（生物化学与分子生物学专业论文）人可溶性脯氨酰胺氨肽酶结构与功能研究.pdf

中文摘要 中文摘要 脯氨酰胺氨肽酶( 氨肽酶p 或a p p ；e c 3 4 1 1 9 ) 在很多不同物种中都 有发现，包括哺乳动物、酵母和细菌。它们催化从氨基端第二个残基是脯氨酸 残基的多肽上去掉第一个氨基端残基。在哺乳动物中有两种脯氨酰胺氨肽酶， 根据其细胞定位分别称为可溶性形式( x p n p e p l ) 和膜结合形式( x p n p e p 2 ) 。 哺乳动物脯氨酰胺氨肽酶表现出能够对血管舒张肽一种调节血压的多肽进 行降解，从而与心肌梗塞疾病有关。 在我们的研究中，我们解析了人可溶性脯氨酰胺氨肽酶( x p n p e p l ) 分辨 率1 6a 的晶体结构。其结构展示出了一个蛋白二聚体，每个亚单位都具有独 特的三个结构域的组织形式，这与以往所知的所有脯氨酰胺氨肽酶和脯氨肽酶 那种两个结构域的组织形式都不同。 x p n p e p l 的羧基端催化结构域配位有两个金属离子，并且与其他脯氨酰胺 氨肽酶的折叠方式相似。金属成分分析以及活性分析证明这个酶的活性是依赖 于两个锰离子的，这纠正了以前的观点即每个x p n p e p l 亚单位只含有一个锰 离子。对e 4 1 a 突变体进行活力分析证明这个被认为是用来稳定质子化的催化 残基h i s 4 9 8 的酸性氨基酸残基在催化中只是起到了无足轻重的作用。 进一步的突变显示出了x p n p e p l 氨基端结构域以及二聚化对其活性的重 要性，据此我们提出了推测的解释。而进一步的结构比较暗示了x p n p e p l 底 物选择性的机理。 关键词：氨肽酶，脯氨肽酶，晶体结构 a b s t r a c t x - p r o l y la m i n o p e p t i d a s e s ( a m i n o p e p t i d a s ep o ra p - p ；e c 3 4 11 9 ) a r ef o u n d i nm a n yd i f f e r e n to r g a n i s m si n c l u d i n gm a m m a l s ，y e a s t ，a n db a c t e r i a t h e yc a t a l y z e t h er e m o v a lo fa nn t e r m i n a lr e s i d u ef r o map e p t i d ew h e nt h es e c o n dn t e r m i n a l r e s i d u ei sp r o l y lr e s o d u e t h e r ea r et w of o r m so fm a m m a l i a na p pi nt e r m so ft h e i r c e l l u l a rl o c a t i o n s ：ac y t o s o l i cf o r m ( x p n p e p 1 ) a n dam e m b r a n e - b o u n df o r m ( x p n p e p 2 ) m a m m a l i a nx p r o l y la m i n o p e p t i d a s e sa r es h o w n t ob er e s p o n s i b l ef o r t h ed e g r a d a t i o no fb r a d y k i n i n ，ab l o o dp r e s s u r er e g u l a t o rp e p t i d e ，a n dh a v eb e e n l i n k e dt om y o c a r d i a li n f a r c t i o n i no u rs t u d yt h e x - r a yc r y s t a l s t r u c t u r eo fh u m a nc y t o s o l i c x - p r o l y l a m i n o p e p t i d a s e ( x p n p e p1 ) w a ss o l v e da tar e s o l u t i o no f1 6 a t h es t r u c t u r e r e v e a l sad i m e rw i mau n i q u et h r e e d o m a i no r g a n i z a t i o ni ne a c hs u b u n i t ，r a t h e rt h a n t h et w od o m a i n sc o n n o nt oa l lo t h e rk n o w ns t r u c t u r e so fx - p r o l y la m i n o p e p t i d a s e a n dp r o l i d a s e s t h ec t e r m i n a lc a t a l y t i cd o m a i no fx p n p e p lc o o r d i n a t e st w om e t a li o n sa n d s h a r e sas i m i l a rf o l d 、历n lo t h e rp r o l y la m i n o p e p t i d a s e s m e t a lc o n t e n ta n a l y s i sa n d a c t i v i t ya s s a y sc o n f i r mt h a tt h ee r l z y m ei sd o u b l em n 2 + d e p e n d e n tf o ri t sa c t i v i t y , w h i c hc o r r e c t e dt h ep r e v i o u sn o t i o nt h a te a c hx p n p e p1s u b u n i tc o n t a i n so n l yo n e m n 2 + i o n a c t i v i t ya s s a y s0 1 1a ne 4 1am u t a n td e m o n s t r a t e st h a tt h ea c i d i cr e s i d u e ， w h i c hu s e dt ob ec o n s i d e r e das t a b i l i z i n gf a c t o ri nt h ep r o t o n a t i o no fc a t a l y t i c r e s i d u eh i s 4 9 8 ，p l a y so n l yam a r g i n a lr o l ei nc a t a l y s i s f u r t h e rm u t a g e n e s i sr e v e a l st h es i g n i f i c a n c eo ft h en - t e x m i n a ld o m a i na n d d i m e r i z a t i o nf o rt h ea c t i v i t yo fx p n p e p1 ，a n dw ep r o v i d e dp r e d i c t e de x p l a n a t i o n s f o rt h e i rs i g n i f i c a n c e s t r u c t u r a lc o m p a r i s o n sf u g t h e rs u g g e s tm e c h a n i s m sf o r s u b s t r a t es e l e c t i v i t yi nx p n p e p1 k e yw o r d s ：a m i n o p e p t i d a s e ，p r o l i d a s e ，c r y s t a ls t r u c t u r e 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提 供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国 家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目 的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活 动。 学位论文作者签名：捻 加。舀年f 月2 - f 日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位 论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开 发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的 法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：徐 加。0 年g - - 月z p 日 第一章引言 第一章引言 第一节人可溶性脯氨酰胺氨肽酶( x p n p e p l ) 研究概况 氨肽酶是一类以蛋白质或者肽分子作为底物，从它们的氨基端水解去掉氨 基酸残基的酶。这一类酶在整个生物界，包括古细菌、真细菌以及真核生物界 都有发现，这一类酶的功能被认为与激素调节、蛋白质成熟以及蛋白质氨基端 降解等很多生物学过程有关。很多氨肽酶对其底物肽氨基端的残基类型具有特 异的选择性，比如甲硫氨酸氨肽酶( m e t a p ) 最适合于切除细菌新表达出的蛋 白质氨基端的甲硫氨酸，而亮氨酸氨肽酶( l e u a p ) 则以带有氨基端的亮氨酸 肽分子作为最适合的底物。为了适应对于底物的氨基端残基辨认的需要，以及 由于脯氨酸残基形成二级胺( c 删i 卜) 而非一级胺( c 删h 一) 这一 现象 1 】所带来的在催化机制上的差异，各种生物体都已经相应地进化出了特定 的肽酶或者蛋白酶。 脯氨酰胺氨肽酶 h 2 n 从此处切开 图1 1 脯氨酰胺氨肽酶催化活性示意图 脯氨酰胺氨肽酶( e c3 4 1 1 9 ) 是一类识别多肽氨基端第二位氨基酸残基 的氨肽酶，当底物多肽氨基端第二位的氨基酸残基是脯氨酸的时候这类氨肽酶 就会把该底物的氨基端第一个氨基酸残基切除掉，如图1 1 。 脯氨酰胺氨肽酶的催化活性通常不能被b e s t m i n 2 】、a m a s t m i n 3 等常见的通 用氨肽酶抑制剂所抑制 4 ，5 】，而能够被专门设计用来抑制脯氨酰胺氨肽酶的 即s t a t i n 所抑制【6 】。b e s t m i n 、猢t m i n 以及a p s t m i n 的化学名如表1 1 所示，结 构式如图1 2 所示。 第一章引言 表1 1 三种抑制剂的化学名表 名称化学名 b c s t a t i n ( 2 s ，3 r ) 3 - a m i n o 一2 - h y d r o x y - 4 - p h c n y l - b u t a n o y i - l - l e u c i n e a m a s t a t i n ( 2 s ，3 r ) - 3 - a m i n o 2 - h y d r o x y - 5 - m e t h y l h c x a n o y l - l - v a l y l - - l - v a l y l l - a s p a r t a t 呛 a p s t a t i n( 2 s ，3 r ) - 3 - a m i n o - 2 - h y d r o x y 4 p h c n y l - b u t a n o y l - l - p r o l y l l - p r o l y l l - a l a n i n a m i d c b c s t a t i n a p s t a t i n h 3 h 3 图1 2b c s t a t i n 、a p s t a t i n 以及a m a s t a t i n 的化学结构式 脯氨酰胺氨肽酶的同工酶从细菌到哺乳动物中都有发现 1 ，7 ，8 】。在哺乳动 物中存在有两种脯氨酰胺氨肽酶，它们在一级序列上存在着一些差异，但是更 2 车。 第一章引言 重要的是它们在细胞中的定位不同，一个定位在细胞浆中，称为可溶性脯氨酰 胺氨肽酶【9 1 2 ；另一种则定位于膜上，称为膜结合脯氢酰胺氨肽酶【1 3 1 5 1 。 盆黑：谳晶。；赢孟矗。蠢品盎品品高品晶；，燃曩爨 匿罂疆萋雅。孳麓雹渤徽：盈塞雾圈 篙琛量嚣繇鬈。巷霉薯；漉：墓襄戳甚喾嚣翟 篙淼要：姜笺蒌某采嚣篙嬲；瑟”嚣：溯堪；潮鐾竺帚 ? 器墨砖；薯要：爨窭篙黼溜霎器：攀 瓮篇甚黧 。6 ，l ，o 圈舞i j 嚣。越。矗。赢。意：品。 图1 3x p n p e p i ( c y t o s o i c ) 与x p n p e p 2 ( m e m b r a n e ) 一级序列比对 人源的可溶性喃氨酰胺氨肽酶( x p n p e p i ，n c b i 编号：n p0 6 5 1 1 6 ) 发现 于白细胞和血小板中( 1 1 ，1 2 】，该蛋白共由6 2 3 个氨基酸残基构成t 分子量约7 0 k d 3 黜萋黑 黼黜 = 第一章引言 ( 6 9 6 5 7 d a ) ，在溶液中通常以1 4 0 k d 的二聚体形式存在。与其他脯氨酰胺氨肽 酶相同，x p n p e p l 能够以氨基端第二个氨基酸残基为脯氨酸的多肽为底物催 化水解去掉底物肽氨基端的第一个氨基酸：x p n p e p i 的活性也同样能够被 a p s t a t i n 所抑制。除此以外根据以前的研究x p n p e p l 属于金属蛋白酶，1 2 + 离子对于蛋白的活性有明显的激活作用，用e d t a 或者1 ，1 0 p h e n a n t h r o l i n e 等 螯合剂处理x p n p e p l 将会使其活性太大降低，甚至完全丧失活性【1 0 。 在人体中与膜结合脯氨酰胺氨肽酶( x p n p e p 2 ) 相比。x p n p e p l 在一级 序列上除了投有氨基端的导肚序列和羧基端的g p i 膜定位序列以外1 3 ，1 4 l ，二 者的序列同源性很高( 如图l3 ) 1 0 】。因此二者一度被认为是同一个基因的不 同剪切产物，后来才被证明一者是由两个不同的基因编码的。二者除都能被 a p s t a t i n 抑制以外，还都能够以血管舒张肽( b r a d y k i n i n ，序列： a r g - p r o p r o - g j y - p h e - s e t - p r o p h e - a r g ) 这样一个多肽类激素为底物，对其进行 氨基端降解。 第二节与x p n p e p l 相关的蛋白研究概况 图14 大脑杆菌脯氨酰胺氨肽酶四聚体结构 一 纂。 o 蠢 0 a 第一章引言 在脯氨酰胺氨肽酶一系列同工酶中，大肠杆菌脯氨酰胺氨肽酶是被研究的 比较透彻的一个。该酶全长共有4 4 0 个氨基酸残基，能够形成二聚体和四聚体， 每个分子中含有两个m n 2 + 离子 1 6 】。大肠杆菌脯氨酰胺氨肽酶四聚体结构如图 1 4 所示，图中的四个分子分别用青( a ) 、蓝( b ) 、绿( c ) 和红色( d ) 来表 示，m n 2 + 离子则用紫色球来表示。 将大肠杆菌脯氨酰胺氨肽酶的m n 2 + 离子替换成其它不同金属离子之后的 蛋白结构 1 7 】，大肠杆菌脯氨酰胺氨肽酶与其催化产物、抑制剂的复合物结构 1 8 ，1 9 ，以及大肠杆菌脯氨酰胺氨肽酶各种突变体结构 2 0 】均已被解析出来，并 且g r a h a m 等人根据以上的结构信息比较可靠地推测出了大肠杆菌脯氨酰胺氨 肽酶的催化机理 2 0 】。这些研究都为我们接下来对x p n p e p l 的研究提供了重要 的信息和线索。 除了大肠杆菌脯氨酰胺氨肽酶以外，还存在一系列脯氨肽酶，这些酶只能 催化x a a - p r o 这样的羧基端为脯氨酸的二肽的水解。用已解析出结构的脯氨肽 酶与大肠杆菌脯氨酰胺氨肽酶进行比较发现它们不仅在活性中心而且在整体结 构上都很相似，这些酶也全部都在其活性中心螯合有两个金属离子而且也全都 能形成二聚体【2 1 ，2 2 】。只是从结构上看这些脯氨肽酶活性中心的口袋与脯氨酰 胺氨肽酶比较深而且扭曲，可能正是由于这个原因这些长链的多肽底物难以进 入脯氨肽酶的活性中心，因此脯氨肽酶只能催化x a a - p r o 二肽的水解。目前已 解析出结构的脯氨肽酶包括人脯氨肽酶、p f u r i o s u s 脯氨肽酶和ph o r i k o s h i io t 3 脯氨肽酶，这些结构也为我们对x p n p e p l 的研究提供了重要的信息。 第三节x p n p e p l 的研究意义 由前面介绍的，人源可溶性脯氨酰胺氨肽酶( x p n p e p l ) 分子量高达7 0 k d ， 然而大肠杆菌脯氨酰胺氨肽酶以及上面提到的各种脯氨肽酶的分子量最大的也 仅有5 5 k d ( 人脯氨肽酶) 。这样x p n p e p l 的分子量远远大于其他具有相似功 能的蛋白，这一现象让我们很有兴趣去揭示x p n p e p l 与其他这些蛋白在结构 上的差异。 另一方面，大肠杆菌脯氨酰胺氨肽酶以及所有上面提到的脯氨肽酶在其活 性中心都结合有两个金属离子，然而在过去的研究中x p n p e p l 一直被认为只 含有一个金属离子 1 0 】。这同样让我们很有兴趣去对x p n p e p l 的结构进行研 5 第一章引言 究，弄清楚究竟是x p n p e p l 分子也含有两个金属离子还是它具有一种独特的 单金属离子催化机制。 x p n p e p l 与x p n p e p 2 均能够以对血管舒张肽( b r a d y k i n i n ) 进行氨基端降 解。而研究表明b r a d y k i n i n 与心肌梗塞等疾病关系密切，用x p n p e p l 与 x p n p e p 2 的抑制剂a p s t a t i n 对小鼠进行体内抑制实验发现，这种抑制剂可以显 著降低小鼠的心肌梗塞程度 2 3 。因此我们研究x p n p e p l 的结构对于进一步基 于结构开发相应的治疗心肌梗塞的药物具有重要的意义。 第四节论文各部分的主要内容 本论文着重对人源可溶性脯氨酰胺氨肽酶( n p e p l ) 母体蛋白及硒代甲 硫氨酸衍生物的表达、纯化，x p n p e p l 晶体结构的解析及结构与功能的关系进 行了研究。 论文的第二章介绍了蛋白质晶体学的原理和方法；第三章介绍了x p n p e p l 蛋白样品的表达和纯化；第四章介绍了x p n p e p l 母体蛋白晶体及硒代甲硫氨 酸蛋白晶体的生长和优化；第五章介绍了x p n p e p l 晶体衍射数据的收集和晶 体结构的解析过程；第六章介绍了x p n p e p l 及其突变体等的酶活力情况；第 七章分析了x p n p e p l 的活性中心和其催化机制；第八章综合分析了x p n p e p l 的特殊结构特点与功能之间的关系；最后一章为结论。 6 第二章蛋白质品体学原理和方法 第二章蛋白质晶体学原理和方法 生物大分子( 包括蛋白质，核酸和多糖等) 及其复合体几乎参与了所有的 生命活动并是各个生物功能的主要执行者。生物大分子要发挥生物学功能，就 必需具备稳定的特有的三维结构及三维结构在各个层次的运动。探求结构与功 能的关系是当代分子生物学的中心问题之一。解析生物大分子的三维结构能够 为认识其功能提供新的视点，并有助于解释已经积累多年的生化数据。而且， 精确的三维结构也是定点突变和分子设计的基础。迄今为止，已有相当多的生 物大分子的结构得到解析，其中大多数的生物功能已经得到了深入的研究，并 基于结构对这些生物大分子进行了分类和相互关系的研究。近年来，随着基因 组测序计划的进展，越来越多的新蛋白质被发现，基于结构的功能研究也日趋 活跃。 蛋白质晶体学，核磁共振( n m r ) 和电镜三维重构是当今用于研究蛋白质 结构的主要手段。n m r 测定的是生物大分子在溶液中的结构，能用于研究分子 在溶液中的动力学行为。但是，n m r 法迄今只能解析相对较小的蛋白质( 分子 量大约小于3 0k d ) 2 4 】。电镜方法则特别适合于大的复合物体系、膜蛋白以及 全病毒的结构研究。在这种方法中，三维模型是从电子衍射谱或所记录的样本 投影重构得来的 2 5 。除以上三种方法外，各种光谱技术，显微技术和计算机 模拟也能提供一定的结构信息。 x 射线衍射技术能够精确测定原子在晶体中的空间位置，是迄今研究生物 大分子结构的主要技术。中子衍射和电子衍射技术则用来弥补x 射线衍射技术 之不足。生物大分子单晶体的x 射线衍射技术是5 0 年代以后，首先从蛋白质的 晶体结构研究中发展起来的，并于7 0 年代形成一门晶体学的分支学科蛋白 质晶体学。生物大分子单晶体的中子衍射技术用于测定生物大分子中氢原子的 位置，也属蛋白质晶体学。纤维状生物大分子的x 射线衍射技术用来测定这类大 分子的一些周期性结构，如螺旋结构等。 1 9 1 2 年德国物理学家劳厄( m v o nl a u e ) 预言晶体是x 射线的天然衍射光 栅。此后英国物理学家布喇格父子( w h b r a g g ，w l b r a g g ) 开创了x 射线晶体 学。几十年来，这门学科不断发展和完善，测定了成千上万个无机和有机化合物 的晶体和分子结构。由它提供的结构资料已经成为近代结构化学的基础。但是 7 第二章蛋白质晶体学原理和方法 传统的小分子晶体结构的分析方法不适用于原子数目多，结构复杂的生物大分 子。直到1 9 5 4 年英国晶体学家佩鲁茨等人提出在蛋白质晶体中引入重原子的同 晶置换法之后，才有可能测定生物大分子的晶体结构。1 9 6 0 年英国晶体学家肯 德鲁等人首次解出一个由1 5 3 个氨基酸组成、分子量为1 7 5 0 0 的蛋白质分子一 肌红蛋白的三维结构。此后生物大分子晶体结构的研究工作迅速发展。至8 0 年代初，已有近2 0 0 个蛋白质、核酸等生物大分子的三维结构被测定，从而有 力地推动了分子生物学的发展。中国继6 0 年代首次人工合成牛胰岛素之后，于 7 0 年代初测定了三方二锌猪胰岛素的三维结构。1 9 8 6 年中国已经完成这个结构 1 2 埃高分辨率的修正工作。 最近一些年，蛋白质x 射线晶体学无论从结构测定的方法还是从结构测定 所用的仪器上都有了飞跃的发展。可变波长的同步辐射加速器的应用使高分辨 率、高质量的衍射数据变得较为容易获得。低温技术的广泛应用使冷冻后的蛋 白质晶体在衍射过程中所受的辐射损害大为减小，从而降低了对晶体的要求并 提高了数据质量。各种形式的面探测器和c c d 的出现大幅度提高了数据收集速 度及精度。而各种计算机硬件和软件的发展更为晶体学发展提供了强有力的计 算工具。如今，在相当程度上，蛋白质晶体学已成为一种常规的技术手段，它 可在原子或接近原子的水平上分析蛋白质的精细三维结构。3 a 以上分辨率的蛋 白质精细结构可提供丰富的信息，如特定原子的位置，它们之间的相互关系( 如 氢键等) ，溶剂的亲和性及分子内柔性的变化等。 第一节x 射线晶体学基本原理 x 射线是一种波长很短的电磁波，能穿透一定厚度的物质，并能使荧光物 质发光、照相乳胶感光、气体电离。在用电子束轰击金属“靶 产生的x 射线 中，包含与靶中各种元素对应的具有特定波长的x 射线，称为特征x 射线。当 一束单色x 射线入射到晶体时，由于晶体是由原子规则排列成的晶胞组成，这 些规则排列的原子间距离与入射x 射线波长有相同数量级，故由不同原子散射 的x 射线相互干涉，在某些特殊方向上产生强x 射线衍射。衍射线在空间分 布的方位和强度，与晶体结构密切相关，因此理论上分析照相底片上得到的x 射线衍射花样就可以推算出晶体内部原子的排列方式。这一理论在1 9 1 2 年最早 由德国物理学家劳厄( m v o nl a u e ) 提出，随即为实验所验证。1 9 1 3 年英国物 8 第二章蛋白质晶体学原理和方法 理学家布喇格父子( w h b r a g g ，w l b r a g g ) 在劳厄发现的基础上，不仅成功地 测定了n a c l 、k c l 等的晶体结构，并提出了作为晶体衍射基础的著名公式 布喇格定律： 2 ds i n o = 2 式中入为x 射线的波长，1 3 为任何正整数。当x 射线以掠角0 ( 入射角的 余角) 入射到某一点阵平面间距为d 的原子面上时，在符合上式的条件下，将 在反射方向上得到因叠加而加强的衍射线。布喇格定律简洁直观地表达了衍射 所必须满足的条件。 进一步的数学推导显示晶体结构同它的衍射效应之间存在着互为傅立叶 ( f o u r i e r ) 变换的关系。这里说的衍射效应，是指从晶体向各个方向发出的衍 射的振幅和相位。因此理论上只要记录下来衍射波的振幅和相位信息就可以通 过傅立叶变换方便地计算出晶体结构。然而目前虽然从衍射实验可以记录下各 个方向上衍射波的振幅，但是由于x 射线光源本身是不相干的而且频率过高， 在目前甚至可预见的将来，还不容易找到有普遍意义的实用方法来记录由晶体 发出的衍射波的相位。因此要想从衍射效应的傅立叶变换解出晶体结构，必须 先设法找回丢失了的相位。这就是晶体学中的“相位问题 ，这一直是研究晶体 结构分析方法的关键问题。 第二节相位问题 x 射线被晶胞内的原子散射到特定的方向( h k l ) ，其散射波可用结构因子 来表示( 包括振幅和相位) 。而电子密度可以表达为结构因子的傅立叶变换： p ( 舻) = 万1 l f ( 办肼) | c o s 2 万( h x + 砂+ l z ) 一c t ( h k l ) ，hkf 其中x ，y ，z 为晶胞中某一点的坐标，v 为晶胞体积，h ，k ，1 为衍射指标， l f ( h k l ) l 和c t ( h k l ) 分别是指标为( 1 l ，k ，1 ) 的衍射的结构振幅和相角。显然，结构因子 的两个部分振幅和相角对计算电子密度来说都是必须的。但是在衍射实验中， 9 第二章蛋白质晶体学原理和方法 只有每一衍射点的实验强度信息可以被记录。而结构振幅信息可以从该衍射强 度h 信息中得到，二者存在以下关系： l 嘲= l o f k l p a e 疆l l 曲式v 其中i o 为入射x 射线强度，为角速度，其倒数表示一个倒易点位于衍射 位置经历的时间，k 为比例因子，l 为l o r e n t z 因子，p 为偏振因子，a 为吸收 和次级消光的校正因子，e 为初级消光校正因子，f ( ) t 为经温度校正的相对结 构因子振幅，v 为晶胞的体积。 由于相角的信息都在数据收集中完全丢失了，因此确定相位就成了x 射线 晶体结构分析中的核心问题。 2 2 1确定相位的主要方法 目前，在蛋白质晶体学中确定相位主要有三种实验方法，即多对同晶置换 法( m u l t i p l ei s o m o r p h o u sr e p l a c e m e n t , m i r ) 、多波长反常散射法 ( m u l t i w a v e l e n g t ha n o m a l o u sd i s p e r s i o n m a d ) 和分子置换法( m o l e c u l a r r e p l a c e m e n t ，m r ) 。此外还有单对同晶置换法( s i n g l ei s o m o r p h o u sr e p l a c e m e n t ， s i r ) 、单波长反常散射法( s i n g l e - w a v e l e n g t h a n o m a l o u sd i s p e r s i o n ，s a d ) 等方 法。不同的方法可以联合使用。对于分子量较小，分辨率相当高的蛋白质晶体 还可尝试用直接法。 2 2 2 多对同晶置换法( m i r ) 2 6 2 7 多对同晶置换法是蛋白质晶体学领域用于相位确定的经典方法。在m a d 进入实际运用以前，它也曾是解析新蛋白结构的唯一手段。同晶置换法的基本 思想是把散射能力强的重金属原子，如h g ，p b 等，引进到蛋白质晶体中作为标 志原子，然后设法解出这些数量较少的重原子在晶胞中的坐标，由这些坐标计 算出重原子散射波在各衍射点的相角，再推引出蛋白质分子在各衍射中的相位。 运用m 瓜方法确定相位，首先要得到与母体同晶型( 空间群相同，晶胞 参数基本相同) 的衍生物晶体，得到衍生物晶体最常用的方法是将母体晶体浸 泡在含有重原子化合物的合适溶液体系中，使得重原子能够在整个晶体范围内 l o 第二章蛋白质品体学原理和方法 有序地结合到蛋白质分子上。要求母体和衍生物的晶体同晶型，这表明重原子 结合到蛋白质分子上后没有引起蛋白质结构的较大变化。这样，母体晶体和衍 生物晶体之间的衍射强度差别就可以确定是由于所结合的重原子引起的。然后 以母体晶体和重原子衍生物晶体的衍射强度差计算同晶差值p a t t e r s o n 函数。 p a t t e r s o n 图上主要的峰就对应于晶体衍生物中重原子之间的向量。通过检查 p a t t e r s o n 峰，就可以确定重原子的位置，进而就可以推引出母体的相位。 i m a g a x i s r e a la x i s 图2 1同晶置换法结构因子图 根据重原子的位置推引出母体相位的简要步骤如下： 设定f p ，f p h 分别代表母体和衍生物晶体的结构因子，f h 是衍生物晶体中 重原子部分的结构因子，如图2 1 所示，有如下关系： f p n = f p f h 在得到重原子位置后，就得到了q h ，f h 也就可以计算出来。而振幅的绝 对值if p hi 和if pi 可由实验测得的衍生物晶体和母体晶体的衍射强度得到，母 体晶体的相位o c p 就可由以上方程推导出： a p = a h + c o s i ( f p h 2 i f p l 2 i f , 酬2 ) 2 1 f p il f h i 等式中余弦项表明如果只用一个衍生物晶体，q p 有两个可能解。为解决相 位的不确定性，就必须采用至少两个在晶胞中结合位置不同的重原子衍生物与 母体配合。这样至少可得出两套可能的相位，其共同解就是正确的相角。 第二章蛋白质晶体学原理和方法 还有一种方法可以消除双解，就是利用重原子的反常散射效应。对大多数 轻原子( c ，h ，o ，m 来说，反常散射效应不显著，当加入重原子后，f r i e d e l 定律 就不适用了。此时，f p h ( + ) 和f e n ( ) 不相等，可以将f p h ( + ) 和f p h ( - ) 看作两个衍 生物的结构振幅，相当于有两个重原子衍生物，可以按照多对同晶的方法得到 正确的相角，这就是单对同晶置换加反常散射法 2 8 】。 2 3 3 多波长反常散射法( 啪) 2 a ，a o 在“正常”t h o m s o n 散射中，由于入射线的频率远远大于原子的固有频率， 而且原子中电子的束缚能量较小，原子中的电子近似于自由电子，电子对入射 x 射线进行弹性散射。在一般情况下，这种近似对于大多数的轻原子来说是正 确的。正常散射因子( f ) 代表了原子的散射能力，具有实数值。在正常散射条 件下，衍射图谱是中心对称的，遵从f r i e d e l 定律： z ( h k l ) = 1 ( h k o 对于重原子，当x 射线的能量达到电子从被束缚的原子轨道发生跃迁的能 量时( 入射线的波长靠近重原子的吸收边) ，共振使得电子加速增强，电子对x 射线的吸收增强并扰乱了正常散射， ( a n o m a l o u sd i s p e r s i o n ) 。在这种情况下， 这种情况下产生的散射称为反常散射 原子的散射因子应表示为： f = f o 七l p 其中f ，和f 分别表示反常散射的实数部和虚数部。它随着波长的变化而变 化。反常散射的出现导致了( h ，k 1 ) 和( 也- k , 1 ) 两个衍射的强度变化并不相等，这 就破坏了f d e d e l 定律。 生物大分子晶体大多是由c ，h ，o ，n 等轻原子组成的，它们的反常散射非 常弱，当蛋白质中存在重原子或加入重原子以后，就能观测到较强的反常散射。 散射性质上的这种差别使得反常散射对于相角确定很有用处：即通过适当的衍 射测量分离反常散射，由此确定反常散射原子的位置；得到这种亚结构之后， 计算其散射模式并以此为参考确定整体散射模式的相角。这样相角问题就可以 1 2 第二章蛋白质晶体学原理平方法 较为容易地通过分析单个晶体的衍射数据而解决。 x 射线散射波的可迭加性是从多波眭反常散射实验中获取相角信息的基 础。象同晶胃换法中母体和衍生物晶体的强度差别一样，利用f r i e d e l 点对之间 衍射强度的差别也u 丁以求出相位信息。它可以用于确定反常散射源的位置，从 而提供额外的相位信息，帮助确定分子的确定构象。 每一个反常散射原子的原子散射园子可以表示为： f = h + r 矿 其中，南是证常散射部分，来自弹性散射是一个实数，与波长无关，随着 散射角2 0 的增加而减小。而反常散射部分是一个复数，柬自非弹性散射。这是 因为它包括了一个额外的相位变化，由于艿振的存在，它随入射光波长x 的变 化而产生急剧变化，但是由于源十内层电子散射的原冈，其基本与衍射角无关。 r 和f 分别为反常散射部分的实部与虚部。 幽2 2 含有反常散射原子的太分子对x 射线的散射 如图2 2 f 是结构园子中非反常散射原子的贡献，f 一是反常散射原予的 非反常散射部分，因此，散射( h k l ) 的结构凼子可以表示为： i f ( h k l ) = 。f 队十。f + “f ” = 。f b 十。f 十l f 十f 0 f b 一是所求的全部正常散刳的结构因子：它是非反常散射原于的散射 。f b ) 和反常散射原子的正常散射部分( o f a ) 的贡献之和。f ” 和f 一分别是 第二章蛋白质晶体学原理和方法 反常散射的实数项和虚数项，随波长变化而变化。将正常散射相关的量与波长 依赖的部分分离，则得： 旧2 = i f b a l 2 + 口i 慨1 2 + b 口f b a i 口f a i c o s ( 口p s a w4 - c i 口f b a i i 口f a i d n ( 。g b a 一。州 其中a ，b ，c 是九的函数，可以由原子吸收系数得到。对于f r i e d e l 点对来 说，l f l 2 值不同，但是它们可以通过实验测量。未知量为 f b a i ，l f a i 和( 9 队q a ) 与九无关，而且除了( 9 b a 9 a ) 的符号以外，其它值对于f d e c l c l 点对是相等的。 因此，相对一个九值的一套数据可以给出关于这三个未知量的两个方程，即从 理论上说，在两个不同波长所收的数据就足够给出i f 队i ，i f a l 和( q b a q a ) 的值。 对于蛋白质电子密度图的计算来说，q b a 是需要的，它可以通过反常散射原子 得出：即用反常差值p a t t e r s o n 函数或直接法定位反常散射原子，然后计算出纵， 再根据已计算出的( q 队叩a ) 就可得到( p b a 。 反常散射效应最为显著的体现是某些散射强度的差别，而这些在正常的散 射中是等值的。差别之一为，f r i e d e l 对( h 和- h ) 或者其旋转对称等效点的结 构振幅之间的b i j v o e t 差： 彳凡兰降i 阳i 另外一个为不同波长下结构振幅的色散差( d i s p e r s i v ed i f f e r e n c e ) ： 彳兰m i - m i 对于通常的衍射实验正常散射的假设是成立的，因为蛋白质分子中的c ， h ，o ，n ，s ，p 等轻原子反常散射非常弱。而重原子则因通常能观测到强烈的 反常散射，而长期以来在相位确定中作为同晶置换法的补充。反常散射原子可 能是附着于蛋白质上的附加重原子，也可能是母体蛋白质结构内原有的铜、铁、 硫等原子( 硫原子的反常散射较弱，只能用于相当小的蛋白质分子) ，因而此法 在金属蛋白中广泛使用。对无金属的蛋白进行标记的一个途径是掺入硒代甲硫 氨酸代替甲硫氨酸培养细菌以产生含硒代甲硫氨酸的蛋白质，达到用硒取代硫 的目的，这要求蛋白质在细菌中能够表达。当然，也可将重原子衍生物作为母体 1 4 第二章蛋白质晶体学原理和方法 处理。目前采用含硒代甲硫氨酸的蛋白质晶体，或采用汞或铂家族的化合物作 为衍生物的晶体进行m a d 方法测定结构已经成为蛋白质晶体学最为常规的方 法之一。它最大的优点在于所有测量可以仅在一个晶体上进行，可以达到完全 同晶的要求。 2 3 4 分子置换法( m r ) 3 1 3 2 也称帕特逊( p a t t e r s o n ) 搜索法。采用这种方法的前提是存在与待解析蛋白质 在结构上类似的已知分子模型。这个模型可以作为相位计算的初始模型。目标 蛋白和已知模型之间结构上的相似性通常依据氨基酸序列的相似性来判定，在 大多数情况下，3 0 4 0 的序列相似性是最低要求。 己知的结构模型必须正确放置在未知结构的晶胞中，如果两个结构相似， 它们的p a t t e r s o n 函数也应相似。分子置换法中旋转函数计算的p a t t e r s o n 函数 是晶胞中分子内向量在原点周围的分布。因此，在原点周围的p a t t e r s o n 函数分 析可以决定模型的取向( 采用旋转函数) 。考虑晶体学对称分子之间的向量可以 决定分子在晶胞中的位置( 采用平移函数) 。 为确定模型的取向，定义交叉旋转函数为： 其中p 。删( u ) 是目标晶体的帕特逊函数；p m o d e l ( c u ) 是根据模型分子旋转后计 算的模型p a t t e r s o n 函数，即将一个旋转矩阵c 作用于模型分子使其旋转至 p m o d e l ( c u ) 。当两个p a t t e r s o n 图的自向量峰最佳叠合，交叉旋转函数具有最大相 关系数时，即可得到搜索模型的正确取向。 当模型被调整到正确取向后，再执行平移搜索以得到模型在晶胞中的正确 定位。平移函数定义为： 其中p 。删( u ) 是待解晶体p a t t e r s o n 函数，而p m o d 。l ( u ，t ) 是模型分子在晶胞中 相对原点平移一个向量t 后计算的晶体学对称相关的两模型的交叉p a t t e r s o n 函 1 5 第二章蛋白质晶体学原理和方法 数。与旋转函数不同，平移函数搜索的是两个p a t t e r s o n 图的交叉向量峰之间的 相关性。这是因为不对称单位之间是晶体学对称元素联系的，因而交叉向量对 平移敏感。一旦模型放在了单位晶胞内正确的位置，平移函数会产生最大的相 关系数。经过成功的旋转和平移搜索后，就可以得到模型分子在待解晶体中的 正确位置。 分子置换法通常用于与某一已知结构属于同一蛋白家族的同源蛋白的结构 解析，也可以用于同一蛋白质不同晶型的晶体结构解析。 般情况下，成功的m r 方法的范例，其模型分子和未知分子间的r m s 的偏差不大于1a 。判断分子置换法的结果是否正确的标准如下： ( 1 ) 最常用而又简单的方法是考察晶胞中堆积的合理性。 ( 2 ) 比较不同分辨率范围内结果的一致性。 ( 3 ) 在多个亚基( 分子) 的情况下，则考察亚基之间的关系是否与自身旋 转函数中的结果吻合。 ( 4 ) 如有重原子衍生物数据的话，用m r 法取得的模型相位计算差值傅立 叶图，图上应能揭示出重原子位点。 第三节蛋白质结构测定的主要过程 2 3 1 第一步克隆、表达、纯化 解析蛋白质晶体结构的前提是制备均一的蛋白质样品并获得晶体。因此获 得表达量高，性质均一的蛋白对后续步骤，特别是结晶起到及其重要的作用。 2 3 2 第二步结昌 在大多数情况下，蛋白质结晶是工作的瓶颈，需要通过大量的条件筛选和 优化以使蛋白质分子间的弱相互作用促使蛋白质分子形成高度有序的晶体而不 是随机聚合形成沉淀。尽管已有相当数量的论文和专著在研究这个问题，但采 用一定的标准方案并不能保证长出所需的单晶。蛋白质晶体作为一种有序的分 子聚集，受到诸如p h 、温度、沉淀剂、缓冲液类型、添加剂及本身分子结构等 众多因素的影响。 1 6 第二章蛋白质晶体学原理和方法 晶体生长过程可以看作两个阶段：首先是形成晶核，然后是周围的分子向 晶核聚集，即晶体长大的过程。根据对小分子物质结晶的研究，晶体的形成取 决于一个一定大小的晶核的形成，如果形成的晶核太小就可能溶解。一定大小 的晶核可能包含1 0 至2 0 0 个分子，晶核形成的时间随条件而变化，成核速度明 显随过饱和度而变化，溶液达到某一过饱和度时，成核速度就迅速增加。为了 减少成核数量，从而控制晶体的数量，必需尽可能使溶液缓慢地达到过饱和度， 并且使过饱和度尽量低。 用于生物大分子结晶的技术主要有4 种：批量结晶法、气相扩散法、液液 扩散法和透析结晶法。批量结晶法直接将未饱和的蛋白质溶液和沉淀剂混合， 依靠体系内部的能量驱动成核直至结晶。这种方法的要点是控制所加沉淀剂的 量而使蛋白质溶液逐步达到低过饱和度