（食品科学专业论文）葡萄酒中不良代谢物的安全性研究.pdf

葡萄酒中不良代谢物的安全性研究 摘要 葡萄酒中的不良代谢物是在葡萄酒的酿造过程中，由于发酵作用和其他代谢活 动同时存在，产生的有毒的、致癌的或者影响葡萄酒风味的发酵副产物，如甲醇、 杂醇油、氨基甲酸乙酯、生物胺等，这些不良代谢物的存在影响了葡萄酒的质量 安全，是危害人类健康不可忽视的因素。当前迫切需要跟踪葡萄酒发酵过程，分 析检测不良代谢物的含量，建立对各种不良代谢物的测定方法和限量标准。进一 步对不良代谢物生成机制和防止、降低不良代谢物的生成作深入研究，确保我国 生产的葡萄酒的安全性。 目前，我国已对葡萄酒中的甲醇制定了限量标准，而对于其他不良代谢物， 如杂醇油、氨基甲酸乙酯、生物胺等还未作出相应的限量标准，葡萄酒的生产过 程中也缺乏对于不良代谢物的控制，影响了葡萄酒的质量安全，限制了葡萄酒行 业的发展。鉴于此，本文着重研究了不同工艺条件对葡萄酒中不良代谢物的影响， 并对各类葡萄酒中不良代谢物的含量进行了调查研究，为我国建立限量标准提供 了可靠依据。研究内容及结果如下： 1 本论文对葡萄酒中的氨基甲酸乙酯的测定方法进行了研究，采用固相萃取法提 取葡萄酒中氨基甲酸乙酯，然后用气相色谱法测定，色谱条件为：载气流速 1 0 m l m i n ；程序升温5 0 ( 1 m i n ) 一1 0 m i n 一1 5 0 一3 m i n 一2 2 0 ( 5 m i n ) ： 进样量2 0ul 。分析时间为3 8 分钟。比较了5 种净化柱提取除杂效果，选择 c l e a i l e r ts i l i c a 柱作为葡萄酒中氨基甲酸乙酯的萃取柱。以内标法定量，测得相 对标准偏差为1 6 、1 2 ，回收率在9 0 4 1 0 1 5 之间。 2 由于葡萄酒中不良代谢物都是在酿造过程中产生，不同的工艺条件，不良代谢 物的生成量有所不同。因此，本论文着重研究了不同工艺条件对葡萄酒中甲醇、 杂醇油、氨基甲酸乙酯、生物胺四种不良代谢物的影响。研究发现：使甲醇、 杂醇油、氨基甲酸乙酯、生物胺四种不良代谢物生成量相对较低的优化工艺条 件为：在常温下，选用x r 酵母普通接种量发酵，在酒精发酵前添加超力果胶 酶，选用31 m b a 乳酸菌进行苹果酸乳酸发酵。 3 本论文对各类葡萄酒中不良代谢物的含量进行了调查研究，研究发现：国产6 8 种成品酒中甲醇、杂醇油的含量水平分别为n 5 2 4 3 4m g l 、2 1 0 6 8 5 9m g l ，甲醇均符合国标要求，杂醇油含量不大于6 0 0 m g l 的占总数的9 4 1 。对 3 1 个z 坩原酒及2 4 个z 刑成品酒中的不良代谢物进行了测定，甲醇含量均符 合国标要求( 白葡萄酒限量1 5 0m g l 、红葡萄酒限量3 0 0m g l ) ；干红葡萄酒 杂醇油含量水平分别为2 3 8 6 4 5 1 6 5 4m g l 、3 4 3 0 5 4 1 2 6 6m g l ，干白葡萄 酒杂醇油含量水平分别为1 6 6 2 5 2 2 3 9 4m g l 、2 3 8 5 7 2 8 8 o om g l ；氨基甲酸 乙酯含量水平分别为7 4 l 3 0 9 3 “g l 、7 4 3 2 6 8 0 p g l ；生物胺含量水平分别为 o 1 4 5 8 8m g l 、0 0 5 5 5 8 m g l 。根据分析，初步确定不良代谢物的限量标准， 杂醇油6 0 0 m g l ( 干红) 、3 5 0 m g l ( 干白) ；氨基甲酸乙酯4 0 p g l ；生物胺1 0 m g l 。 关键词：葡萄酒，甲醇，杂醇油，氨基甲酸乙酯，生物胺，限量标准 i i s e c u r i 呵o nt h ea d v e r s em e t a b o l i t e si nw i n e a bs t r a c t s i l l c ef - e 珊e n t a t i o na i l do m e rm e t a _ b o l i ca c t i v i t i e se x i s ti nt h ep r o c e s so fb r e 丽n g w i n e ，t h ea d v e r s em e t a b o l i t e s ，w h j c ha r et o x i c ，c a r c i n o g e co rc a na 丘宅c tm ef l a v o ro f w i n e ，a r ep r o d u c e d ，s u c ha sm e t h a n o l ，如s e lo i l ，e t h y lc a r b a l n a t ea n db i o g e i l i c 锄i i l e s e t c t h e s ea d v e r s em e t a b 0 1 i t e sa f f e c tt h ew i i l e q u a l i 田a n ds a f e 毋a 1 1 da r eh a 彻m 1t o h u n l a j l sh e a l t h a tp r e s e n ti ti su r g e n tt ot r a c kf e m l e n t a t i o np r o c e s so fw i n e ，t oa j l a l y z e a n dd e t e c tm ec o n t e n to fa d v e r s en l e t a b o l i t e sa n dt oe s t a 【b l i s hd e t e m i n a t i o na n dl i m i t s t a n d a r d s t be n s u r et h es e c u d t yo fw i n ei nc l l i n a i ti sa l s oi m p o r t a i l tt os t u d yt ：h e m e c h a n j s ma i l dr e d u c t i o no fa d v e r s em e t a b o l i t e sf o m a t i o nf h r t h e r a tp r e s e n t ，t h ec 1 1 i n e s eg o v e m m e n th a se s t a b l i s h e dt h el i m i ts t a i l d a r df o rm 甜l a n o l i i l 埘n e ，b u th a s n te s t a b l i s h e dc o r r e s p o n d i n g1 i m i ts t a l l d a r d sf o ro t l l e ra d v e r s e m e t a b o l i t e s ，s u c ha sm s e lo i l ，e t h y lc a r b 锄a t e2 u l db i o g e m c 锄i n e se t c i nw i n e p r o d u c t i o n ，t h e r ei sl a c ko fc o n t r o l l i n ga d v e r s em e t a b o l i t e s i ti m p a c t st l l e 、杭n e q u a l i 付 a n ds a f - e 够a n dl i m i t st h ed e v e l o p m e n to fw i n ei n d u s t r y i n a s m u c ha st h e s es i t u a t i o n ，t l l i s p a p e rf o c u s e so ns t u d y i n gm ee f f e c to fd i f f e r e n tt e c l u l o l o g yo fw i n eo nt h ea d v e r s e m e t a b o l i t e sa 1 1 dr e s e a r c h i n gi n t ot h ec o m e n to fa d v e r s em e t a b o l i t e si nv a r i o u sw i n e n p r o v i d e sar e l i a b l eb a s i so ne s t a b l i s l l i n gl i m i ts t a i l d a 帕s t h ec o n t e n t sa 1 1 dr e s u l t si l lt h i s s t u d ya r ea sf o l l o w s ： 1 i nt h i ss t u d y ，t h ed e t e m l i n a t i o nm e m o do fe t h y lc a r b 锄a t ei n 、析n ew a ss t u d i e d s 锄p l ew a se x t r a c t e db ys o l i d p h a s ee x t i 乏屺t i o n ( s p e ) a n dt h e na n a l y z e db yg a s c h r o m a t o 掣a p h y ( g c ) t h eo p t i m a ls 印a r a t i o nc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：n o wr a t e w a s1 o m l m i n ，c 0 1 l l m n t e m p e r a t l l r ea st e m p e r a t u r ep r o g r a m ：5 0 ( 1 m i n ) _ 1 0 m i n _ 1 5 0 _ 3 m i n _ 2 2 0 ( 5 m i n ) ，s 锄p l es i z ew a s2 o 此：t h et i m eo f d e t e m i n a t i o n ，a 匹3 8m i n t h ee 行i c a c i e so ne x t r l c t i o no ff i v ee x t “l c t i o nc o l l 】m n s w e r ec o m p a r e da 1 1 dt l l ec l e a n e r ts i l i c ac o l u m nw a sc h o s e n i n t e m a ls t a l l d a r dm e t h o d w a su s e da st h eq u a n t i t a t i v ed e t e m i n a t i o n n l er s d sw e r e1 6 、1 2 a i l dt h e r e c o v e r yr a t e s 、e r e9 0 4 l01 5 r e s p e c t i v e l y 2 b e c a u s et h ea d v e r s em e t a b 0 1 i t e sa r ep r o d u c e di nt l l eb r e w i n gp r o c e s s ，d i 丘e r e n t c o n t e n to fa d v e r s em e t l b o l i t e sa r ep r o d u c e di nd i f 虽m e n tt e c h n o l o g y i nt l l i sp a p e r ， 、es t u d i e dt h ee f f e c to fd i f f e r e n tt e c k l o l o g yo f 、航n eo nm e t h a n o l ，m s e lo i l ，e t h y l c 拍a m a t ea n db i o g e n i ca m i n e s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m u mc o n d i t i o n si n w 1 1 i c ht h ec o m e n t so fm e t h a n o l ，m s e lo i l ，e t h y lc m a m a t ea n db i o g e l l i c 锄i r l e s 、e r er e l a t i v e l yl o ww e r ea sf o l l o w s ：a tr o o mt e m p e r a t u r e ，x ry e a s tw i t hg e n e r a l i n o c u l a t i o nw a sc h o s e n ，a n db e f o r ea l c o h o l i c f e r n l e n t a t i o n ， t h es u p e r - p o w e r p e c t i n a s ew a sa d d e d ，a n di nm a l o l a c t i cf e m e i l t a t i o n ，31m b al a c t o b a c i n u sw a s c h o s e n 3 i nm i ss n 】d y ，t l l ec o n t e n tl e v e l so fa d v e r s em e 讪0 1 i t e si i lv 撕o u sw i n e sw e r e i d e t e c t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt l l ec o n t e ml e v e l so fm e l a n o la i l dm s e lo i li n6 8 l 【i n d so f d o m e s t i cw i i l e sw e r e1 1 5 2 4 3 4m g l 、2 1 o 6 8 5 9m g l t h ec o m e n t s o fm e t h a n o la l lc o m p l i e d 谢t ht l l er e q u i r e m e n t so fg b i nt h ew i n e st h a tw e d e t e c t e d ，t h o s emw i l i c ht h ec o n t e n t so fm s e io i lw e r en o tm o r et h a n6 0 0 m g l a c c o u l l t e df o r9 4 1 w ed e t e c t e dt 1 1 ec o n t e n t so fa d v e r s em e t a b o l i t e si n31k i n d s o f 乃r p to r i g i n “w i n e sa n d2 4 妯n d so fz y p tf i i l i s h e dw i n e s ，t l l ec o n t e m so fm e t h a i l o l a 1 1c o m p l i e dw i t ht h er e q u i r e m e n t so fg b ( w m t e 、访n e15 0m g l ，r e d 、i n e3 0 0 m l ) 7 n l ec o m e n tl e v e l so fm s e lo i l i nr e dw i n e sw e r e2 3 8 6 4 5l6 5 4m g l ， 3 4 3 0 5 4 1 2 6 6m g l ，a n d 廿1 ec o n t e n tl e v e l so fm s e lo i li nw l l i t ew i l l ew e r e 16 6 2 5 2 2 3 9 4m g l ，2 3 8 5 7 2 8 8 0 0m l ；t h ec o n t e n tl e v e l so fe t h y lc a r b 锄a t e w e r e7 4 1 3 0 9 3 u g l 、7 4 3 2 6 8 0 g l ；t h ec o n t e n t1 e v e l so f b i o g e n i ca n l i n e s 、e r e 0 1 4 5 8 8m g l 、0 0 5 5 5 8 m g l a c c o r d i n gt ot h ea i l a l y s i s ，w ep r i m a r i l vg o tt h e a d v e r s em e t a b o l i t e sl i i l l i ts t a l l d a r d s ：f u s e lo i li s 6 0 0 m g l ( r e dw i i l e ) ， 3 5 0 m g l ( 州t ew i n e ) ；e t h y lc 曲锄a t ei s4 0 p g l ；b i o g 砌c 锄i n e si s1o m g l 髓y w o l m s ：诵n e ，m 甜1 锄o l ，觚e 1o i l ，e n l y lc a r b 锄a t e ，b i o g e l l i c 锄i n e s ，l i n l i t e d s 鼬d a r d s 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：缉捋啤 日期：殄眸6 月r 日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密 口，在年解密后适用本版权书。 指导教师签名：梆 日期：夕叫 年f 月f 踟 啪蝴日棚确泪鹕储阵 蝌 朋 伍期 上海海洋大学硕士学位论文 1 1 前言 第一章绪论 葡萄酒是新鲜葡萄或葡萄汁经发酵获得的饮料产品。在葡萄酒中除酒精外， 还含有许多其他物质，如甘油、高级醇、芳香物质、色素等。这些物质的含量与 比例决定了葡萄酒的种类和风味。葡萄酒中含有各种有机和无机物质，味道鲜美， 色泽怡人，它不仅是营养丰富的饮料，而且适量饮用，还能防止各种疾病，增强 人体健康，所以越来越被更多的我国消费者所青睐【l j 。我国葡萄酒工业发展几经沉 浮，近十几年来的发展速度较稳定，葡萄酒产量也逐年增高，虽然我国的葡萄酒 业正处于稳步上升的阶段，但葡萄酒安全体系尚不完善，质量安全隐患相对较大， 我们必须有足够的重视。 在葡萄酒的酿造过程中，会产生许多发酵副产物【2 】，其中包含许多不良代谢物， 如甲醇、杂醇油、氨基甲酸乙酯、生物胺等，这些不良代谢物的存在影响了葡萄 酒的质量安全，是危害人类健康不可忽视的因素。目前，我国已对葡萄酒中的甲 醇制定了限量标准，而对于其他不良代谢物，如杂醇油、氨基甲酸乙酯、生物胺 等还未作出相应的限量标准，葡萄酒的生产过程中也缺乏对于不良代谢物的控制， 影响了葡萄酒的质量安全，限制了葡萄酒行业的发展，因此对于葡萄酒中不良代 谢物的安全性研究势在必行，对于为我国建立限量标准提供可靠依据，使葡萄酒 生产达到优质安全的质量控制水平，使葡萄酒企业走向更加安全及健康的发展之 路，提升我国葡萄酒行业整体竞争力具有很高的实际意义。 1 2 葡萄酒行业现状及发展趋势 大约7 0 0 0 年以前葡萄栽培已经在小亚细亚里海与黑海之间开始，欧洲最早开 始种植葡萄并进行酿造的国家是希腊，随着罗马帝国的扩张葡萄栽培和葡萄酿酒 技术开始迅速传播。我国引入欧亚种葡萄是在西汉时期，张骞出使西域将葡萄从 大宛引入并引入了酿酒艺人，从此我国开始有了葡萄酒1 4 j 。 我国葡萄酒工业化生产始于1 8 9 2 年烟台张裕葡萄酿酒公司的建立，1 0 0 多年 来，葡萄酒业几经沉浮，近十几年来的发展速度较快，2 0 0 7 年全国葡萄酒年产量 达6 6 5 万吨，酿酒葡萄的栽培面积也达到9 0 万亩。 上海海洋大学硕士学位论文 随着产业政策的转变、社会生活的丰富、人们追求健康的意识不断加强，葡 萄酒作为一种健康时尚的饮品【5 】，越来越受到消费者的信赖。随着葡萄酒市场的发 展、葡萄酒知识的普及与葡萄酒文化的传播，人们对葡萄酒的了解越来越多，不 再是雾里看花般的盲目，消费者对葡萄酒的消费意识也日趋理性。这给葡萄酒业 的健康稳定发展创造了有利条件。另外，随着葡萄酒市场的细分，对产品风格与 质量的要求也越来越高且越来越多样化、个性化，因此我们必须提高产品质量， 以提高中国葡萄酒的水平与档次，提高葡萄酒与国外同类产品的竞争力。 入世以后，由于关税的大幅度降低，2 0 0 4 年葡萄酒的关税降为1 4 ，国外各 类档次的葡萄酒进入中国市场将会越来越多，进一步加剧了中国葡萄酒市场的激 烈竞争，面对国内外日趋激烈的竞争环境，国内葡萄酒行业应对的关键之一就是 产品质量，因此提高产品质量、丰富产品结构、满足差异化需求成为葡萄酒企业 的首要任务，唯此才能真正应对市场的竞争，才能使得中国的葡萄酒产业得到健 康有序的发展。 1 3 葡萄酒中不良代谢物的研究现状 葡萄酒中的不良代谢物是在葡萄酒的酿造过程中，由于发酵作用和其他代谢 活动同时存在，产生的有毒的、致癌的或者影响葡萄酒风味的发酵副产物，如甲 醇、杂醇油、氨基甲酸乙酯、生物胺等，这些不良代谢物的存在影响了葡萄酒的 质量安全，是危害人类健康不可忽视的因素。当前迫切需要跟踪葡萄酒发酵过程， 分析检测不良代谢物的含量，建立对各种不良代谢物的测定方法和限制标准。进 一步对不良代谢物生成机制和防止、降低不良代谢物的生成作深入研究，确保我 国生产的葡萄酒的安全性。 1 3 1 甲醇 甲醇( m e t h a n 0 1 或m e t h y la l c o h 0 1 ，缩写m e 0 h ) ，又名木醇，是脂肪簇醇类中最 简单的醇类。它是食用酒中的有害成分，也是最重要的卫生指标之一【6 j 。m e o h 在人 体内能逐渐累积，不易排出体外，即使少量也能引起人慢性中毒；食用4 1 0 m l 可 引起人恶性中毒，损害神经系统；食用1 0 m l 以上可致失明：3 0 m 1 可致死亡。m e 0 h 的蒸汽与眼接触，也可引起失明。其慢性中毒表现为头晕、头痛、视力模糊以及耳 鸣等。急性中毒可出现恶心、胃痛、呼吸困难、昏迷等症状，甚至死亡1 7 j 。正是由 于m e 0 h 具有以上生理作用，加上m e 0 h 与乙醇气味相近，导致人们对食用酒中m e o h 2 上海海洋大学硕士学位论文 含量超标或甲醇含量的差异根本无法用感官辨析出来。因而，为确保食用者生命 安全，国家对食用酒中m e o h 含量制定了限量标准。国标规定，葡萄酒中m e o h 最高 允许含量不超过3 0 0 m g l 。 1 3 1 1 葡萄酒中甲醇的来源 葡萄酒中m e 0 h 来源于酿酒的原料一葡萄。m e o h 不是发酵的直接产物，是葡萄在 酿酒过程中，经过发酵，由其中的果胶质水解而生成，即由果胶质中所含半乳糖 醛酸的甲氧基( 一o c h 3 ) 分解而生成【s 】。甲醇含量范围由于不同国家、产地的葡萄酒 及不同工艺过程而有差异。 1 3 1 2 甲醇的检测方法 ( 1 ) 品红比色法：甲醇在磷酸酸性条件下，被高锰酸钾氧化为甲醛，然后加入无 色的品红亚硫酸试剂，与甲醛作用生成紫色鲲型色素，根据颜色的深浅来检测白酒 中甲醇含量【i2 ，j 。 ( 2 ) 气相色谱法( g c 法) ：气相色谱分析是采用气体为流动相的一种层析方法， 由于气体为流动相，物质在气相中传递速度快，气态样品中各组分与色谱柱中固定 相相互作用( 吸附或分配) ，因而混合物通过气相色谱柱可以得到良好分离，再通过 检测装置进行鉴定，就能定性或定量地确定样品的组分【1 4 。1 7 。 ( 3 ) 顶空气相色谱法( h s g c 法) ：将样品置于密闭容器中，在一定的温度条件 下与其上方的蒸汽达到平衡后，采用适当的方法抽取上方的蒸汽以供气相色谱分 析，进而达到分析液体样品的目的。该方法具有样品制备简单、分析结果代表性强、 操作简单、快速，以及避免人为因素的影响、不受非挥发性组分的干扰等优点【l 8 ，1 9 1 。 1 3 1 3 降低葡萄酒中甲醇含量的方法 甲醇是由果胶分解而得，葡萄中的果胶质大部分集中在果皮上，带皮发酵的 红葡萄酒中的甲醇含量高于不带皮发酵的白葡萄酒。甲醇含量范围由于不同国家、 产地的葡萄酒及不同工艺过程而有差异。因此，可适当改变一些工艺条件，从而 降低甲醇生成量，但考虑到对旧的风味、稳定性等的影响采取该措施时需慎重田】。 1 3 2 杂醇油 杂醇油( f u s e lo i l ) 又称高级醇( h i g h e ra l c o h 0 1 ) ，是碳原子数大于2 的 脂肪族醇类的统称。目前从葡萄酒中检测到一百余种杂醇油类物质，比较重要的 有正丙醇、异丁醇( 2 一甲基一卜丙醇) 、异戊醇( 3 一甲基一卜丁醇) 和活性戊醇( 卜 戊醇，2 一甲基一卜丁醇) 等。杂醇油含量过高或过低都会对葡萄酒的风味产生不良 影响，含量过少会使葡萄酒的风味淡薄；含量过多会给人以辛辣、腐臭感和不愉 上海海洋大学硕士学位论文 快的苦涩味【2 3 。2 6 1 。杂醇油在人体内的氧化速度比乙醇慢，停留时间长，饮用一定 量后会使神经系统充血，引起口干和剧烈的头痛，俗称“上头 ；长期饮用杂醇 油较多的葡萄酒，会慢性中毒。在葡萄酒中杂醇油的含量一般在8 0 5 4 0 m g l 【2 7 之9 1 。 旧的国家卫生标准规定，每1 0 0 m l 酒中杂醇油( 以戊醇计) 不得超过0 1 5 9 或以异丁 醇与异戊醇计不超过0 2 0 9 ，新国标还未制定限量标准。 1 3 2 1 葡萄酒中杂醇油的来源 葡萄酒中杂醇油可由两种途径形成：( 1 ) 由葡萄糖代谢产生。由糖类提供生物 合成氨基酸的碳骨架，在其合成中间阶段，形成了a 一酮酸中间体，由此脱羧和还 原，就可形成相应的杂醇油。( 2 ) 氨基酸脱氨作用。实验证明，亮氨酸、异亮氨酸、 缬氨酸、苏氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等均能发生脱氨作用，从而生成相 应的杂醇油【i j 。 1 3 2 2 杂醇油的检测方法 ( 1 ) 分光光度法：取酒样蒸馏、稀释，加入对二甲氨基苯甲醛浓硫酸溶液，使 显色，然后进行比色测定，采用g b l 0 3 4 5 卜8 9 的方法绘制高级醇标准曲线，进而 由回归方程求出高级醇的含量1 3 0 3 引。 ( 2 ) 气相色谱法：酒类风味物质的分析方法有毛细管气相色谱法、毛细管气相 色谱一质谱联用法( g c m s ) 、顶空气体捕集技术( h e a d s p a c e a j l a l y s i s ) 和气相色谱一 嗅觉测量计( g c o ) 与g c s n i f f i n g 同时使用等方法，目前应用最广泛的是毛细管气 相色谱法和毛细管气相色谱一质谱联用法( g c m s ) 。杂醇油的分析方法多采用毛细 管气相色谱法，样品常压蒸馏后直接进行气相色谱分析，外标或内标法定量，具 有操作简单、快速的特点【3 4 - 3 8 】。 1 3 2 2 降低葡萄酒中杂醇油含量的方法 影响杂醇油形成的因素很多，不同工艺条件和不同种类酵母对其影响不同。 因此可以从酵母菌种改良和酿造工艺两个方面来降低葡萄酒中杂醇油含量，其方 法有：选择优良的葡萄酒酵母发酵、控制发酵温度、向发酵液或培养基中添加氮 源、延长陈酿时间等等，另外，醪液初始p h 值、加压处理、果胶酶的添加对杂醇 油的生成量也有影响，需进一步研刭删郴j 。 1 3 3 氨基甲酸乙酯 氨基甲酸乙酯( e t h y lc a r b 硼a t e ，简称为e c ) 具有致癌作用，其可以引起肺肿 瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等。1 9 7 1 年，l o f r o t h 和g e j v a l l 在葡萄酒中发现了e c ， 人体摄取e c 主要是通过饮用酒精饮料m 。调查显示，如果饮用e c 含量超过3 0 4 上海海洋大学硕士学位论文 1 0 。6 9 l 的酒，人饮用后患癌的机率大大增加。根据加利福尼亚环保机构的一项统 计数据得知，假设每个人的患癌症的机率为1 1 0 一，可推断e c 的摄入量大约为0 7 hg d 。可见e c 是危害人类健康的一个不可忽视的因素。 世界卫生组织对软饮料中e c 制定了限量标准。1 9 8 5 年，加拿大报道了某些酒 中e c 含量高，同年加拿大政府的卫生与福利组织规定了各类酒中的e c 限量标准： 佐餐葡萄酒3 0ug l ，强化葡萄酒1 0 0ug 儿，蒸馏酒15 0ug l ，烈性酒、水果白兰 地4 0 0 pg l ，日本清酒1 0 0 ug l 。美国的葡萄酒工业也对葡萄酒中e c 含量做出了 限定：佐餐葡萄酒1 5 l lg l ，餐后甜葡萄酒6 0ug l 。氨基甲酸乙酯已经成为2 0 0 2 年联合国粮农组织重点监控物质，并制定了国际标准，其含量不得超过2 0i lg l 。 2 0 0 5 年日本学者对上百种清酒和烧酒中的e c 含量进行了测定。普通清酒中e c 平均 含量为4 7ug l ，最大2 1 0i lg l ；储存3 年以上的清酒中e c 平均含量为1 8 3ug l ， 最大为1 1 0 0ug l ；烧酒中e c 含量最大为3 7ug l 。合成清酒中的e c 含量均低于日 本限量标准( 2 0 ug l ) 。我国在酒精饮料和发酵食品中尚未制定氨基甲酸乙酯限 量标准，也没有引起足够的重视。随着我国人民生活水平的提高，酒饮料的消费 量日趋上升，尤其是葡萄酒、米酒、啤酒等营养丰富的含酒精饮料更是人们消费 的热点，因此制定e c 限量标准势在必行【4 孓47 。 ，一 1 3 3 1 葡萄酒中氨基甲酸乙酯的来源m j 葡萄酒中的e c 主要是由尿素和乙醇反应形成的，其次，由氨甲酰磷酸和瓜氨 酸分别与乙醇反应形成e c 。由尿素和乙醇生成e c 的反应式如下： h 2 n c o n h 2 + c 2 h 5 0 h h 2 n c 0 2 c 3 h 5 + n h 3 在葡萄酒酿造中影响尿素含量的因素很多。一是在葡萄生长过程中，添加氮 源会使生成品葡萄酒中尿素含量增加。二是酵母发酵过程中，加入尿素作为氮源。 三是在酵母菌株本身内部代谢由精氨酸分解产生的。 但研究发现，影响e c 的生成量的因素除尿素和乙醇的浓度之外还有酵母菌株 的种类、葡萄汁中q 一氨基酸态氮的含量、发酵及贮藏温度等，其中反应温度对e c 的形成速度影响最大，加热可以加快e c 的形成。 有研究表明，温度每升高1 0 ，e c 的形成速度就增加约1 倍。有研究者对精氨 酸、瓜氨酸、氨、尿素和谷氨酸在葡萄酒汁发酵过程中对e c 形成的影响进行了研 究，结果表明，e c 的主要来源是由精氨酸分解而产生的尿素，由尿素形成的e c 远 多于由氨甲酰磷酸形成的e c ，由尿素形成的e c 量是成品葡萄酒中e c 含量的绝大部 分，因而形成e c 的主要前体物质是尿素。研究表明，在葡萄汁中、发酵过程以及 贮藏过程中，都存在形成e c 的前体物质。在葡萄酒的贮藏过程中，仍存在乙醇和 尿素形成e c 的反应，但此阶段形成的e c 的速度较慢。 上海海洋大学硕士学位论文 1 3 3 2 氨基甲酸乙酯的检测方法 ( 1 ) 二氯甲烷吸附+ 色谱质谱( g c m s 法) ：该法是先将e c 吸附到二氯甲烷液体 中再用g c m s 法分析e c 。方法是精确称取( 1 0 0 0 1 ) g 的液体样品置于1 0 0 m l 烧杯 中，加入1 n i ln 一氨基甲酸丙酯作为内标液，然后加入蒸馏水到4 0 0 0 9 ，将此液体 移入内填有e x t r e i u tq ec e li t e 的固相抽提柱中，用8 0 m l 二氯甲烷进行洗脱，收 集洗脱液，用旋转蒸发器在3 0 水浴中将洗脱液浓缩为2 m l 3 m l ，再用氮气将其 浓缩至1 m l ，将浓缩液移入自动进样瓶中，用于g c m s 分析1 4 踟5 0 j 。 ( 2 ) 固体微萃取+ g c m s ：先将样品用固体微萃取法吸附样品中的氨基甲酸乙酯， 然后用色谱质谱方法检测样品中的含量【5 。我国进出口商品检验行业标准s n 0 2 8 5 9 3 中，出口酒类中氨基甲酸乙酯残留量检测采用二氯甲烷提取，然后进行 g c m s 分析，该方法回收率低，色素等杂质多；国外多采用固相提取净化技术进行 样品提取。采用固相萃取技术对酒精饮料中氨基甲酸乙酯进行提取净化，然后用 g c m s 进行定性、定量分析的方法精度和效率都有了很大提高。 ( 3 ) 用二维或多维色谱一稳定同位素稀释质谱联用技术测定氨基甲酸乙酯：某些 白酒可采用二维色谱技术直接定量的方法，省去了测定之前复杂的化学处理，加 快了测定的速度。但是，此方法有一定的限制，并且偏差较大。另外可用同位素 标记，该标记用1 3 c ( 羰基) 和1 5 n ( 氨基) 标记，氨基甲酸乙酯( l e c ) 和多维色 谱质谱( g c g c m s ) 相结合的方法。将标记过的试样经化学前处理后，进行 g c g c c i m s 测定阱引。 ( 4 ) 气相色谱热离子检测器法：对于吸附有e c 的固体物质可用g c t s d ( 气相色 谱热离子检测器) 方法测赳5 4 1 。 ( 5 ) 高效液相色谱结合荧光监测器( h p l 0 _ f l d ) ：近来一种新的利用高效液相色 谱结合荧光监测器的方法公布于众，这种方法不需要对样品进行预处理【55 。但是 该技术还不够成熟，实验中所用的参数还在进一步摸索中。 1 3 3 3 降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量的方法 降低葡萄酒中e c 含量的方法大致有：第一是选育酵母菌株，使得酵母生产仅 够酵母本身生长使用，而不能释放到细胞外，从而减少葡萄酒中的e c 形成量。第 二是从酿酒工艺方面考虑，可适当改变一些工艺条件，从而降低e c 形成量，但考 虑到对旧的风味、稳定性等的影响采取该措施时需慎重。第三是添加酸性脲酶， 取出葡萄酒中的部分尿素。尿素是e c 的前体物，降低了葡萄酒中尿素的含量，就 可以降低葡萄酒中形成的e c 量。该方法操作简单、方便、有效，且对葡萄酒质量 无影响m 叫7 1 。日本已研制出用酸性脲酶清除葡萄酒中氨基甲酸乙酯的简易方法： 将5 m g 酸性脲酶粉末加入含有3 5 10 - 6 尿素的酒中，先在1 5 保持2 d ，后在3 0 保 6 上海海洋大学硕士学位论文 持1 4 h ，这样可使酒中尿素的含量几乎降至零m 。 1 3 4 生物胺 生物胺是一类含氮的脂肪族或杂环类低分子量有机化合物，通常分为单胺和 多胺两大类。生物胺是动物、植物和多数微生物体内的正常生理成分，在机体细 胞活动中发挥着重要作用。然而，过度摄入生物胺会使人体产生产生一系列应激 反应，可能引起头痛、呼吸紊乱、心悸、血压变化等不良症状，严重情况下，可 以引起大脑出血，甚至死亡垆6 删j 。 生物胺引起的食品安全问题，也就是生物胺的毒性作用。其中组胺对人类的健 康的影响最大，其次是酪胺。除了组胺、酪胺本身的作用外，其他生物胺的存在会 增强组胺和酪胺的不良作用。当食品中生物胺含量达到1 0 0 0m g k g 时会对人体健 康造成极大的危害。欧美及我国对部分食品中组胺含量做了限量要求：美国f d a 要 求进口水产品组胺不得超过5 0m g k g ；欧盟规定鲭科鱼类中组胺含量不得超过1 0 0 m g k g ；其他食品中组胺不得超过1 0 0m g k g ，酪胺不得超过1 0 0 一8 0 0m g k g ； 我国规定鲐鱼中组胺不得超过1 0 0 0m g 瞻；其他海水鱼不得超过3 0 0m g k g l 6 1 彤j 。 1 3 4 1 葡萄酒中生物胺的来源 葡萄酒中的生物胺是由乳酸菌在发酵过程中对氨基酸脱羧而产生的。在酒精 发酵结束后，几乎所有的红葡萄酒和部分白葡萄酒都需要进行苹果酸一乳酸发酵 ( m a l o l a c t i cf e r m e n t a t i o n ，m l f ) 。m l f 在乳酸菌作用下，将葡萄酒中苹果酸脱羧 生成乳酸和二氧化碳，二元酸向一元酸的转变，降低了酒的酸度。许多属的乳酸菌 具有氨基酸脱羧能力。葡萄酒中含有多种氨基酸，在乳酸菌产生的脱羧酶作用下脱 羧而生成组胺、酪胺、腐胺、尸胺及苯乙胺等生物胺。其中组胺、酪胺、腐胺为 葡萄酒中主要的生物胺。对葡萄酒中生物胺的分析表明，酒精发酵后葡萄酒中的生 物胺含量很低，但在经苹果酸一乳酸发酵后，葡萄酒中的生物胺的含量发生不同程 度的增高。早在葡萄醪液中就已经存在甲胺、乙胺、苯乙胺、异戊胺和尸胺，这些 生物胺在葡萄酒的酿造过程中可被微生物降解。葡萄酒中的生物胺随着酒种、产 区和酿造工艺等的不同，含量变化较大【6 孙6 j 。 1 3 4 2 生物胺的检测方法 目前，食品中生物胺的测定方法主要有高效液相色谱法( h p l c 法) 、毛细管 电泳法( c e 法) 、离子色谱法( i c 法) 、薄层色谱法( t l c 法) 和生物电化学法。 其中，以高效液相色谱一荧光检测法最为常用【67 ，6 8 】。 h p l c 法几乎可以分离所有的有机化合物，被多数研究者选择用于对食品中的 7 上海海洋大学硕士学位论文 生物胺进行分离和定量分析。许多食品中的生物胺在可见和紫外区域既没有满意 的吸收，也没有荧光成分，所以在采用h p l c 测定时，一般需要对生物胺进行化学 衍生处理。衍生有柱前衍生和柱后衍生之分。柱后衍生是样品经过色谱柱分离后， 先进入特殊的衍生设备中进行衍生化反应，再通过检测器鉴定分析。柱后衍生的 结果色谱图干扰少、重复性好、耗时少，并且实现了操作的程序化、自动化；但 所需的仪器设备昂贵，投资大。所以研发者多选择各种柱前衍生法。衍生试剂的 选择以衍生产物稳定性好、杂质少、衍生过程简单为原则。常用的柱前衍生剂有 邻苯二甲醛( o p a ) 、丹磺酰氯( d n s c 1 ) 、二硝基甲酰氯( d a b s c 1 ) 等l 眇7 7 1 。邻苯二 甲醛的优点在于衍生反应快，耗时少，生物胺衍生物的检测限可以达到f m 0 1 水平， 但缺点也很明显，即其仅与初级生物胺反应，衍生物不稳定，必须严格控制反应 条件，否则影响结果的重复性【7 8 7 9 1 。二硝基甲酰氯的稳定性最好，有结果表明，其 生物胺衍生物室温下可稳定4 周，一2 0 下稳定性超过1 年瞄。 检测器是h p l c 系统测定生物胺的重要组成部分。u v 检测器是h p l c 应用最多的 一种检测器，灵敏度较高；二极管阵列检测器是一种新型u v 检测器，已应用于生 物胺的检测；但荧光检测器对于生物胺衍生物具有更高的灵敏度和选择性峭。食 品中生物胺的种类较多，为了有效分离，一般选择混合流动相的梯度洗脱，从而 达到同时测定多种生物胺的目的。 1 3 4 3 降低葡萄酒中生物胺含量的方法 葡萄酒中的生物胺主要是由乳酸菌产生的，这些自然的生物胺产生菌广泛地 存在于葡萄酒中。如果m f l 采用自然发酵( 非接种发酵) ，则其发酵特性就无法控制。 因此，生产上应采用接种无h d c 活性的乳酸菌进行m l f 。这也是目前控制葡萄酒中 生物胺含量的最为有效的方法。研究发现，接种优选菌株进行m l f 后的葡萄酒，其 生物胺含量显著低于自然m l f 葡萄酒中的含量。这可能是因为接种的乳酸菌抑制并 消除了葡萄酒中的自然菌群，也可能是由于接种的乳酸菌降解了自然菌群产生的 生物胺。m l f 结束后，乳酸菌群体数量并不迅速下降，如果不及时采取终止措施， 乳酸菌就会利用葡萄酒中的氨基酸生成生物胺。这就要求在m l f 结束后应立即对乳 酸菌进行清除。可以采用的工艺方法包括：( 1 ) 添加足够的s 0 2 。m l f 结束后立即调整 总s 0 2 至1 0 0 m g l 或游离s 0 2 至3 0 m g l 。较高浓度的s 0 2 ，可以抑制葡萄酒l a b 的生长。 该方法最简单、最有效，在生产上广为采用；( 2 ) 尽早下胶、倒罐、去酒脚、澄清 或进行瞬间高温灭菌；( 3 ) 降低贮酒温度至1 5 左右；( 4 ) 添加溶菌酶。该酶对乳酸 菌具有很好的溶菌效果，随着p h 的增加，酶活增强。使用溶菌酶可以降低s 0 2 的用 量而且不影响葡萄酒的感官质量。溶菌酶的用量：白葡萄酒2 5 0 5 0 0 m g l ，红葡 萄酒1 2 5 2 5 0 m g l 【6 4 ，8 2 1 。 8 上海海洋大学硕士学位论文 1 4 本论文研究的目的和意义 葡萄酒产业在我国存在历史较短，基础薄弱。目前我国葡萄酒产业中，葡萄 酒质量安全隐患较大。生产环境中微生物污染( 包括霉菌病害、细菌病害) 仍十 分严重，如腐败微生物产生的黄曲霉素、红曲霉素等毒素及一些微生物的不良代