（食品科学专业论文）菜籽皮中原花色素的提取、纯化及其抗氧化性质研究.pdf

菜籽皮中原花色素的提取、纯化及其抗氧化性质研究 摘要 原花色素是植物中广泛存在的一类的天然多酚化合物，具有很强的抗氧化 活性和清除自由基能力，被广泛应用于医药、保健品、食品及化妆品等诸多领 域。国内外关于原花色素的研究多取材于葡萄籽或松树皮，而鲜有关于菜籽皮 原花色素( r a p e s e e ds h e l lp r o a n t h o c y a n i d i n s ，r s p c ) 的报道。本文对菜籽皮原 花色素的提取、分离工艺进行了研究，通过对r s p c 的抗氧化性分析测定，得 到以下结论： 1 ) 菜籽皮中含有水分1 1 7 2 ，蛋白质9 2 3 ，粗脂肪1 0 9 3 ，单宁3 7 6 ， 植酸2 4 5 ，硫代葡萄糖苷1 0 8 9 9 m o l g ，原花色素2 9 8 ，其中游离态原花色 素含量为1 5 2 ，与纤维结合原花色素0 7 9 ，与蛋白质结合原花色素0 6 7 。 测定结果表明，菜籽皮中游离原花色素含量较高，可作为提取原花色素的原料。 2 ) 采用响应曲面法对超声波辅助提取菜籽皮原花色素的工艺进行优化， 在原料粒度6 0 目，乙醇浓度5 4 ，提取液p h5 0 ，料液比l ：1 2 ，浸提时间为 2 3m i n ，提取3 次的条件下，原花色素提取率最高，其值达9 1 1 3 。 3 ) 选用2 倍体积的石油醚和3 倍体积的氯仿对r s p c 提取液进行初步纯 化后，其含量提高到5 6 7 5 。在上述初步纯化的基础上，以大孔吸附树脂为介 质作进一步提纯。对6 种型号的大孔树脂筛选结果表明，以h p d 7 5 0 大孔树脂 作为吸附填料效果最佳，纯化条件为：上样浓度3m g m l ，样液p h 为5 o ，上 样流速2m l m i n ，洗脱液为9 0m l6 0 乙醇，洗脱速度2m l m i n 。此条件下， 树脂对原花色素的吸附率为9 1 9 ，解析率为9 6 8 ，冷冻干燥后产品含量可 达到9 6 2 。 4 ) r s p c 抗氧化能力研究结果显示其具有很高的还原力，r s p c 清除羟自 由基、超氧阴离子自由基及d p p h 自由基的能力均高于v c ，且与葡萄籽原花 色素无明显差别，抗脂质体体系过氧化能力略低于b h t ，高于v c ；同时，菜 籽皮原花色素对高温和光照较为敏感，应在低温下避光密封保存。由此表明， r s p c 是一种有效的抗氧化剂，具有广阔的开发应用前景。 关键词：菜籽皮，原花色素，超声波，抗氧化，响应曲面法，纯化 e x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o na n d a n t i o x i d a t i o no f p r o a n t h o c y a n i d i n sf r o mr a p e s e e ds h e l l a b s t r a c t p r o a n t h o c y a n i d i n s ( p c ) ，a l s ok n o w n a sc o n d e n s e dt a n n i n s ，a r ep o l y m e r i cc o m p o u n d s ， w h i c ha r ew i d e l yd i s t r i b u t e di np l a n tk i n g d o m i ta c t sa sa l la n t i o x i d a n t ，r e m o v e sf r e e r a d i c a l s ，a n dr e d u c e sr i s ko fc l l r o m cd i s e a s e ss u c ha sc a r d i o v a s c u l a rd i s e a s ea n dc a n c e r t h e r e f o r ei nr e c e n ty e a r sm u c he m p h a s i sh a sb e e np u to ns t u d i e so fp r o a n t h o c y a n i d i n s w h i c ha r em o s t l yf r o mg r a p es e e da n dp i n eb a r k b u ta tp r e s e n tf e wr e p o r t sa r ef o u n do n t h er e s e a r c ho ft h er a p e s e e ds h e l lp r o a n t h o c y a n i d i n s ( r s p c ) t h i sp a p e rh a ss t u d i e dt h e e x t r a c t i o n , p u r i f i c a t i o na n da n t i - o x i d a t i o na c t i v i t yo fr s p c ，r e s e a r c hr e s u l t s a r ea s f o l l o w s ： 1 ) r a p e s e e ds h e l lc o n t a i n s ii 7 2 w a t e r ，9 2 3 p r o t e i n ，1 0 9 3 f a t ，3 7 6 t a n n i n s ， 2 4 5 p h y t i c a c i d ， 10 8 9 i t m o l gg l u c o s i n o l a t e s ， a n d2 9 8 p r o a n t h o c y a n i d i n s t h ep cc o n t e n t so ff r e ef o r m ，b o u n d e d 而t hp r o t e i na n df i b e ri nt h e r a p e s e e ds h e l lw e r e1 5 2 ，0 6 7 a n d0 7 9 r e s p e c t i v e l y t h e r e f o r er a p e s e e ds h e l lc a nb e c o n s i d e r e da san e wr e s o u r c eo fp r o a n t h o c y a n i d i n s 2 ) b a s e do ns i n g l e f a c t o r t e s t s ，t h em a i nf a c t o r sa f f e c t i n gt h e e x t r a c t i o no f p r o a n t h o c y a i n d i n sw e r es t u d i e d t h e nap r e d i c t i v ep o l y n o m i a lq u a d r a t i cm o d e lw a ss e tu p b ym e a n so fc e n t r a lc o m p o s i t ed e s i g nt oo p t i m i z et h ee x t r a c t i o np a r a m e t e r so fr s p c t h e o p t i m a lc o n d i t i o n so fe x t r a c t i o nb yu l t r a s o n i cw a v ew e r ec o n c l u d e da sf o l l o w s ：g r a n u l a r i t y o fr a p e s e e ds h e l l6 0m e s h ，c o n c e n t r a t i o no fe t h a n o l5 4 ，s o l i d - l i q u i dr a t i o1 ：12 ，p h5 0 ，t h e t i m eo fu l t r a s o n i ct r e a t m e n t2 3m i n ，e x t r a c t i n gf o r3t i m e s u n d e rt h i sc o n d i t i o n , t h e e x t r a c t i o ny i e l dr e a c h e dt o91 13 3 ) a r e rh a n d l i n gw i m2t i m e sv o l u m eo fp e t r o l e u me t h e ra n d3t i m e sv o l u m eo f c h l o r o f o r m ，t h ep cc o n t e n tr e a c h e dt o5 6 7 5 e x p e r i m e n t so f6k i n d so fm a c r o p o r o u s a d s o r p t i o nr e s i na d s o r b i n ga n dd e s o r b i n gr s p cs h o w e dt h a t h p d 7 5 0w a st h em o s t a p p r o p r i a t er e s i ni na l lf o rt h ep r e l i m i n a r yp u r i f i c a t i o no fr s p c ，t h eo p t i m a lc o n d i t i o no f p u r i f i c a t i o nw a s ：c o n c e n t r a t i o no fr s p cw a s3m g m l ，p h5 0 ，t h ea d s o r p t i v ev e l o c i t y w a s2m l m i n ；o r d i n a le l u t i o nw i t h9 0m l6 0 e t o h ，d e s o r p t i v ev e l o c i t yw a s2 m l m i n u n d e rt h i sc o n d i t i o n ，t h ec o n t e n to fp co ft h ev a c u u mf r o z e nd r y i n g p r o d u c t sr e a c h e dt o9 6 2 4 ) c o m p a r e dw i t hv c ，r s p ch a ss t r o n g e r c a p a c i t yi nt h ee x p e r i m e n t so n d e o x i d i z a t i o nc a p a c i t y ，s a v e n g i n gh o ，0 2 - a n dd p p h f r e er a d i c a l s o n l yi nt h e e x p e r i m e n to ni n h i b i t o r ye f f e c t so nt h eo x i d a t i o no fl i p o s o m ep e r o x i d a t i o ns y s t e m ， t h eb h ts h o w e das t r o n g e rc a p a c i t yt h a nr s p c r s p cs h o w e dn os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c ew i t hg r a p es e e dp r o a n t h o c y a n i d i n si nt h ea b o v ee x p e r i e m e n t s a l l p r o v e dt h a tt h er s p ch a ds t r o n ga n t i o x i d a t i o na b i l i t y , a n di ti s ak i n do fg o o da n d p u r en a t r a la n t i o x i d a n t k e yw o r d s ：r a p e s e e ds h e l l ，p r o a n t h o c y a n i d i n ，u l t r a s o n i cw a v e ，a n t i o x i d a n t ，r e s p o n s e s u r f a c e ，p u r i f i c a t i o n 插图清单 图1 1 原花色素主要二聚体结构2 图3 1 溶剂种类及浓度对原花色素提取率的影响一1 5 图3 2 原料粒度对原花色素提取率的影响。1 6 图3 3 料液比对原花色素提取率的影响。1 6 图3 4p h 对原花色素提取率的影响1 7 图3 5 超声时间对原花色素提取率的影响。1 7 图3 6y = f ( x l ，x 2 ) 响应曲面图及等高线图2 1 图3 7 y = f ( x l ，z 3 ) 响应曲面图及等高线图2 1 图3 8y = f ( x l ，x 4 ) 响应曲面图及等高线图2 l 图3 9 y = f ( x 2 ，x 3 ) 响应曲面图及等高线图2 2 图3 1 0 y = f ( x 2 ，x 4 ) 响应曲面图及等高线图。2 2 图3 1 1y = f ( x 3 ，x 4 ) 响应曲面图及等高线图2 2 图3 1 2 菜籽皮原花色素粗品2 3 图4 1h p d 7 5 0 树脂对r s p c 静态吸附动力学曲线2 9 图4 2 上样浓度对h p d 7 5 0 树脂吸附率的影响2 9 图4 3 样液p h 对h p d 7 5 0 树脂吸附率的影响3 0 图4 4 上样流速对h p d 7 5 0 树脂吸附率的影响3 0 图4 5 洗脱液浓度对h p d 7 5 0 树脂解析率的影响。3 1 图4 6 洗脱流速对h p d 7 5 0 树脂解析率的影响。3 1 图4 7h p d 7 5 0 树脂动态解析曲线3 2 图4 8 菜籽皮原花色素。3 3 图4 9 菜籽皮原花色素红外光谱图。3 3 图4 1 0 葡萄籽二聚体高效液相色谱图3 4 图4 1 1r s p c 2 高效液相色谱图3 4 图4 1 2r s p c 3 高效液相色谱图3 4 图5 1 不同抗氧化剂还原力的比较。4 0 图5 2 不同抗氧化剂对h o 自由基的清除作用的比较4 l 图5 3 不同浓度菜籽皮原花色素对脂质体体系的抗氧化作用4 1 图5 4 不同抗氧化剂对脂质体体系的抗氧化作用比较。4 2 图5 5 不同抗氧化剂对超氧阴离子自由基的清除作用比较4 2 图5 65 1 , t g m l 不同抗氧化剂对d p p h 自由基的清除动力曲线4 3 图5 7 不同抗氧化剂对d p p h 自由基的清除作用比较4 3 表格清单 表2 一l 菜籽皮中主要组成13 表3 1 提取次数对原花色素提取率的影响。1 8 表3 2 超声波提取菜籽皮原花色素试验的因素与水平1 8 表3 3 超声辅助提取r s p c 四因素二次旋转正交设计试验方案与结果。1 9 表3 4 方差分析及显著性检验2 0 表3 5 提取前后菜籽皮中主要成分变化比较。2 4 表4 1 梯度洗脱程序2 8 表4 2 有机溶剂初步纯化后原花色素提取液成分的变化2 8 表4 3 不同树脂对r s p c 的吸附效果的比较2 8 表4 4h p d 7 5 0 大孔吸附树脂的重复使用周期比较。3 2 表5 1 h o 清除试验加样表3 8 表5 20 2 一清除试验加样表3 9 表5 3 温度对菜籽皮原花色素稳定性的影响4 0 表5 4 光照对菜籽皮原花色素的影响4 0 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得 金壁- 王些太堂 或其他教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文作者签字：签字日期：冽年乒月矽日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 金壁至些太堂 有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人 授权 金墨王些太堂 可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 名：稚昭 签字日期：卅年p 月“日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 签字帆伽年华月上7 日 电话： 邮编： 第一章绪论 1 1 油菜籽简介 油菜籽是草本十字花科作物，是我国主要油料作物和蜜源作物，也是当今 世界发展最快的多用途作物之一。其种植面积占我国油料作物总面积的4 0 以 上，产量占全国油料总产量的3 0 以上，居世界首位【1 1 。 现在的菜籽加工除极少数用于科学研究以外，几乎全部采用带皮加工工艺 制油。由于菜籽皮主要由纤维素和木质素等非营养物质组成，有效成分油脂和 蛋白含量低，还含有大量的抗营养因子如硫甙、多酚等，带皮加工时皮中大量 的多酚和木质素与蛋白质发生缩合，大大降低了菜籽饼粕的蛋白含量和营养效 价【2 】，并使菜籽饼粕呈苦涩味，降低了菜籽饼粕的利用价值。 近年来随着菜籽皮脱皮冷榨技术的兴起，我国每年将有大量的菜籽皮产生。 经测定，油菜籽皮中水分含量为1 1 左右、蛋白质1 0 左右、粗脂肪5 左右、 不溶性膳食纤维4 7 左右【3 】。菜籽皮中含有丰富的酚类物质，l9 5 9 年b a t e s m i t h 和r i b e r e a u 首次报道了菜籽皮中缩合单宁( 原花色素) 的存在；1 9 7 1 年d u r k e e 等证实了这一发现。另外，n a c z k 和s h a h i d i 报道菜籽皮中单宁的含量会因菜籽 品种和生长环境的差异而不同，其值在0 1 4 o 2 3 o 间。因此，若能合理开发和 利用这些成分，将会产生巨大的生物技术价值和实际应用价值。例如，将废弃 的油菜籽皮单独收集储存，可以用于提取单宁、色素等深加工产物，也可以直 接用做牛饲料，或做燃料、纤维板原材料等，变废为宝，从而提高了油菜籽产 业的附加值。 1 2 原花色素 原花色素又称原花青素( p r o a n t h o c y a n i d i n s ，简称p c ) 也称缩合单宁，是植 物中广泛存在的一类属于双黄酮衍生物的天然多酚化合物，有人将其归为生物 类黄酮【4 】，也有人将其归为缩合鞣质，这类物质在酸性介质中加热，可降解和 氧化产生红色花色素( c y a n i d i n s ) ，故称为原花色素”j 。起初人们将其划归为缩合 单宁类，随着分离鉴定技术的提高和对此类物质的深入研究和深刻认识，现已 成为独树一帜的一大类物质并称之为原花色素【6 1 。 1 2 1原花色素的来源与分布 原花色素在自然界中广泛存在，人们对它的研究己有3 0 多年历史，特别是 自8 0 年代以来，全世界对原花色素的研究日益广泛和深入，德、法、意、奥、 美、日、印、匈、韩等国的研究人员主要针对下列植物的原花色素进行了研究： 葡萄，英国山植，单子山植，花生，银杏，日本罗汉柏，北美崖柏，土耳其侧 柏，花旗松，白桦树，野生刺葵，番荔枝，野草墓，日本莽草，扁桃，高梁， 两谷椰子，可可豆，贯叶金丝桃，头状胡枝子，粘胶乳香树，海岸松，洋委陵 菜和大黄等。此外，还用银杏、花旗松的叶和小连翘进行了组织培养研究。除 植物外，葡萄汁、红葡萄酒、苹果汁、苹果酒和啤酒中也都含有原花色素【7 】。 1 2 2 原花色素的结构与理化性质 原花色素由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成，平均聚合度( d e g r e eo f p o l y m e r i z a t i o n ，d p ) 2 1 5 ，平均分子量5 7 8 5 0 0 0 d 引。最简单的是儿茶素、 表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，此外还有三聚体、四聚体等直至 十聚体。根据聚合度的大小，通常将二四聚体称为低聚体( p r o a n t h o c y a n i d i n s o l i g o m e r s ，简称o p c ) ，将五聚体以上的称为高聚体( p r o a n t h o c y a n i d i n sp o l y m e r s ， 简称p p c ) 9 1 ，低聚体中二聚体分布最广，是最重要的一类原花色素。二聚体中， 因两个不同聚合体的构象或者键合位置的不同，可有多种异构体，已分离鉴定 的8 种结构形式分别命名为b 1 b 8 ，其中b l b 4 是由c 4 c 8 键合，b 5 b 8 由 c 4 c 6 键合，主要二聚体结构如图1 1 所示【l 们。到目前为止，已从葡萄籽和皮 中分离、鉴定了1 6 种原花色素，其中包括8 个二聚体、4 个三聚体、其它为四 聚体、五聚体和六聚体等。目前的研究结果表明，在原花色素各种不同聚合体 中以二聚体的抗氧化能力最强【1 1 】。 n 啊撺嘣蛔b lr 氓阳 哟岫妇b ll t - o t r 佣 h 筘面妇b ir 萨喟 h 啊扣嘶霸b r 1 啪ir 嘲 图1 1原花色素主要二聚体结构 f i g 1 一ls t r u c t u r eo fd i m e r i cp r o a n t h o c y a n i d i n s 原花色素具有水溶、无毒、无过敏等特性。比儿茶素有更多的自由酚羟基， 极性较大，能很好地溶于丙酮、甲醇、乙醇、冰醋酸、乙酸乙酯，不溶于苯、 氯仿、石油醚等有机溶剂。结构中含有的羟基越多，在水中的溶解度越大，羟 基经甲基化后，则增加了它在有机试剂中的溶解度。 另外，原花色素还具有多种化学反应活性，这类反应活性使其具有多种功 能，并被广泛应用的化学基础。例如，原花色素的酚羟基可以进行醚化、酰化 等反应；b 环的邻位羟基可以与c a 2 + 、f e 2 + 、f e 3 + 、c u 2 + 、z n 2 + 和c r 3 + 等多种金 属离子形成稳定的五元螯合环【1 2 l ；酚羟基还具有抗氧化和清除自由基活性等。 利用原花色素的酚羟基反应活性，不仅可进行定性、定量检测，而且可以制备 脂溶性原花色素、药物中间体、重金属吸附分离材料、抗氧化剂等。此外，原 花色素还可以与蛋白质、生物碱、多糖和脂质等发生复合反应【1 3 】。 1 2 3 原花色素功能及应用 1 2 3 1 原花色素的功能 2 原花色素具有极强的抗氧化特性，是目前发现的最强最有效的自由基清除 剂和脂质过氧化抑制剂之一p 引，尤其是其体内活性，更是其它抗氧化剂所不可 比拟的，并且还具有保护心血管、预防高血压、抗肿瘤、抗辐射、抗突变及美 容等作用【3 9 1 。 抗氧化活性 原花色素分子中存在大量活性酚羟基，因此具有很强的清除体内自由基和 抗氧化的作用，主要表现在以下几个方面：( 1 ) 能有效地清除超氧阴离子自由 基和羟自由基等，也可中断自由基链式反应；( 2 ) 参与磷脂、花生四烯酸的新 陈代谢和蛋白质磷酸化，保护脂质不发生过氧化损伤；( 3 ) 为强有力的金属螯 合剂，可螯合金属离子，在体内形成惰性化合物；( 4 ) 保护和稳定维生素c ， 并有助于维生素c 的吸收。b a g c h i d 等曾用小鼠进行体内实验，结果表明，葡 萄籽提取物原花色素可对氧化损伤起到保护作用，且其保护作用优于其它抗氧 化剂。体外实验也获得了相似的结果【4 1 1 。张丁等测定了低聚原花色素对小鼠 体内s o d 活力的影响，并进行了延缓果蝇衰老试验，结果显示其具有抗氧化、 清除体内自由基和一定的延缓衰老作用【4 2 1 。目前，从茶叶中制备的茶多酚( 单 体原花色素) ，以及从海岸松树皮与葡萄皮中制备的低聚原花色素，已经作为天 然抗氧化剂广泛应用。 保护心血管和预防高血压 原花色素可被用于提高血管抵抗力，降低毛细血管渗透性，它的抗氧化和 抗酶作用已被几个改善毛细血管渗透性的体内试验模型所证明 4 3 - 4 4 】。r o g e r 等 证明，原花色素能够逆转失调的内皮功能，从而达到治疗心血管疾病的目的【4 5 1 。 动物实验和临床研究发现，原花色素可以有效地降低胆固醇和低密度脂蛋白水 平，预防血栓形成，有助于预防心脑血管疾病的发生【4 们。 抗致突变活性 日本s u g i m o t o 证实葡萄籽原花色素低聚体对t r pp 2 ( 一种来自食品的致突 变剂) 的抑制率达9 4 。原花色素的抗致突变活性可部分地归因于它的抗氧化剂 活性【4 ，同时也为其用于预防慢性变性疾病提供了理论基础。 抗辐射作用 自由基学说是辐射损伤的基础理论，机体受辐照后可产生的内源性自由基， 引发脂质过氧化等损伤。而原花色素具有清除自由基、抑制氧化损伤的功效【4 引。 据报道，将s 1 8 0 肉瘤小鼠分别给予6 0 c o y 射线局部照射，口服p c 和局部照射 加口服p c 的不同方法处理，结果表明，同未受照射组比较，照射组的m d a ( 丙 二醛) 水平均升高，显然与其体内脂质过氧化加强，氧化产物在体内蓄积有关。 而给予p c 可使m d a 水平降低，且剂量愈大降低幅度也愈大。表明p c 可抑制 辐射引发的脂质过氧化，这也可能是p c 抗辐射损伤的主要原因。 防癌抗癌作用 原花色素具有抑制皮肤癌、前列腺癌、乳腺癌细胞生长，并促使其凋亡的 活性。s h a n gx j 等研究表明原花色素可以加速引起前列腺癌的p c 3 系细胞死 亡【4 9 1 。n o m o t o 等发现，长期服用低浓度的原花色素产品，可以有效预防结肠 癌，体内试验表明，与对照组相比，o 0 0 2 的原花色素能明显增加大鼠结肠癌 细胞的致死率，抑制癌细胞增长1 5 。 提高免疫力 段玉清等探讨了莲房原花色素对机体免疫功能的影响，结果表明莲房原花 色素能显著增强巨噬细胞的吞噬功能，能刺激t 、b 淋巴细胞增值，提高n k 细胞活性，有效地增强机体免疫功能1 5 。 其他功能 实验表明，原花色素还具有保养皮肤、抗过敏、抗菌消炎、改善微循环、 舒缓下肢水肿和静脉曲张、增加关节灵活性、提高对维生素c 和e 、以及环孢 素、雌激素、特菲那丁等药物的口服吸收率、增强其药效等作用【5 2 1 。 1 2 3 2 原花色素的国内外应用现状 原花色素在食品中的应用 国外生产的p c 制剂已像维生素一样，成为人们经常服用具有延缓衰老和 美容等功能的保健食品。如美国的p a n a 1 i f e 葡萄籽抗氧化剂，意大利的o p c s ( 葡乐安) ，法国的p y c n o g l n o l ( 碧箩芷) 等。近年来，国内也出现了类似的产 品，如“视明宝”、“雷震子护康胶囊 等保健食品已相继问世。原花色素在食 品领域的应用，不仅表现在保健品的研究开发方面，同时它既可以作为营养强 化剂，又可以作为食品防腐剂应用于一般饮料和食品，符合人们目前消费流行 趋势的要求1 5 引。 原花色素在化妆品中的应用 原花色素的抗皱、美白、保湿和抗辐射等功效为其在化妆品领域开辟了广 阔的前景。意大利的i n d e n a 公司用了5 年时间验证成功了以磷脂为载体的功能 化妆品p h y t o s o m e ，此产品含5 银杏原花色素二聚体，用于皮肤消炎和改善微 循环，经1 8 名健康受试者试验，表明该化妆品具有较好的防护紫外线伤害的作 用。日本y a m a s k o s h 研制了含1 原花色素的可使皮肤亮洁的油性化妆品。韩 国某化妆品公司还研制出一种含有原花色素单体的眼霜，并获专利保护。 原花色素在药品中的应用 在药物方面，原花色素对血管疾病的治疗价值在上世纪8 0 年代初已被证 实。在法国，用葡萄籽原花色素制成的专利产品用于治疗微循环疾病，包括眼 睛与外周毛细血管通透性疾病及静脉与淋巴功能不全。法国s a n o f i 公司用原花 色素与大豆卵磷脂制成复合物，用作血管保护剂和抗炎剂。此外，德国的 b e r k h m a n 等研制了用于治疗酒精中毒的原花色素制剂，并得到专利保护1 4 引。 综上所述，原花色素经历了5 0 多年的研究开发和临床应用试验，以其优 4 越的抗氧化活性、多种保健功能及无副作用等受到人们的青睐，是一种具有广 阔发展前景的天然资源。 1 2 4 原花色素提取与纯化研究现状 原花色素的制备有3 种方法，即化学合成法、生物合成法和植物提取法。化 学合成法副产物比较多，特别是产物的异构体难以分离，造成产物的纯度不高， 因而影响了它在食品、药品等安全性要求极高领域的应用。生物合成法要求的 条件比较苛刻，使得生产成本增加，同时技术还不成熟。因此，目前原花色素 主要是从植物中提取与纯化。【1 4 j 1 2 4 1 原花色素的提取方法 溶剂提取法 用溶剂提取天然植物成分，是基于“相似相溶 的原理，利用天然产物中 各成分在溶剂中的溶解度不同，选用对活性成分溶解度大，对无效成分不溶或 少溶的溶剂，从而将有效成分从植物组织内溶解出来的方法。常用的方法有浸 渍法、渗流法、煎煮法、回流法、逆流法等，考察的因素包括粒度、成分、提 取温度、时间、溶剂用量、溶剂p h 、溶剂浓度梯度及设备条件等各种影响因素。 法国的教授j a c q u e sm a s q u e l i e rj 于1 9 5 1 年以水为溶剂，首次成功地从海松 皮中提取除了原花色素；美国的t h o m g a t ej h 等选用8 0 的乙醇为溶剂从葡萄 籽中提取原花色素【l 钉；r o m a n c z y k 等发明从可可中提取原花色素时，对脱脂可 可豆用质量分数7 0 m e o h 去离子水提取后，再用质量分数7 0 丙酮去离子水 溶剂提取2 次，真空浓缩，除去有机溶剂后，再溶于水中，用c h c l 3 提取，其水 相用乙酸乙酯提取后，真空浓缩除去乙酸乙酯，水相冷冻干燥，得到原花色素。 吕丽爽采用乙醇从经石油醚脱脂的葡萄籽中提取低聚原花色素，冷却离心提取 液再减压蒸馏，在料液比l ：7 ，提取温度4 8 6 ，提取时间3 0m i n ，乙醇浓度6 1 4 条件下提取三次，提取率达到9 0 1 附1 6 以7 1 。 超临界c 0 2 萃取法 孙传经等【1 8 】发明了一种超临界c 0 2 从黑加仑籽中提取黑加仑籽油和原花色 素低聚物的方法。该法分两步进行：第一步，是利用超临界c 0 2 提取黑加仑籽 油，控制萃取压力在2 5m p a 2 9m p a ，温度为6 0 ；第二步是超临界c 0 2 加人丙 酮与水的体积比为7 0 ：3 0 的改性剂，c 0 2 与改性剂流量体积比为4 ：1 ，压力为2 2 m p a 2 5m p a ，温度为6 0 ，提取原花色素低聚物。黑加仑籽油得率为1 6 ，原 花色素低聚物得率为4 。该法优点是同时获得两种产品，流程简单可靠，c 0 2 和改性剂循环利用，产品中无溶剂残留，对环境无污染。 微波辅助提取法 在微波场中，吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中 的某些组分被选择性加热，从而使得被萃取物质从基体或体系中分离，进入到 具有较小介电常数、微波吸收能力相对较差的萃取溶剂中。吕丽爽等【l9 】探索了 5 微波对从葡萄籽中提取低聚原花色素的影响，微波功率为5 0w ，微波作用时间 为1 5m i n ，料液比为l ：9 时，原花色素提取率达到3 8 。该工艺具有快速、高效 的特点。李瑞丽等人研究了微波辅助水提葡萄籽原花色素，所得原花色素的提 取率比单用传统水提法提高了约1 倍【20 1 。 超声波辅助提取法 超声提取法是对提取过程进行超声强化处理，由于其快速、高效等优点在 天然药物研究中有较多的应用，引起了广泛的重视。波兰的o s z m i a n s k ij a n l 9 9 6 年申请专利，以丙酮为溶剂采用超声波提取原花色素【2 l 】；国内的吴澎等用6 0 的乙醇配合超声波辅助法从白刺果籽中提取出了原花色素【2 2 1 。 酶法提取 由于原花色素多存在于植物的种皮和外壳中，其多被以纤维素为主构成的 细胞壁所包围，且部分会与纤维素结合成为结合态原花色素，大大降低了提取 率，因此可以考虑利用纤维素酶将种皮的纤维素水解后，再进行提取，以提高 原花色素得率。哈尔滨商业大学的吴春等研究了利用纤维素酶法提取葡萄籽中 原花色素的工艺，所得葡萄籽中原花色素的提取率为4 1 6 眩引。 1 2 4 2 纯化方法 原花色素提取液中含有色素、蛋白质、脂肪、胶质、糖类及悬浮物等杂质， 原花色素含量较小，为了得到纯度较高的菜籽皮原花色素产品，还需要进一步 除杂、精制纯化。植物粗提物中原花色素的分离包括溶剂萃取、膜过滤及吸附 层析法等。 溶剂萃取法：是最传统的纯化工艺，其工序一般为：有机溶剂浸提葡萄 籽，过滤，滤液用有机溶剂脱色素和咖啡因，再用乙酸乙酯萃取，浓缩干燥得 原花色素。但这类方法有机溶剂用量大，萃取率较低，对环境可能带来污染， 同时也容易造成产品中有毒有机物残留【2 4 1 。 树脂吸附法：大孔吸附树脂是7 0 年代以来发展起来的有机高聚物吸附剂， 具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，交换速度快、机械强度高、抗污 染能力强、热稳定好，在水溶液和非水溶液中都能使用。并且具有物理化学稳 定性高、吸附选择性独特、不受无机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和， 使用周期长、宜于构成闭路循环，节省费用等诸多优点。目前常采用的纯化方 法多用柱层析法进行。 张峻【25 】等人研究了用吸附层析法制备低聚原花色素，以a b 8 大孔吸附树脂 对葡萄籽原花色素粗体物进行了分级分离，再以乙酸乙酯洗脱，所得产物总酚 含量可达9 0 以上，且其中低聚原花色素占6 4 。该法工艺简单，能耗少，对 环境污染小，且树脂可重复利用，提取效率高。目前该方法己被广泛应用，有 望成为提取原花色素的可靠工业方法。 膜分离法：随着科技的发展，膜分离技术在制备天然药物注射剂、天然 6 药物口服药液、提取天然药物有效成分等方面己经有了很多成功应用的实例。 a r i g at o s l n a k i 等将原花色素含量1 0 0m g l 的乙醇溶液，通过一个相对分子截 面量5 0 0 0 的超滤膜或是阻盐率3 0 的反渗透膜进行过滤。使用相对分子截 面量为5 0 0 5 0 0 0 的超滤膜可以得到高纯度的原花色素【2 引，可以应用于食品和化 妆品等的抗氧化剂，或是作为广泛领域的配药的原料。 高速逆流色谱法：该技术由美国国家医学院i t oy i o c h i r o 博士于2 0 世纪6 0 年代首创，最初是一种制备型色谱技术，是一种不用固体载体或支撑体的液液 分配色谱，主要根据化合物在不相溶的两相间的分配能力进行分离 2 7 - 2 8 】，具有 分离效率高，产品纯度高，不存在载体对样品的吸附和污染，制备量大，溶剂 消耗少，而且操作条件简单( 室温、t e f l o n 惰性柱材) 的特点。目前己被广泛用于 天然药物材料的制备和分析。钟世安等1 2 9 1 采用反相高效液相色谱技术，分离制 备粗儿茶素粉末中表没食子儿茶素没食子酸酯( e g c g ) 、没食子儿茶素没食子酸 酯( g c g ) 、表儿茶素没食子酸酯( e c g ) z 种酯型儿茶素馏分。各物质经h p l c 检 测纯度达9 9 2 以上。 凝胶色层分离法：又称凝胶排阻色层分离法，主要是根据溶质分子的大 小进行分离的方法。在实际操作中，除了凝胶的分子筛效应外，还存在着吸附 作用，可以利用梯度洗脱的方式增加分离效果。目前普遍采用的固定相有葡聚 糖凝胶s e p h a d e xl h 一2 0 。但s e p h a d e xl h 2 0 凝胶的物理特性决定其并不能对原花 色素进行高效率分离。所以进一步的纯化和分离要采用凝胶过滤色谱或h p l c 进行【3 0 1 。 综上所述，利用溶剂分离虽然设备简单，操作费用低，但其产品纯度不能 满足要求，收率不高，只可作为前处理步骤。而膜分离法和逆流色谱法虽然得 到产品纯度较高，但成本也较高，且操作复杂。对比而言，采用大孔树脂吸附 设备简单，生产成本低得到的产品纯度高，而且流动相可选用醇一水系统，回收 容易。因此本文选择利用超声波辅助法提取菜籽皮原花色素，并采用溶剂萃取 初步纯化菜籽皮原花色素，进而选择适合型号的大孔吸附树脂以及适合的工艺 条件，以求得到纯度较高的菜籽皮原花色素产品。 1 2 5 原花色素的检测 国内外关于原花色素的检测一般采用紫外分光光度法、铁盐催化比色法、 正丁醇盐酸法、香草醛盐酸法，香草醛硫酸法、h p l c 法、h p l c m s 法等。 紫外分光光度法是利用原花色素在2 8 0n m 下有最大吸收【3 l 】的特点来测定 原花色素的含量，此法灵敏、稳定，操作简便，但是对原花色素的纯度有较高 要求，因此适用范围受到限制。 铁盐催化比色法最早由s w a i n 和h i l l i s 提出【3 2 】，反应的特征性显著，操作 简便，但反应时间长，重现性比较差。 正丁醇盐酸法1 3 3 j 是依据原花色素的反应原理，原花色素在热酸作用下能 生成红色物质，并可用分光光度法进行测定。此法对原花色素化学结构的依赖 性较大，选择性高，它与儿茶素单体不发生显色反应，因此不适宜于低聚原花 色素的测定，它与原花色素的高聚体反应也不完全。 采用香草醛法测定是因为原花色素在酸性条件下，a 环的化学活性较高， 其上的间苯二酚或间苯三酚与香草醛发生缩合，产物在浓酸作用下形成有色的 正碳离子。用分光光度法测定其吸光度，根据标准曲线来计算样品中原花色素 含量盐酸和硫酸都可作为反应过程的催化剂。但在香草醛一硫酸法中，硫酸的加 入会引起反应体系放热，从而导致原花色素的氧化分解，而使测定结果偏低。 香草醛盐酸法在国外最早用于测定干豆( p h a s e o l u sv u l g a r i sl ) 中的单宁含量。 后来，b a t es m i t h1 3 4 1 发现，香草醛盐酸法对原花色素( 缩合单宁) 的测定具有 特异性，特别是对于黄烷醇类物质测定效果较好，p r i n c e 对高粱中的原花色素 的测定进行了研究。目前，国外已采用香草醛盐酸法对测定葡萄籽中原花色素 的含量，但由于原料的来源不同，因此所用盐酸、香草醛的浓度、显色时间、 温度也不同，测定方法还有待进一步改进【3 5 】。 高效液相色谱法目前常用来分离鉴定原花色素。该法包括r p h p l c 和 n p h p l c 。s u n 等认为采用r p h p l c 进行分离鉴定原花色素时，通常是聚合度 小于3 的化合物能被较好的分离，而聚合度大于3 的化合物则仍然是一个“馒 头峰，而且出现顺序与聚合度大小无关【3 6 】。 h p l c m s 法主要用于鉴定原花色素的结构。y i n gy a n g 等采用n p h p l c a p c i m s 对葡萄中聚合度小于1 5 的原花色素成功地进行了分离和鉴定1 2 5 】。杨 成对等采用h p l c m s 技术分离分析了葡萄籽粗提物中的低聚原花色素【3 。7 1 ，主 要分离出5 种原花色素成分，分别为2 种单体、3 种二聚体和1 种三聚体。 此外还有薄层层析法、毛细管电泳法、荧光分析法等，但这些方法都因为 各方面的局限而较少应用，目前应用最为广泛的还是香草醛检测法及正丁醇 盐酸法。 1 3 本课题研究的目的意义及研究内容 1 3 1 课题研究的目的意义 我国是油菜籽生产大国，年产量在1 0 0 0 万吨以上，随着油菜籽脱皮冷榨 制油技术的发展，我国每年将会产生大量的菜籽皮。若按油菜籽含种皮1 6 计 算，经脱皮分离后约有7 5 的种皮分离出来，即每年将产生1 2 0 万吨以上的菜 籽皮。目前国内对菜籽皮的处理方法是将其作为饲料低价售卖。但油菜籽中9 0 以上的植酸、色素及皂素等抗营养因子都存在于种皮之中，直接作为饲料非但 不利于动物的吸收，同时也大大降低了菜籽皮的利用价值。 菜籽皮中含有丰富的酚类物