（食品科学专业论文）雪莲果叶中酚酸的分离鉴定及其生物活性研究.pdf

雪莲果叶中酚酸的分离鉴定及其生物活性研究 雪莲果叶中酚酸的分离鉴定及其生物活性研究 捅要 本文以云南丰富的雪莲果叶为材料，对雪莲果叶的化学成分，雪莲果叶中酚酸 的提取进行了研究，采用大孔树脂柱层析法对雪莲果叶粗提物进行了分离纯化，确 定了雪莲果叶中酚酸的最佳提取和分离纯化的条件，对雪莲果叶酚酸中绿原酸进行 了分离鉴定，研究了雪莲果叶酚酸抗氧化活性和抑菌能力，主要研究结果如下： 1 雪莲果叶的化学成分及矿物元素组成研究 雪莲果叶中含2 4 8 9 的总糖，1 8 7 5 的粗纤维，1 6 3 5 的蛋白质，1 1 3 7 的 水分，5 1 0 的脂肪和9 1 4 的灰分，此外还含有p 、c a 、m n 、m g 、f e 等多种矿 物质元素。 2 雪莲果叶中酚酸的提取工艺研究 采用乙醇回流法研究了雪莲果叶中酚酸的提取工艺，通过溶剂对比实验和单因 素实验确定了从雪莲果叶中提取酚酸的最佳提取溶剂及影响提取率的主要因素，并 通过正交实验优化了提取条件，得到了从雪莲果叶中提取酚酸的最佳工艺条件：用 乙醇3 0 提取，料液比为1 ：4 0 ，在9 5 预处理1 5m i n ，提取温度为7 0 ，浸提 1h ，提取2 次，在此条件下酚酸提取量为3 2 9 2m g g 。 3 雪莲果叶中酚酸的分离纯化研究 筛选出x - 5 型大孔吸附树脂用于分离纯化雪莲果叶酚酸，最佳分离条件为：进 样液酚酸含量低于1 3 8 4m g m l ，p h 为3 ，流速为1 0m l m i n 下进行吸附，用5 0 乙醇以1 0m l m i n 的流速进行洗脱，得到纯度为4 6 8 的雪莲果叶酚酸，用乙酸乙 酯进一步纯化可提高纯度至8 2 5 3 。 4 雪莲果叶中酚酸中绿原酸的鉴定研究 利用薄层色谱( t l c ) 和高效液相色谱( h p l c ) 技术分离出雪莲果叶中含有绿原酸。 t l c 以硅胶g 为固定相，以乙酸乙酯水甲酸甲苯( 8 5 ：1 0 ：1 0 ：4 ，v ：v ：v ) 为流动 相，绿原酸为对照品，用2 f e c l 3 1 k 3 f e ( c n ) 6 为显色剂，分离鉴定出雪莲果叶中 酚酸含有绿原酸成分。利用h p l c 对雪莲果叶酚酸进行了分析，建立了h p l c 测定 雪莲果叶中绿原酸的方法。色谱条件为：色谱柱为h y p e r s i lo d s 2c 1 8 柱( 4 6m m x 3 0 0 i n l i l ，5l am ) ，流动相为乙腈一0 5 磷酸水溶液( 8 ：9 2 ，v ：v ) ，检测波长为3 2 5n l n ， 流速为1 0m l m i n ，柱温为2 5 。雪莲果叶中的绿原酸含量为0 4 9 4m g g 。 华中农业大学2 0 0 9 届硕十学位论文 5 雪莲果叶酚酸的生物活性探讨 雪莲果叶酚酸提取物对o h 、0 。一和d p p h 自由基有一定的清除作用，清除自由 基的效果与样品浓度存在一定的量效关系。雪莲果叶酚酸对革兰氏阳性细菌和革兰 氏阴性细菌均有良好抑制生长作用，对于供试的三种菌中，雪莲果叶酚酸对金黄色 葡萄球菌抑制作用最强。 关键词：雪莲果叶；酚酸；分离；纯化；生物活性 i l 雪莲果叶中酚酸的分离攀定及其生物活性研究 s t u d yo ni s o l a t i o n ，c o m p o s i t i o ni d e n t i f i c a t i o na n db i o l o g i c a l a c t i v i t yo fp h e n o l i ca c i df r o m s m a l l a n t h u s s o n c h i f o l i u sl e a v e s a bs t r a c t i n t h i sp a p e rs m a l l a n t h u s s o n c h i f o l i u sl e a v e sw a su s e dt oi n v e s t i g a t e dt h ec h e m i c a l c o n s t i t u e n t s ，e x t r a c t i o no fp h e n o l i ca c i da n db i o l o g i c a la c t i v i t y , i n c l u d i n gt h es e p a r a t i o na n d p u r i f i c a t i o nw i t hm a c r o p o r o u sr e s i n s ，i d e n t i f i c a t i o nc h l o r o g e n i ca c i di nt h ep h e n o l i ca c i d ，a n d s t u d yo na n t i m i c r o b i a la c t i o na n da n t i o x i d a n ta c t i o no fp h e n o l i ca c i df r o ms m a l l a n t h u s s o n c h i f o l i u sl e a v e s t h em a i nf i n d i n g sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h ec h e m i c a lc o n s t i t u e n t sa n dm i n e r a le l e m e n t so fs m a l l a n t h u s s o n c h i f o l i u sl e a v e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts m a l l a n t h u ss o n c h i f o l i u sl e a v e sc o n t a i n s2 4 8 9 t o t a ls u g a r , 1 8 7 5 c r u d ef i b e r , 1 6 。3 5 p r o t e i n ，1 1 3 7 w a t e r , 5 1 0 f a t ，9 1 4 a s h ，i ti n c l u d i n g m a n ys p e c i e s em i n e r a le l e m e n t s ，s u c ha sp ，c a ，m n ，m g ，f ea n ds oo n 。 2 t h ee x t r a c t i o np r o c e s so fp h e n o h ca c i di ns m a l l a n t h u ss o n c h i f o l i u sl e a v e s f r o mt h ee x p e r i m e n t so fs o l v e n te x t r a c t i o nc o m p a r i s o na n ds i n g l ef a c t o re x t r a c t i o nt e s t s ， t h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n s f o re x t r a c t i o no fp h e n o l i ca c i df r o ms m a l l a n t h u s s o n c h i f o l i u sl e a v e sw e r eo b t a i n e d ，b yt h eo r t h o g o n a lt e s t st h eo p t i m u me x t r a c t i n gc o n d i t i o n s w e r ec o n f i r m e da sf o l l o w s ，3 0 e t h a n o l ，l i q u i dm a t e r i a lr a t i o1 ：4 0 ，p r e t r e a t m e n ta t9 5 ， e x t r a c t i n gt e m p e r a t u r e7 0 ，e x t r a c t i o nf o r1h o u r s ，e x t r a c t i o n2t i m e s ，u n d e rt h i sc o n d i t i o n t h ee x t r a c t i n gc o n t e n to fp h e n o l i ca c i dw a s3 2 9 2m e d g 3 i s o l a t i o na n dp u r i f i c a f i o no fp h e n o h ca c i di ns m a l l a n t h u s s o n c h i f o l i u sl e a v e s t h em a c r o p o r o u sr e s i n sf o rp u r i f i c a t i o np h e n o l i ca c i do fs m a l l a n t h u ss o n c h i f o l i u s l e a v e sw e r es e l e c t e d ，t h eb e s ts u i t a b l er e s i n si sx 一5 t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rs e p a r a t i n g a n dp u r i f y i n gp h e n o l i ca c i do fs m a l l a n t h u s s o n c h i f o l i u sl e a v e sw e r eo b t a i n e d t h er e s u l t s s h o w e dt h a t ，w h e nt h ec o n t e n to f p h e n o l i ca c i do f i n i t i a ls a m p l ei sl o w e r1 3 8 4 m g m l ，p h3 ， w i t h5 0 e t h a n o la se l u t i n gs o l v e n t ，w h i l et h em o v i n gs p e e do fi s 1 0m l m i na n dt h e e l u t i n gs p e e d1 0m l m i n t h ep u r i t yo fp h e n o l i ca c i do f s m a l l a n t h u ss o n c h i f o l i u sl e a v e si s 4 6 8 t h ep u r i t yo fi tc a l lb eu pt o8 2 5 3 w i t he t h y la c e t a t ee x t r a c t i o n 4 i d e n t i f i c a t i o ne h l o r o g e n i ca c i do fp h e n o f i ca c i di ns m a l l a n t h u ss o n c h i f o l i u sl e a v e s t h et h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h i c ( t l c ) m e t h o d o fp h e n o l i ca c i do fs m a l l a n t h u s s o n c h i f o l i u s l e a v e sw a s d e v e l o p e db y t h e u s eo fe t h y l a c e t a t e w a t e r - f o r m i c a c i d - t o l u e n e ( 8 5 ：10 ：10 ：4 ，i nv o l u m er a t i o ) a sm o b i l ep h a s e c h l o r o g e n i ca c i dw a sd e v e l o p e d i i i 华中农业人学2 0 0 9 届硕士学位论文 b ya s c e n d i n gt e c h n i q u eo nt h es i l i c ag e lgp l a t ew i t ht h i c k n e s so f0 5m n l ，v i s u a l i z e db y2 f e c l 3 1 k 3 f e ( c n ) 6w i t hb l u es p o t s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a sc h l o r o g e n i ca c i d i np h e n o l i ca c i do fs m a l l a n t h u s s o n c h i f o l i u sl e a v e s h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) w a si n t r o d u c e dt oa n a l y s i sp h e n o l i c a c i do fs m a l l a n t h u s s o n c h i f o l i u sl e a v e s t h ec h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n sw e r ea s f o l l o w ： h y p e r s i lo d s 2c 18c o l u m n ( 4 6m m x 3 0 01 t l n l ，5l am ) ，a c e t o n i t r i l e 一5 p h o s p h o r i c a c i d ( 8 ：9 2 ，i nv o l u m er a t i o ) a sm o b i l ep h a s e ，u vd e t e c t o r3 2 5r l n l ，f l o wr a t e1 0m l m i n ， c o l u m nt e m p e r a t u r e2 5 t h ec o n t e n to fc h l o r o g e n i ca c i di ns m a l l a n t h u ss o n c h i f o l i u s l e a v e sw a s0 4 9 4m g g 5 b i o l o g i c a la c t i v i t i e so fp h e n o l i ca c i di ns m a l l a n t h u ss o n c h i f o l i u sl e a v e s p h e n o l i ca c i do fs m a l l a n t h u s s o n c h i f o l i u sl e a v e sh a dt h es c a v e n g eo f o h 、0 2 一。a n d d p p hr a d i c a la c t i v i t y , b e t w e e ne f f e c to ft h es c a v e n g er a d i c aa n dc o n c e n t r a t i o no fs a m p l e s h o w e dc e r t a i nd o s e e f f e c tr e l a t i o n s h i p s p h e n o l i ca c i do fs m a l l a n t h u s s o n c h i f o l i u sl e a v e s s h o w e dg o o di n h i b i t i o ng r o w t ha b i l i t yt og r a m p o s i t i v eb a c t e r i aa n dg r a m - n e g a t i v eb a c t e r i u m ， i th a de f f e c t i v ea n t i m i c r o b i a la c t i o no ns t a p h y l o c o c c u sa u r e u st ot h et e s t e dt h r e eb a c t e r i a k e yw o r d s ：s m a l l a n t h u ss o n c h i f o l i u sl e a v e s ；p h e n o l i ca c i d ；s e p a r a t i o n ；p u r i f i c a t i o n ； b i o l o g i c a la c t i v i t i e s 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 卉 如需保密，解密时间年月日 是否保密l 7 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：倦气瘪时间：砂7 1 年6 月j 一日 揪黼鲐啪壅一、锄鲐助确 签名魄加d 1 年6 月j 毛 签名魄z d a j 年6 月f 6 。日 雪莲果叶中酚酸的分离鉴定及其生物活性研究 第一章文献综述 1 雪莲果研究概况 雪莲果( s m a l l a n t h u ss o n c h i f o l i u s ，英文名y a c o n ) 又称雪莲薯、亚龙果、亚贡， 为菊科向日葵属双子叶革本植物，原产于秘鲁南部和玻利维亚西部的安第斯高原( 李 卓亚，2 0 0 7 ) 。雪莲果植株地面上部植株高度l 14 m ，地面下部结有1 0 - - 2 0 个类似 甘薯的块根，果实为块根其主要食用部分是块根，形状如甘薯，被称为地下水果， 雪莲果具有耐强光，耐中低温，忌水怕早的特性，适宜在低纬度、高海拔、常年云 雾缭绕的温凉山区种植( 钱林等，2 0 0 6 ) 。 一凶 图1 - 1 雪莲果块茎图1 - 2 雪莲果植株 f i g l 一1 t h e t u b e ro f t h ef i g 1 2 t h e l e a f a n d f l o w e ro f t h e s m a u a n t h u ss o n c h i f o i l u ss m a l l a n t h u ss o n c h i f o f l u s 雪莲果块茎中含有丰富的低聚果糖，可预防肥胖、便秘及肠道疾病，降低血脂 和胆固醇，减少胆石症发生，具有提高人体免疫功能。降火清毒、防治面疱、暗疮 等功效。民间将雪莲果叶加工成茶冲泡饮，具有降低高血压、高血脂，治疗糖尿病 的功效。有实验证明2 浓度的雪莲果叶的浸出液对降低血糖值有明显的作用雪 莲果叶已成为国际上针对糖尿病人保健品及药品的珍贵原料( 金文闻等，2 0 0 6 ) 。 雪莲果味甜多汁，且热量极低，人们逐渐认识和了解到其是一种药用型水果， 在市场上备受大众青睐。雪莲果除了直接生吃，还可以煮食、烤食、油炸、腌制、 榨汁，利用雪莲果块撮进行加工的产品多种多样。目前雪莲果块根的开发应用主要 还是针对其中的低聚果糖，并在很多国家的糖尿病协会内部被推荐使用。随着对雪 莲果研究的深入，许多学者发现雪莲果是一种极具市场潜力的植物，不仅可以应用 于食品行业，在医药行业的也有着广阔的前景，在2 0 世纪8 0 年代中期，日本以 及一些欧洲国家逐渐引种雪莲果，并对雪莲果及其叶子均开展了深入，。泛的研究开 发。目前在我国只有海南、云南等6 个省区引种成功。云南由于有着得天独厚的地理 环境，已建立了多处大型雪莲果种植基地，雪莲果的种植和发展有良好的发展前景。 华中农业人学2 0 0 9 届硕士学位论文 1 1 雪莲果有效化学成分介绍 雪莲果块根中含有大量的水分，富含低聚果糖，并含有酚酸、类黄酮、萜类、 挥发油、氨基酸等活性成分以及钾、钙、锌、铁、镁等元素。雪莲果的叶中多糖、 蛋白质都很高，低聚果糖量则很低，活性成分包括酚酸、黄酮类、萜类等物质。 ( 1 ) 低聚果糖 雪莲果具有“低聚果糖之王”之称，其块茎主要由低聚果糖、蔗糖、果糖、葡 萄糖等糖类物质组成，其含量占雪莲果果实干基的9 0 以上，但不含淀粉。据研究， 雪莲果在收获后由于储存条件的不同，其功能性成分低聚果糖的含量会出现明显的 变化，低聚果糖会分解成蔗糖，甚至还原成葡萄糖和果糖( s g r a e f ee ta l ，2 0 0 4 ) 。 ( 2 ) 酚酸类 雪莲果叶中已分离测定除了含有绿原酸、咖啡酸、阿魏酸外，还含有具抗肿瘤、 抗菌、降血脂作用的原儿茶酸，具有降血糖活性的异绿原酸，包括4 ，5 二咖啡酰奎 尼酸( 异绿原酸a ) 、3 ，4 二咖啡酰奎尼酸和3 ，5 二咖啡酰奎尼酸( 异绿原酸c ) 。雪 莲果块根中也分离鉴定出5 种水溶性咖啡酸衍生物，分别为3 一绿原酸，3 ，5 二咖 啡酰奎尼酸，2 ，4 d i c a f f e o y l a l t r a r i ca c i d ，2 ，5 - d i c a f f e o y l a l t r a r i ca c i d 和2 ，4 ， 5 - t r i c a f f e o y l a l t r a r i ca c i d 及2 个辛酮酸以及阿魏酸。 c h c o o 籽 e t o 图1 - 3 咖啡酸的分子结构式 f i g 1 - 3t h es t r u c t u r a lf o r m u l ao f c a f f e i ca c i d c h c o o h o 疆， 图1 - 5 阿魏酸分子结构式 f i g 1 - 5t h e s t r u c t u r a lf o r m u l ao ff e r u l i ca c i d 2 图l - 4 绿原酸分子结构式 f i g 1 - 4t h es t r u c t u r a lf o r m u l ao f c h l o r o g e n i ca c i d 雪莲果叶中酚酸的分离鉴定及其生物活性研究 ( 3 ) 类黄酮 雪莲果根中含有槲皮素和另外2 种类黄酮，雪莲果叶子水解物含有类黄酮和槲 皮素，黄酮类占雪莲果叶重的0 0 0 9 。黄酮主要分布在叶和花中，目前发现亚贡叶 中降血糖功效的活性物质也与黄酮类物质有关，已经确认的有异槲皮苷。 ( 4 ) 萜类 2 0 世纪9 0 年代初，倍半萜和二萜脂类物质已从雪莲果叶的甲醇提取物中分离 鉴定出，其中主要是对映贝壳杉烯酸及其几种二萜脂类衍生物。 ( 5 ) 挥发油 a d a m 等从雪莲果干叶中提取出3 种挥发油，分别为1 3 - p i n e n e ，c a r y o p h y l e n e 和y c a d i n e n e 。 ( 6 ) 其他 雪莲果根提取物中还含有羟基苯丙酮衍生物，1 4 种氨基酸，6 种无机元素，雪 莲果的多糖含量和粗纤维含量明显较低，但蛋白质含量较高( 饶之坤等，2 0 0 7 ) 。雪 莲果叶中粗蛋白质、脂肪、纤维及总糖的含量均较高，矿物质元素中硒含量较高， 铜、锌的含量超过一般叶类蔬菜和水果( 马挺军等，2 0 0 4 ) 。 1 2 雪莲果叶的药理作用及研究进展 ( 1 ) 抗氧化和抗动脉硬化作用( v a l e n t o v ae ta l ，2 0 0 3 ) 雪莲果叶提取物中含有绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、原儿茶酸、槲皮素等成分， 具有抗氧化作用，其中以槲皮素为代表的黄酮类物质的抗氧化作用最强，能抑制脂 质氧化，预防动脉硬化。研究表明，用雪莲果的叶的萃取液进行大白鼠的体内试验， 其萃取液对大白鼠的肝细胞膜表现出很好的保护作用，能够清除自由基，缓解肝细 胞氧化损伤，保护肝脏，此外雪莲果叶的萃取液还能减少肝细胞生成葡萄糖的量， 这也是雪莲果叶能够用来治疗糖尿病的原因之一。 ( 2 ) 抑菌 从雪莲果叶中提取的8 - b m e t h a c r y l o y l o x y m e l a m p o l i d - 14 一o i c a c i d m e t h y l e s t e r 有明显的抗枯草杆菌作用，f l u c t u a n i n 的抑菌作用最强，s o n c h i f o l i n 显示了最强 的抑真菌p 妒c u l a r i ao r y z a e 的作用。 ( 3 ) 降血糖( a y b a re ta l ，2 0 0 1 ) 研究人员对雪莲果叶煎熬出的茶水进行大白鼠的活体试验。发现用2 雪莲果叶 的提取液代替饮用水喂养患糖尿病的鼠3 0 天，其身体如血糖、胰岛素含量、体重得 到很大改善，另外肾脏机能也得到增强，原因就是由于雪莲果水提液能增加血浆中 3 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 胰岛素浓度，从而降低血糖水平。 ( 4 ) 其他 雪莲果含有丰富的低聚果糖、酚酸、类黄酮和萜类物质，还有降血脂，减肥， 调节内分泌，防治血管老化，预防骨质疏松，抗菌等作用。 2 酚酸的研究概况 2 1 酚酸的生物活性 酚酸类化合物( p h e n o l i ca c i d ) 是指同一苯环上有若干个酚性羟基的一类化合物。 对酚酸类物质的功能研究表明，酚酸类物质具有利胆、抗菌、降压、增高白血球、 兴奋中枢神经系统、清除体内自由基、预防心血管疾病、糖尿病和某些癌症等多种 药理作用，对人体的健康具有独特的保健作用。它具有抗氧化、清除自由基、抑制 突变和抗肿瘤、抗血小板凝集、促进前列腺素的释放、抗菌、抗病毒、止血、增高 白血球，缩短血凝和出血时间等重要的生理功能作用。目前对于具有天然抗氧化性 的酚酸类化合物现在已经引起人们的普遍关注，并成为研究热点。 2 1 1 对心血管和血液系统的作用 ( 1 ) 抗氧化作用 国内外的研究表明，绿原酸是一种有效的酚型抗氧化剂，其抗氧化能力要强于 咖啡酸、对羟苯酸、阿魏酸和丁香酸，以及常见的抗氧化剂。绿原酸及其衍生物具 有比抗坏血酸，咖啡酸和生育酚更强的自由基清除效果，可有效清除d p p h 自由基、 羟基自由基和超氧阴离子自由基；它还可抑制低密度脂蛋白的氧化。绿原酸对体内 自由基的有效清除，对于维持机体细胞正常的结构和功能，防止和延缓肿瘤、突变 和衰老等现象的发生( 杜延兵，裘爱泳，2 0 0 6 ) 。柳艳等人在对丹酚酸b 活性研究 中发现其具有较强的清除d p p h 自由基的能力，在相同浓度下其清除能力均高于 b h t 和a s a ，显示了其作为天然抗氧化剂的潜力。 ( 2 ) 抗血小板活性作用 研究者发现，阿魏酸钠是一种选择性的血栓素a 2 ( t x a 2 ) 合成酶抑制剂。通过抑 制t x a 2 的生成，拮抗t x a 2 的活性，增强前列环素( p g l 2 ) 抗血小板聚集活性等多 种途径影响t x a 2 p g l 2 的平衡，从而抑制血小板聚集和血栓形成。表没食子儿茶素 没食子酸酯可明显抑制血小板聚集，其机理为抑制血小板血浆产生的血栓素b 2 ( t x b 2 ) 、血小板膜糖蛋白( p s e l e c t i n ) ，且可下调p s e l e c t i n 表达，从而产生抗血 栓作用( 张囡等，2 0 0 6 ) 。 4 雪莲果叶中酚酸的分离鉴定及其生物活性研究 ( 3 ) 对心血管作用 异绿原酸b 对大鼠具有较强促进f i i j n 腺环素( p g l 2 ) 的释放和抗血小板聚集作 用；对豚鼠肺碎片感应的抗体诱导s r s a 释放抑制率达6 2 3 。此外，对血小板血 栓素生物合成和氢过氧化物诱导的内皮素细胞损伤有极强抑制作用。 2 1 2 抗病毒作用 研究表明，阿魏酸对感冒病毒、呼吸道合胞体病毒和艾滋病病毒都有显著抑制 作用。阿魏酸对病毒的抑制机理可能与它能抑制黄嘌呤氧化酶的活性有关，因为该 酶与一些炎症性疾病关系密切。e i c h 教授在研究植物此生代谢产物作为抗逆转录病 毒剂时发现，绿原酸( c h a ) 是有希望的抗艾滋病毒( h ) 的先导化合物。这与 国内关于利用绿原酸预防和治疗h i v 感染的报道相一致，该报道认为c h a 可以降 低该病毒的感染性，通过调节吸收、增加h i v 的代谢，抑制该病毒对脑的感染。 2 1 3 抗菌作用 有文献报道，绿原酸和异绿原酸对多种致病菌和病毒有较强的抑制和杀灭作用。 对急性咽喉炎症及皮肤病有明显疗效，临床上用于治疗急性细菌性感染疾病。绿原 酸的水解产物咖啡酸也具有升白、止血、利胆及抑制单纯疱疹病毒之功效。倪学文 对银杏酚酸进行抑菌试验表明，分离得到的酚酸物质对蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆 菌和金黄色葡萄球菌有很好的抑制作用。孟日增等人的实验表明金银花中绿原酸有 较高的抗金黄色葡萄球菌和链球菌的活性。 2 1 4 抗肿瘤作用 绿原酸还可通过降低致癌物的利用率及其在肝脏中的运输来达到防癌、抗癌的 效果。并能抑制由苯并芘、4 - n q o ( 氧化硝基喹啉) 引发的癌症，绿原酸对大肠癌、 肝癌和喉癌具有显著的抑制作用，它被认为是癌症的有效化学防腐剂。 倪学文对银杏酚酸的抗肿瘤作用机制及抑制细菌和病原真菌的活性进行了研 究，发现其酚酸能显著抑制移植性肿瘤细胞s 1 8 0 的生长，对荷瘤小鼠细胞免疫和体 液免疫功能有显著的增强作用，而且银杏酚酸能显著提高荷瘤小鼠红细胞过氧化氢 酶活性，能剂量依赖性地显著抑制人宫颈癌h e l a 细胞增殖。 2 1 5 保肝作用 娄红祥等从金银花水溶性部分经乙酰化后分得c h a 四乙酰化物，经药理实验表 明，对c c h 引起的小鼠肝损伤有明显的保护作用，这为阐明金银花的保肝作用提供 了依据。研究表明丹皮酚通过自由基的清除作用及其保护线粒体c a 2 + a t p 酶，抑制 c a 2 + 内流作用对抗异烟肼和利福平对肝脏的损害。 5 华中农业人学2 0 0 9 届硕士学位论文 2 1 6 其他生物活性 有调查显示，常饮咖啡能降低患i i 型糖尿病的风险，这与咖啡中含有的绿原酸有 关。2 0 世纪9 0 年代中期，绿原酸被认为是肝微粒体g 6 p a s e ( 葡萄糖6 磷酸酶) 的 专一性抑制剂。绿原酸类物质通过抑制透明质酸酶( h a a s e ) 活性起消炎作用，其抗炎 活性和抗感受伤害活性比阿司匹林强，通过抗炎起止痛作用。在z u c k e r 鼠中的实验 显示了绿原酸具有降低血浆中胆固醇和甘油三脂含量的作用，也使肝脏中胆固醇水 平下降。绿原酸还能通过改善血管内皮增生降血压，通过保护胶原蛋白不受活性氧 等自由基损伤而抗紫外线辐射( 陈绍华，王亚琴，罗立新，2 0 0 8 ) 。 2 2 酚酸类化合物的分析方法的研究进展 目前，酚酸类化合物的测定方法很多，主要有光度法、毛细管电泳法、色谱分 析法、电化学分析法等。 2 2 1 光度法 ( 1 ) 可见分光光度法 该方法此法操作简便，应用广泛，仪器成本和材料消耗较低，是目前国内对食 品或其它植物中多酚类化合物进行总含量测定最常用的方法。于敏等采用国产7 2 2 分光光度计测定在6 7 9n l l l 处的吸光度值，对蜂胶总黄酮中总酚酸的含量进行了测 定，方法简便，可靠。付煜荣等人对景天三七中总酚酸的含量测定采用可见分光光 度法，在7 2 0n l t l 波长处进行测定。总酚酸分析的线形范围为0 4 6 4 0 2 3 2 0u g m l ( r = 0 。9 9 9 3 ) ，平均回收率为9 9 2 1 ，r s d 为2 0 ( n = 6 ) ，方法简单快捷，重现性好。 ( 2 ) 紫外分光光度法 酚酸类化合物具有吸收紫外光的特点，它们的吸收峰值在2 7 0n l t l 3 3 0n l n 之间。 汪美芳对芦根中提取的阿魏酸检测采用在3 2 2n l l l 处紫外光谱测定。张风云等采用两 种提取方法和两种分离方法对三种样品中的绿原酸进行了测定，比较结果证明用氯 仿一乙醇提取、纸层析分离的效果较好。紫外分光光度法在3 2 5n l l l 处测定了杜仲叶、 杜仲皮或杜仲产品中绿原酸的含量。方法简便可行、结果可靠，为基层实验室提供 了简易省时、结果可靠的绿原酸研究方法。张雁冰等用紫外分光光度法测定了密县 金银花及其茎、叶中绿原酸的含量，其质量分数分别是1 2 5 、0 4 8 、1 7 5 ( 王 晓霞，汪敬武，2 0 0 3 ) 。 ( 3 ) 化学发光分析法 贺彩霞等利用碱性介质中绿原酸对鲁米诺一铁氰化钾化学发光的抑制作用首次 建立了绿原酸的化学发光分析法。方法的检出限为5 2 x1 0 。9g m l ，线性范围为1 0 6 雪莲果叶中酚酸的分离鉴定及其生物活性研究 1 0 一g m l 一1 o 1 0 g m l ，回收率为1 0 4 。 ( 4 ) 催化光度法 耿玉珍等根据在盐酸介质中，绿原酸能灵敏地阻抑铁催化过氧化氢还原亮绿s f 的褪色指示反应，建立了测定痕量绿原酸的阻抑催化动力学光度分析方法，该方法 测定绿原酸的线性范围为0 o 1 2m g l ，检出限达4 2 x1 0 击g l 。 2 2 2 毛细管电泳法 张兰等利用毛细管电泳同时分离测定中药石韦中绿原酸、槲皮素含量，采用柱 端喷壁式三电极系统的电化学检测方式，以7 0e r n ( o d 3 6 0l am ，i d 2 5um ) 的熔融石 英毛细管为分离通道，在最佳电泳介质( p h = 7 0 ，1 0 0m m o l l 磷酸盐缓冲溶液) 中，当 分离电压为2 1k v 时，两待测物质在8m i n 内完全分离。该方法具有良好的重现性， 峰电流的r s d 小于3 5 。彭友元采用毛细管电泳电化学检测法同时测定了荞麦的 表儿茶素、芦丁、金丝桃甙和槲皮素的含量。他以直径为3 0 0um 的碳圆盘电极为 检测电极，检测电位为+ o 9 0v ( 1 3s s c e ) ，在5 0m m o l l 硼酸盐( p h 8 7 ) 的运行缓冲 液中，上述各组分在2 0m i n 内能完全分离。被测物浓度与峰电流在三个数量级范围 内呈良好线性，检测限在1 1 0 7g m l n5 1 0 - 7g m l 之间，该法简单可靠，已经 成功的应用于荞麦多酚的测定。 2 2 3 色谱分析法 ( 1 ) 薄层色谱法 薄层色谱法是测定酚酸类化合物常用的一种方法。朱玉等以聚酰胺薄膜为固定 相、体积分数为3 6 的乙酸溶液为流动相，研究建立了薄层色谱分离测定葵花仁粕 中绿原酸的方法。绿原酸样品溶液上行展开8 5e l r l ，其r f 值为o 6 1 。绿原酸的检测 量在0 0 5p 鲫6l ag 范围内，其斑点的面积与绿原酸的检测量具有良好的线性关系。 景晓明等利用薄层色谱法，用硅胶h ，o 7 的c m c 板，乙酸丁脂：甲酸：水：乙醇 ( 1 ：1 ：1 ：0 2 ) 上层液为展开剂，较好的分离出了金银花提取物中的绿原酸。程德军等 通过两次制备薄层色谱分离纯化杜仲叶中的绿原酸，所建立的纯化制备方法简便、 直观、对绿原酸有很好的分离效果，适合于数百毫克级克级的制备。 ( 2 ) 气相色谱法 李秋怡等建立了利用气相色谱法对川芎油中阿魏酸的含量测定方法。方法采用 内标法，以香荆芥酚为内标物，测定川芎油中阿魏酸的含量，结果为阿魏酸在 0 4 0 2 - 6 4 3 2m g m l 。1 范围内具有良好线性关系，平均加样回收率为1 0 1 5 ， r s d = i 6 6 。方法简单、重现性好，可作为川芎油中阿魏酸的含量测定方法。 7 华中农业大学2 0 0 9 届硕十学位论文 ( 3 ) 高效液相色谱法 高效液相色谱法以其高速、高效、高灵敏度等优点在中药有效成分的检测中应 用逐渐增多。利用h p l c 法检测主要对色谱条件进行选择，如色谱柱、流动相、流 速等。对于酚酸类物质主要是采用反相高效液相色谱法进行测定。 翁芳华等采用l i c h r o s p h e r1 0 0 r p 一1 8 e 色谱柱( 2 5 0 4 0 t u m i d ，5 l lm ) ，以甲醇： 乙酸：水溶液为流动相，流速为1 0m l m i n 梯度洗脱，s p d 6 a v 紫外检测器，3 0 柱温，紫外检测波长为2 8 0n t n 。建立了一种新的同时测定蓝莓酒中1 1 种酚酸含量 的高效液相色谱分析方法，实验结果表明该方法简单实用，且准确度、灵敏度较高， 重复性好。南敏伦等采用h p l c 法建立了同时测定不同产地返魂草中绿原酸含量的 方法。结果绿原酸质量在6 2 3 0 1n g 内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为 9 9 2 ，r s d 为0 9 1 ( n = 9 ) 。方传代通过建立反相高效液相色谱法测定了金银花中 绿原酸的含量，流动相为甲醇0 4 磷酸( 体积比为2 5 ：7 5 ) ，流速1 0m l m i n ，光电 二极管阵列检测器，检测波长3 2 7n l t i ，柱温2 5 ，绿原酸在0 6 4 6 4 0pg 范围 内其进样量与峰面积呈良好的线性关系。该方法具有简便、快速，回收率、精密度 高的优点，可作为金银花质量控制的有效手段。 2 2 4 电化学分析法 索志荣等建立测定了葡萄酒中4 种酚酸的色谱电化学分析方法，采用 h y p e r s i l o d s 色谱柱( 2 5 0m i l l 4 0r n n l ，5 0 1 tm ) ，流动相为甲醇4 醋酸，梯度洗 脱，流速为o 8m l m i n ，工作电压为o 7v ，柱温为3 0 。结果表明，电化学法的 检出限比紫外法的检出限低4 6 0 0 倍，而且可同时测定，样品不需预富集即可进行 分析。 2 2 5 其它分析方法 许高燕等采用高效液相色谱串联质谱法( h p l c m s m s ) 同时测定水溶性迷迭香 提取物中迷迭香酸、阿魏酸和咖啡酸的含量，以甲醇和o 1 乙酸铵溶液为h p l c 的流动相，m s m s 使用多反应监测( m r m ) 扫描方式，在3m i n 内可完成迷迭香酸、 阿魏酸和咖啡酸三种化合物的分离分析。吴方评等用固相萃取微柱高效液相色谱法 ( s p e m h p l c ) 测定了金银花中的绿原酸。王月伶等用一种离子液体( 1 乙基3 - 甲基咪 唑四氟硼酸盐，1 e 3 m i t f b ) 修饰毛细管胶束电动色谱法分离测定异槲皮甙、绿原酸 和槲皮素，将此方法应用于分离测定欧亚旋覆花中的异槲皮甙、绿原酸和槲皮素， 取得良好结果。王宁等建立了一种用声光可调( a o t f ) 近红外m 瓜) 光谱技术快速测 定复方丹参片中丹参酮i ia 和丹酚酸b 的新方法。戴玲等利用自动电位滴定法对多 雪莲果叶中酚酸的分离鉴定及其生物活性研究 酚类化合物进行测定，与紫外分光光度法加以比较，实验结果基本一致。 2 3 酚酸提取纯化方法的研究进展 2 3 1 酚酸提取方法 2 31l 溶剂提取 酚酸类物质呈弱酸性，易溶解于水、醇、丙酮、乙酸乙酯等溶剂，在工业生产 中一般采用水为提取溶剂。在常规提取方法中，根据萃取溶剂的不同可分为水提法 与有机溶剂提取法。 ( 1 ) 水提醇沉法 利用酚酸易溶于水的特性，采用水作溶剂，加热煮沸提取，然后用高浓度醇沉 淀蛋白质、多糖等杂质。该方法工艺简单、经济，但是水提液中杂质较多，醇沉过 程中伴随吸附夹带，使部分绿原酸消失。顾娟等采用水提取丹参中酚酸，最佳提取 工艺为1 6 倍水煎煮，每次煎煮时间不能超过0 5h ，煎煮4 次后基本提取完全。段 晓颖以水为提取溶媒，提取金银花中的绿原酸。绿原酸在醇沉和干燥的工艺步骤损 失较多，醇沉过程中沉淀会对绿原酸进行包裹和吸附，而干燥过程中的损失原因是 由绿原酸的化学性质决定的，绿原酸对热不稳定。郑喜群等以水酶法提取葵花籽油 脂后分离出的水浸提液为原料，采用醇沉淀法去除浸提液中的多糖，抽滤浓缩滤液 后得到绿原酸。 另外还有用水提石灰乳沉淀法提取绿原酸，绿原酸与钙盐生成沉淀，在水提液 中加入石灰乳，使绿原酸沉淀下来，然后用硫酸分解沉淀。该方法操作简单、经济， 其缺点是石灰乳沉淀不完全，硫酸钙对绿原酸有吸附作用，从而降低产率。 ( 2 ) 醇提法 刘军海等采用乙醇对杜仲中绿原酸进行提取，利用响应面分析优化了提取绿原 酸的最佳工艺条件为乙醇浓度5 2 ，提取温度7 8 ，料液比1 ：1 3 ，提取时间2 h ， 浸提两次。鞠玉琳等通过对向日葵叶中绿原酸提取方法的比较研究，发现水提石灰 乳法提取的绿原酸含量较低，且石灰乳可引起绿原酸水解，而水提石硫法的提取物 对粘膜，尤其对鼻粘膜具较强刺激性并有溶血现象，水提法不能有效地将向日葵叶 中的绿原酸提尽，采用稀醇提取法较为理想。林丹等采用了不同方法对金银花中绿 原酸进行提取，结果尤以醇提法较好，绿原酸的得率可达到1 5 2 8 ，而且随着乙醇 浓度的增加绿原酸的得率先增加后减少。 此外还可采用醇提铅盐沉淀法，用乙醇作为提取溶剂，在醇提液中加入乙酸铅 溶液，使绿原酸以铅盐的形式沉淀下来。优点是可得到较纯绿原酸，缺点是工艺复 9 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 杂，产量低，并