（食品科学专业论文）酶膜反应器水解酪蛋白连续制备ACE抑制肽的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文摘要 摘要 本论文研究了以牛乳酪蛋白为原料，通过将酶解反应与膜分离相耦合高效、 经济、连续地水解酪蛋白制取血管紧张素转化酶( a c e ) 抑制肽的技术。 本文首先进行了水解用蛋白酶的筛选及酶解条件的优化。以酶解液的a c e 抑制率、蛋白质得率为指标，通过单酶和双酶复合水解的相互综合比较，确定了 以中性蛋白酶作为本试验的水解用酶，并采用正交试验进行酶解条件的优化，得 到酶解反应的最佳条件为- 水解温度为4 0 。c ，p h 值为7 0 ，酶用量为2 0 0 0u g ， 底物浓度为8 ( w v ) ，酶解时间为2 h 。 继而本文研究了将酶解与膜分离耦合连续制备a c e 抑制肽的方法。通过综 合考察超滤膜包对原料蛋白质的截留、对酶的截留、膜通量以及膜包滤出液的 a c e 抑制活性，确定了以截留分子量( m w c o ) 5 k 的再生纤维素膜包作为试验 用的膜包，并通过优化得到了超滤条件为操作压力o 1 m p a ，底物浓度8 ( w v ) ； 在此基础上采用静态间歇式反应、半连续反应和连续反应3 种不同的模式进行 a c e 抑制肽的制备，结果表明静态反应的得率、单位时间产量和单位活力酶对 应的产量远小于半连续和连续反应，其中连续反应的得率达到4 3 4 ，单位时间 产量为6 2 8 4m g h ，单位活力酶对应的产量为0 2 3m g u ，产物的a c e 抑制率达 到了8 1 6 ( 1 m g m l ) ，整个系统能持续稳定反应8 h 以上；所得的a c e 抑制肽 产物经肠道蛋白酶消化后，a c e 抑制率升高，测得其i c 5 0 值为o 18 9m g m l ，是 同等条件下测得的卡托普利的i c 5 0 值( 0 0 0 0 3 5m g m l ) 的5 4 0 倍。 关键词：酪蛋白，酶膜反应器，a c e 抑制肽，连续制备 浙江大学硕士学位论文a b s t r a c t a b s t r a c t t h i sp a p e rr e s e a r c h e do nt h ee f f i c i e n t ，e c o n o m i ca n dc o n t i n u o u st e c h n o l o g yw h i c h a i m e da tp r e p a r i n ga c e ( a n g i o t e n s i ni - c o n v e r t i n ge n z y m e ) i n h i b i t o r yp e p t i d e s t h r o u g ht h ec o m b i n a t i o no fc a s e i ne n z y m a t i ch y d r o l y s i sa n dm e m b r a n es e p a r a t i o n f i r s t l y , t h ep r o t e a s e s s c r e e n i n ga n dt h eo p t i m i z a t i o no fe n z y m a t i cr e a c t i o nc o n d i t i o n s w e r ec a r r i e do u t u s i n gt h ea c e i ( a n g i o t e n s i ni - c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t i o n a c t i v i t y ) a n dy i e l d so fh y d r o l y s a t e sa si n d i c e s ，n e u t r a s ew a sc h o s e na c c o r d i n gt o m u t u a lc o m p a r i s o no fs i n g l ea n dd u a l - e n z y m ec o m p l e xh y d r o l y s i s o r t h o g o n a ld e s i g n w a sa d o p t e da n dt h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fe n z y m a t i cr e a c t i o nw a so b t a i n e da sf o l l o w s ： t e m p e r a t u r ew a s4 0 c ，p hw a s7 0 ，d o s a g eo fp r o t e a s ew a s2 0 0 0 u g ，s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o nw a s8 ( w v ) ，t i m ed u r a t i o nw a s2h o u r s t h e nt h et e c h n o l o g yt op r e p a r ea c e i p ( a n g i o t e n s i ni - c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t i o n p e p t i d e ) t h r o u g hc o m b i n a t i o no fe n z y m a t i ch y d r o l y s i sa n dm e m b r a n es e p a r a t i o nw a s s t u d i e d t h em w c o5 km e m b r a n ep a c k a g ew a sc h o s e na c c o r d i n gt ot h ec o m p a r i s o n o f p r o t e i nr e t e n t i o n ，p r o t e a s er e t e n t i o n ，m e m b r a n ef l u xa n dp e r m e a t e s a c e i a c t i v i t y , t h eo b t a i n e do p t i m a lu l t r a - f i l t r a t i o np r e s s u r ew a s0 1m p a ，s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o nw a s8 ( w v ) ；t h r e ed i f f e r e n tm o d e l s ：b a t c hr e a c t i o n ，s e m i c o n t i n u o u s a n dc o n t i n u o u sr e a c t i o nw e r es t u d i ea n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ey i e l d ，p r o d u c i v i t y p e rh o u r , p r o d u c t i v i t yp e rp r o t e a s eu n i to fb a t c hr e a c t i o nw e r em u c hl o w e rt h a nt h a to f s e m i c o n t i n u o u sa n dc o n t i n u o u sr e a c t i o n ，t h ey i e l do fc o n t i n u o u sr e a c t i o nw a s4 3 4 ， p r o d u c i v i t yp e rh o u rw a s6 2 8 4m g h p r o d u c t i v i t yp e rp r o t e a s eu n i tw a s0 2 3 m g u ，a c e ia c t i v i t yw a s81 6 ( 1m g m l ) ，t h er e a c t i o ns y s t e mc a np r o d u c e c o n t i n u o u s l ya n ds t a b l yf o rm o r et h a n8 h ；t h ea c e ia c t i v i t yo f t h ep r o d u c tw a s i n c r e a s e da f t e rb e i n gd i g e s t e dw i t hp e p s i na n dp a n c r e a t i n ，t h ei c 5 0o f a c e i pa n d c a p t o p r i lw e r er e s p e c t i v e l y0 18 9m g m la n d0 0 0 0 35m g m l k e y w o r d s ：c a s e i n ，e n z y m a t i cm e m b r a n er e a c t o r ，a c ei n h i b i t o r yp e p t i d e ，c o n t i n u o u s p r e p a r a t i o n 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝逛太堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：耆 厄屋 签字日期： 2 口口孑年月尸日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝婆太堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝塑太堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：鹰小互是 签字日期：粥年月罗日 导师签名： 二6 ，弭尹 签字日期：声吣猝 6 月，o 日 浙江大学硕：l ：学位论文致谢 致谢 在这两年的研究生生活即将结束、将要走上工作岗位之际，我最想表达的 就是对老师、家人和同学的感激之情。 首先要感谢的是我的导师冯凤琴副教授。两年来导师无论是在学业还是生 活上都给予了我无微不至的关怀，使我能够顺利完成学业。本论文从选题到实施、 论文的撰写和修改都凝聚了导师的智慧和心血，她丰富的理论和实践知识，严谨 的治学精神，一丝不苟的作风对给我留下了非常深刻的印象，将对我今后的发展 产生深远的影响。在此特向冯老师表达我由衷的感谢和最诚挚的敬意! 此外还要感谢同实验室的张辉师兄、王红艳、韦何雯、刘静、杜鹃、王恩 寒、张璐，何国庆老师实验室的王金玲师姐，研究生同学翟金亮、朱承亮、刘杰 尔等以及同宿舍的姚聪、许凯和张继泽，他们在平时的生活和实验工作中都给予 了我无私的帮助，使我的试验得以顺利完成。 最后还要特别感谢一直关心和鼓励我的在远方家乡的父母和亲戚朋友们， 他们的支持是我成长和进步不可或缺的动力。 老师的教诲，同学、朋友的帮助，亲人的真情我都将永远铭记于心，值此 论文完成之际，再次向所有曾经关心和帮助过我的人们表达我衷心的感谢! 李恒星 2 0 0 8 0 5 1 6 于浙大华家池 浙江大学硕- j 二学位论文 第一章引言 1 前言 第一章引言 高血压是最常见的心血管疾病，是目前全球范围内的重大公共卫生问题。 根据世界卫生组织预测，至2 0 2 0 年非传染性疾病将占我国死亡原因的7 9 ，其 中心血管病将占首位。同时，高血压又是冠心病、脑中风、心脏及肾功能衰竭的 最主要的发病因素，被国际上称为“无声杀手”。因此，高血压防治成为全球医务 界面临的一项艰巨任务。5 0 年代至今，我国共做过3 次全国性高血压流行病学 调查，结果显示我国高血压患病率上升的速度不断加快，上升的幅度逐年增加。 我国1 5 7 4 岁人群高血压患病率1 9 5 9 年为5 1 1 ，1 9 7 9 年为7 7 3 ，1 9 9 1 年 为1 1 8 8 。一项涉及9 4 万人的调查结果显示：我国仅有2 6 8 的患者知道自己 是高血压病人，服药率城市为1 7 ，农村为5 ；控制率城市为4 1 ，农村为 1 2 。因此，我国高压血的防治工作任重而道远，我国卫生部已于1 9 9 8 年宣布 将每年的1 0 月8 日定为高血压日1 1 捌。 根据各类药物在血压调节系统中的主要影响及作用部位，传统上将降压药 物分为五大类： 表卜1 抗高血压药物的分类3 】 t a b l e1 1c l a s s i f i c a t i o no fa n t i h y p e r t e n s i o nd r u g 类别 代表药物 干扰肾上腺素类神经药物 血管扩张药物 钙拮抗剂药物 利尿降压药物 血管紧张素转化酶( a c e ) 抑制剂 可乐定、美加明、利血平、甲基多巴 肼苯哒嗪、硝普钠 硝苯地平、维拉帕米、硫氮卓酮 氢氯噻嗪 卡托普利、洛沙坦、a c e 抑制肽 1 1 血管紧张素转化酶与高血压 血管紧张素转化酶( a n g i o t e n s i ni - c o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ，e c3 4 1 5 1 ) 是 浙江大学硕十学位论文 第一章引言 一种膜结合的二肽羧基肽酶( d i p e p t i d l yc a r b o n o x y p e p t i d a s e ) ，a c e 分子是一种糖 蛋白，含有维持其活性所必需的锌离了和氯离子。广泛存在于人体组织及血浆中， 在肺毛细管内皮细胞的含量最为丰富【4 1 。在高血压人群中有9 5 以上的患者是原 发性高血压，通过抑制血管紧张素转化酶的活性可有效地降低原发性高血压【5 1 。 1 2a c e 对血压的调节机理 a c e 是多功能酶，在体内肾素一血管紧张素系统( r e n i n a n g i o t e n s i ns y s t e m ， r a s ) 和激肽释放酶一激肽系统( k a l l i k r e i n k i n i ns y s t e m ，k k s ) 中，对血压的 调节起着重要的作用 6 1 在r a s 系统中，肾素能将血管紧张素原( a n g i o t e n s i n ) 水解释放出十肽的血 管紧张素i ( a n g i ) ，而a n g i 是a c e 的底物，a c e 能水解a n g i 羧基末端的二肽， 产生八肽的血管紧张素i i ( a n g i i ) 。a n g i i 是r a s 系统中最主要的生物活性成 分，而其前体a n g 和a n g i 则无活性。a n gi i 是已知最强的收缩血管物质之一， 它作用于小动脉，使血管平滑肌收缩，迅速引起升压效应；同时，a n g i i 通过刺 激醛固酮分泌，促进人体肾脏对n a + 、k + 的重吸收，引起钠贮量和血容量的增加， 使血压升高。在正常条件下，a c e 是a n g i i 生成的限速因素，a c e 的活性决定 了a n g i i 的生成量【7 l k k s 系统是机体内源性降压系统，激肽释放酶作用于本身无活性的激肽原， 产生具有血管舒张功能的激肽。a c e 可使具有血管舒张作用的激肽转变为没有 活力的缓释肽。a c e 活力升高破坏了正常体液中升压和降压体系的平衡，导致 血管紧张素i i 生成过多，而体系中扩血管物质激肽和前列腺素合成减少，两个系 统在a c e 的协同作用下，造成了人体内血压的升高【8 】。因此，对肾素活性高的原 发性高血压患者，如果服用a c e 的抑制剂，则血管紧张素i 的生成和激肽的破 坏均减少，血压必然下降，从而达到治疗的目的，这对占高血压总数的9 5 以上 的原发性高血压患者来说无疑具重大实际意义。 2a c e 抑制肽 a c e 抑制肽( a n g i o t e n s i ni - c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r yp e p t i d e ，a c e i p ) 指的是一类具有抑制a c e 活性的相对分子量较小的多肽物质，这些多肽的氨基 浙江大学硕七学位论文第一章引言 酸序列和肽链长度各不相同，但都具有类似的功能。a c e 抑制肽最早是f e r r e i m 在1 9 6 5 年从美洲茅头蝮蛇( b o t h r o p s j a r a r a c a ) 毒中发现的【引。1 9 7 7 年o n d e t t i 等合 成了第1 种口服有效的降血压药物卡托普开1 ( c a p t o p r i l ，化学名：巯甲丙脯氨酸， d - 3 - m e r c a p t o - 2 一m e t h y l - p r o p a n o y l - l - p r o l i n e ) ( 见表1 2 ) 1 0 】，以后研究者又合成和 提取了许多a c e 抑制剂类抗高血压药物。 表1 2 几种以抑制a c e 活性为机理的降血压药物 t a b l e1 2a n t i - - h y p e r t e n s i o nd r u g sa i ma ti n h i b i t i o no fa c e a c e 抑制肽链长一般为2 1 4 个氨基酸，其抑制活性与其特殊的肽链结构 密切相关。虽然a c e 抑制肽的结沟活性关系尚未建立，但这些肽显示了一些共 同特征：当抑制肽产物c 末端出现p r o ，或是芳香族氨基酸如p h e 和t y r ，亦或 出现一些脂肪族氨基酸如l e u 时，其抑制活性较高；同时，当序列中含有疏水氨 基酸时，亦可以使肽维持高活性；另外对于二肽的n 末端来说，具有脂肪族氨 基酸如v a l 和1 1 e 等，可以最有效地增加肽对a c e 的抑制【n l 。 2 1a c e 抑制肽的分类 为区分a c e 底物及真正的a c e 抑制肽，在检测肽的a c e 抑制活性前通常 将肽与a c e 共同孵育由此将a c e 抑制肽分为3 类：( 1 ) 抑制剂类型，这类肽 与a c e 孵育后其i c 5 0 值不变，即a c e 不能将这种肽水解，它的活性保持不变， 如i l e t y r 和i l e l y s t r p ；( 2 ) 前体药抑制剂类型，这类肽被a c e 或胃肠道消 化酶水解后转化为真正的a c e 抑制剂，如l e u l y s p r o a s n m e t ( i c 5 0 = 2 4 i t m ) 被 a c e 水解后生成活性更强的l e u l y s p r o ( i c 5 0 = 0 3 2 p m ) 。( 3 ) 底物类型，这类 肽被a c e 水解生成活性更低或无活性的肽片段，如p h e l y s g l y a r g t y r t y r p r o ( i c 5 0 = 0 5 5 1 a m ) 被a c e 水解成p h e l y s g l y ，a r g t y r 和t y r p r o ，i c 5 0 升至3 4 9 m t l 2 】 浙江大学硕士学位论文第一章引言 2 2 食品蛋白质来源的a c e 抑制肽 目前的a c e 抑制剂类抗高血压药物的作用机理是药物作为竞争性抑制剂与 a c e 结合，从而扰乱a n g i i 的正常形成。而大多数竞争性抑制剂与酶之间是非 共价结合，它们对酶活性部位的抑制是可逆的，因此药物作用时间不长，停药后 会产生血压反跳，同时这类药物吸收和排泄较快，从肾脏排出易损害肾功能，会 有一定的副作用。此外还有其他许多临床不良反应，如降压过度、持续性咳嗽、 味觉失真和血管神经性水肿等。随着人们健康意识的不断增强，对a c e 抑制剂 的安全性也更加重视。食品蛋白质来源的的a c e 抑制肽是一类具有a c e 抑制 活性的多肽物质，虽没有合成降压药降压作用强，但只对高血压患者起作用， 对血压正常者无压降作用，降压作用平稳，安全性高，容易吸收利用，可长期服 用达到预防、控制、缓解和辅助治疗高血压的目的，因而从不同的食品中提取 a c e 抑制肽成为了国内外科学家研究的一个热点，具有广阔的应用前景【1 3 1 。 大量研究表明，从天然蛋白质中可获得的各种功能活性肽，如降血压肽( a c e 抑制肽) 、阿片活性肽、免疫调节肽、抗氧化肽、抗菌肽、抗血栓肽、高f 值寡 肽等，其中具有降血压活性的血管紧张素转换酶抑制肽( a c e 抑制肽) 研究最为详 细【。1 9 7 9 年o s h i m a 等首次报道了从食品蛋白质中制取a c e 抑制肽，用细菌 胶原酶降解明胶获得了6 条分子量都在1 5 0 0 d a 以下的具有显著a c e 抑制活性 的小肽【1 5 】。 随后，人们对从天然食物蛋白中获得a c e 抑制肽展开了广泛的研究。到目 前为止，研究人员已从多种植物蛋白、动物蛋白，甚至微生物的自溶物中获得了 a c e 抑制肽【1 q ： ( 1 ) 陆地动物蛋白资源，如乳蛋白，肌肉蛋白，卵蛋白，血清蛋白等； ( 2 ) 植物蛋白资源，如大豆蛋白，蔬菜蛋白，麸皮玉米醇溶蛋白，大麦醇溶 蛋白，大蒜和油菜籽蛋白； ( 3 ) 海洋蛋白资源，如沙丁鱼、金枪鱼、鲣鱼、小虾、螃蟹、海藻的酶解物 中都发现了具有新的氨基酸序列的降压肽； ( 4 ) 我国的特色食品资源，如即墨老酒、腐乳汁中也发现了具有降压作用的 活性肽。 浙江大学硕上学位论文第一章引言 2 2 1 乳蛋白来源的a c e 抑制肽 目前，从牛奶蛋白质中提取a c e 抑制肽是研究最多也是最成熟的，已经从 酪蛋白、乳清蛋白和牛乳发酵制品中发现了很多a c e 抑制肽。牛乳中蛋白质主 要有酪蛋白和乳清蛋白，其中酪蛋白占8 0 左右，它含有a s l 、a s 2 、d 、佟酪蛋 白四种结构，其比例为3 4 ：8 ：3 3 ：9 。牛乳蛋白质构比较松散，易受各种蛋白 酶的作用而发生水解【1 7 1 。 酪蛋白来源 研究表明，完整的酪蛋白几乎没有a c e 抑制活性，而其酶解产物则具有较 高的a c e 抑制活性，说明这些小肽是隐藏于牛乳酪蛋白一级结构中的，通过酶 的水解作用，这些具有特定结构的小肽得以释放出来。 1 9 8 2 年s u z u k i 等首次从牛乳酪蛋白的水解物中获得具有a c e 抑制活性的 1 2 肽c e i l 2 ( f f 心f p e v f g k ) ，i c 5 0 为7 7 9 m o l l ，经氨基酸分析发现此肽 与a s l 2 酪蛋白2 3 3 4 位序列相同；1 9 8 5 年该研究者又用脯氨酸专一性内切酶 水解c e i l 2 得到了5 肽c e l 5 ( p h e p h e v a l a l a p r o ) ，它的a c e 抑制活性是 c e i l 2 的1 3 倍，同时从酪蛋白中分离出7 肽c e l 7 ( a v p y p q r ) ，经鉴定对应于 d 酪蛋白的1 7 7 18 3 氨基酸片断；随后他又在1 9 8 7 年从a s l 酪蛋白的胰蛋白酶 水解物中获得了6 肽( t t m p l w ) 和5 肽( f f 心) 1 5 , 1 8 ，o1 9 9 0 年，k a r a k i 等用酪 蛋白的胰蛋白酶水解物饲喂自发性高血压大鼠( s p o n t a n e o u s l yh y r e r t e n s i v er a t s ， 简称s h r ) ，饲喂量为3 9 k g 时，3 5 小时血压显著降低，当饲喂的食物中a c e 抑制肽占3 时，至第4 周末血压下降为1 6 3 士4 m m h g ( 对照组为1 7 7 士4 m m h g ) 1 1 明；19 9 4 年，y a m a m o t o 等用l c c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u sc p 7 9 0 蛋白酶水解0 【一酪蛋 白和p 一酪蛋白，之后通过两步反相高效液相色谱分离水解物，其中序列为l y s v a - l e u p r o v a l p r o g i n 的肽链通过s h r 实验显示具有很强的降血压活性【2 伽；1 9 9 9 年，h a i l e s e l a s s i e 等人用商业蛋白酶和微生物蛋白酶水解干酪，通过反相液相色 谱分离出一条具有a c e 抑制活性的短肽( y p f p g p i ) ，对应于b 酪蛋白的6 0 一 6 6 序列2 1 1 。 有一些专利也是通过酶解酪蛋白来制备a c e 抑制肽：r e c i o 等通过酶解牛 乳酪蛋白得到了具有a c e 抑制活性的肽，其序列为l e u l y s l y s i l e s e r - g l n 、 p r o t y r - v a l - a r g t y r - l e u 和a r g t y r o l e u g l y t y r t 2 2 1 ；v a n d e r 等用a s p e r g i l l u s 蛋 浙江大学硕士学位论文第一章引言 白酶水解酪蛋白，所得产品具有高含量的三肽v a l p r o p r o ( v p p ) ，i l e p r o p r o ( i p p ) 和l e u p r o p r o ( l p p ) ，它们均具有a c e 抑制活性，用于食品配料( u n i l e v e r ) 1 2 3 1 ； 霍贵成等以牛乳酪蛋白为原料，采用蛋白酶进行水解，再通过离心，脱盐，冷冻 干燥制备出高活性可食用的a c e 抑制肽产品1 2 4 ；t o l t o njk 等用胰蛋白酶水解酪 蛋白，经超滤分离得到了具有a c e 抑制活性的片段：1 2 c ( 9 0 7 ) 、6 c ( 3 9 6 ) 和 7 c ( 3 9 7 ) ，平均分子量为1 4 0 0 3 0 0 0d a 2 5 1 。 表1 3 来源于牛乳酪蛋白的血管紧张素转化酶i 抑制肽【2 6 1 t a b l e1 - 3b o v i n ec a s e i n - - d e r i v e da n g i o t e n s i n i c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r y p e p t i d e s 6 浙江大学硕士学位论文第一章引言 注：n d 未确定 撑i c 5 0 单位为i t g m l ! 这个序列也存在于a 酪蛋白f ( 1 4 6 - a ：1 4 7 ) ，f ( 1 5 9 - a ：1 6 0 ) 和p - 酪蛋白f 01 4 + 1 1 5 ) q 乳清蛋白来源 1 9 9 7 年，m u l l a l y 等研究了p 乳球蛋白、a 乳白蛋白和乳清浓缩蛋白( w p c ) 水解物的a c e 抑制活性，结果表明未水解的底物具有较低的a c e 抑制率( o 8 ) ， 且这四种酶解产物的a c e 抑制率与风味蛋白酶的酶解产物相比差异极显著( s i g 值 c d a ，即p h 值 酶用量 底物浓度 水解温度，使水 解度最大的组合为a l b 2 c 2 d 卜 ( 2 ) 对于得率，a c d b ，即水解温度 酶用量 底物浓度 p h 值，最佳组 合为a i b 2 c i d i 。 ( 3 ) 对于a c e 抑制率，d a c b ，即底物浓度 水解温度 酶用量 p h 值， 最佳组合为a l b 3 c l d 2 。 对正交试验结果中的水解度与a c e 抑制率用s p s s 软件进行相关分析结果 仍为不显著( 显著性为0 5 4 ) ，与前面试验所得结果一致，因此后面的实验将不 再考虑水解度的影响。 对得率和a c e 抑制率这两个指标进行极差分析，得到的反应条件最佳组合 有所不同，必需兼顾这两个指标，选择合理的最佳组合：从分析的结果可以看出 不同之处在于因素b 和d ，即p h 值和底物浓度。由于因素b 对得率和a c e 抑 制率的影响都是最小的，因此根据得率的结果选择p h 值相对较低的b 2 水平， 以减少反应体系消耗的碱量；因素d 对a c e 抑削率的影响最大，而对得率的影 响相对较小，因此为了保证较高的a c e 抑制率，d 因素水平的确定应根据a c e 抑制率的结果选择d 2 水平。 综合考虑后确定的酶解反应条件为a l b 2 c l d 2 ，即水解温度为4 0 。c ，p h 值 为7 0 ，酶用量为2 0 0 0u g ，底物浓度为8 。通过验证，在这个最佳反应条件下 产物得率为6 6 2 ，产物浓度为l m g m l 时对应的a c e 抑制率为6 3 3 。 4 3 2 双酶水解 根据单酶试验的结果，中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰酶的水 解产物都具有较高的a c e 抑制率，因此将这四种酶两两组合进行水解试验，测 定其水解产物的a c e 抑制率和得率，结果如表2 - 6 浙江大学硕士学位论文第二章酶的选择及酶解条件的优化 表2 - 6 双酶水解的试验设计 t a b l e2 - 6e x p e r i m e n t a ld e s i g no f d o u b l e e n z y m eh y d r o l y s i s 作用顺序试验结果 组合方式先加入的酶后加入的酶a c e 抑制率( )得率( ) 中性蛋白酶 中性蛋白酶碱性蛋白酶71 2 士2 36 0 4 + 2 4 碱性蛋白酶中性蛋白酶 7 4 4 + 1 64 9 9 4 - 3 5 + 碱性蛋白 同时加入 4 2 2 士2 4 2 8 1 4 - 1 3 碱性蛋白酶 碱性蛋白酶木瓜蛋白酶 6 3 5 4 - 1 65 0 6 4 - 2 1 木瓜蛋白酶碱性蛋白酶6 5 9 4 - 0 94 8 4 4 - 2 4 + 木瓜蛋白酶 同时加入 5 8 6 4 - 2 33 9 1 4 - 3 0 中性蛋白酶 中性蛋白酶木瓜蛋白酶 6 3 0 士1 75 5 9 士2 7 木瓜蛋白酶中性蛋白酶 6 8 8 + 3 04 7 9 4 - 1 6 + 木瓜蛋白酶 同时加入5 7 1 4 - 4 531 6 4 - 1 9 中性蛋白酶 中性蛋白酶胰酶6 9 4 4 - 1 55 0 1 4 - 2 2 胰酶中性蛋白酶 7 1 9 4 - 2 05 6 3 4 - 2 9 + 胰酶 同时加入 6 6 7 士1 1 4 4 1 士2 4 碱性蛋白酶 碱性蛋白酶胰酶 7 1 8 4 - 1 34 6 7 士3 4 胰酶碱性蛋白酶6 7 1 士2 45 6 4 4 - 3 1 + 胰酶 同时加入 6 1 3 4 - 2 13 8 6 4 - 1 8 木瓜蛋白酶胰酶 7 4 3 + 1 35 3 6 d ：1 7 木瓜蛋白酶 胰酶木瓜蛋白酶 7 0 3 + 0 751 2 4 - 2 7 + 胰酶 同时加入6 7 1 + 1 63 1 6 4 - 2 1 注：表中的a c e 抑制率对应的蛋白质浓度为1 0 m g m l 从表2 - 6 可以看出，在a c e 抑制率方面，所有双酶组合水解得到的产物的 a c e 抑制率无论和组合中任何一种酶单独作用时( 图2 2 至图2 6 ) 还是和中性 蛋白酶正交优化后( 表2 5 ) 的结果相比较低，同时在每一组合内，两种酶同时 加入所对应的结果比两种酶分别先后加入时低；在得率方面，所有组合的产物得 率与中性蛋白酶正交优化( 表2 5 ) 的结果相比差别不大，但是与所得的a c e 抑制率方面结果相似的是，在每一组合内两种酶同时加入对应的结果也比两种酶 分别先后加入时低。蒋菁莉等【9 1 1 和吴建平1 9 2 1 也观察到了类似的结果，究其原因， 可能是由于反应体系中某些被第一种酶释放出来的a c e 抑制肽恰好被加入的 第二种酶所降解，从而使产物的a c e 抑制活性降低。当两种酶同时加入时，酶 浙江大学硕士学位论文第二章酶的选择及酶解条件的优化 之问的相互水解作用也会使其活力降低，从而影响了酶对底物的水解能力和产物 的得率。综上所述，本试验不适合用双酶组合进行反应，因此最终选择在经正交 试验优化过后的中性蛋白酶的酶解条件下进行水解反应来制备a c e 抑制肽。 5 本章小结 ( 1 ) 以酶解液的a c e 抑制率、蛋白质得率和水解度为指标，综合考察了胰 酶，碱性蛋白酶，中性蛋白酶，风味蛋白酶，木瓜蛋白酶这5 种工业用酶制剂， 确定了中性蛋白酶为本试验较理想的水解用酶。 ( 2 ) 研究了5 种酶的酶解液水解度和a c e 抑制率的相关性，结果表明除木 瓜蛋白酶以外的其他4 种酶解液的水解度和a c e 抑制率的相关系数都较低( 小 于0 5 ) ，用s p s s 软件进行相关性分析的结果为不显著。 ( 3 ) 选择l 9 ( 3 4 ) 正交试验表，以水解度，得率和a c e 抑制率为试验指标 优化中性蛋白酶的酶解反应温度、p h 值，底物浓度、酶用量这4 个反应参数， 经过综合评价确立了最佳的酶解反应条件为：水解温度4 0 c ，p h 值为7 0 ，酶 用量为2 0 0 0u 儋，底物浓度为8 。 ( 4 ) 将经单酶筛选试验结果较好的中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和 胰酶这4 种酶两两组合进行水解试验，测定其水解产物的a c e 抑制率和得率， 结果表明：所有双酶组合水解得到的产物的a c e 抑制率均比组合中任何一种酶 单独作用时低，得率的变化不明显，因此本试验不适合用双酶组合进行反应，最 终采用正交试验的优化结果，以单一的中性蛋白酶进行反应。 3 9 浙江大学硕士学位论文第三章a c e 抑制肽的连续制备 1 引言 第三章a c e 抑制肽的连续制备 酶水解蛋白的过程是一个多底物，多产物、既有平行反应又有串联反应的 复杂系统。在用蛋白酶水解酪蛋白制备a c e 抑制肽的过程中，其酶解底物可以 是酪蛋白、胨、不同链长的肽等，产物可以是胨、不同链长的肽等。大部分水解 下来的片断既是产物又是进一步水解的反应物【9 3 1 。酪蛋白经过蛋白酶作用后， 可以得到具有较高a c e 抑制活性的酶解物，由于酶解物的成分复杂并且有效的 a c e 抑制肽相对分子质量多在1 5 0 0 以下，因此选择经济合理的分离方法富集 a c e 抑制肽是非常必要的【5 8 1 。目前用酶法水解蛋白质制备a c e 抑制肽的报道中 分离纯化多以产物的相对分子质量大小作为依据，超滤技术以压差为推动力，按 分子量的大小对物质进行分离，由于分离操作过程没有相变，可在较低的温度下 操作，节省能耗，在食品工业中已得到广泛的应用，在蛋白质及生物活性物质的 浓缩及分离方面具有重要意义。但是传统的静态间歇反应的不同批次的产品分子 组成差异较大，产品质量不稳定，相比之下在用酶膜反应器连续制备a c e 抑制 肽的过程中，水解产生的小分子肽透过超滤膜随滤出液移出酶解系统，使其无法 继续参加反应从而使产物中的分子量不会变化太大，产物的分子量分布相对集中 ( 7 5 1 。同时用酶膜反应器连续制备a c e 抑制肽相对于静态间歇反应还具有生产成 本低、酶的利用率高，易实现连续化工业生产等优点，因此具有广阔的应用前景。 本章的主要研究内容是：首先确定适用于分离a c e 抑制肽的膜材料和膜型 号( 截留分子量) 并优化超滤的工艺条件；然后将酶解反应和超滤分离耦合起来， 采用静态间歇式反应、半连续反应和连续反应3 种不同的模式进行a c e 抑制肽 的制备，对3 种模式的得率及生产效率等指标进行比较；最后对制备得到的a c e 抑制肽进行模拟体内消化过程的稳定性试验，同时与经典的降血压药物一卡托普 利( c a p t o p r i l ) 的a c e 抑制活性进行比较以确定a c e 抑制肽产物实际应用的意 义。 浙江大学硕士学位论文 第三章a c e 抑制肽的连续制备 2 材料，试剂和设备 2 1 材料和试剂 血管紧张素转化酶( a c e )s i g m a 公司产品 马尿酰组氨酰亮氨酸( h h l )s i g m a 公司产品 马尿酸国药集团化学试剂有限公司 干酪素云南香格里拉乳业开发有限公司 卡托普利片( c a p t o p r i l )深圳海王药业有限公司 n e u t r a s e ( 5 h 性蛋白酶)诺维信( 中国) 生物技术有限公司 胃蛋白酶北京鼎国生物科技有限公司 胰酶苏州三绿生物技术有限公司 其他试剂：氢氧化钠( 分析纯) ，盐酸( 分析纯) 、溴甲酚绿一甲基红指示剂、 福林酚试剂，浓硫酸( 分析纯) 、硫酸铜( 分析纯) 、硫酸钾( 分析 纯) 、硼酸( 分析纯) 、9 5 乙醇，三氯乙酸( 分析纯) 2 2 仪器设备 d f 1 0 1 s 集热式恒温加热磁力搅拌器巩义市英峪予华仪器厂 雷磁p h s 一3 c 型精密p h 计上海精密科学仪器有限公司 k j e l t e c2 3 0 0 全自动定氮仪f o s s 公司 a l i k et g l 1 6 g 离心机 上海安亭科学仪器厂 w a t e r s2 6 9 5 高效液相色谱仪及2 9 9 6 二极管阵列检测器 w a t e r s 公司 7 5 2 紫外可见分光光度计上海光谱仪器有限公司 j a l 2 0 0 2 型百分之一电子天平上海精密科学仪器有限公司 f a 2 1 0 4 型万分之一电子天平上海精科天平 d s k 1 2 型不锈钢新型电热恒温水浴锅沈荡中新电器厂 s h b i i i a 型循环水式多用真空泵河南省太康科教器材厂 k q - 2 5 0 e 型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司 1 0 1 - 3 a 型数显电热鼓风干燥箱上海锦屏仪器仪表有限公司 4 1 浙江大学硕上学位论文第三章a c e 抑制肽的连续制备 超滤装置( 包括p e l l i c o nm i n i h o l d e r 支撑架 m i l l i p o r e 公司 和p e l l i c o nm i n if i l t e r 膜包：b i o m a x p o l y e t h e r s u l f o n e10 k 和5 k ，p l c g c r e g e n e r a t e dc e l l u l o s e1 0 k ，5 k 和l k ) 3 试验方法 3 1 分析检测方法 3 1 1 蛋白酶活力的测定 同第二章的3 1 1 。 3 1 2 蛋白质含量的测定 准确量取5 m l 液体样品，移入干燥消化管中，加入0 2 9 c u s 0 4 、3 9 k 2 s 0 4 和1 0 m l 浓h 2 s 0 4 ，摇匀后置于消化炉消化，直至管内的液体成蓝绿色且澄清透 明后，再继续消化0 5 h ，取下冷却，于全自动定氮仪上蒸馏定氮并读数。 3 1 3 膜通量的测定 膜通量( j ) 是指单位时间内通过单位面积膜的透过物的体积。 j ：j l a 0 u 式中：g 为透过液体的体积，m l a 为膜的面积，m 2 ( 本试验用的膜包面积均为o 1 m 2 ) 0 u 为超滤时间，m i n 待膜过滤过程稳定后进行测定，用秒表计时，用量筒收集一定时间内膜包 的滤出液，读取滤出液的体积并根据公式计算膜通量。 4 2 浙江大学硕士学位论文第三章a c e 抑制肽的连续制各 3 1 4a c e 抑制活性的检测方法 同第二章的3 1 5 。 3 1 5a c e 抑制肽半抑制浓度o c 5 0 ) 的计算 将a c e 抑制肽稀释成不同浓度测定其a c e 抑制率，以a c e 抑制肽的浓度 为横坐标，a c e 抑制率为纵坐标，通过一元二次回归计算出半抑制浓度( i c 5 0 ) 。 3 1 6a c e 抑制肽的稳定性实验 模拟消化道的环境对a c e 抑制肽产物进行稳定性实验，参照b l a n c a t 9 4 】和 j i a n p i n g w u 【9 5 1 等的方法，略有改动，具体操作为： ( 1 ) 先将a c e 抑制肽配制成l o m g m l 的溶液，并用h c l 调整其p h 值到 2 0 ，加入胃蛋白酶，酶用量为8 0m g 酶儋蛋白质( 胃蛋白酶活力为8 0 0 u m g ) ， 在3 7 c 水浴反应2 h ，随后反应液在1 0 0 。c 水浴中加热5 分钟终止反应。 ( 2 ) 用n a o h 将经胃蛋白酶消化后的反应液的p h 值调整到7 5 ，加入胰酶， 酶用量为2 0m g 酶儋蛋白质，在3 7 。c 水浴反应4 h ，随后反应液在1 0 0 c 水浴中 加热5 分钟终止反应，1 0 0 0 0 r m i n 离心1 0 分钟，上清液用于测定a c e 抑制活性。 3 1 7c p p s 含量测定方法 测定原理 在c p p s 的酸性溶液中加入一定浓度的钡离子后，钡离子在c p p s 在分子间 形成桥梁，再加入一定浓度的乙醇即可使桥梁状的c p p s 分子团沉淀下来，将沉 淀过滤，干燥并称重，计算即可得知产品中c p p s 的含量。 测定步骤 ( 1 ) 量取5 0 m l 待测的肽液，用2 m o l l 的h c i 的溶液将p h 值调至4 7 。 ( 2 ) 加入1 0 b a c l 2 溶液使体系中b a