 6 种有机磷农药残留量的方法。本方法对苹果样品中农药的回 收率为7 9 6 7 1 0 4 6 8 ，变异系数4 1 5 ，方法的最低检出限为 0 0 0 3 2 - 0 0 1 0 m g 1 【g 该方法准确率好，精密度高，完全能够满足苹果中农药残 留检测的要求。 3 建立了中性氧化铝m s p d 、g c f p d 测定1 6 种有机磷农药残留量的方法a 本方法对苹果样品中农药的回收率为7 6 1 2 一1 0 5 1 3 ，变异系数4 1 0 ，方法 的最低检出限为0 0 0 3 2 - 0 0 1 0 m g k g ，均低于国际和国内苹果中农药的m r l 值。 4 提出了同时检测1 9 种有机氯和菊酯类农药的色谱条件。检测时间3 0 r a i n ， 1 9 种农药分离效果好，线性关系良好，相关系数 0 9 9 4 7 。 5 建立了氟罗里硅土m s p d 、气相色谱一电子捕获检测器( g c e c d ) 测定1 9 种有机氯和菊酯类农药残留量的方法。本方法对苹果样品中农药的回收率为 7 8 6 2 1 0 3 4 2 ，变异系数4 0 6 。方法的最低检出限为0 0 0 0 0 9 8 - 0 0 0 7 m g k g ， 均低于国际和国内苹果中农药的m r l 值。 6 建立了中性氧化铝m s p d 、g c e c d 测定1 9 种有机氯和菊酯类农药残留量 的方法。本方法对苹果样品中农药的回收率为8 0 6 0 1 0 4 2 0 ，变异系数 4 3 7 ，该方法准确性好，精密度高，而且高效、灵敏。 7 建立了c 。基质固相分散，柱后衍生、h p l c f l d 测定苹果中6 种氨基甲酸 酯农药的方法。该方法对苹果样品中农药的回收率为8 1 5 0 一9 6 5 8 ，变异系数 3 5 4 ，方法的最低检出限为o 0 0 4 4 - 0 0 1 8 m k g 。采用柱后衍生、h p l c 测定， 大大提高了氨基甲酸酯农药的灵敏度，而且干扰少，色谱分离效果好。 关键词：苹果，农药多残留，前处理方法，气相色谱及高效液相色谱测定。 s t u d i e so nt h em u l t i - r e s i d u em e t h o d sf o ra n a l y s i so f p e s t i c i d er e s i d u e si na p p l e s w ui i - h u a a b s t r a c t ：a f t e ra c c e s s i n gt ow t o ，t h ef a r mp r o d u c t sp r o d u c i n gi nc h i n aa r e f r e q u e n t l yf r u s t r a t e db yt e c h n i c a lb a r r i e r s i ne x p o at r a d e ，a m o n gt h e m ，p e s t i c i d e r e s i d u e sa r et h em a i np r o b l e m sa st h eg r e e nb a r r i e r r r e c e n t l y , c o r e a ，e e c ，a n d j a p a na r ca l lr a i s e dt h eq u a l i t ys t a n d a r di m p o r tf a r mp r o d u c e c h i n ah a sa b u n d a n t a p p l e s ，t h ep r o b l e mo fp e s t i c i d er e s i d u e si na p p l eh a ss e r i o u s l y f r u s t r a t e dt h e e x p o r t t h e r e f o r e ，e x p l o r i n ga n da p p l y i n gaf a s t ，e f f i c i e n ta n ds e n s i t i v ed e t e r m i n e m e t h o di si m p o r t a n ta n dn e e d e du r g e n t l yt ob r e a k t h m u g ht h et e c h n i c a lb a r r i e r s ， s m o o t hf l o wa p p l e st ot h ew o r l dm a r k e t i nt h i st h e s i s ，4 1p e s t i c i d e sw h i c hm o s tc o m m o n l yu s e di nf r u i tg a r d e na n do r f r e q u e n ta p p e a r a n c ei na p p l e sw e r es e l e c t e da st h et a r g e ts u b s t a n c e t h eb r a n d n e w m e t h o do fm a t r i xs o l i d p h a s ed i s p e r s i o n ( m s p d ) t e c h n i q u ew a sa p p l i e di ns a m p l e e x t r a c t i o n ，a n d4 1p e s t i c i d e sw e r ed e t e r m i n e db yg a sc h r o m a t o g r a p h ( o c ) a n d h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ( h p l c ) t h er e s u l t so ft h es t u d i e sa r e l i s t e da sf o l l o w e d ： 1 t h e c h r o m a t o g r a p h i c i n s t r u m e n t a t i o n w o r k i n g c o n d i t i o nf o r1 6 o r g a n o p h s p h o r u sp e s t i c i d e sh a sb e e ne s t a b l i s h e d 1 6o r g a n o p h s p h o r u sp e s t i c i d e s w e r ew e l ls e p a r a t e di n2 5m i n u t e s ( m i n ) w i t hg o o dl i n e a r i t yr a n g e sf r o mo 9 9 4 3t o 1 0 0 0 0 2 a ne f f i c i e n tm e t h o dw i t hf l o r i s i lm s p da n dg c - f p d t e c h n i q u e f o r d e t e r m i n a t i o no f1 6o r g a n o p h s p h o r u sp e s t i c i d er e s i d u e sh a sb e e ne s t a b l i s h e d t h e r e c o v e r i e sw e r e7 9 6 7 一1 0 4 6 8 ，t h ec o e f f i c i e n tv a r i a t i o n s ( c v ) 4 1 5 ，a n dt h e d e t e c t i o nl i m i t sw e r e0 0 0 3 2 - 0 0 1 0 m g k g t h i sm e t h o dc a nm e e tt h ed e m a n d sf o r d e t e c t i o no r g a n o p h s p h o r u s p e s t i c i d er e s i d u e si na p p l e s 3 t h em e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no f1 6o r g a n o p h s p h o r u sp e s t i c i d er e s i d u e sb y n e u t e ra l u m i n am s p da n dg c - f p dt e c h n i q u eh a sb e e ne s t a b l i s h e d t h er e c o v e r i e s w e r e7 6 1 2 - 1 0 5 1 3 ，w i t ht h ec v 4 1 0 ，a n dt h ed e t e c t i o nl i m i to f1 6 p e s t i c i d e sw e r ea l ll e s st h a nt h em a x i m u mr e s i d u a ll i m i t s ( m r l s ) 4 t h e c h r o m a t o g r a p h i c i n s t r u m e n t a t i o n w o r k i n g c o n d i t i o nf o r1 9 o r g a n o c h l o r i n ea n dp y r e t h r o i dp e s t i c i d eh a sb e e ne s t a b l i s h e d 1 9o r g a n o c h l o r i n e i l l p e s t i c i d er e s i d u e sw e r ew e l ls e p a r a t e di n3 0 r a i nw i t hg o o dl i n e a r i t yr a n g e s f r o m 0 9 9 4 7t o0 9 9 9 9 5 t 1 i em e t h o df o rs i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no f1 9o r g a n o c h l o r i n ea n d p y r e t h r o i dp e s t i c i d e si na p p l e sw i t hf l o r i s i lm s p d a n dg c e c dt e c h n i q u eh a sb e e n e s t a b l i s h e d 1 1 1 er e c o v e r i e sw e r e7 8 6 2 一1 0 3 4 2 w i t ht h ec v 4 0 6 ，a n dt h e d e t e c t i o nl i m i t sw e r e0 0 0 0 0 9 8 - 0 0 0 7 m g k g w h i c hw e r ea l ll e s st h a nt h em r l s 6 n em e t h o dw i t hn e u t e ra l u m i n am s p da n dg c - e c dt e c h n i q u ef o r s i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no f1 9o r g a n o c h l o r i n ea n dp y r e t h r o i dp e s t i c i d e sr e s i d u e s h a sb e e ne s t a b l i s h e d t h er e c o v e r i e sw e r e8 0 6 0 - 1 0 4 2 0 w i t ht h ec v 4 3 7 t h i sm e t h o dh a sh i g hv e r a c i t yp r e c i s i o n 。e f f i c i e n ta n ds e n s i t i v e 7 1 1 h em e t h o df o rs i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no f6c a r b a m a t ep e s t i c i d er e s i d u e s w i t hf l o r i s i lm s p da n dp o s t - c o l u m nd e r i v a t i z a t i o nt e c h n i q u e sb yh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yf l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nh a sb e e ne s t a b l i s h e d n cr e c o v e r i e s w e r e8 1 5 0 一9 6 5 8 w i t hc v 3 5 4 。a n dt h el i m i t so fd e t e r m i n a t i o nw e r e 0 0 0 3 2 - 0 o l o m g k g p o s t - c o l u m nd e r i v a t i z a t i o nt e c h n i q u eb o t hg r e a t l ye n h a n c e d t h es e n s i t i v i t yo fc a r b a m a t ep e s t i c i d e s ，a n dm a d et h ec h r o m a t o g r a mp e a k sw e l l s e p a r a t e d k e yw o r d s ：a p p l e ，m u l t i r e s i d u e o fp e s t i c i d e ，s a m p l ep r e t r e a t m e n t ，g a s c h r o m a t o g r a p ha n dh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p hd e t e r m i n a t i o n i v 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 作了明确说明并表示谢意。 作者签名：日期： 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师 范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电 子版和纸质舨；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校 图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索： 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名：日期： 垒、。 文献综述 l 农药使用情况简介 近年来，我国农药的年生产量达3 8 2 万吨，制剂8 0 1 0 0 万吨，生产品种共2 5 0 多个，居世界第二，包括杀虫剂、杀螨剂、杀鼠剂、杀菌剂、除草剂和植物生长 调节剂等，销售额占世界农药市场总销售额的8 9 1 1 , 2 j 。到2 0 0 0 年底，我国已 有农药合成厂家5 0 0 个，加工厂家1 6 0 0 多家。年产量在万吨以上的7 个杀虫剂品种 中有6 个是有机磷类：甲胺磷、甲基对硫磷、敌敌畏、毒死蜱、乐果、氧乐果。 目前我国农药的生产使用仍以杀虫剂为主，产量超过2 7 万吨，占农药总产量的 7 0 以上，在杀虫剂类农药中，有机磷农药占7 0 。在有机磷农药中，发达国家 禁用的高毒的甲胺磷、久效磷、对硫磷、甲基对硫磷、氧乐果、敌敌畏等在我国 占7 0 ，高毒、剧毒农药的比例占总量的3 5 【引。 在农药使用上，全国平均用药水平为2 3 4 k g h m 2 , 都处在一个较高的数量水 平。我国上海、浙江等地达到1 0 8 k g h m 2 ，福建、广西、湖南、江苏、山东等地 也较高，从4 0 3 7 8 5 k g h m 2 不等【4 1 。鉴于我国农药的生产与使用状况，年均发 生的农药急性中毒事件多达数万起，可谓触目惊心阁。 1 1 有机氯农药 有机氯农药是我国最早大规模使用的农药，其中六六六( h c h ) 和滴滴涕 ( d d t ) 使用历史长、范围广、用量大。我国从1 9 8 3 年起正式停止h c h 和其他 一些有机氯农药的生产和使用，但2 0 多年来，已累计使用h c h 和d d t 约超过 5 1 0 h ，严重污染了大气、土壤、地表水和地下水，由于这些农药化学性质稳定， 因此，对环境的危害不会在短期内消失，至今仍有检出【6 , 7 , 8 l 。据报道在远离农业 活动的南、北极地区已发现有d d t 或六六六的残留；我国的长江、松花江、黑 龙江等许多江河名川都已不同程度地遭受农药的污染；我国江苏、江西以及河北 等地的地下水中已发现有六六六、阿特拉津、乙草胺、杀虫双等农药的残留【9 1 ； 美国在地下水中检出1 3 0 多种农药或其降解产物残留1 1 0 】。2 0 0 1 年5 月2 2 日在斯得 哥尔摩来自1 0 0 多个国家环境官员参加的联合国环境会议上通过了关于持久性 有机污染物的斯德哥尔摩公约，决定在全世界范围内禁用或严格限用1 2 种有机 污染物。这1 2 种有机污染物中有9 种为有机氯农药，即艾氏剂、狄氏剂、异狄氏 剂、氯丹、七氯、灭蚁灵、毒杀芬、六氯苯、滴滴涕。 1 2 有机磷农药 有机磷农药与乙酰胆碱酯酶的结合对乙酰胆碱酯酶的活性造成不可逆的抑 制，从而失去了原有的催化乙酰胆碱水解的功能，造成乙酰胆碱的积累，乙酰胆 碱是一种神经传递物质，在神经冲动的传输中起着重要的作用，当乙酰胆碱的积 累到一定程度，引起神经功能紊乱，引起机体痉挛、瘫痪等一系列神经中毒症状， 甚至死亡1 1 。 2 0 世纪7 0 年代有机磷农药用于防治农作物病虫害，年产量迅速增长，新品 种不断出现。由于有机磷农药比有机氯农药容易降解，对环境的污染及对生态系 统的危害和残留也都没有有机氧农药那么普遍和突出。有机磷农药具有药效高， 品种多，防治范围广，成本低，选择作用高，药害小，在环境中降解快、残毒低 等优点，现仍在世界范围内广泛应用，有着极为重要的地位。然而，有机磷农药 品种不同，它的毒性和性质相差很大，甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷、 磷胺等被列为高毒农药已禁止使用，但目前仍有检出 1 2 - 1 5 l 。在粮食和经济作物 中存在残留超标现象，特别对生产周期短的蔬菜水果类食品，有机磷农药残留超 标现象突出。 1 3 氮基甲酸酯类农药 氨基甲酸酯类农药是在天然毒扁豆碱结构基础上发展起来的，是应用较广泛 的一类杀虫剂，可用于杀虫、杀螨、杀菌、除草等方面。与有机磷杀虫剂一样， 它的作用机理是抑制胆碱酯酶的活性，使昆虫不能分解乙酰胆碱，使昆虫的神经 持续兴奋，直至死亡，与有机磷农药毒性的不同之处在于，它是以化合物分子整 体与昆虫内乙酰胆碱酯酶发生反应，而有机磷是先水解呈磷氧化而抑制胆碱酯酶 的，其抑制程度与水解程度成正比，氨基甲酸酯类化合物与此相反，水解后抑制 作用降低，故毒性一般较有机磷要低。有些氨基甲酸酯农药毒性大，易发生人畜 中毒事件，例如呋喃丹、涕灭威都是高效、内吸、广谱杀虫剂，但其母体及代谢 物均具有极高毒性，其残留会对人体和环境产生危害，已经被逐渐禁止使用。目 前对氨基甲酸酯类农药高毒品种结构改造使其低毒化的研究受到重视。 1 4 拟除虫菊酯类农药 天然除虫菊素是高效、低毒、低残留的杀虫剂，由于除虫菊生产受到限制， 供应量不大。2 0 世纪4 0 年代后期，第一个合成拟除虫菊酯一丙烯菊酯问世，此后 陆续合成了不少品种，但对光均不稳定，限制了使用。2 0 世纪7 0 年代以来，出现 了新品种，有更高药效，对光稳定，适用于防治农业害虫。一般拟除虫菊酯性能 是高效、杀虫广谱、残效较长，对螨类效果差，对鱼类毒性高，是高抗类型农药， 合成拟除虫菊酯类在哺乳动物体内通过水解、氧化和轭合代谢，在组织中无蓄积， 在土壤和植物中迅速降解，在生物体内几乎没有生物蓄积趋势。近年来，我国在 农业上推广使用的品种有溴氰菊酯、杀灭菊酯，皆属中等毒性农药1 1 6 】，田间施 药量少，作物上残留低，合理使用，不会造成危害。 2 拟除虫菊酯的毒理作用比较复杂，它具有驱避、击倒及毒杀三种不同作用。 对于拟除虫菊酯的作用机制，在许多具体方面尚有不同意见，存在争论，但一般 认为，拟除虫菊酯对周围神经系统、中枢神经系统及其他器官组织( 主要是肌肉) 同时起作用。 2 国内外苹果农药残留现状 2 1 国外苹果农残现状 苹果农药残留问题早在上世纪8 0 年代就受到国内外的高度重视，美国食品和 药物管理局( f d a ) 从1 9 8 7 年开始实施农药残留监测项目，对市场上进口和国产水 果农药残留进行了长达1 3 年的监测。据报道1 9 9 8 年检测1 0 6 6 个国产水果样品( 批 次) ，农药检出率为5 8 6 ，超标率为0 9 ，其中苹果2 1 9 个样品农药检出率为 6 8 9 ，超标率为0 5 。同期检测进口水果1 2 5 7 个( 批次) ，农药检出率为3 6 o ， 超标率为2 9 ，其中苹果4 4 个样品农药检出率为5 5 5 ，未发现超标1 1 7 1 。此外 英国、爱尔兰、希腊、芬兰等国同期对水果蔬菜监测的结果表明农药残留检出率 和超标率也分别在3 0 和2 左右。据欧盟2 0 0 1 年对苹果农药残留的监测结果， 在检测的乙酰甲胺磷、苯菌灵类、百菌清、毒死蜱、甲基对硫磷、抑菌脲、代森 锰类、甲胺磷、腐霉利等9 种( 类) 农药2 6 4 1 个样品中，5 2 样品未检出农药残留， 4 7 的样品农药残留水平未超过m r l ，仅有1 1 的样品超标。 苹果农药残留作为评价其安全性的主要内容，己纳入美国、日本及欧共体各 国的食品安全监测计划，年年进行例行监测。俄罗斯政府有关部门甚至明令规定 从中国进口的水果必须提交产地及运输途经各地的环境质量及农药施用情况的 检测报告。 2 2 我国苹果农药残留现状 我国在农药的法律法规、农药的使用和控制、残留监控体系等方面，尚未建 立全国范围的协调一致的监控体系，没有真正做到对出口食品和农产品的全过程 监管。禁用药物市场上时有销售，甚至一些农药成分标注不明，种植户违规用药 的情况经常发生，所以农药残留情况严重，对出口农产品造成很大的威胁i “j 。 我国也尚未对苹果农药残留进行系统监测【1 9 1 。但在1 9 9 9 年农业部果品及苗木质 检中心( 兴城) 对第四届中国国际农业博览会送检苹果中抽取的7 7 个样品进行了 有机氯类农药( 六六六、d d l 等) 残留的检测结果发现有2 7 个样品超标，超标率高 达3 5 。2 0 0 6 年，广东省对8 个城市8 、9 月份农产品质量安全抽检结果显示，在 各地的蔬菜、水果样品中，甲胺磷等禁用农药都有不同程度检出，9 月份共抽检 水果样品1 3 批次1 5 4 个，检出不合格样品1 2 个，平均农药残留超标率为7 7 9 。 3 主要超标品种为李子、苹果和桔子，检出的超标农药为：甲基对硫磷、氧化乐果、 对硫磷【2 0 l 。2 0 0 5 年，第1 、2 季度在天律市随机抽检样品6 8 份，其中蔬菜4 4 份，水 果( 苹果、鸭梨、油桃等) 2 4 份，国家禁用农药甲拌磷的检出率为5 9 ，最大 残留量高达3 1 9 7 m g k g ，样品不合格率为7 4 ，在苹果中检出氧化乐果和甲拌磷 1 2 冯建国等2 0 0 0 年对苹果产区的普查表明，溴氰菊酯、辛硫磷、h c h 、d d t 、 杀螟硫磷、马拉硫磷等6 种农药的检出率分别为1 0 0 、1 0 0 、8 7 1 0 、6 5 6 7 、 6 0 、5 4 5 5 ，其中d d t 和对硫磷超标2 倍以上【”】。沈阳市疾病控制中心于2 0 0 3 年8 、9 月份对市场销售的蔬菜和水果进行了随机抽检，水果有机磷农药检出率为 1 6 7 。检出的农药有乐果、乙硫磷、敌敌畏、敌百虫、杀扑磷、二嗪农、对硫 磷、马拉硫磷和乙草胺等1 2 ”。 3 农药残留分析检测技术研究进展 3 1 国外研究情况 农药残留检测是微量或超微量分析，必须采用高灵敏度的检测器才能实现。 近几年来，随着高效农药品种不断出现，在农产品和环境中的残留量很低，国际 上对农药最高残留限量要求也越来越严格，给农药残留检测技术提出更高的要 求，因此出现了一些新型的、先进的农药残留分析技术。 国外农药残留分析技术十分先进，气质联用、液质联用等高端的先进检测设 备已成为农药残留分析的主要手段，色谱分离、质谱确证大大提高了分析的准确 性1 2 4 1 。超i 临界流体萃取、固相微萃取、加速溶剂萃取等先进的前处理技术广泛 用于农药残留分析中p j 。 3 2 国内研究进展 近年来我国农药残留分析技术在许多领域都取得了重要进步。农药作为对 环境和食品的重要污染源之一，越来越受政府和公众的关注。其分析技术的提高 也受到高度重视，由于农药品种和用量的不断增加，新的分析方法，特别是多种类 型农药的多残留分析方法、同类型农药的多残留分析方法以及新的单个农药在多 种试样中的分析方法都取得了重要进展；毛细管气相色谱、气相色谱质谱联用 ( g c m s ) 等先进的检测技术逐渐应用于农药残留的分析检测中，使农药残留检出 灵敏度进一步提高；传统的费事的样品预处理工作正在被周相萃取( s p e ) 、 超临界液体萃取( s f e ) 、微波辅助萃取、基质固相分散萃取( m s p d ) 、自动索 氏萃取等省时、省力、廉价、溶剂用量少、污染少得现代萃取技术取代。另外， 农药残留快速检测技术也得到了快速发展 2 9 。 国家8 6 3 计划现代农业研究在农药残留降解与检测技术方面获得了突破性 4 进展，取得了国际领先或先进水平的技术成果，为无公害农产品生产保障体系建 立提供了有效的技术支撑和保障。 ( 1 ) 化学农药多残留免疫检测技术研究取得重要突破，实现了对同类农药的 同时在线检测。 以间苯氧基苯甲酸( p b a ) 为半抗原，通过活性酯法与b s a 偶联后免疫新西 兰大白兔，获得对多种菊酯类农药有免疫学反应的通用抗体。该抗体对氯菊酯、 甲氰菊酯、氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、功夫菊酯、二氯苯醚菊酯均有 特异性识别，而对氰戊菊酯识别弱；以二乙基膦酸乙酸为半抗原，分别用 n h s d c c 法和e d c 法与b s a 连接合成了人工免疫原，免疫后获得了针对双乙 氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的通用多抗血清。该抗体与毒死蜱、氧乐果，二嗪 农、乙基对硫磷、丙溴磷、辛硫磷等农药均有特异性反应。 ( 2 ) 农药重组抗体技术研究处于国际领先水平，为试剂盒的规模化生产提供 了高质量的抗体保证。 先后完成了免疫小鼠脾细胞m r n a 的提取和c d n a 链的合成，全套v i i 和 v l 基因的扩增和鉴定，并将全套v h 和v l 基因拼接成s c f v 基因，构建了重组 s c f v 抗体库。通过加入辅助噬菌体富集和多克隆e u s a 筛选，能产生甲胺磷抗 体的特异性s c f v 噬菌体阳性克隆；对部分阳性克隆进行了表达研究，并经竞争 e l i s a 方法验证获得了甲胺磷特异性重组抗体。目前，化学农药重组抗体的制 备在国内外还未见报道。 ( 3 ) 研发了甲胺磷、速灭威、氟虫腈、对硫磷、玉米赤霉醇、m i l b c m y c i no x i n e e l i s a 检测试剂盒，初步建立了化学农药快速免疫检测技术体系。 3 3 样品前处理技术 现代农药残留分析方法通常包括样品前处理和检测两部分，食物样品组成复 杂，基质成分与目标物含量相差悬殊，且存在农药的同系物、异构体、降解产物、 代谢产物以及轭合物的影响。由于环境的迁移作用，环境中残留的各种化学污染 物也可能在农作物组织中蓄积，从而增加了食品中农药残留分析的难度。农药残 留测定之前要有适合于各种食品和目标物理化性质的萃取、净化，浓缩等预处理 步骤，这些预处理过程往往在分析中起着主要作用。食物样品中农药提取、净化 等前处理方法有其特殊性，对于不同性质样品中的不同目标物需要采用不同的前 处理技术。农药残留分析中，样品的净化要尽可能的除去与目标物同时存在的杂 质，以减少色谱图中的干扰峰，同时避免杂质对色谱柱和检测器的污染。样品前处 理效果的好坏对于样品的测定有着决定性的影响，一般认为前处理工作占样品的 整个分析过程的6 0 。 样品的前处理方法在很长的时间内，一直沿用经典的索氏提取法，震荡摇瓶 法，液液萃取法，柱层析，共沸蒸馏等技术，尽管这些技术不需要昂贵的设备和 特殊仪器，但却是整个分析过程中费时费力，准确度灵敏度低，且大量有机溶剂的 使用造成了对环境的污染。进入9 0 年代后，样品萃取净化技术有了较快的发展1 2 ， 如固相萃取法1 3 们、固相微萃取1 3 、顶空固相微萃取【3 2 】、基质固相分散1 3 3 、 凝胶渗透色谱法 3 4 1 及超临界流体萃取法等得到不断改进和应用，样品前处理技 术的研究成为分析化学领域中最为活跃的前沿课题之一。 3 3 1 液液萃取( l i q u i d - l i q u i de x t r a c t i o n 。l l e ) 液液萃取是最早使用的一种提取净化方法，也是一种经典的方法该方法不 需要昂贵的设备和试剂，方法简单，易于操作。早期的a o a c ( 国际官方分析家协会) 方法和我国现有的国家标准方法中，大多使用u 正作为提取净化的手段。其一般 步骤是将样品和萃取剂置于匀浆机或组织捣碎机中高速捣碎匀浆，使农药被完全 萃取，然后过柱净化。常用的柱填料吸附剂为硅酸镁( f l o r i s i l ) 、氧化铝、硅胶等。 早期的液液萃取法先是用乙腈提取，然后用正己烷一二氯甲烷进行液液分配，最后 用硅酸镁柱净化。1 9 8 5 年以后，逐步用丙酮代替了乙腈，主要是因为乙腈有剧毒， 而且价格昂贵，而丙酮具有低毒、便宜的优点，并且它既能萃取极性物质，也能萃取 非极性物质。同时剧毒的二氯甲烷也逐步被环己烷、轻油等取代。l l e 的缺点 在于使用了大量有毒溶剂，对环境和操作人员的身体健康是一种威胁，另外，使用 l l e 进行提取净化费时费力，不能进行即时检测，已经逐步被其他一些提取方法 所取代，但在我国目前仍然广泛使用。 3 3 2 固相萃取技术( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) 固相萃取技术，发展于上世纪7 0 年代，由于其具有高效、可靠、消耗试剂 少等优点，在许多领域取代了传统的液一液萃取而成为样品前处理的有效手段。 s p e 是由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来，s p e 法与传统的柱色谱比 较相似，在s p e 小柱中填装不同极性的填料，形成不同极性，不同用途的s p e 小柱。 样品处理时，选择极性适宜的小柱，当样品溶液注入小柱后，待测组分基于分配、吸 附、离子交换等机理吸留在小柱中，不同极性的杂质流出，再用适宜极性的洗涤液 冲洗小柱，充分去除杂质，最后用少量的洗脱液，将待测组分洗脱，这样就达到分 离、净化、浓缩目的。s p e 柱根据固相萃取柱中填料的不同分为正相s p e ( 如硅 藻土、硅胶、氧化铝、硅酸镁等) 、反相s p e ( 如c 8 、c l s 、c n 、苯基柱等) 、离 子交换型s p e ( 如n h 2 ) 、吸附树脂类等i ”j 。 s p e 的基本模式有两种洗脱模式，一种是被分析物比所存在的生物介质与 固相之间的亲和力更强，因而被保留，然后用一种对被分析物亲和力更强的溶剂 6 洗脱：另一种是存在的生物介质较被分析物与固相之间亲和力更强，则被分析物 被直接洗脱。 s p e 方法最早的s p e 方法是，将含有被分析物的液相倒入盛有适当吸附剂 的器皿中，振摇一定时间，使被分析物在两相间分配达平衡，通过过滤或倾泻的 方法实现两相的分离。如果吸附剂有效，则大部分被分析物被吸附于固相，然后 再用适当的溶剂使之解吸附即可。 现代s p e 方法采用长约2 - 3 c m 的聚丙烯小柱，内装各种填料，两端装有烧 结片或多孔圆片，可通过加压或抽负压的方法使液相经过小柱，实验步骤如下( 以 c 1 8 柱为例) ： 第一步：使用甲醇润湿小柱，活化填料，以便固相表面易于和被分析物发生 分子间相互作用，同时，可以除去填料中可能存在的杂质李增标比较了柱的湿 润性对多种药物吸附的影响后指出，c 1 8 柱在甲醇含量大于8 的水溶液中才能 保持湿润而有利于药物的吸附，否则，将导致回收率的降低。 第二步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱，转移过多的甲醇，以便样本与固 相表面发生作用。但清洗不宜过分，否则会使甲醇含量过低，从而导致湿润度木 足，回收率降低。 第三步：加样，使样本经过小柱，弃去废液。 第四步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱，转移样本中的内源性杂质和其他相 关杂质。 第五步：选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥干溶剂以备 后用或直接进行在线分析。 7 s p e 的应用s p e 法与传统的液相萃取法相比，操作简便，节省溶剂，回收率高， 有利于微量待测组分有效回收，由于其浓缩作用，可大大降低方法的检出限。另 外，容易实现自动化。目前，已经有了固相萃取的自动化设备。关于应用固相萃 取技术的研究报道也很多诸思燕等【蚓在有机氯及菊酯类农药的气相色谱法研 究时采用固相萃取方法进行了样品的前处理，取得较好的效果。王芳等 3 7 1 建立 了超声波提取，硅胶s p e 柱净化，g c e c d 法测定土壤中的有机氯农药的多残留 分析技术。王一茹等p 驯应用了c 。8 s p e 柱处理样品，实现了新鲜水果中农药的多 残留快速检测。 s p e 技术的出现使样品前处理过程大为简化，自动化s p e 的使用真正实现 了样品的在线分析。但是，专属性填料的开发尚处于起步阶段，而自动化仪器仍 有待于进一步完善，尤其是全自动系统中，如何使小柱更为耐压且易于更换，值 得进一步研究。尽管如此，仍然有理由相信s p e 技术会逐步成熟，在样品处理 7 技术中处于主要地位。 3 3 j 固相微萃取( s p m e ) ，顶空固相微萃取( h s s p m e ) 3 3 j 1 固相微萃取( s o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n ，s p m e ) 固相微萃取技术是在s p e 基础上发展起来的【 l 。s p e 需用少量溶剂作冲洗 剂，s p m e 可不用溶剂萃取，是真正意义上的固相萃取s p m e 技术中的固相为 一支覆盖着一层高聚物固定相( 聚甲基硅氧烷或聚丙烯酸酯) 的熔融石英纤维， 该纤维被置于一个微量注射器的针腔内，使用时将针筒推出，则纤维降低，放入 样品液中一段时间，在转子的搅拌下，分析物被吸附，然后将纤维退回进样针内， 当进样针插入g c 进样口时，样品发生热解吸附，从而进入分离柱中。 s p m e 是集取样、萃取、富集和进样于一体的无溶剂制样技术，1 9 8 9 年由 c a r t 咄r 和j p a w l i s z y n 首先提出1 4 0 1 ，1 9 9 3 年推出商品化装置，最初只用于水中 挥发性化合物的提取分析，1 9 9 4 年首次应用于农药残留分析。在水样、土壤、 食物和生物流体四种类型的样品中，对水样中农药残留又是其中一个主要的部 分，占6 0 以上。 3 3 3 2 顶空固相微萃取( h s s p m e ) 在s p m e 技术基础上，如果将s p m e 与顶空方式结合，不将萃取头直接插入待 测溶液中，而放置在顶空瓶液上部分，吸附、浓缩液上挥发性组分。这样的技术被 称为顶空固相微萃取。h s s p m e 结合了h s 技术和s p m e 技术的特点，由于不接 触样品基体，净化效果更加有效。h s s p m e 技术尤其适宜复杂基体中挥发性有机 物的分离测定。 3 3 4 基质固相分散萃取技术( m s p d ) m s p d 方法最初是1 9 8 9 年由美国l o u i s i a n a 州立大学的s t a t e nb a r k e r 教授提 出，用于动物组织样品中抗生素等药物的提取和净化1 4 。近年来m s p d 在应用 范围和使用技术上都有了很大的发展，尤其是在蔬菜和水果中农药残留分析方面 f 4 2 州。 m s p d 方法首次提出是用来处理动物组织样品，该样品与涂渍有c - 8 等的各 种聚合物担体固相萃取材料一起研磨，得到半干状态的混合物并将其作为填料装 柱，然后用不同的的溶液淋洗柱子，将各种待测物洗脱下来。其依据是采用脂溶 性材料( c 1 8 ) 破坏细胞膜并将组织分散，c 1 8 充当分散剂。在硅胶固相萃取材料表 面键合有机相，与传统方法使用砂子做吸附剂类似，在样品与固体材料搅拌的过 程中，利用剪切力作用将组织分散。键合的有机相犹如溶剂或洗涤剂一样，将样 品组分溶解和分散在支持物表面，这大大增加了萃取样品的表面积，样品按各自 极性分布在有机相中，如非极性组分分散在非极性有机相中，这受此过程的动力 8 变化影响。小的、极性分子( 水) 与硅胶粒子上的硅烷醇结合，也可与基质组分形 成氢键；大的、弱极性分子则分散在多相物质表面，显微扫描电镜观察可证明 m s p d 方法对样品基质分离分散效果明显1 4 ”。 m s p d 是一种崭新的萃取技术，其基本操作时将试样直接与适量填料研磨、 混匀得到半干状态的混合物并将其作为填科装柱，然后用不同的溶剂淋洗柱子， 将各种待测物洗脱下来1 4 6 j 。m s p d 浓缩了传统样品前处理中所需的样品均化、组 织细胞裂解、提取、净化等过程，是简单高效的提取净化方法，适用于各种分子 结构和极性农药残留的提取净化，更适用于自动化分析1 4 7 埘1 。 。 固定相种类和性质在m s p d 中具有很重要的作用。与s p e 类似，正相m s p d 所使用的吸附剂都是极性的，如键合硅胶、氧化铝、硅镁吸附剂等，用来萃取极 性物质；反相m s p d 所用的吸附剂通常是非极性的或弱极性的，如c 8 、c i s 、苯 基柱等，所萃取的目标化合物是中等极性到非极性的化合物。林竹光，金珍等采 用中性氧化铝和氟罗里硅土作为净化剂，乙酸乙酯为洗脱剂的方法，利用g c m s 检测建立了果汁中1 0 种拟除虫菊酯的快速检测方法l 删冯秀琼等在研究中草药 中有机磷农药多残留测定方法时，采用m s p d 法处理固体样品节约试剂、时间、 人力，优化了前处理方法1 5 “。杨容，翟彤宇研究了应用基质固相分散( m s p d ) 处 理复杂样品技术与高效液相色谱法相结合测定食物中痕量异丙威和溴氰菊酯残 留物的新方法，并将该方法用于水果、粮食等食物中取得了良好的效果1 5 2 1 。乌日 娜采用c 18 和硅胶m s p d 两种键合材料研究了苹果和浓缩苹果汁中甲胺磷、对硫 磷等苹果中常用的五种有机磷农药残留，取得了较好的效果【5 3 】。 3 3 - 5 超临界流体萃取( s t p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n s f e ) 超临界流体萃取是近几年发展起来的一种特殊的分离技术。s p e 主要是以超 临界流体代替各种溶剂来萃取样品中待测组分的萃取方法。超临界流体是指物质 处于其临界温度和临界压力以上时的状态，兼有液体和气体的优点，有极高的溶 解能力，能深入到提取材料的基质中，发挥非常有效的萃取能力，且溶解能力随 压力的升高急剧增大。这些特性使得超临界流体成为一种好的萃取剂【5 4 1 。目前 最常用的