（食品科学专业论文）大豆发芽及其营养特性研究.pdf

摘要 本文以。铁丰2 9 号。大豆为试材，用响应面法( 骼m ) 优化了大豆发芽富集y 一氨基丁酸( g a b a ) 的发芽工艺条件，研究了发芽大豆的营养特性和生理功能性，并将发芽大豆制作成豆腐和豆浆进 行感官评定，考察发芽大豆制品的接受度，最后对发芽大豆及其豆腐制品的抗氧化特性进行了研 究。 研究结果表明： 1 发芽处理可激活大豆种子中的蛋白酶， g a b a 的底物谷氨酸含量在发芽时期显著增加， 发芽大豆中游离氨基酸含量增加尤其是合成 促进了谷氨酸脱羧酶合成g a b a ： 2 利用响应面法优化发芽工艺条件，得到当浸泡时问为9 5 0 h 。发芽温度为2 3 ，发芽时 问为2 8 3 8h 时，g a b a 最大值为7 0 7 1m g 1 0 0 9 干基。同时通过显著性分析可知浸泡时间、发芽 时间是影响g a b a 值的晟主要的因素； 3 大豆发芽后营养特性有所提高：一方面。糖类、蛋白质、脂肪等营养成分发生水解，降解 为小分子物质，利于消化吸收；另一方面，抗营养物质植酸和胰蛋向酶抑制因子随发芽时闻延长 不断降低，从而提高了蛋白质的体外消化率； 4 发芽处理对豆制品的总体接受度产生了不良影响，但大豆发芽处理2 4 h 后制成的豆浆和内 酯豆废，其在总接受度方面与未经发芽处理的大豆制品无显著性差异而发芽2 4 h 的大豆g a b a 含量最高，且各种抗营养因子含量都有所下降。发芽处理4 8 h 和7 2 h 的大豆制成的豆浆和内酯豆 腐样品与未发芽样品相比，总的接受度都明显降低。用仪器测定的豆腐硬度和颜色与感官试验呈 现了较好的相关性； 5 - 通过与未发芽大豆的清除a b r s 和d p p h 自由基能力相对照，研究结果表明对大豆种子 的萌发处理，可显著提高大豆及其豆腐制品的自由基清除能力，提高了大豆及其豆腐制品的抗氧 化能力。这些抗氧化物质为水溶性，可能为多肽、水溶性维生素等发芽过程中产生物质，其活性 成分有待进一步研究 关键词：大豆，发芽，y 氨基丁酸，营养特性，抗氧化 a b s t r a c t n i ss t u d yf o c u s e so np r o c e s s0 p 缅出蚯明o fg e r m i n a t e ds o y b e a na n di to fy - a m i n o b u t y r i c a c i d ( g a b a ) t h ec h a n g e * o f n u t r i t i o n a lc h a r a c t e r i s t i c so f g e r m i n a t e ds o 叫o e a d _ ma l s om v e s t i g a t e d i n 山i s 蛐叫y ，a n dt h et o f ua n dt h e ”咄m a d e f i o ms o y b e a nt r e a t e db yg e r m i n a t i o nw 淝c o n d u c t e d b ys e n s o r ye v a l u a t i o nt oi n s p e c tt h e i ro v e r a l la c c e p t a b i l i t y t h ea n t i o x i d a t i v ea c t i v i t i e so fg e r m i n a t e d s o y b e a na n d i t sp r o d u c tt o f uw e r ea l s oi n v e s t i g a t e di nt h i ss t u d y t h ec o n c l u s i o n sa l ea sf o l l o w s ： 1 t h ep m t e i n a s ei n y b e 姐w a sa c t i v a t e db yg e r m i n a t i o n , w h i c hc a u s e dt h ei n c r e a s eo ff r e ea m i n o a c i dc o n t e n t , e s p e c i a u yt h er e a c t i o ns n b s l r a t eg l u t a m a t ei n c r e a s e dd u r i n gg e r m i n a t i o np l m e m , w h i c h f m t h e r r e s u l t e d i n t h e i n c r e l s o o f g a b a c o n l e n l 乞l r o c e 魁o p t i m i z a t i o no fg e r m i n a t e d 如，b c 柚a n de n r i c h m e n to fy - 蛐t y r i ca c i dw m 缸 鲥掣她正e x p e r i m e n t a lo p t i m i z a t i o no ft h eg 蛐t e dp r o c e s sw a lc o n d u c t e db yt h em e t h o do f r s m 佛p 彻s u r f a c em e t h o d o i o g y ) t h em o d e l so fp r e d i c t i v ep o y n o m i a lq u a d r a t i ce q u a t i o m w e 糟o b t a i n e du s i n gs o y b e a n q i e f e n g2 9 a st h el a wm a t e r i 蛆t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tw h e nt h e s o a k 血畴t h eg e r m i n a t i o nt i m ea n dt h et e m p e r a t u r ew u w e9 5 0 h , 2 3 0 9 ，2 8 3 8h ，r e s p e c t i v e l y , t h e c o n t e n to f y - a m i n o b u t y r i ca c i d ( g a b a ) c o u l da c h i e v ea sh i g ha s7 0 7 1m g 1 0 0 9d r yb a s e 3 t h em a i e n tv a l u eo fs o y b e a nw a si m p m v e db yg e r m i n a t i o n n u t r i e n 缸s u c h c a r b o h y d r a t e s , p r o t e i n a n df a tw e f cd e g r a d a t e di n t o 锄a nm o l e c u l e s , w h i c hh e l p e di t s d i g e s t i b i l i t y a n d a b 叩t a b 埘哆m e a n w h i l e , t h ec o n t e n to fa n t i - n u t r i t i o n a lf a c t o r ss u c ha sp h y t i ca c i da n dt r y p s i n i n h i b i t o r yd e c r e a s e da l o n gw i t ht h e 砸口e 咖o f g e r m i n a t i o nt i m e 。w h i c hi m p r o v e d 跏v t op r o t e i n d i g e s t i b i l i t y 4 g e r m i n a t i o nt r e a t m e n ti n o u g h ta d v e r s ei m p a c t0 1 1 1t h eo r g a n o l e p f i cp r o p e r t i e so fs o y b e a np r o d u c t s t h e “缸如m a d ef r o mn o n g e r m i n a t e ds o y b e a ns h o w e ds u p e r i o go r g a n o l e p t i cp r o p e r t i e s , b u tt h e p r o d u c t so ft h e2 4 - h - g e r m i n a t e ds o y b e a nw e ms a t i s f a c t o r y t h e r e f o r e , 2 4 hg e r m i n a t i o nw a s c o n s i d e r e daw o r t h w h i l ep i d s s i n gs i n c ei to b t a i n e dt h eh i g h e s tl e v e lo fg a b a , a n dr e d u c e d a n t i - n u t r i t i o n a lf a c t o r st ot o l e r a b l el e v e l sw i t h o u tas i g n i f i c a n tc h a n g ei na c c e p t a b i l i t y 5 i ti n d i c a t e dt h a tg e r m i n a t i o n 啪s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s et h ea n t i o x i d a t i v ea c t i v i t i e so f s o y b e a na n di t s p r o d u c tt o f u t h ec o m p o n e n t so ft h ew a t e re x t r a c t sc o n t r i b u t e dt ot h ea n t i o x l d a t i v ea c t i v i t i e s r c i e p r o b a b l yf m mp o l y p e p t i d e s , w a t e r - s o l u b l ev i t a m i n sa n do t h e rs u b 酬囊n o 髂w h i c ha c c u m u l a t e dd u r i n g g e r m i n a t i o np r o c e s s k e yw o r d s ：s o y b e a n , g e r m i n a t i o n , y - a m i n o b u t y r i ca c i d , n u t r i t i o n a lc h a r a c t e r i s t i c s , a n t i o x i d a f i v e a c t i v i t y 缩略词表 v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 算 时间：二一7 年月j 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 彳膨 时问：埘7 年, e l , s n 导师硌毒沉夸 帆州年珀 中国农业大学硕 学位论文 第一章绪论 1 1 研究背景 1 1 1 大豆食品 第一章绪论 大豆是我国主要的植物性蛋白食物资源。大豆蛋白是一种理想的植物蛋白，舍量一般为3 5 - 4 0 。氨基酸种类齐全，其中人体所必需的8 种氨基酸的含量基本上与联合国卫生组织所建议的 相近。因此，大豆又有。植物肉”、。绿色牛乳”之美誉。大豆中脂肪含量为1 5 珈，其中人 体所必需的亚油酸含量约占5 0 ，碳水化合物含量为2 0 - 3 0 ，此外还含有多塘、维生素、无机 盐等营养物质，不含胆固醇，故有降血脂，治疗糖尿病( 他i 甜以，1 9 8 7 r e n a t a d 以，2 0 晒； f o s t e r - p o w e l l & m i l l c r ，1 9 9 5 ) 、缺铁性贫血( 郑建仙，1 9 9 9 ) ，防止动脉硬化( y a m a s h i t ada 1 ，1 9 9 8 ) 和防治肿瘤( m e s s i n & 1 9 9 9 ) 等医疗功效以美国为例，法律已经许可在产品上标示大豆蛋白有 益健康，美国心脏病学会和糖尿病学会都在推荐的膳食中号召要“增加豆类摄入( a m e r i c a n d i a b e t e s a x c h t i o a , 2 0 0 2 ) 。此外。我国人民每人每天的蛋白质实际摄入量只有6 5 9 ，低于f a o i w h o 规定的每人每天7 0 - 7 5 9 的标准。美国经济展望 杂志认为：未来1 0 年晟成功最具有市 场潜力的并非汽车和电子产品，而是中国的豆腐等传统豆制品。美国的大豆食品以1 0 的速度递 增，豆腐作为一种保健食品越来越受到消费者的青睐( 1 ：删i n 1 9 9 4 ) 有人预言到2 0 2 0 年世界大豆 产量的一半将用于制作大豆食品，东方的豆制品将风靡全球( 蒋建平，2 0 0 0 ) 因此，就我国目前的 实际国情来看，开发大豆食品，特别是传统大豆制品提高我国人均优质蛋白的每天摄入量，提 高人们的营养水平具有重要的现实和战略意义。 大豆虽然具有上述优点，但同时还含有许多抗营养因子，如植酸、胀气因子、脂肪氧化酶和 胰蛋白酶抑制剂等他们的存在有碍营养素的吸收，导致身体的不适和豆制食品感官上的缺陷， 所以在加强大豆资源开发利用的同时，应该重视抗营养因子去除的研究( 励建荣等，1 9 9 7 ) ，而 发芽处理正是去除大豆抗营养因子安全节能、经济简单、有效的方式之一事实上，我国食用黄 豆芽已经有上千年的历史。日本也已经将种予芽类引入日常的膳食中，尤其是发芽糙米、黄豆芽、 绿豆芽等，成为日常必不可少的膳食成分( e r l a s e t a l ，2 回而在韩国，人们认为其长寿的秘诀 是一日三餐中的豆芽菜。芽类食品在美国虽然只有凡十年的历史，1 9 9 7 年美国的芽类食品市场份 额约2 5 亿美元，有4 7 5 家大的生产商，每年生产3 0 万吨芽类食品并在国际上有一个机构称为 i n t e r n a t i o n a ls p r o u tg r o w e r sa s s o c i a t i o n 大约有1 0 的美国人常吃芽类食品( k u z w e i l , 1 9 9 9 ) ，说 明芽类食品不止在亚洲受到消费者的青睐，现在已经有越来越多的人认识到芽类食品的的安全、 经济、健康等特点开始食用芽类食品。 1 1 2y 一氨基丁酸( g 蛐l a ) 的生理功能 随着经济的发展，我国正经历一个由贫到富的经济转型的关键时期，我国居民的食物消费行 为发生了显著变化，膳食营养过剩加之现代社会经济压力增加，一些与营养相关的慢性疾病如高 血压、高血脂等疾病比率明显增大。高血压是造成冠心病等心脑血管疾病的主要因素之一据统 计，全世界每年因高血压引起的心脑血管疾病的死亡人数超过1 2 万( 杨胜远，2 0 0 5 ) 。一些长 中国农业大学硕卜学位论文第一章绪论 时间防治这些疾病的药物常常有一定的毒副作用，所以医患双方都倾向于非药物疗法。而随着科 学研究发展及对药物药理及食品生理功能认识的深入，加之人们对自身健康意识的增强，从食物 中获取天然，安全的防治疾病的营养功能性成分可能成为人们选择的首要目标 g a b a 是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，在哺乳动物的脑、骨髓中存在，是抑制性神经传 递物质1 9 5 0 年，r o b e n t ( 1 9 5 0 ) 和a w a p m ( 1 9 5 0 ) 分别发现在大脑中存在着大量的g a b a 。哺 乳动物的脑血管中有g a b a - - 能神经支配，并存在相应的受体，g a b a - 与起扩张血管作用的突触 后q a b a 授体和对交感神经末梢有抑制作用的g a b a b 受体相结合，能有效促进血管扩张，从而 达到降血压的目的g a b a 通过脑内系统的调节，起到抑制心血管和调节血压的作用( d e f e u d i s , 1 9 8 3 ) g a b a 的舒缓血管和降血压的药理功能已经在大量的动物实验和临床医学中得以证实。血 管紧张素转换酶( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e 。a c e ) 血压调节过程中起着十分关键的作用， 它可以将无活性的血管紧张素i 水解生成具有血管收缩作用的血管紧张素，从而导致血管收 缩，机体的血压升高( 杨胜远等，2 0 0 5 ) 最近的一些研究表明富含g a b a 的食品可以抑制a c e 的活性，从而起到降低血压的作用林智等( 2 0 0 2 ) 人研究发现在活体或离体条件下，富含g a b a 的茶饮料对大鼠a c e 活性具有较强的抑制作用。k a z a m i 等( 2 0 0 2 ) 也报道了含g a b a 的复合风味 科可使轻度离血压和高血压患者的血压显著降低，而正常人组的血压保持不变，也未观察到有任 何副作用1 h y a k a w a 等( 2 0 0 4 ) 发现富含g a b a 的乳制品可以显著降低自发性高血压鼠的血压。 而且，g a b a 还有肾功能活化功能高血压病人往往肾功能降低，使肾功能活化后，即使盐分摄 取量增多，也可因为利尿作用激活，过剩盐分可从尿中摊出，使血压降低，从而可预防高血压( 张 晖等。2 0 0 2 ) g a b a 目前作为医药品已有应用，可用于改善大脑的血流、增加氧的供给，改善大脑的代谢， 还有助于治疗因脑中风、头部外伤后逋症、脑动脉硬化后遗症等产生的头痛、耳鸣、意识模糊等 病症还可用于因脑内缺少g a b a 所z j l 起的精神焦虑不安，初期的老年痴呆症的治疗，并可改善 a l z h e i m e r 型痴呆。此外，g a b a 还有促进乙醇代谢的作用，改善高脂血症、防止肥胖、消除体臭 的效果 上世纪9 眸代，日本首先开发成功了发芽糙米产品，当发芽糙米的芽长为0 5 1 m m 时，大米 营养价值处于最高状态。张燕( 2 0 0 6 ) 的研究表明通过优化糙米的发芽条件，发芽糙米的g a b a 含量可达到白米的9 倍以上。大豆是谷氨酸的丰富来源而谷氨酸正是g a b a 生物合成的前体物质， 因此，g a b a 在大豆发芽过程中积累的量比糙米中积累的要多得多。 1 1 j 氧化与疾病 根据卫生部( 2 0 0 0 年) 的调查，癌症、脑血管病以及心血管疾病，位于我国十大死亡原因前 三位。这些癔病多与机体衰老有关环境污染、紫外线、放射线、摄取氧化变质的食品以及机体 的自身代谢过程都可以产生自由基。自由基在体内可与脂肪、蛋白质和d n a 贫 予迅速反应，造成 膜损伤、蛋白变性、酶失活以及d n a 链的断裂或碱基修饰等，其结果就是形成各种疾病，如动脉 硬化、心血管疾病、癌症以及炎症、白内障等( h a l l i w e l l g u t t e r i d g e , 1 9 8 4 ；陈瑗和周玫。2 0 0 4 ) 人体在正常生理状态下，体内自由基的产生和清除处于动态平衡，但是许多外源性或内源性刺激 均可使人体内氧化还原状态趋向氧化。生物体许多慢性疾病及衰老现象均与体内自由基水平失衡 有关，过量的自由基可对机体产生氧化性损伤，当这种损伤不能及时修复并且积累到一定程度时 2 中国农业大学硕卜学位论文第一章 绪论 就会导致疾病的发生机体组织有两个途径来保护自己免于自由基的伤害g 一方面是超氧化物歧 化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等酶系对自由基的清除和吞噬作用；另一方面是低分子量的化合 物如维生素e 维生素c 、多酚类物质等非酶物质的保护作用目前的研究指出，除了内源性的 保护机钥外，外源性的抗氧化成分也可在抵御自由基侵害方面发挥重要作用在日常饮食中多摄 入一些天然的抗氧化成分可以防治一些与自由基损伤有关的疾病，如心血管疾病、癌症等，还可 以防止机体的衰老，因此研究大豆食品的抗氧化性具有重要意义 综上所述，如果利用发芽处理带来的大豆营养功能性的提高，尝试对传统的大豆制品进行改 一进，提高其营养及生理功艟，则是十分有益的同时，以每日三餐的。医食同源”来提高我国人 民的生话质量，预防和缓解中老年多发症的发生减轻国家和个人的医保负担，其社会意义和经 济意义也显然是十分巨大的。 1 2 国内外研究现状 1 2 1 发芽处理富集g a b a 研究 高等植物中g a b a 的合成主要由l - g i u 的脱羧反应而来，这一反应由l 谷氨酸脱羧酶催化 鼬橱和n n p s 给萝 叶片饲喂【1 4 c 】i 崩u 后，叶片内有大量【1 4 qo a b a 形成( s t r e e t e r & t h o m s o n ，1 9 7 2 ) ；t s l i s l i i 血和m m i 给茶叶饲喂鳓m o o l l 的【”n 】l m k 并在厌氧条件下培育6h 后，叶片中有大量【郇a b a 生成，从而证明g a b a 来源于l - g i u 的脱羧反应( t s u s h i d a m u n i , 1 9 8 7 ) 谷氨酸脱羧酶( g a d ) 存在于胞浆中，以5 磷酸吡哆醛为辅酶，存在c j “虻a m 结 合区域并能被其激活，能够不可逆催化其作用底物l - g l u ，最适p h 为5 8 ( i a n ge ta i 1 9 9 4 ) 。其反应 式如下： c o o h i c h - n h 2c h r n h 2 c l i o i 谷氨酸脱羧醇 i g a b a 转氨酶 i p k 一一，m 1 ：c 啦 钒 、吼啦 ic qii c o o hc o o hc o o h 谷氨酸 g a b a 琥珀酸半醛 田1 - ! g i n 转化为丙幂酸示意田 f i g 1 - 1t h et t a a s 五o r m a t i o no f g i u t a m i ca c i di n t op y m v i ca c i d 谷氨酸脱羧酶活性主要受胞内c a ”，c a m ( s n c d d c n e t a l ，1 9 9 5 ) 、p h 值( c r a w f o r d e t 吐，1 9 9 4 ) 及谷氨酸水平( s c o t t - t a g g e r t e t a l ，1 9 9 9 ) 的调控从图1 1 可以看出，增加g 蝴a 积累的可能途 径有两条：一是使谷氨酸脱羧酶的活性增加，加速g a b a 合成；= 是y 一氨基丁酸转氨酶和琥珀酸 半醛脱氢酶活性减弱，g a b a 降解转化速率减慢。但影响g a b a 代谢的主要因素是谷氨酸脱羧酶 因为谷氨酸脱羧酶是一系列酶促反应的第一个关键酶，对g a b a 代谢的调控起着决定性作用。 1 9 9 4 年，s a i k m 等人实验发现糙米经过发芽处理，其中的g a b a 召 量增加了4 1 0 倍( s a i k u s a e t a 1 ，1 9 9 4 ) ，引发了发芽米制品研究的热潮，并已开发出成熟的产品。还有研究者发现，只给大麦 3 中围农业大学硕仁学位论文第一章绪论 种子种子提供水，它们便利用自身酶系获得了比发芽前更高含量的g a b a ( y u a 甜a i , ，1 9 9 8 ) 研 究证明，g a b a 的合成与大豆种子的抵抗逆环境有关在保护细胞膜及抵抗环境污染、涝渍和干 旱所造成的氧化逆境过程中，对活性氧的清除是植物体重要的保护机饲( b o w n s h e l p , 1 9 8 9 ) s m i m o f f 和c e m b e s 的体外实验表明外源脯氨酸、甜菜碱、肌醇，山梨糖醇、g a b a 等多种物质都 具有清除活性氧的功能，并且在相同浓度( 1 6 r a m ) 下。外源g a b a 的清除活性氧功能要远高于 脯氨酸和甜菜碱的清除功能( s i r m m o f f c e m b e s 。1 9 8 9 ) s h e l p 等人发现发芽大豆种子的g a b a 代谢途径与缺氧有关系( s h e l p 矗a 1 1 9 9 5 ) 。o h 和q 帕i 研究了g a b a 和谷氨酸脱羧酶在大豆幼苗 中的含量变化情况，发现在根尖部分g a 队含量占到了总游离氨基酸的1 2 3 。而在子叶中只占 到4 2 ，而谷氨酸的分布情况则刚好相反，谷氨酸脱羧酶活性在根尖部位也是最高的，从而证明 了大豆幼苗生长发育最旺盛的组织既是g a b 甜台成最旺盛的，同时也是g a b a 台 量最高的部分 ( o h c l m i , 2 0 0 1 ) 日本很多研究者对糙米进行发芽处理，探隶合适的富集g a b a 的发芽条件，可使发芽糙米中 的o a b a 含量成倍提高。张燕( 2 0 0 6 ) 的研究也表明优化糙米的发芽工艺条件可使发芽糙米的 q a b a 含量达到白米的9 倍以上但目前还没有以富集g a b a 为目的，对大豆发芽工艺条件优化的 相关报道 1 2 2 发芽处理对营养特性的改善 大豆中的抗营养因子根据其稳定性又可分为两类，即热不稳定性抗营养因子( 如蛋白酶抑制 因子血球凝集素、致甲状腙肿因子和抗维生素) 和热稳定性抗营养因子( 如抗原成分，皂角苷、 氰类化合物，植酸盐、低聚糖类和细胞溶丙氨酸) 大豆中的胰蛋白酶抑制因子引起蛋白质利用率的下降其主要有以下两方面原因： ( 1 ) 导 致蛋白质消化率下降：胰蛋白酶抑制因子可和小肠液中胰蛋白酶结合，生成无活性的复合物，降 低有活性胰蛋白酶的浓度；( 2 ) 引起动物体内蛋白质内源性消耗：肠道中胰蛋白酶由于和胰蛋 白酶抑制因子结合。通过粪便捧出体外而数量减少，引起胰腺机能亢进分泌更多的胰蛋白酶， 补充到肠道中去胰蛋白酶中含硫氨基酸( 胱氨酸) 特别丰富，造成含硫氨基酸的内源性丢失。 引起含硫氨基酸缺乏而导致体内氨基酸代谢不平衡，引起生长受阻或停滞。 植酸在植物体内不是以游离态存在，虽然受到p h 值、金属离子类型和阳离子浓度的影响，但 其在p h 值为卵的范围内，几乎可以与所有的多价阳离子形成稳定的化合物。从而阻碍人体对矿 物质的吸收( 袁俊杰等，1 9 9 9 ；c h e r y a a , 1 9 8 0 ) 。 研究表明，发芽处理降低豆类中抗营养因子的含量，消除或降低其抗营养作用，从而提高豆 类的营养效价许多发展中国家将发芽作为常用的改善食品营养、制作膳食补充食品的方法。非 洲牛西部如尼日利亚等国家将将小米，高粱发芽后煮粥，作为婴幼儿的膳食补充。研究表明，发 芽可有效地增加淀粉原料的能量与营养密度( n n a n y c l u g o e t 4 l 2 0 0 3 ) 。豆类蛋白也是埃及人的主要 蛋白来源，但由于其抗营养因子的存在，使其应用受到限制，发芽也是常用的去除或减少抗营养 因子的手段( 日a d “，ye t a l ，2 0 0 3 ) 。豇豆是尼日利亚人重要的蛋白来源，常用于婴儿断奶食品 为了改善其营养与功能特性，发芽是其中常用的一种加工方法。s u n d a y ( 2 0 0 0 ) 研究了发芽与未 发芽豇豆种子的化学组成与功能性。发现发芽处理增加了租蛋白含量，总磷量，可溶性氮。吸脂 性和起泡性，降低了乙醚提取物、多酚及植酸的含量、吸水性、堆积密度和起泡性。未发芽的种 4 中国农业大学硕卜学位论文 第一章绪论 子吸水性很强，而发芽的种子吸脂性强( g i a 商甜4 l2 0 0 1 ) 蚕豆、碗豆与小扁豆发芽7 2 h 后，其 总蛋白、脂肪与蒽糖( 淀粉，还原糖、水苏四糖、蜜三糖) 的含量显著下降。而非蛋白态氮与纤 维素等含量明显增加。各种抗营养因子都在发芽后大大减少，如蛋白酶抑制剂、丹宁酸在发芽后 大幅度下降，植酸、红血球凝集素活性随着发芽时间而减少发芽显著改善了蛋白消化率、可溶性 指数、吸水率和乳化能力、起泡性及泡的稳定性( s a n d h i r a 4 l2 0 0 2 ) 1 2 3 发芽大豆食品研究 苗颖等人( 2 0 0 2 ) 以大豆芽为主要原料制成豆乳，并以豆乳的植酸分解率和豆乳感官水平为 评价指标，确定了最佳发芽条件为发芽2 天，发芽温度为2 5 c 郑丽娜等人( 2 0 0 6 ) 则以发芽大 豆和牛乳为原料，开发了复合乳制品。他们将大豆经发芽处理后，以不同比例与牛乳混合制成复 合乳，利用合适的发酵条件，研制成了具有与酸牛乳有相同外观组织状态的混合酸乳对发芽 大豆乳制品的开发具有一定实际意义 1 3 存在的问题 通过检索国内外专利、文献，发现目前关于发芽大豆研究中主要存在以下问题： 不同的研究者对大豆进行发芽处理时选择的温度和时间不同，因此，不能从国内外关于 大豆发芽过程中g a b a 含量变化的报道中找出其变化规律。根据发芽糙米富集g a b a 的研究经验， 发芽温度、时间等因素对功能因子g a b a 名t 量影响很大，而国内外未见以g a b a 为富集目标的发 芽工艺研究的相关报道 抗营养因子的含量与发芽条件有很大关系，有必要研究在富集g a 队的发芽条件下大豆 营养特性的变化。 关于大豆进行过发芽处理后制作传统豆制品尚属空白 馀了g a b a 含量的增加带来的降血压能力，发芽处理还能否给大豆带来其他功能性的改 善，例如抗氧化能力 1 4 研究的内容和目标 本课题是基于上述背景和我国大豆和发芽食品的研究现状而提出，主要目标是通过发芽处理 提高大豆营养和功能特性，开发新的具有功能性的大豆制品本课题的主要研究内容有： ( 1 ) 选取铁丰2 9 号( 东北大豆品种) 为研究对象，以g a b a 的变化为应变量，对影响大豆发芽 的不同因素进行单因素试验，然后用响应面法( r s m ) 进行实验设计，主要以g a b a 的含量作评 价指标，得出大豆发芽的最佳生产工艺： ( 2 ) 在该最佳工艺下，研究发芽处理对大豆营养特性的改善作用： ( 3 ) 探索以发芽大豆为原料制成传统豆制品豆浆和豆腐的可能性，提高传统豆制品的营养功能 性； “) 研究发芽处理对大豆及其豆腐制品的抗氧化性的影响。 5 中国农业大学硕十学位论文 第二章大豆发芽与g a b a 富集 2 1 前言一 第二章大豆发芽与g a b a 富集 大豆种子含有大量的贮藏物质，蛋白质和脂肪等。这其中也包括酶，如蛋白酶，淀粉酶、核 酸酶、脂肪酶等。萌发前它们都以结合态贮存于子叶中当种子吸胀后，使部分贮藏物质变为溶 胶与此同时。酶由结合态转化为游离态，而发挥其酶解作用。使籽粒中不溶于水的物质转化为 可供种子利用的物质。发芽处理可激活大豆种子中的酶系，对g a b a 合成代谢产生影响。 高等植物中g a b a 合成代谢途径如下式表示： h o o c - c h z - c h 2 - c h c o o h 釜氲酸h 0 l x 飘“m 腮n 扎舶t i脱羧酶 ( 谷氨酸)nh2(gaba) g 蛆a 含量的多少与水分氧气的供给、发芽时间、发芽温度等发芽工艺条件有重要关系。三 枝贵代( 2 0 0 1 ) 在研究发芽糙米时发现，富集温度6 0 、时间2 0 r a i n 会使g a b a 的富集被限制；p h8 时g a b a 含量也很低。g a b a 最佳富集条件是4 0 、口h5 5 ，说明这是米胚芽中谷氨酸脱羧酶 ( g a d ) 的最适作用条件在此条件下米胚芽浸泡4h ，可使g a b a 富集到未富集前的1 0 倍左右。 国内的一些研究者也同样发现，发芽工艺条件会对糙米富集g a b a 的能力产生重要影响( 黄迪芳， 2 0 0 4 ；张燕，2 0 0 6 ) 根据发芽糙米富集g a b a 的研究经验，发芽温度，时间等因素对功能因子g a b a 含量影响很 大，而国内外还未见以g a b a 为富集目标的大豆发芽工艺研究的相关报道基于此。本章即对大 豆发芽富集q 蚍艺进行研究首先研究大豆发芽过程中与g a b a 合成代谢相关的关键酶( 谷 氨酸脱羧酶) 和底物( 谷氨酸) 的动态变化规律，然后对其发芽工艺进行研究，即对影响大豆发 芽的浸泡时间、培养温度、培养时间三个因素先进行单因素试验。用响应面法( r s m ) 进行实验 设计，以g a b a 的含量作评价指标，得出大豆发芽富集g a b a 的最佳工艺条件 2 2 材料与方法 2 2 1 试验材料 试验材料见表2 - 1 6 中囝农业大学硕卜学位论文 第二章大豆发芽与g a b a 富集 襄2 - 1 试验材料 ! 些至! 丛磐里坐堑坚匹虫兰氅 材科名掾 说明来源 2 2 2 仪器与设备 仪器与设备见表2 - 2 襄2 - 2 仪嚣与设鲁 ! 型! z ：2 生理塑些垒! e 匹蜜氅坐 仪器名称 型号生产厂家 7 中国农业大学硕十学位论文 第二章大豆发芽与g a b a 富集 2 2 3 实验方法 2 2 3 1 发芽大豆样品制备 首先进行人工精选，去除无胚粒。异色粒，未成熟粒及石子等杂质。取：a ) 0 9 大豆置于烧杯 中用2 0 0 0 m l 自来水冲洗3 遍，洗去表面的灰尘，沥干烧杯内的水用5 0 0 m l 蒸馏水冲洗2 追，然 后用0 0 5 次氯酸钠溶液浸泡3 0 m i a 对大豆种子进行表面杀菌，加入量以淹没种子为宜，然后将 次氯酸钠溶液倒掉，用蒸馏水清洗大豆，去除表面的次氯酸钠，沥干烧杯内的水后，再加入蒸馏 水在室温条件下浸种8 小时。浸种完成后将剩余的水倒出，将大豆分成6 份分别均匀地摊在6 个 底部有小孔的培养篮( 经过消毒) 中，盖上已消毒的纱布，加入适量蒸馏水，置于2 5 的恒温培 养箱中进行发芽3 天，每隔4 小时淋适量水以保持湿度。每隔1 2 小时用蒸馏水冲洗以免霉菌污 染每隔1 2 小时取出一培养篮发芽大豆，冻千后经粉碎过目筛备用。样品制各为3 个重复 2 2 3 2 发芽处理对大豆g a b a 合成代谢影响 1 蛋白酶活性测定 ( 1 ) 试剂配制 0 2 m p h 7 5 磷酸缓冲液：1 7 9 n a 2 h p o , 1 2 h ：, o 与4 9 9 9 n a h 2 p 0 4 2 啦0 混匀用蒸馏水定容 至1 l o - 5 酪蛋白：0 5g 酪蛋白溶于1 0 0m l0 2m p h 7 5 磷酸缓冲液 1 0 - - - 氯乙酸：5 0 9 三氯乙酸加3 , 4 5 0 9 蒸馏水 酪氨酸标准液：0 , 0 1g 酪氨酸溶于1 0 0r a l0 2 mp h 7 5 磷酸缓冲液。 ( 2 ) 测定方法 采用r a m a d a ( 2 0 0 5 ) 的方法，并稍加改进取1 9 样品置于4 5m i 离心管中。加入5m l 缓冲液 均质后，漫提1 h ，离心3 0 0 0 x 2 0 l a i n ，取上清液即为酶液。取酶液1m l ，加入酪蛋白2 0 m l ，4 0 摇匀，迅速反应2 0 m l n ，用1 0 t c a 2 0m l 中止反应，离心3 0 0 0 x 1 0r a i n ，取上清液，用分光 光度计在2 7 5l i r a 处测光密度值 作空白对照实验：样品处理同上。取1 a 2 0n d ，酪蛋白2 om l ，酶液l m l 混匀，迅速反应 2 0r a i n ，离心3 0 0 0 x 1 0r a i n ，取上清液用分光光度计在2 7 5 衄处测光密度值 以吸光度为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标绘制标准曲线将在上述条件下l m l 酶液在1m i l l 释放出相当于1 鹏酪氨酸的酶活定义为一个酶活单位。 2 游离氨基酸测定( 茚三酮比色法) ( 1 ) 试剂配制 2 茚三酮溶液：称取茚三酮1 og 溶于2 5m l 热水，加入氯化亚锡( s n c h h ! o ) 4 0m g ( 作防 腐剂) 过滤，滤液置冷暗处过夜。定容至5 0m 1 磷酸盐缓冲液( p h s 0 4 ) ：准确称取磷酸二氢钾( i g 1 2 p 0 4 ) 4 5 4g 于烧杯中，用少量蒸馏水溶解， 定容于5 0 0 m i 容量瓶中，稀释至刻度。称取磷酸氢二钠( n a 2 h p 0 4 ) 1 1 9 4 9 于烧杯申，用少量蒸馏 水溶解，定容于5 0 0m l 容量瓶中，稀释至刻度，摇匀备用取上述配好的磷酸二氢钾1 0 0m l 和 1 9 0m l 磷酸氢二钠溶液混合均匀即为p h 8 ，0 4 磷酸盐缓冲液。 氨基酸标准液：称取甘氨酸标样2 0 珥g ，加水配制成2 0 0m g l 的氨基酸标准液。 8 ( 2 ) 测定方法 标准曲线绘制：准确吸取2 0 0 嘲皿的甘氨酸标准溶液o o 、n 5 、1 0 1 - 5 ，2 0 、3 0 m l ( 相当 于0 ，1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0 、5 0 0 、6 0 0 m g 氨基酸) 。分别置于试管中各加水补充至体积4 f om i t 然后加入茚三酮和磷酸缓冲液各1m 1 混合均匀于水浴上加热1 5r a i n 。取出迅速冷至室温，加 水1 9m i ，摇匀，静置1 5n f i n ，在波长5 7 0 波长下。以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸 光度以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线 样品的测定；准确称取1g 豆粉于5 0m l 烧杯中。加求2 5l n l ，水浴锅浸提3 0r a i n ，离心 ( 3 5 0 0 x1 5m i n ) | , 取上清液并定容至2 5 耐，取3m l 样品液，加入水，茚三酮、磷酸缓冲液各1 m i ，其余过程同标准曲线 一一一 3 谷氨酸脱羧酶活性测定 ( 1 ) 谷氨酸脱羧酶的提取 取5 9 发芽的大豆匀浆，加入1 0 m l 的磷酸缓冲液提取【5 0 i n m o l ，l n | 2 l ，o 口h h 2 p ( p h 5 7 ) ；0 2 m m o f l p i p ；2 m m o f l e d t a ；1 m m o f l p m s f ；0 2 ( v v ) 1 3 巯基乙醇：l ( w v ) 聚乙烯毗咯烷酮 f p w _ ) ；, 0 1 5m o f l n a c l ，用均质机均质均匀，静止提取7 h 于4 0 0 0r i n 血下离心5 r a i n ，得到的上 清液即为粗酶液，以备酶活性的测定之用 ( 2 ) 谷氨酸脱羧酶活性的测定 谷氨酸脱羧酶活性的测定采用比色法( a n t o i n e e t a l ，2 0 0 1 ；许建军等，2 0 0 4 ) l 取o 2m 1 5 0 m m o l l 的磷酸缓冲液( p h5 a 其中含l m s g 及0 2m m o l l 的p l p ，加入1 m l 待测酶液和0 1 m l 蒸馏水，于3 7 1 2 水浴中保温3 0 r a i n ；然后迅速置于冰浴，加入o 2 m 1 0 2 m m o f l p h 9 o 的硼酸缓冲 液，1 m 1 6 的重蒸酚溶液，o 4m l 有效氯为9 的次氯酸钠溶液，充分振荡；沸水浴1 0 r a i n 后，立 即冰浴2 0 r a i n 并不断的振荡。直至有蓝绿色化合物出现，然后加入2 m 1 6 0 的乙醇于6 4 5n m 下比 色以所得的吸光度之差作为相对酶活值( ) 。 空白对照实验：取0 2n l l 5 0 m m o f l 的磷酸缓冲液( p h 5 刀，其中含l m s g 及0 2 m m o l l 的 p l p ，加入lm l 待测酶液和o 1m l 蒸馏水，d 2 面0 2m m o f lp h 9 0 的硼酸缓冲液于3 7 水洛中 保温3 0m i n ；然后迅速置于冰浴，加入1m l6 的重蒸酚溶液，o 4m l 有效氯为9 的次氯酸钠溶 液，充分振荡。其余步骤同上 4 发芽过程中谷氨酸和十氨基丁酸含量的测定 n ) 样品提取 9 中国农业大学硕士学位论文第二章大豆发芽与g a b a 富集 发芽豆粉5 0 9 卜提取液( 1 5 m l l o - - k l , f 睦) 涡旋1 m i a , 3 7 c 水浴振荡锅中提取4 小时 0 离心1 2 0 0 0 x g , 4 。1 5 m i n 上清液残渣 上清液 1 5 m ll o 三氯乙酸 残渣 上 弃去 合并、上清液 1 | 定容2 5 n d i 4 c 保存( 待衍生) 圈二1 样品提