（食品科学专业论文）适合乳果糖制备的β半乳糖苷酶高产株的筛选及产酶条件的优化.pdf

摘要 摘要 乳果糖( 1 a c t u l o s e ) ，又称作乳酮糖、异构乳糖，是由半乳糖和果糖以b 1 ，4 糖苷键结 合的二糖。乳果糖属于非消化性低聚糖，具有低甜度、低热能、低致龋齿性、选择性的 促进人体肠道内有益菌增殖等生理学性质，在食品、保健品、药品的应用潜力很大。目 前商业上生产乳果糖的方法是用化学合成法，但化学合成法存在很大缺点如：大量的有 色副产物难以分离，分离这些副产物的成本较高并在分离的过程中使乳果糖降解，酶法 合成乳果糖可以克服化学合成的缺点。本论文以筛选适合生产乳果糖的p 半乳糖苷酶高 产菌株为目标，对产p 半乳糖苷酶的菌株诱变筛选、培养基及摇瓶培养条件优化、b 半 乳糖苷酶酶学性质研究、筛选所得菌株发酵罐发酵条件的确定和酶法合成乳果糖的过程 进行了系统的研究，实验结果表明： 以乳酸克鲁维酵母( k l u y v e r o m y c e st a c t i s ) 为出发菌株，物理诱变和化学诱变相结合 的方法，5 溴4 氯3 吲哚吡喃半乳糖苷( 简称x g a l ) 作为筛子，经过紫外诱变、超声 诱变和甲基磺酸乙酯( e m s ) 诱变，筛选出一株具有较高转糖苷活力乳果糖高产菌株， 菌株编号为乳酸克鲁维酵母k 1 a c t i s l 1 6 7 。该菌株产生的p 半乳糖苷酶以o n p g 为底 物的酶活较诱变前提高了3 o o 倍，以乳糖为底物的酶活较诱变前提高了2 7 5 倍，乳果 糖产量可达4 4 8 8 9 l 。对该菌株培养基及培养条件进行了优化。优化后的培养基配方为 酵母膏1 0 7 9 l ，蛋白胨f 4 0 3 为9 4 9 l ，乳糖1 2 1 9 l ，m g s 0 4 5 6 9 l ，k h 2 p 0 4 4 7 9 l 。 最佳培养条件为培养温度3 0 ，p h 6 0 ，装液量4 0 m l 2 5 0 m l ，摇床转速1 6 0 r p m ，接种 量6 ，培养时间2 4 h 。在最佳条件下酶活最大可达1 0 6 4 u m l 。 乳酸克鲁维酵母k 1 a c t i s l 1 6 7 p 半乳糖苷酶最适反应温度为4 0 ；最适p h 为7 o ； 1 、a + 、c u 2 + 对p 一半乳糖苷酶有抑制作用，c o ”、m 孑+ 、f e 2 + 、m n 2 + 对d 半乳糖苷酶具有 激活作用，其中m 9 2 + 的激活作用最大。 在摇瓶发酵基础上进行了2 l 发酵罐扩大实验，对发酵罐扩大实验的培养基和发酵 条件进行了优化。此时p 一半乳糖苷酶酶活约为3 3 4 7 u m l ，比摇瓶发酵提高了2 1 3 8 。 以乳糖和果糖为底物，由乳酸克鲁维酵母l 【l a c t i s l 1 6 7 p 半乳糖苷酶催化生成乳果 糖的最佳反应条件为：乳糖和果糖的最佳比例为质量比为2 ：1 摩尔比为1 ：l ，乳糖和果 糖的最佳浓度分别为4 0 ( w v ) 和2 0 ( w v ) ，加酶量为3 u m l ，反应温度为5 0 ， 反应体系p h 为7 o ，反应时间为1 0 h 。在此最佳反应条件下乳果糖的产量为5 7 8 3 e e l 。 关键词：乳果糖，乳酸克鲁维酵母k l a c t i s l 1 6 7 ，d 半乳糖苷酶，菌株筛选，发酵条件， 酶学性质 a b s t r a c t a b s t r a c t l a c t u l o s ea r ec o m p o s e do fg a l a e t o s ea n dg l u c o s eu n i tl i n k e db y1 ，4 一g l y c o s i d i cb o n d l a c t u l o s ea r ek n o w nt ob en o n - d i g e s t i b l eo l i g o s a c c h a r i d ew i t hl o ws w e e t n e s s ，l o wc a l o r i c v a l u e s ，l o wc a r i o g e n i c i t y , a n ds e l e c t i v e l yp r o m o t et h eg r o w t ho fb e n e f i c i a l b a c t e r i ai nt h e c o l o n s oi ti sap o t e n t i a li n g r e d i e n ti nf o o di n d u s t r y , h e a l t hi n d u s t r ya n dl e e c h d o m l a c t u l o s ei s c u r r e n t l yp r o d u c e db yc h e m i c a ls y n t h e s i s h o w e v e r ，t h i sm e t h o dh a ss e v e r a ld r a w b a c k s ，s u c h a sah i 曲l e v e lo fl a c t u l o s ed e g r a d a t i o na n dac o n s i d e r a b l ea m o u n to fc o l o r e db y p r o d u c t st h a t a r ed i f f i c u l tt os e p a r a t e t h er e q u i r e ds e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o ns t e p st or e m o v et h e s e b y - p r o d u c t sa r ec o s i l ya n dl c a d t ol o wl a c t u l o s ey i e l d s b i o p r o d u c t i o no fl a c t u l o s eb y e n z y m e si s t h e r e f o r ead e s i r a b l es t r a t e g yt oo v e r c o m et h ed i s a d v a n t a g eo fl a c t u l o s e p r o d u c t i o nb yc h e m i c a ls y n t h e s i s t h ep r i m a r yo ft h i sr e s e a r c hw a st os c r e e nah i g h - p - g a l a c t o s i d a s e - y i e l ds t r a i ns u i t i n gf o r l a c t u l o s ep r o d u c t i o n s t u d i e so nt h es t r a i ns c r e e n i n g ，o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nm e d i u m ，e - n z y m a t i ep r o p e r t i e sa n df a c t o r sa f f e c t i n gl a c t u l o s ef o r m a t i o nw e r es y s t e m a t i c a l l yc a r r i e do u t i nt h i sp a p e r t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s as t r a i ns u i t i n gf o rl a c t u l o s ep r o d u c t i o nw a so b t a i n e du s i n g5 - b r o m o 4 c h l o r o 3 - i n d o y l p - d - g a l a c t o p y r a n o s i d e ( x - g a l ) a si n d i c a t o rf r o mk l u y v e r o m y c e sl a c t i s 、) l ，i t l l 巩u l t r a s o n i c a n de t h y l m e t h a n es u l f o n a t e ( e m s ) a sm u t a g e n i tw a sc o d ek l u y v e r o m y c e sl a c t i sk 1 a c t i s l - 16 - 7 t h ea c t i v i t i e so fp g a l a c t o s i d a s et on i t r o d i p h e n o l p - d g a l a - c t o s i d e ( o n p g ) a n dl a c t o s e w e r ei n c r e a s e db v3 0 0t i m e sa n d2 7 5t i m e s ，r e s p e c t i v e l ya n dt h ey i e l do fl a c t u l o s er e a c h e d 4 4 8 8 9 l t h e nt h ef e r m e n t a t i o nm e d i u ma n dc o n d i t i o nw e r eo p t i m i z a t e d n i eo p t i m i z a t e d f e r m e n t a t i o nm e d i u mw a sy e a s te x t r a c t10 7 9 l ，p e p t o n e f 4 0 39 4 9 l ，l a c t o s e12 1g l ，m g s 0 4 5 6 9 l ，k h 2 p 0 44 7 9 l t h eo p t i m i z a t e dc o n d i t i o nw a st e m p e r a t u r e 4 0 。c ，p h 6 0 ，l i q u i dv o l u m e 4 0 m l 2 5 0 m l , r o t a t i o ns p e e d16 0 r p m ，i n o c u l u m 6 ，f e r m e n t a t i o nt i m e 2 4 h ，a f t e rt h eo p t i m i z a t - i o n ，t h ey i e l do f1 3 一g a l a c t o s i d a s ew a s10 6 4 u m l t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r eo f k l a c t i s l 1 6 7w a s4 0 t h eo p t i m a lp hw a s7 0 n a 十、c u + c a ni n h i b i tt h ea c t i v i t i e so f 3 g a l a c t o s i d a s ew h i l ec 0 2 + 、m g + 、f e 2 + 、l 、l n 2 + c a np r o m o t et h e a c t i v i t i e so fp g a l a c t o s i d a s e t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f 定l a c t i s l 16 7 迹2 lf e r m e n t e rw e r es t u d i e d n l ea c t i v e - i t i e sr e a c h e d3 3 4 讥，m la n di n c r e a s e d2 1 3 8 n l eo p t i m u ms u b s t r a t ea n de n z y m ec o n c e n t r a t i o n sw e r e4 0 ( w v ) l a c t o s ea n d2 0 ( w v ) f r u c t o s ea t3 0u n i t s m l ，r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s 5 0 。c t h eo p t i m a l p hw a s7 0 u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h e1 3 - g a l a c t o s i d a s ef r o m l a c t i s1 - 16 7p r o d u c e d a p p r o x i m a t e l y5 7 8 3 e d ll a c t u l o s ei nl0ho f r e a c t i o nt i m e k e yw o r d s ：l a c t u l o s e ，k l u y v e r o m y c e sl a c t i skl a c t i sl 一16 7 ，1 3 - g a l a c t o s i d a s e ，s c r e e n i n g ， f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，e n z y m a t i cp r o p e r t i e s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是芬人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：勇赵日期：墅! 绛曼目! 生旦 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名： 毯彗导师签名：盈垒趔 日期：堡学 第一章绪论 第一章绪论 1 1 功能性低聚糖 低聚糖( 或寡糖) ，是指2 1 0 个单糖通过糖苷键连接形成的低聚合糖。普通低聚糖如 蔗糖、麦芽糖等可被机体消化吸收，而所谓功能性低聚糖是指对人、动植物具有特殊生 理功能的低聚糖，甜度一般只有蔗糖的3 0 5 0 左右，因其难消化性、低热量，用它作 为甜味剂不易引起血糖、胰岛素升高，也不会导致肥胖，其中有些糖不被龋齿病原菌突 变链球菌所利用，用其作为甜昧剂可防止龋齿。有些低聚糖因难被人体消化吸收，故可 通过小肠直入大肠，而起到膳食纤维的作用。且它只能为双歧杆菌利用而不能为肠道中 腐败细菌所利用，因而具有整肠效果。这种双歧因子作用正是新型( 或功能性) 低聚糖越 来越受到人们青睐的原因所在。母乳喂养婴儿优于牛乳喂养的原因之一是因为人乳中含 有乳果糖及一种蔗五糖等双歧因子，可防止婴儿感染病源性大肠杆菌引起的痢疾。一些 由植物或霉菌细胞壁多糖分解得到的低聚糖具有植物生长调节作用和诱导植物产生抗 生物质的作用【l 卅。低聚糖的特殊功能已引起学术界的重视，随着各种酶的发现和分离 技术的进步，以高科技为背景的新功能性低聚糖的开发应用已成为食品生物技术领域研 究的新热点。 日本在功能性低聚糖研究、开发与应用方面居于国际领先地位，目前已经实现工业 化生产的低聚糖种类有十多种，现在欧洲国家对非消化性低聚糖作为人类和动物食品功 能因子的研究工作也十分重视，很多科教单位投入力量进行研究，如荷兰w a g e n i n g e n 农业大学、比利时l o u v a i n 大学、瑞典l u n d 大学、英国d u n n 临床研究中心掣5 1 。目前 欧洲市场的功能性低聚糖主要品种为低聚果糖、低聚半乳糖。我国功能性低聚糖自1 9 9 6 年批量生产，主要品种有低聚麦芽糖、低聚果糖、大豆低聚糖、水苏糖和低聚木糖。 1 2 乳果糖 乳果糖( 1 a c t u l o s e ) ，又称作乳酮糖、异构乳糖，被人们称为“双歧杆菌增殖因子”， 是由半乳糖和果糖以p 一1 ，4 糖苷键结合的二糖。最早于1 9 2 9 年由m o n t g o m g r y 和h u d - s o n 发现的。1 9 5 7 年，p e t u e l y 首先发现了其与母乳中双歧因子n 乙酰1 3d 氨基葡糖苷 有相似作用，能够帮助乳儿建立肠道双歧菌群。19 6 0 年日本森永乳业将其添加到婴儿配 方乳粉中投放市场，大大增强了人工喂养的婴儿对疾病抵抗力，降低了死亡率，取得了 很好的效果。目前，我国也正将乳果糖用于婴儿、老年人、运动员食品及一些保健品之 中，所以乳果糖具有巨大的市场潜力1 6 。 乳果糖为白色不规则的结晶性粉末。分子式为c 1 2 h 2 2 0 1 1 ，分子量为3 4 2 ，熔点为 1 6 9 ，比旋率( q ) d 2 0 = 5 1 4 度。易溶于水，2 5 、3 0 、6 0 和9 0 时的溶解度分 别为7 0 、7 6 4 、8 1 和8 6 。纯净乳果糖的甜度纯正，带有清凉、醇和的感觉，甜 度为蔗糖的4 8 6 2 。乳果糖能够从乙醇溶液中结晶出来，它的结晶形式被认为为脱水 水解物【7 1 。 江南大学硕士学位论文 “u 雾幂糖施生毽学 芭质 1 2 1 1 促进双歧杆菌增殖，调整肠道茵群平衡 1 9 5 7 年澳大利亚生物学家p e t u e l y 发现了这一结果，并确定了乳果糖的化学结构。 乳果糖在单胃动物小肠内不被吸收，进入结肠后能为双歧杆菌产生的d 半乳糖苷酶分解 而成为双歧杆菌生长的碳源，从而促进双歧杆菌增殖。双歧杆菌作为人体生理性优势菌， 代谢生成乳酸和乙酸，酸化肠道环境，降低肠道还原电位，抑制有害菌生长。对便秘、 腹泻、肠炎等肠道菌群失调患者均有好的疗效。 史漱石等( 1 9 9 3 ) 报道，喂养含乳果糖奶粉2 个月后，鼠粪便中双歧杆菌增殖1 0 0 倍。 f e i l i m ( 1 9 9 6 ) 等将从不同年龄段的猪粪中提取的双歧杆菌与乳果糖等寡聚糖共同培养， 其中含有乳果糖的培养基双歧杆菌繁殖最好。h o f f m a n n ( 1 9 9 2 ) 报道，乳果糖做为载体 能与沙门氏菌结合而抑制其在肠道内的存活。法国南希大学b a l l o n g u e 等学者( 2 0 0 1 ) 发现，早晚各服1 0 9 乳果糖，就能保持粪便的p h 值在5 8 6 9 的范围内，这是肠道有益 菌群的最佳p h 酸度。 1 2 1 2 增强机体免疫作用 乳果糖属于寡聚糖，而寡聚糖的免疫增强作用可概括为：刺激有益菌的增殖及营养 成分的吸收，发挥间接免疫作用；抑制病原菌繁殖与定植，增强抗感染免疫能力：降低 不利于内环境的植物凝集素等因子的作用；对免疫因子可能有直接刺激或保护作用。 ( 1 ) 间接免疫增强作用 促进双歧杆菌的增殖，增强机体的免疫力。史俊华和孙君江研究发现，活双岐杆菌 可显著提高小鼠的耐寒、耐热、耐疲劳能力和免疫力；死双岐杆菌仅能提高小鼠的耐疲 劳能力和免疫力。王立生和潘令嘉( 2 0 0 2 ) 报道，双歧杆菌能刺激裸鼠腹腔巨噬细胞产 生i l 1 和i l 6 。 ( 2 ) 直接免疫增强作用 尽管绝大部分乳果糖都不能被吸收转运到肝脏参加全身循环，但- - d , 部分( 0 2 5 2 ) 被吸收便足以产生免疫反应( c h r i s t i a n 等，2 0 0 2 ) 。体外试验表明，乳果糖抗内毒素的 作用被限制了，但内毒素诱导单核细胞产生的肿瘤坏死因子( t n f q ) 却显著减少( l i e h r 和h e i n e ，1 9 8 1 ) 。还有报道认为，乳果糖能明显激活c 3 、c 6 、c 9 等补体，从而降低病 理球蛋白含量，抑制病理性免疫反应。这证明乳果糖有直接的免疫增强作用。 1 213 影响营养物质代谢 乳果糖可影响动物对糖、脂肪、微量元素的吸收和代谢。h o s a k a 等( 1 9 7 2 ) 报道，在 隔离的空肠环境中，乳果糖减少了4 0 的葡萄糖吸收而不影响氨基酸的利用。对于微量 元素的吸收，结论较不一致，s u z u k i 等( 1 9 8 6 ) 用富含乳糖、乳果糖、山梨醇和淀粉的食 物饲喂小鼠4 6 d ，结果发现，c a 、m g 、c u 、f e 、z n 的吸收率和在体内的存留时间皆高 于对照组，盲肠p h 值变低，而盲肠重量和双歧杆菌含量均大于对照组。r o b e r t 等( 19 9 3 ) 研究了乳果糖对肠道c a 吸收的影响，结果发现，乳果糖对c a 的吸收促进作用比乳糖强， 尤其是对5 3 8 周龄的小鼠。g e e v e r 等( 1 9 6 8 ) 报道，无菌小鼠对铁的吸收利用显著高于普 通小鼠。r e d d y 等( 1 9 7 2 ) 贝j j 认为，若小鼠体内微生物区系不成熟会使铁的吸收和在体内 2 第一荦绪论 保留韵耐同减弱，无菌小鼠c a 韵吸收和存留时同要面于普通小鼠，但对_ p 的吸收却无 影响。n a g e n d r a 等( 1 9 9 4 ) 用含乳果糖的奶粉饲喂断奶后的小鼠，结果发现，n 、p 、c a 、 f e 的吸收率和在体内的存留时间实验组与对照组之间无显著差异，小鼠的生长性能、血 液生化指标以及肝脏的组织病理学调查与普通水平接近。这说明动物年龄、环境等因素 对乳果糖作用效果影响很大。一般情况下，动物年龄越小( 微生物区系尚未成熟) 、所处 环境越差，益生素使用效果越好。 1 2 1 4 影响胆汁酸循环 乳果糖具有降低胆固醇的作用。r o t s t e i n 等( 1 9 8 1 ) 发现，饲喂乳果糖的小鼠血清中胆 固醇和可致结石的胆汁显著小于未饲喂乳果糖组。v a n 和r u b e n ( 1 9 8 6 ) 进一步证实，乳 果糖能减少患胆结石的几率。乳果糖影响胆汁酸循环的机理可简单概括如下：乳果糖具 有增加中性固醇的排出、减少胆固醇的吸收、减少次级胆汁酸和其他毒素的生成、保护 丁酸盐的作用。 1 2 1 5 降低血内毒素 乳果糖降低血内毒素的机理一般认为是：服用乳果糖，降低肠道p h ，抑制产生内 毒素的有害菌繁殖，减少毒素来源与吸收。由于肠道p h 降低，使肠道中的氨变成铵离 子随粪便排出体外，阻断氨的肝肠循环，从而降低血氨。 减轻了肝脏的解毒负担，有利于肝脏恢复，可以有效地防止肝性昏迷的发生。血氨 的降低，使尿素合成减少，减少肾脏的代谢负担，使肾功能得以恢复。m a g i j u l o 等( 1 9 7 9 ) 发现，乳果糖能治疗内毒素血症，并可用于病毒性肝炎的内毒素血症治疗。侯瑞兴和王 福民( 1 9 9 1 ) 在临床体外试验发现5 5 m g 乳果糖能使o o l m g 内毒素失去凝聚活性。王永丽 和金学源( 1 9 9 1 ) 认为，乳果糖控制内毒素的机制分为3 种形式：加速内毒素排泄；抑制 细菌生长，减少内毒素的产生；对内毒素的直接中和作用。 1 2 1 6 防治便秘 乳果糖在小肠内不被水解吸收，其渗透性使水和电解质保留于肠腔，在结肠中细菌 将其分解成乳酸、醋酸，使肠内的渗透压进一步增高，产生导泻作用，防治便秘。 1 2 1 7 非消化性 由于乳果糖化学结构的特异性，其不被人体口腔唾液和胃分泌的酶液水解，小肠上 皮细胞产生的d 半乳糖苷酶活力通常很弱或不能产生p 半乳糖苷酶，因此，乳果糖在肠 道内不被吸收而直接到达盲肠和大肠。人体试验结果表明：健康的成人摄入3 0 9 乳果糖， 没有发现人体血糖升高，说明乳果糖没有被人体肠道内的b 半乳糖苷酶水解。人体的氢 呼吸试验也表明，乳果糖具有非消化性。 1 2 1 8 低龋齿性 口腔链球菌在含乳果糖的培养基生长试验结果表明，包括变异链球菌在内的2 6 株 口腔链球菌均不能利用乳果糖生成乳酸。葡萄糖转苷酶试验结果表明，口腔内细菌不能 利用乳果糖生产水溶性或不溶性低聚糖。因此，乳果糖具有低龋齿性。 1 2 1 9 安全性高 乳果糖是人母乳的组成成分之一，婴儿每天可以大量食用。以乳糖为底物，应用生 3 江南大学硕士学位论文 粝囊垒性商韵微茔物菌株生产韵弘半乳糖苷酶合成乳栗糖同样具有较面的食用安全性。 对乳果糖生理功能的不断认识，激发了它的工业生产，同时也促进了乳果糖在医药 临床方面的研究。目前，乳果糖广泛用于便秘、血内毒素、肝性脑病等临床治疗，而且 由于乳果糖对人体没有不良作用，其毒性只相当于蔗糖，而广泛添加到奶粉、面包、饮 料中作为日常生活的健康食品【8 。1 到。 1 2 2 乳果糖的生产 1 2 2 1 化学方法合成乳果糖 早在1 9 8 5 年，l o b r yb r u y n 和v a ne k e n s t e i n 发现还原性糖在碱性溶液中会发生异构 化反应生成非还原性糖，此类反应被称为l o b r yb r u y n v a ne k e n s t e i n 反应。乳果糖的制 备正是利用这一反应原理。在早期的研究中，人们较多使用的是强碱性试剂如c a ( o r 0 2 、 n a o h 、k o h 及强有机碱类如叔胺等。这类碱性试剂作用于乳糖，使乳糖异构化生成乳 果糖，但同时生成了相当数量的降解产物如半乳糖、果糖等，产物不仅难以分离，而且 颜色常常较深。副产物和色素的产生，不但降低了乳果糖的产率，也给糖浆的进一步纯 化及制取结晶带来困难。为了提高反应的产率，减少副产物的生成，人们相继开发出许 多催化剂，如碱金属及碱土金属的亚硫酸盐，硼酸盐，四硼酸盐，阴离子交换树脂，金 属镁的化合物等。曾有报道用镁的催化合物作为碱性催化试剂对乳糖进行异构化，反应 体系中通入氮，防止降解氧化产物的生成。要求糖溶液的浓度很稀，反应的时间也较长。 r c p i s t o i a 等对此方法进行了改进，用等量的m g o 和n a h s 0 3 作为催化试剂，反应时 间短，产物中副产物含量较少，但产率较低。日本的土井等人报道，在他0 3 及少量 n a 2 c 0 3 存在下，可以经济地得到高纯度的乳果糖溶液，没有半乳糖等降解产物的生成， 但是反应的产率低，只有2 0 ，而且反应的时间较长。 采用n a o h 和硼酸作为碱异构化的催化体系，是目前乳果糖工业化生产的主要方 法。在碱性条件下，硼酸能使乳果糖形成l a e t u l o s e h 3 8 0 3 络合物，使反应的平衡朝着 有利于乳果糖生成的方向移动。络合物的形成及反应平衡的移动最大程度地减少了降解 产物的生成。h i c k s 等人用等摩尔的乳糖和硼酸，在胺类如叔胺的存在下迸行异构化， 发现反应的产率较高，接着又提出用n a o h 取代叔胺，以降低反应成本。m k o z e m p e l 和m k u r a n t z 在n a o h - 硼酸体系中，对乳果糖的异构化反应进行了动力学研究，认为 在最佳条件下( 乳糖与硼酸摩尔比为1 ：1 ，溶液p h 值为1 1 ) ，乳果糖的平衡转化率可达到 7 5 ，进而设计了一套连续生产的小规模实验装置，为工业化生产提供了依据。此反应 的缺点是很难将硼完全除去。也有报道使用碱金属的铝酸盐作碱性催化剂。铝酸钠可以 使反应平衡向乳果糖的方向移动，有望获得较高的产率，并减少副产物的产生。但铝离 子的除去比较困难。有报道用n a a l 0 2 作催化剂进行异构化反应，反应产率达6 0 以上。 大部分铝以a i ( o i - i ) 3 沉淀形式除掉，少量的a l ”用超滤除去。但a l ( o h ) 3 沉淀不可避免 地会带走一定量的糖【1 2 1 4 1 。 1 2 2 2 酶法合成乳果糖 化学法合成乳果糖具有很多缺点，如大量的有色副产物难以分离，分离这些副产物 的成本较高并在分离的过程中使乳果糖降解。酶法合成乳果糖可以克服化学合成的缺 4 第一覃绪论 点。用于生产乳果糖的酶主要是p 半乳糖苷酶。酶法生产乳果糖的原理是通过p 半乳糖 苷酶的水解活力将乳糖水解成半乳糖和葡萄糖，通过d 半乳糖苷酶的转糖基活力将半乳 糖转移给果糖受体生成乳果糖。 目前，用酶法生产乳果糖的报道很少，还在研究过程中，没有工业化。l e e y j c s 等人将细胞用5 0 ( v v ) 的乙醇渗透来优化乳果糖的生产条件。在最适的条件下渗透 细胞- - ：j , 时大约产生了2 0 9 l 乳果糖，乳果糖生产率为6 8 ：g ( u h ) 。y e o n g s uk i m 将 s s o l f a t a r i c u s 硫化叶菌的p 半乳糖苷酶基因编码克隆表达到大肠杆菌上。s s o l f a t a r i c u s d s m l 6 7 1 的染色体d n a 作为半乳糖苷酶的基因来源。大肠杆菌e r 2 5 6 6 和质粒p e t 2 4 a 作为基因表达的宿主。并研究了用这种p 半乳糖苷酶由乳糖和果糖生成乳果糖。在最佳 条件下，反应6 h 可生成乳果糖5 0 9 g ，产量为8 3 趴l h ) 【1 4 - 1 7 1 。 1 3b 半乳糖苷酶 乳糖酶( l a c t a s e ，e c 3 2 1 2 3 ) ，其系统名为p d 半乳糖苷半乳糖水解酶( d d g a l a c t o s i d eg a l a c t o h y d r a s e ) ，或简称p - 半乳糖苷酶( 1 3 g a l a c t o s i d a s e ) t 1 8 1 。一般说来，该酶有两种催 化性质：一是催化水解反应，将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖；二是催化转移反应，在乳 糖分子的半乳糖一侧连接1 4 个半乳糖，生成低聚半乳糖( g a l a c t o o l i g o s a c c h a r i d e ，g o s ) ； 在乳糖水解产物半乳糖一侧连接果糖，生成乳果糖( 1 a e t u l o s e ) 【1 9 1 。 1 3 1b 半乳糖苷酶应用现状 乳糖酶在工业中具有广泛的应用价值，概括起来主要包括食品工业、医药工业、环 境保护、分析方面、生产功能性低聚糖等方面。 1 3 1 1 在食品方面的应用 ( 1 ) 被列为食品添加剂新品种 中国食品添加剂标准化委员会第1 9 次年会于1 9 9 8 年在江苏省靖江市召开，会议讨 论并通过了将乳糖酶列为食品添加剂新品种的决定，为其在食品工业中的应用奠定了基 础。 ( 2 ) 解决“乳糖不耐症”问题 利用乳糖酶水解乳糖的能力，生产低乳糖制品( 如乳糖水解乳、低乳糖奶粉等) ，有 效解决“乳糖不耐症 问题。这是目前乳糖酶在食品工业的最大用途之一。乳及乳制品 含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部己知的维生素和多种矿物质， 所以乳及乳制品有“近乎完美的食物的美称，是人类改善营养、增强体质不可缺少的 理想食品。乳糖是乳中最主要的碳水化合物。牛乳中乳糖含量约占4 7 5 o ，占其总 糖量的9 8 以上，是牛乳能量的主要来源。 然而，不是所有的人群都可以享用牛奶，特别是亚洲地区，患有“乳糖不耐症 而 导致不能食用牛乳的人群比例相当大。据报道，亚洲人口中约有7 0 的人患有程度不同 的“乳糖不耐症”。“乳糖不耐症”使相当一部分人无法接受牛乳这一天然、具有良好平 衡性的食品，这成为阻碍我国乳品工业发展的主要障碍之一。 用p 半乳糖苷酶水解牛乳或乳制品中的乳糖，可以有效地消除人体对乳糖的不耐受 5 江南大学硕士学位论文 症状，菊亍友震我萄乳品工业，提荷人们的健康水平具有十分重要的意义。 ( 3 ) 其他用途 利用乳糖酶的水解作用，能够提高浓缩乳制品的质量，克服奶粉、炼乳、冰淇淋等 的乳糖析出，延长货架期；用于发酵乳制品，可以缩短发酵时间，减少蔗糖用量。 1 3 1 2 在医药方面的应用 ( 1 ) 乳糖酶可作为助消化类药物，适用于婴儿各种消化不良症，如先天性乳糖酶 缺乏症，因胃障碍及缺铁所致的幼儿慢性腹泻、幼儿及新生儿腹泻。 ( 2 ) 霉菌乳糖酶更适合作为医用酶制剂，因为它的最适p h 与胃液环境相一致，将 其制成口服药剂，口服后可以有效防止乳糖不耐症。 1 3 1 3 在环境保护方面的应用 乳糖酶在环境保护中有着重要的应用。乳清是乳品工业的主要副产品，其中含有 o 6 0 9 的蛋白质、4 0 5 0 的乳糖。因为人体不能吸收利用乳糖，除少部分作为饲 料，大部分排放到自然界。由于乳糖的b o d 值( 生化需氧量) 非常高( 3 4 0 0 0 4 2 0 0 0 ) ， 造成严重的环境污染。综合利用乳糖酶的各种催化作用，可以综合利用乳糖，生产乳清 糖浆、半乳糖果葡糖浆和功能性低聚糖。 1 3 1 4 在分析方面的应用 分析方面，将乳糖酶和其他酶( 如过氧化物酶、葡萄糖氧化酶) 联合使用可以分析冰 淇淋、干酪和奶粉中的乳糖含量，该法简便快捷，费用低廉。 1 3 1 5 在免疫检测及疾病诊断方面的应用 免疫学方面，将乳糖酶与人体胞外淀粉状蛋白前体融合形成融合蛋白，可做为砧吐 e i m e r 病的免疫源，并迸一步制备其单克隆抗体。还有报道将乳糖酶作为一种辅蛋白， 用来稳定和增加u r 5 - u 砒融合蛋白的溶解性，以此作为自血病毒g p 7 0 的疫苗。在诊断 方面将抗性h i v 病毒基因与乳糖酶基因l a c z 重组后作为诱导基因在c o s 细胞中产生 h i v - l a e z 缺陷型病毒，最后在c d 4 + 靶细胞中表达乳糖酶，用这一系统可定量h i v 利用 循环的早期抑制作用，并预测化合物抗h i v 活性。 1 3 1 6 合成或修饰其他碳水化合物以及促进果蔬软化和成熟 d 半乳糖苷酶普遍存在于各种植物中，了解它在果蔬中各个生长时期的含量对于果 蔬的成熟、风味、颜色以及采收后加工都有重要意义，一般在植物成熟期p 半乳糖苷酶 含量增加，它降解含半乳糖苷的胞壁多糖，释放游离的半乳糖。可溶性的半乳糖能促进 胡椒成熟，对于番茄能促发乙烯加快成熟。b 半乳糖苷酶己用于梨、苹果、土豆的软化 和番茄、胡椒、甜瓜、樱桃和牛汕果的成熟。 1 3 1 7 在基因工程上的应用 利用乳糖酶的酶活测定及在凝胶上的特异性显色分析来衡量目的基因在各种表达 系统中的可能表达效果是基因工程中常用的筛选基因表达系统方法。 1 3 1 8 在生产功能性低聚糖方面的应用 p 半乳糖苷酶通过转糖苷作用生成低聚糖，如低聚半乳糖、乳果糖等，有报道从 b c r i c u l a n s 中分离得到的6 半乳糖苷酶在分解乳糖时发生转糖苷作用可以形成1 1 种低 6 第一鼋绪论 聚糖，且酶源不同形成的低聚糖也不同。用于生产低聚糖的酶源有米曲霉( a s p e r g i l l - u s o r y z a e ) 、乳酸克鲁维酵母( k l u y v e r o n y c e sl a t h s ) 、脆壁克鲁维酵母( k t u y v e r o n y c e s f r a # t i ：s ) 、环状芽孢杆菌( b c r i c u l a n ) 2 0 - 2 6 1 。 1 3 2b 半乳糖苷酶来源 p 半乳糖苷酶来源广泛，植物、动物器官、细菌、霉菌、酵母菌都能产生p 半乳糖 苷酶，见表1 1 。微生物来源的p 半乳糖苷酶具有数量大、制备容易和酶活力高等特点， 因此，大量生产p 半乳糖苷酶主要采用微生物发酵产酶。 表1 1p - 半乳糖苷酶来源 t a b l e l 1s o u r c eo fp 2 a l a c t o s i d a s e 植物动物器官 细菌酵母菌霉菌 大肠杆菌乳酸克鲁维酵母黑曲霉 桃小肠( e s c h e r c h i ac o t o ( k l u y v e r o m y c e s ( a s p e r g i l l u sn i g e r ) l a c t i c ) 嗜热脂肪芽抱杆菌脆壁克鲁维酵母米曲霉 杏脑( b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s ) ( k l u y v e r o m y c e s ( a s p e r g i l l u s f r a g i l i s ) o r y z a e ) 苜蓿皮肤巨大芽袍杆菌热带假丝酵母黄曲霉 种子组织( b a c i l l u sm e g a t e r i u m ) ( c a n d i d a ( a s p e r g i l u s f l a v u s ) p s e u d o t r o p i c a i s ) 德氏乳杆菌保加利亚亚种米根霉 ( l a c t o b a c i l l u s d ( r h i z o p u s or y z a e ) e l b r u e c k i i s u b s p , b u a r i c u s ) 嗜热链球菌产黄青霉 ( s t r e p t o c o c c u s t h e rm o p h i l u s ) ( p e n i c i l l i u m c 丝鲨翌! 里2 1 3 2 1 产b 半乳糖苷酶安全菌株 由于乳糖酶主要用于与人体、健康有关的食品、医药工业等方面，所以生产上使用 的菌株必须是无毒的安全菌株，即必须具有g r a s ( g e n e r a l l yr e c o g n i z e d a ss a f e ) 资格。 由于黑曲霉、米曲霉、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母曾经历过多次试验，在历史上 尚未发生过中毒现象，所以它们是公认的安全菌株，普遍作为工业化生产的酶源。大肠 杆菌的乳糖酶主要用于生化和分析试剂。 1 3 2 2b 半乳糖苷酶酶学性质 b 半乳糖苷酶来源广泛，不同种类微生物产生的p 半乳糖苷酶不仅表现在最适p h 值、最适温度等酶学性质方面的差异，而且催化合成的乳果糖产率也不相同，不同微生 物来源的乳糖酶的酶学性质见表1 2 。 细菌产生的乳糖酶是胞外酶，在培养过程中不能分泌到培养基中，需破壁才能分离、 提取。最适温度较低，通常在4 0 左右，为常温乳糖酶。但耐热细菌乳糖酶的作用温度 很高，最高温度可达9 0 ( 2 。大肠杆菌产生的乳糖酶研究的最彻底，并已大量应用于生化 分析中。因其产量低及可能的毒性问题，迄今未用于工业化生产。 酵母菌乳糖酶通常是胞内酶，分离提取需破碎细胞。酶的最适温度很低，一般在 3 7 ，生产中容易污染杂菌；该酶对酸、热不稳定，当存在某些激活离子时，才有最大 7 江雨大学坝士学位论文 酶活力。但是，酵母菌容易培养，液态深层培养条件下可产生大量乳糖酶。同时，酵母 乳糖酶的最适p h 近于中性，与牛乳的天然p h 接近。这些优点掩盖了它的不足，使得 酵母乳糖酶得以成功地开发。乳酸克鲁维酵母和脆壁克鲁维酵母是目前生产乳糖酶的主 要酵母菌种。 表1 2 不同微生物来源的乳糖酶的特性 t a b l e l 2p r o p e r t i e so fl a c t a s ef r o md i f f e r e n tm i c r o b i a ls o u r c e s 霉菌产生的乳糖酶是胞外酶，既可以采用固态培养也可以采用液态深层培养来生 产，在发酵过程中酶分泌到培养基，发酵成本低、分离提取较为方便。霉菌乳糖酶是高 温乳糖酶，最适温度较高，一般在5 0 c 以上，生产中能够有效防止杂菌污染。目前应用 较多的霉菌乳糖酶产生菌是黑曲霉和米曲霉【2 7 。2 引。 1 3 2 3b 半乳糖苷酶反应机制 已从许多微生物中分离得到p 半乳糖苷酶，并对其水解反应的动力学模型作了研 究，但对反应机制仍不是很清楚。已经知道的催化机制都是以大肠杆菌的b 半乳糖苷酶 作为研究对象的，确定了其亚结构、主要序列及三维结构。 低聚半乳糖和乳果糖都是以乳糖为底物，由乳糖酶催化合成的。乳糖酶的活性位点 上有两个官能团：巯基和咪唑基，其中巯基可作为广义碱使半乳糖苷的氧原子质子化， 咪唑基可作为亲核试剂攻击半乳糖分子的第一个碳原子上的亲核中心，反应机理如图 1 1 ，反应至少由3 步进行，过程如下： 酶+ 乳糖一一酶乳糖 酶乳糖一一半乳糖苷酶+ 葡萄糖 半乳糖苷酶+ 受体一一半乳糖苷受体+ 酶 反应第3 步酶将半乳糖苷转移给含羟基的亲核受体。当受体是水则生成半乳糖，受 体是糖则生成二糖、三糖和其它相应的半乳糖苷低聚糖。例如，当受体是果糖则生成乳 果糖；受体是1 4 个半乳糖，则生成低聚半乳糖。这些产物反过来又可以作为底物被酶 缓慢水解。因此乳糖的水解反应可视为是半乳糖苷转移反应的特殊情况。在大多数情况 下，由于反应体系中水的高浓度使水解反应占主导地位，低聚糖的生成量很少。因此提 高反应体系中底物( 受体) 的浓度或( 和) 降低水的浓度都能够提高低聚糖的产量。酶氨基 基团的化学修饰也能提高低聚糖的产量，但机理尚不清楚。 不同来源的酶生成的低聚糖在体系总糖中的含量差异很大，从1 到4 5 不等。由 8 墨二耋堡垒 于反应条件各异，所以在不同酶源间做比较很困难。反应过程中低聚糖是在不断地生成 和降解的，反应的各个时期其含量也在不断变化，一般用峰值或最大值来表示。因为低 聚糖的生成要求有