（环境科学专业论文）海洋厌氧细菌srb22和psb11抗菌活性物质的研究.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t i ti sw e l lk n o w nt h a tt e r r e s t r i a lm i c r o o r g a n i s m ，o n c ef o r m e dab r i l l i a n te r ao fa n t i b i o t i c s ， h a sb e c o m ea ni m p o r t a n tr e s o u r c eo fa n t i b i o t i c s ，e n z y m ei n h i b i t o r sa n do t h e rb i o a c t i v e s u b s t a n c e s h o w e v e r ，w i t ht h ee x t e n s i v eu s eo fa n t i b i o t i c s ，t w oi s s u e sh a v eb e e nr a i s e di n c l i n i c a lp r a c t i c e f i r s t ，b a c t e r i a lr e s i s t a n c eh a si n c r e a s e dy e a rb yy e a r , r e s u l t i n gi ne f f e c t d e c r e a s e do re v e nn oe f f e c to fs o m ea n t i b i o t i c s a n o t h e rp r o b l e mi st h a ts o m e n o n p a t h o g e n i c b a c t e r i ab e c o m eo p p o r t u n i s t i cp a t h o g e n ，c a u s i n gac e r t a i nt h r e a t i ni nc l i n i c a lp r a c t i c e s on e w a n t i b i o t i c so fn e ws t r u c t u r ea n dn e wm e c h a n i s m so fa n t i b a c t e r i a la c t i v i t yn e e dt ob es c r e e n e d c o n t i n u o u s l yi no r d e rt om e e tc l i n i c a ln e e d s h o w e v e r ，t h r o u 。g ht h el o n g - t e r ms t u d yo f t e r r e s t r i a lm i c r o o r g a n i s m ，t h i sa n c i e n tr e s o u r c e sh a v eb e c o m ei n c r e a s i n g l ye x h a u s t e d ，s oi ti s u r g e n t l yn e c e s s a r yf o ru st ob r o a d e nn e ww a yf o rd r u g s o c e a nh a sau n i q u en a t u r a l c o n d i t i o n s ，h i g hp r e s s u r e ，l o w n u t r i t i o n ，n ol i g h t ，l o c a lh i g h t e m p e r a t u r e ，h i 【g hs a l t ，m a k i n g m a r i n em i c r o o r g a n i s m sh a v es p e c i a lm e t a b o l i cp a t h w a ya n dg e n e t i cb a c k g r o u n d ，w h i c hh a s g r e a tp o t e n t i a lo fp r o d u c i n ga c t i v es u b s t a n c e sw i t hs p e c i a ls t r u c t u r ea n df u n c t i o n i tw a s f o u n dt h a ta b o u t2 7 o fm a r i n em i c r o o r g a n i s m sc a np r o d u c ea n t i b i o t i cs u b s t a n c e s w h i c h h a sb e c o m ea ni m p o r t a n ts o u r c eo fs c r e e n i n gn e wa n t i b i o t i c s i nt h i sr e s e a r c h a l l a n t i m i c r o b i a l s u l f a t e r e d u c i n gb a c t e r i u ms r b 2 2a n da n a n t i m i c r o b i a lp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i u mp s b 11 i s o l a t e df r o mt h es e aw a t e rs a m p l eo f h e i s h i j i a os e aa r e ai nd a l i a n ，w e r es t u d i e do nt h o s ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，a n dt h e i r a n t i m i c r o b i a la c t i v es u b s t a n c e s m a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： t h ee f f e c to ff e r m e n t a t i o nt i m eo nt h eb i o a c t i v es u b s t a n c e sp r o d u c t i o nw a sd e t e r m i n e d am e t h o do ft a n d e mu s eo fm a c r o p o r o u sa d s o r p t i v er e s i nn k aw a se s t a b l i s h e df o re x t r a c t i n g t h ea n t i m i c r o b i a la c t i v ep r o d u c t sf r o mt h ef e r m e n t a t i o nb r o t h b ye x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m a l f e r m e n t a t i o nt i m ew a sd e t e r m i n e dt ob e2 8d t h es u i t a b l ee x t r a c t i o np r o c e s sw a ss t r e a m l i n e d f i r s tf e r m e n t a t i o nb r o t hw a st r e a t e db ys a n df i l t e r s u b s e q u e n t l ye x t r a c tw i t hn k ar e s i n c o l u m na tp h6 0 。f r o m1 5 0lf e r m e n t a t i o nb r o t h ，1 0 o ogo fc r u d ee x t r a c tw a so b t a i n e d o n e a c t i v ea u b s t a n c e sw a so b t a i n e d t h e n i n d e n t i f i e da sm o n o n b u t y lp h t h a l a t eb ys p e c t r a l a n a l y s i so f1 h n m r ，1 c n m r ，d e p t 9 0a n dd e p t 1 3 5a sw e l la sb yc o m p a r i s o nw i t hd a t a r e p o r t e di nr e f e r e n c e k e yw o r d s ：m a r i n es u l f a t e - r e d u c i n gb a c t e r i u m ；m a r i n ep h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i u m ； a n t i m i c r o b i a ia c t i v es u b s t a n c e s ；e x t r a c t i o na n ds e p a r a t i o n h 大连交通大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解太蓬銮通太堂有关保护知识产权及保 留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的 知识产权单位属太造塞通太堂，本人保证毕业离校后，发表或使用 论文工作成果时署名单位仍然为太整塞通太堂。学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件及其电子文档，允许论文被查 阅和借阅。 本人授权太整交通太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入 中国科学技术信息研究所中国学位论文全文数据库等相关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 、 又。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此规定) 学位论文作者签名：伽则军导师签名：穆翌 魄卯7 年石月千日嘴：吲年6 月千日 学等篁毒作者毕业后托杆协姚幽衔哆 工作单位：电话： 。 通讯地址：邮编： 电子信箱： 大连交通大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢及参考 文献的地方外，论文中不包含他人或集体已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得太整銮通太堂或其他教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 本人完全意识到本声明的法律效力，申请学位论文与资料若有不 实之处，由本人承担一切相关责任。 学位论文作者签名： 吼叫年 棚彳 6 月7 千日 绪论 绪论 海洋独特的环境造成了海洋微生物的多样性和特殊性。美国海洋生物实验室米切尔 t 索根研究表明，海洋微生物种类多达10 0 0 万种以上【。日本近年来对海洋微生物进行的 广泛研究，发现约有2 7 的海洋微生物具有抗菌活性。海洋微生物资源的研究开发和应 用越来越受到世界各国特别是沿海国家的重视。我国是海洋大国，近年国内海洋微生物 代谢产物研究取得了长足进步。国内发现并发表新颖结构和新活性化合物的研究报道也 明显增多。然而，目前，国内海洋微生物代谢产物研究仍存在一些值得注意的问题，如 所采用的活性评价指标非常有限，绝大多数产物的活性评价均集中于抗肿瘤上，又如海 洋样品采集区域不够广泛，远海乃至深海微生物产物尚未涉足等。又如目前对于海洋微 生物生物活性物质的研究主要基于海洋好氧微生物这一大类群，而对于海洋微生物的另 一大类群海洋厌氧微生物的报道非常少。 海洋厌氧微生物作为海洋微生物的一大类群，具有种类繁多、形态各异的特点，并 且具有好氧微生物所不具备的生理代谢途径，因此其作为海洋活性物质研究来源的潜力 巨大。 海洋硫酸盐还原细菌作为海洋微生物的一大特殊类群，其物种蕴藏量巨大，而且代 谢途径独特。海洋硫酸盐还原细菌物种的多样性以及参与新陈代谢的酶系与海洋好氧微 生物有较多的不同，因此，其产生的次生代谢产物理论上也会有较大的差异。而且，海 洋硫酸盐还原细菌和大多数常规研究的海洋好氧微生物一样，在生态环境中为了个体和 种群生存，会分泌特殊的次生代谢产物作为拮抗剂来抑制和杀灭其他微生物，这就成为 从中寻找抗菌活性化合物的理论基础。 海洋光合细菌是一大类可进行光合作用的原核生物。菌体无毒，营养非常丰富，含 6 0 以上的蛋白质，并富含多种维生素，是一类营养价值高且成分较全的细菌。但目前 对这类微生物药用方面的研究不多。 本实验室从中国近海分离筛选多株具有抗菌抗肿瘤活性的海洋光合细菌和海洋硫 酸盐还原细菌，其中菌株s r b - 2 2 及p s b - 11 的发酵产物具有很强的抑白色念珠菌和枯草芽 孢杆菌活性。本文通过大孔吸附树脂对s r b - 2 2 和p s b 1 1 的发酵产物进行提取，并以抑菌 活性为指标，利用薄层色谱法、柱层析法及高效液相色谱法等分离方法进行活性追踪分 离，并对分离到的活性化合物进行结构鉴定。旨在寻找具有抗菌活性的药物先导化合物， 这将为开发拥有自主产权的海洋微生物抗菌活性先导化合物提供理论和实践帮助。 大连交通人学t 学硕十学位论文 第一章海洋抗菌活性物质的研究进展 1 1 海洋抗菌活性物质的主要来源 海洋抗菌活性物质主要来源于海洋放线菌、海洋细菌、海洋真菌及海洋微藻等。 1 1 1 海洋放线菌 陆地放线菌产生的抗生素占已发现的天然来源抗生素的2 3 以上，其中包括许多在 医药上有重要作用的抗生素。在海洋生态系统中，放线菌虽然不是主要的微生物区系1 2 3 1 。但近来研究表明海洋放线菌及其代谢产物却是寻找新抗生素的重要来源卜。 w o o 等【8 】在海洋链霉菌a p 7 7 的培养液中分离到一种1 6 0 k d 的蛋白质( s a p ) ，其显 示出强烈的抗真菌活性。l a a t s h 研究纠9 l 从太平洋p o h o i k i 湾红树林沉积样中分离到 海洋链霉菌属( b 7 0 4 6 ) ，抗菌活性跟踪筛选得到一类大环内酯类化合物( c h a l c o m y c i na 和c h a l c o m y c i nb ) 。c h a l c o m y c i nb 为新化合物，对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌等的m i c 的质量浓度与红霉素相当，尤其对金黄色葡萄球菌的m i c ，其质量浓度达到o 3 9 t g m l ， 显示出高效抗菌活性。c a p o n 等【1 0 】从维多利亚l o m e 海岸采集到的海洋放线菌 ( m s t - m a l 9 0 ) 培养液中分离到两个芳香氨基酸类化合物( l o m e a m i d e sa 和b ) ，活性研 究结果显示，l o m e a m i d e sa 对枯草杆菌的l d 9 9 的质量浓度为5 0 x g m l ，具有中等抗 生素活性。c h a r a n 等1 1 1 】从放线菌m i c r o m o n o s p o r as p 中获得一种新型的生物碱化合 物 d i a z e p i n o m i c i n ( 1 ) ，研究表明，该物质具有抗菌活性。另外，日本m a s k e y 等1 1 2 j 从海洋放线菌a c t i n o m a d u r as p 培养液中获得新型的抗肿瘤抗生素 c h a n d r a n a n i m y c i n a ( 3 e ) 、b ( 3 d ) 和c ( 4 ) 】。s u j a t h a 等1 1 3 1 分离到一株新的海洋链霉落 ( b t - 4 0 8 ) ，该链霉菌能 产生抗生素类聚酮化合物s b r 2 2 ，s b r 2 2 能有效作用于对甲氧青霉素产生耐药性的金 黄葡萄球菌。福建海洋研究所的方金瑞教授等首次报道由海洋耐盐、嗜碱放线菌产生的 抗菌物质，它有强的耐盐能力，特别能在p h 值为1 0 的培养基里生长并产生抗菌物质。 所产生的抗菌物质包括两个部分：一部分是脂活性的抗革兰氏阳性菌的物质：另一部分 是水活性的广谱的抗生素。后者经分离、纯化和鉴定，是一种新型的氨基糖苷类抗生素， 称为丁酰苷菌素。它对许多细菌具有强的抑制作用。过去报道，丁酰苷菌素是由环状芽 孢杆菌产生的，而由海洋微生物产生还是首次报道。这对氨基糖苷类抗生素的化学改造 开辟了新的途径。成为我国首次发现的海洋新抗菌药。黄维真等1 1 4 j 自福建沿海海泥分 离到1 0 0 0 多株海洋放线菌，经初步鉴定，以小单孢菌属居绝对优势，至少占所分离菌 株总数的7 0 ，且相当一部分还高达9 5 ，其次是链霉菌属，其中一株代表性菌株鲁 特格斯链霉菌，鼓浪屿亚种( s r u t g e r s e n s e s u h s p g u l a n g y u n e n s i s ) 能产生一种新的抗生 2 第一章海洋抗菌活性物质的研究进展 素，还产生2 个次要组分，鉴定为肌醇胺霉素和春同霉素。另一有代表性的易于生长在 碱性培养基里的海洋放线菌2 b ，产生一种典型的氨基苷类抗生素，过氢谱、碳谱和快 原子轰击质谱等的研究鉴别为j 酰苷菌素a 。王书锦等【1 5 l 从中国黄、渤海，辽宁近海 1 2 个地区1 2 8 个定位点的海水及海泥中分离到1 1 1 1 8 株放线菌，通过初步鉴定以链霉 菌属为主，占总数的9 5 ，多株具有抗菌活性，其中m b 9 7 、m b 9 8 、m b j 5 等对病原 真菌、病原细菌、病原弧菌等有很强的抑制与杀灭作用。周美英等【1 6 j 在开展厦门海域 海洋放线菌的分布及其产生的活性物质研究中分离到一株能产生专一性较强的抗真菌 抗生素s 2 1 6 。 1 1 2 海洋细菌 海洋细菌是海洋微生物中分布最广、数量最大的一类生物。在抗细菌、真菌活性物 质的研究方面，i s n a n s e t y o 等 1 7 - 1 9 l 研究报道了来自海洋藻类表面假单胞菌 p s e u d o o n a ss p a m s n 产生的化合物【2 ，4 d i a c e t y p h l o r o l u c i n o l ( d a p g ) ，该物质具有抑制 v r s a ( v a n e o m y e i n r e s i s t a n ts t a p h ) l o c o c c u sa u r e u s ) 和m r s a ( m e t h i e i l l i n r e s i s t a n t s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 的活性。a d a c h i 等【2 0 】从微藻s c h i z y m e n i a 分离到的海洋枯草杆 菌的培养液中提取纯化得到m a c r o l a c t i n sg m 。这些化合物在对金黄色葡萄球菌和枯草 杆菌抑制的m i c 质量浓度的平均值为l o t g m l 。a n d e r s e n 等研究组【2 l j 从巴步亚纽新 几内亚海岸海水培养出的细菌b a c i l l u sl a t e r o s p o r u sp n g2 7 6 中提取得到的代谢物 ( b a s i l i s k a m i d ea 和鳓在抗菌实验中对白色念珠菌的m i c 的质量浓度分别为2 5 t g m l 和5 0 9 9 m l ，抗真菌活性强。刘全永等【2 2 l 从辽宁渤海水域分离得到广谱抗真菌活性物 质的海洋细菌( l u b0 2 ) ，对人体病原真菌c a n d i d aa l b i c a n s 有较强的抑菌作用。最近， c h e l o s s i 等【2 3 j 报道了分离自海绵p f i c i f o r m i s 体表的细菌，经1 6 sr d n a 鉴定为 r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s 和p s e u d o m o n a s 属的细菌，它们能产生抑制s t a p h y l o c o c c u s a u r e u 和革兰氏阳性菌的活性物质。在抗病毒研究方面，美国国立癌症研究所( n c i ) b a r r i e n t o s 等1 2 4 j 最近发现一种海洋细菌蓝绿菌c y a n o b a c t e r i u m 的蛋白【c y a n o v i r i n n ( c v n ) 1 不但能抵抗人免疫缺陷病毒( h w 3 的感染，还能抵抗埃博拉病毒( e b o l av i r u s ) 的 感染。研究者在实验中发现这种蛋白能延长受埃博拉病毒感染的小鼠的寿命。田黎等从 东海大陆架、渤海、珠江口、黄岛等地采集菌株，从中筛选出若干株具有抗菌活性的芽 孢杆菌，研究了这些海洋芽孢杆菌的培养、提取条件与抗菌蛋白的关系及抗菌蛋白的性 质，发现海洋芽孢杆菌的生长适宜范围宽，生长繁殖快，抗逆力强，产生的抗菌活性物 质，抗菌谱广，性状稳定，具有很好的开发价值。来自陆地的芽孢杆菌产生的多肽类， 大多对病原细菌具有抑菌作用，仅少数抗真菌，而该实验发现的芽孢杆菌对病原真菌具 3 大连交通大学t 学硕十学位论文 有很强的抑制作用，这些抗菌活性物质的纯化和结构测试工作尚在进行之中。何培青等 也从海泥中发现了海洋芽孢菌，其胞外代谢产物多肽类具有很强的抑菌活性。马悦欣从 1 0 种不同海藻中分离的1 2 2 株细菌进行的抑菌试验表明，6 0 7 的菌株有抗菌活性，且 对海洋细菌和陆生细菌均有作用，但2 0 0 2 年分离的菌株对指示菌枯草杆菌没有抑制作 用，而2 0 0 3 年分离的菌株有6 株对枯草杆菌有抑制作用，且5 株分离自石莼，该5 株 菌对海洋革兰氏阴性菌的抑制作用较差。郑忠辉等从厦门海区潮间带的石莼和浒苔中各 分离的8 株拮抗菌中分别有2 株对枯草杆菌有抑制作用。可见不同藻类、同一藻类不同 海域环境、不同年份分离的海洋细菌有不同的抗菌机制。不同海域生物样品中拮抗菌的 分离比例也不同。骆祝华等从厦门海域生物样中分离到3 0 株细菌，拮抗菌株占3 0 ； 从红树林区生物样中分离的菌株拮抗比例高达6 9 2 。张军东等的试验也证明了这一 点，2 0 0 2 年角叉菜上拮抗菌的分离比例最高为8 7 5 ，其次是石莼和浒苔，均为5 0 ， 而鼠尾藻的拮抗菌分离率仅为2 5 ；2 0 0 3 年石莼的分离比例最高达1 0 0 ，其次是海 膜，分离比例为8 0 ，分离比例最低的为角叉菜和单条胶粘藻，也达到了6 0 ，说明 了有抗菌活性菌株的分离比例与分离时间有关。黄耀坚等从厦门海域的石莼和浒苔分离 拮抗菌的比例是1 7 4 和1 5 4 ，而马悦欣等从大连海域两种藻类分离拮抗菌的比例与 之相比要高得多，原因之一是试验菌株的培养时间不同，也反映了海洋细菌的多样性、 不同海藻个体的特异性和不同海域环境的差异，说明海藻附生拮抗细菌的存在和数量取 决于宿主及其体表的微环境条件。 1 1 3 海洋真菌 相对于海洋细菌天然产物研究的巨大成就，海洋真菌活性成分的研究自上世8 0 年 代中期才开始有零星的报道。第一个被报道的海洋真菌抗生素为l e p t o s p h a e f i n r s p j 。随 着近年来海洋开发技术的不断发展，越来越多的海洋真菌将成为抗生素的新来源。 d a f e r n e r 等f 2 6 】通过分离其培养的海洋真菌a s c o m m y c e t ez o p f i e l l al a t i p e s ，得到两个 吡咯烷酮类化合物( z o p f i e l l a m i d e sa 和b ) 。其中化合物a 对革兰氏阳性细菌的m i c 的 质量浓度为2 1 0 t g m l ，化合物b 的活性相对较弱。林听等1 2 7 l 对海洋木栖真菌的抗菌活 性进行了初步研究，结果显示，1 7 6 株海洋木栖真菌中有9 6 株对大肠杆菌、枯草杆菌 及白色假丝酵母中的一种或多种拮抗指示菌具有抑制作用；具有抗大肠杆菌活性的菌株 占全部菌株数的1 6 4 ，且有望在后续工作中分离得到具有一定抗大肠杆菌活性的生物 活性物质。海洋青霉菌属产生的抗生素较少。e d r a d a 等【冽报道了从海绵 x e s t o s p o n g i a e x i g u a 体内的p e n i c i u i u mc f m o n t a n e n s e 发酵液中分离提取到十元大环内酯 结构的活性物质( x e s t o d e e a l a t o n ea c 1 ，其中化合物b 对白色念珠菌c a n d i d aa l b i c a n s 具有抑制作用。不同的海洋真菌抗菌范围不同。李淑彬等对从1 0 种不同海藻上分离的 4 第一章海洋抗菌活性物质的研究进展 9 9 株真菌进行了抑菌试验，结果表明，3 1 3 的菌株有抗菌活性，其中9 株对海洋细菌 和陆生细菌均有作用，尤其是指示菌费氏弧菌对2 1 株拮抗真菌敏感，2 5 8 的菌株对 大肠杆菌有拮抗活性。拮抗真菌的初步鉴定结果表明，有拮抗活性的菌株以青霉属为主， 占总拮抗菌的7 1 。王书锦等从辽宁近海的8 个位点( 包括大连) 的海泥和海水样品中分 离得到3 0 株真菌，初步鉴定认为青霉属菌株居多数，占海洋真菌总数的7 0 。 1 1 4 海洋微藻 海洋微藻是真核原生生物，属微生物范畴。从海洋微藻中也可分离到具有抗细菌、 抗病毒、抗真菌的活性物质。p r a t t 等是最早从微藻中分离抗生素的研究者，他们从小 球藻c h l o r e l l a 中分离到小球藻素( c h l o r e l l i n ) 脂肪酸混合物，此混合物具抗细菌和自身 毒性的功能。h a n s e n 研究发现马汉母赭胞藻o c h r o m o n a sm a l h a m e n s i s 中存在一种结构 尚未鉴定清楚的叶绿素酯( c h l o r o p h y l l i d e s ) 抗生物质。p e s a n d o 研究表明同本星杆藻 a s t e r i o n e l l a j a p o n i c a 中产生的 - - 十碳五烯酸( c i s e i c o s a p e n t a e n o i ca c i d ) 的光氧化产物具 极强的抗生活性。l s h i b a s h i 等从伪枝藻s c y t o n e m a p s e u d o h o f m a n n i 中分离出s c y t o p h y t i n - a 是强烈的细胞毒素和杀菌剂，对k b 癌细胞最低抑制浓度为l n g m l ，在浓度为1 0m l 时， 具有广谱的抗真菌作用。b e r i a n d 等认为固着列金藻s t i c h o c h r y s i si m m o b i l i s 具有抗生活 性的物质可能是一种多肽。丙烯酸( a c r y l i ca c i d ) 是人们第一次从一种褐囊藻h a e o c y s t i s p o u c h e t i i 中分离得到并确认对革兰氏阳性细菌、酵母菌、曲霉菌等很有效的抗菌物质， 它在细胞内通常部分以游离状态存在，部分以无活性的巯基乙酸二甲内盐形式存在。后 来这两种化合物在许多微藻中都有发现。灰色念珠藻n o s t o cm u s c o r u m 中含有的酚类化 合物能够抑制多种人类致病菌的生长。对海洋蓝藻次级代谢物生理活性的研究报道最早 见于1 9 6 2 年s t a r t 等发表的文章，研究者从夏威夷的蓝藻l v n g b y am a j u s c u l a 藻体的甲 醇提取物中发现有抗生素活性，对m i c r o c u c c u sp y o g e n e sv a r a u r e e u s ，m y c o b a c t e r i u m s m e g m a t i s 等有拈抗作用，但对e s c h e e r i c h i ac o l i 和p 4 e r u g i n o s a 则无作用，当时未能分 离到活性成分。m o o r e 等从陆生的蓝藻泉生软管藻h a p a l o s i p h o n f o n t i n a l i s 的提取物中分 出一种含氯和异腈基团的吲哚生物碱，软吲哚a ，这种吲哚生物碱具有抑制藻类生长和 抗真菌的活性。后来m o o r e 又从这种藻中分离出1 8 种含量极少的软吲哚，它们皆具有 抗细菌和真菌的活性。g e r w i c kwh 等从北波多黎各沿岸的浅水域中采集的热带海洋蓝 藻h o r m o t h a m n i o ne n t e r o m o r p h o i d e s 中分离到一系列亲脂性的环肽，其中极性最小的一 个环肽h o r m o t h a m n i na 具有细胞毒性和抗微生物活性，其藻体的脂提物有明显的抗革 兰氏阳性菌的活性，用硅胶柱层析和r p h p l c 可以容易地将其分离。e n t z e r o t h 等从海 水蓝藻河口鞘藻l y n g b y aa e s t u a r i i 中分出一种脂肪酸，2 ，5 二甲基十二酸，它同样能 5 大连交通大学下学硕十学位论文 抑制别的藻类及水生高等植物的生长。这种藻的浅水变种l y n g b y am a j u s c u l a 中含有一 种7 氧甲基十四碳4 烯酸，它能抑制革兰氏阴性细菌的生长。m o o r e 等在o a h u 的 k a h a l a 海滩的蓝藻l m a j f u s c u l ag o m o n t 藻体的二氯甲烷提取物中得到的内酯 m a l y n g o l i d e 则具有明显的抗菌活性，尤其对s m e g m a t i s 和s t e r p t o c o c c u sp y o g e n e s 有较 强拮抗活性，对s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 和b a c i l l u ss u b t i l i s 的活性稍弱，而对e n t e r o b a c t e r a e r o g e n e s ，ec o l i ，p a e r u g i n o s a ，s a l m o n e l l ae n t e r i t i d s 无活性。从培养的甲藻 g t o x i c u s h a i 中分离出的几个多环醚化合物g a m b i e r i ca c i da 、b 、c 和d 以及g a m b i e r o l 显示出抗真菌活性。甲藻产生的多醚化合物和大环内酯化合物与链霉菌属产生的大环内 酯抗生素很相似。前一类化合物以冈田酸( o k a d a i ca c i d ) 为代表，它是一种强力的蛋白磷 酸酶抑制剂。后一类化合物包括一系列细胞毒素化合物，如由a m p h i d i n i u ms p 产生的 a m p h i d i n o l i d e sa v ，来自p r o r o c e n t r i u m l i m e p r o r o c e n t r o l i d e 以及发现于g o n i o d o m as p 的g o n i o d o m i na 。g o n i o d o m i na 除了具有强力的抗真菌活性外，该2 5 元环的大环内酯 能刺激放线菌a t p a s e 的活性。另外，由一些硅藻表现出来的抗生素活性过去主要归结 为相当普通的游离脂肪酸衍生物，但是最近在普通的硅藻a s t e r i o n e l l as p 中发现了一组 具有偶氮酸酯结构的化合物a s t e r l i o n e l l i na ，b 和c ，这种未曾见过的具有环烯偶氮酸 酯基的结构需要进一步研究加以证实。偶氮酸酯基是发现于若干种抗生素如e l a i o m y c i n 油霉素中氧化偶氮基的同分异构体，它们可能有相似的生物合成来源。近来的研究表明， 海洋硅藻c h a e t o c e r o sl a u d e r i ，c b r e v i s ，c s o c i a l i s ，c d i a d e m a ，c p r o t u b e r a n s ， c p s c e u d o c u r v i s e t u s ，c s i m p l e x ，死f ，口s e 砌西s u e c i c a ， s k e l e t o n e m ac o s t a t u m 等具有抑制 弧菌的作用，特别是s k e l e t o n e m ac o s t a m m 具有极广的抗菌谱。r i c h a r d 等对蛋白核小球 藻的研究中发现，无论是其脂溶性化合物的粗提物，还是其各洗脱组分。对2 种革兰氏 阴性菌一大肠杆菌和普通变形杆菌均没有抑制活性。说明蛋白核小球藻的脂溶性化合物 对革兰氏阳性菌的抑制活性大于对革兰氏阴性菌的抑制活性。有关藻类提取物对细菌和 真菌抑制活性的比较，通常是对细菌的抑制活性大于对真菌的抑制活性。该实验对蛋白 核小球藻的研究中，其脂溶性化合物的粗提物对真菌的抑制活性明显大于对细菌的抑制 活性。因此，不同的藻类对细菌和真菌的抑制活性有明显的差异。 综上所述，海洋微生物是一种丰富的抗生素资源，具有产生多种新颖抗生素物质的 巨大潜力，同时由于海洋环境的低营养，一些海洋微生物的人工培养比陆地微生物的人 工培养更容易，且成本也较低，因而具有很大的开发潜力。 6 第一章海洋抗菌活性物质的研究进展 1 2 海洋抗菌活性物质的现代分离方法 1 2 1 色谱方法 1 9 0 3 年俄国植物学家t s w e t t ，在一填有碳酸钙的玻璃柱中注入用石油醚萃取的植 物色素。在室温下展层。得到不同的色素区带，后来称之为色谱1 2 9 1 。色谱分离又称层 析。最初，层析技术并未得到关注。2 0 世纪5 0 年代。气液层析得到发展，并在石油、 化工、制药等领域得到应用。到6 0 年代，由于开发出适用于生物物质分离纯化的层析 固定相。层析技术才被用于生物物质的分离纯化并得到迅速发展1 3 。至今，已有丰富 的色谱技术被用于生物活性物质的分离。 液相色谱法是分析化学中发展最快，应用最广的分析方法，它在许多领域成为必不 可少的手段，其中高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 更是以 其独特的优点占据突出地位。h p l c 用于生物化学样品分析始于2 0 世纪7 0 年代中期， 8 0 年代针对生命科学领域分离和制备而设计的生物色谱填料为h p l c 在生命科学研究 领域的地位奠定了坚实的基础；9 0 年代，随着生物医药研究与开发的迅速发展，各种 类型的高通量及手性色谱柱纷纷出现【3 l l 。h p l c 是目前最通用、最有力和最多能的层析 形式。在生物大分子的分离分析中，h p l c 分离模式主要有反相色谱( r e v e r s e d p h a s e ， c h r o m a t o g r a p h y ，r p c ) ，空间排阻色谱( s i e f i ce x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y ，s e c ) ，离子交 换色谱( i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ，i e c ) ，疏水作用色谱( h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y ，h i q ，亲和色谱( a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ，a c ) 等。反相液相色谱柱效 高、分离能力强、重复性好、操作简便、保留机理清楚，是液相色谱分离模式中使用最 为广泛的一种。它与多数其它形式的层析不同之处在于固定相基本上是惰性的。固定相 与被分离物之间只可能有疏水作用。它吸引人的地方在于流动相的小小变化，例如加入 盐，改变p h 或有机溶剂的量就能成功地影响分离特性【3 2 】。它在2 0 世纪5 0 年代就已用 于许多有机小分子的分离和分析，8 0 年代后逐步应用于生物大分子如蛋白质、多肽、 核酸的鉴定，并用于制备规模的分离。半个世纪前，随着交联聚苯乙烯的出现和发展。 离子交换色谱成为一种重要的分离工具。离子交换色谱的填料及含盐的缓冲流动相系统 类似于蛋白质稳定存在的生理条件，有利于保持生物分子的活性和构象。因此，它在解 决生物学中许多难于分离的问题上起到了重大作用。随着h p l c 的飞速发展，以及各种 新型离子交换材料的出现，离子交换色谱在氨基酸、蛋白质、核酸、有机酸、糖类及药 物等方面的应用越来越广1 3 3 l 。空间排阻色谱所用的固定相是具有一定孔径范围的多孔性 物质凝胶，是按溶质分子大小进行分离的色谱技术。又称尺寸排阻色谱或凝胶色谱。按 流动相类型不同分为凝胶渗透色谱和凝胶过滤色谱。十多年来该法在凝胶制备，仪器技 7 大连交通人学t 学硕十学位论文 术性能，数据处理和理论研究上取的进展，促进了该技术在许多领域的应用。亲和层析 是6 0 年代发展起来的一种高效、快速的分离纯化技术【川。它是一种利用生物大分子能 够通过范德华力、疏水力、空间和静电相互作用，与配体特异、可逆地结合在一起的生 物学特性，从复杂的生物样品中分离得到目标产物的液相色谱技术p 5 。亲和层析容量大， 选择性强，分离效率高，且对目标产物的生物活性起到一定的保护作用。最先被 用于酶的纯化，现在已广泛地用于核营酸、核酸、免疫球蛋白、膜受体、细胞器甚至完 整细胞的纯化1 3 6 】。科学的发展使得分离分析的对象越来越复杂从而提高了对分离分析技 术的要求。促进了各种新技术的发展。二维液相分离方法，二维液相分离质谱分析方 法等多种自动化二维系统均得到了开发利用。如l u n d e l l 和m a r k i d e s t 采用离子交换和反 相色谱二维液相模式分离了复杂生物样品中的肽；b u s h e y 和j o r g e n s o n t l 3 7 j 设计了用阳 离子交换和体积排除分离模式的自动化二维系统等。h p l c 与光谱或波谱技术的在线联 用也成为了解决复杂样品体系的有力手段【3 8 】。目前最常用最有效的是高效液相色谱质 谱( m a s ss p e c t r o s c o p y ，m s ) 联用技术，高效液相色谱核磁共振( n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e s p e c ，等也在研究开发中。与此同时，快速分离技术也得到了迅猛发展。 在2 o t r o 世s c 纪o p y 7 0 和n m 8 0 r ) 年代需要1 h 分离的样品现在可能只要几分钟甚至几秒钟即可完成， 有关快速h p l c 及其应用也多有报道。如u n g e r 等【3 9 】最早采用缓冲溶液盐浓度梯度，以 4 m i _ m i n 流速在2 5 m i n 内分离了8 种蛋白质。近年来，随着生物技术和医药工业的发 展，传统的分离手段已经不能满足对大量样品高纯度分离的要求。液相制备色谱的发展 研究为解决实际应用中出现的问题带来希望。2 0 世纪7 0 年代初开发的模拟移动床色谱 具备分离能力强，设备体积小，投资成本低，便于实现自动控制并特别有利于分离热敏 性及难以分离的物系等优点。在制备色谱技术中最适合用于进行连续性大规模工业化生 产，其应用范围也不断扩大，已出现采用该技术分离氨基酸、单克隆抗体和蛋白质的研 究【加1 。 超临界流体色谱( s u p e r c r i t i c a lf l u i dc h r o m a t o g r a p h y ，s f c ) 是以超临界流体 ( s u p e r c f i t i c a lf l u i d ，s f ) 作为流动相的一种新颖的色谱技术。具有分析速度快、选择性好、 分离效率高、分析条件温和等优点，可分析气相色谱不宜分析的高沸点、高分子量、低 挥发性和热不稳定试样，又比高效液相色谱有更快的分析速度和更高的柱效1 4 。自6 0 年代起逐渐出现一些有关该技术的研究报道。超临界流体色谱应用领域十分广泛。可用 于分离分析热敏性物质、非挥发性高分子、生物大分子、极性物质和手性对映体等。目 前，s f c 与m s 、f t - i r ( f o u r i e rt r a n s f o i t i ii n f r a r e ds p e c t r o m e t e r ，傅里叶变换红外光谱仪) 、 n m r 等联用技术也逐渐得到开发。 8 第一章海洋抗菌活性物质的研究进展 1 2 2 电泳技术及其它 电泳现象于1 8 0 8 年被发现，在1 9 3 7 年由瑞典科学家t i s e l i u sa 首次将其作为一种 分离技术所应用【4 引。随着电泳支持物的改进，电泳条件的完善，区带电泳、等电聚焦 电泳、双向电泳等技术逐渐建立起来。同时，在电泳模式上也有了极大的发展。先后出 现了圆盘电泳、垂直板电泳、脉冲电泳等，电泳分辨率也随之得到提高。 1 9 5 6 年s m i t h i e s 和p o u l i k 最早引入双向电泳技术。他们将纸电泳和淀粉凝胶电泳 结合起来分离血清蛋白，随后双向电泳技术得到很快的发展。目前所应用的双向电泳体 系由0 f a r r e l l 等于1 9 7 5 年发明。第一向为等电聚焦电泳，第二向为变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳。这是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术。