杂交瘤技术ppt课件.ppt

杂交瘤技术（hybridomatechnique）,1,内容纲要,细胞融合概述诱导细胞融合的常用方法杂种细胞的筛选（HAT）杂交瘤技术与单克隆抗体的制备基本概念三个技术关键单克隆抗体的制备过程,2,杂交瘤技术又称单克隆抗体制备技术。1975年，Kohler和Milstein将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成的杂交细胞即可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了具有划时代意义的杂交瘤技术。这种技术的基础是细胞融合技术。,3,一、细胞融合（cellfusion）,1、概述细胞融合是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。可在自发或人工诱导下发生。,4,两个不同基因型的细胞可形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的细胞称为杂种细胞或杂交细胞（hybridcell）。,5,2、诱导细胞融合的常用方法,生物方法：如仙台病毒化学方法：如聚乙二醇（PEG）物理方法：如电融合,6,（1）仙台病毒融合法,常用的能诱导细胞融合的病毒有疱疹病毒、牛痘病毒和副粘病毒科病毒等。其中属副粘病毒科的仙台病毒应用最为广泛。因病毒具有凝集细胞的能力，某些病毒的糖蛋白还有促进细胞融合的功能，因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。,7,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图,8,（2）聚乙二醇融合法,聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）分子可在质膜之间形成分子桥，使细胞质膜发生粘连促使质膜的融合。其优点是融合成本低，勿需特殊设备；简便、融合效率较高。因此在1975年获得成功后很快取代仙台病毒法。,9,10,（3）电融合法,电融合法是80年代出现的细胞融合技术，将细胞置于电场中，使它们彼此靠近紧密接触并排列呈串，然后在高强度、短时程的直流电脉冲的作用下，相互连接的细胞膜被击穿而导致细胞融合。其优点是：融合率高、重复性强、对细胞伤害小；可在显微镜下观察融合过程；诱导过程可控性强。,11,电融合示意图,12,3、杂种细胞的筛选,人工诱导细胞融合是一个随机的过程，可能产生多种类型的细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。应根据其细胞特性来选择适当的筛选方法（如酶缺陷、药物抗性标记、营养缺陷、温度敏感等）。,13,HAT是最常用的筛选系统,原理细胞DNA合成有两条途径：主要合成途径补救合成途径,14,主要合成途径,即利用糖和氨基酸这些可从培养液中摄取的简单的含碳、含氮复合物来合成核苷酸，进而合成DNA。这一过程需四氢叶酸参与供甲基及甲酰基，因此该途径可被叶酸拮抗物氨基喋呤阻断。,15,补救合成途径,细胞可通过次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK），将核苷酸前体合成核苷酸以供DNA合成的原料。,16,Hhypoxanthine（次黄嘌呤）Aaminopterin（氨基喋呤）Tthymidine（胸腺嘧啶核苷）,DNA的生物合成途径与HAT选择培养基,17,凡能在HAT选择培养基中生长的细胞，必须能利用外源性次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）；HGPRT或TK细胞在HAT培养基上不能存活；HGPRT与TK细胞融合或与正常细胞融合后的杂交细胞，可在HAT培养基上存活。,18,HGPRT细胞的筛选,可人为地筛选或致突变，诱发一些细胞缺乏HGPRT或缺乏TK，如用毒性药物8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine，8-AG)作用于细胞株，可选育出HGPRT细胞株，这是因为HGPRT+细胞利用了8-AG后，因合成毒性核苷酸而死亡。,19,由此可见，HAT选择培养基及补救合成途径酶缺乏的突变细胞株的建立，是细胞融合后选择出杂交细胞株的关键因素。,20,二、杂交瘤技术与单克隆抗体的制备,（一）基本概念杂交瘤细胞指肿瘤细胞与体细胞融合形成的杂交细胞，它既保留了肿瘤细胞无限增殖的能力，又具有参与融合的体细胞的一些特征。,21,杂交瘤技术（也称单克隆抗体制备技术）是指建立杂交瘤细胞系的技术，通常指B淋巴细胞杂交瘤技术，即将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，以建立可以分泌单一性抗体的杂交瘤细胞系的技术。,22,单克隆抗体（monoclonalantibody，McAb)指由一个B淋巴细胞克隆所产生的，只识别一种抗原决定簇的均质抗体。克隆指通过一定方法获得由单个细胞无性繁殖形成的细胞集落。,23,McAb技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞(hybridomacell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。,杂交瘤技术的基本过程,24,（二）杂交瘤技术产生的三个技术关键,1、B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性B淋巴细胞（Blymphocytes）：接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡短命细胞。,25,骨髓瘤细胞(myelomacells)：恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活长命细胞。没有抗体分泌。经筛选HGPRT或TK。,26,2.细胞融合技术,27,3.杂交瘤细胞的筛选,28,HAT培养基筛选,B淋巴细胞：HGPRT+，TK+存活但短命骨髓瘤细胞：HGPRT或TK死亡杂交瘤细胞：HGPRT+，TK+存活,29,（三）单克隆抗体的制备过程,30,三个基本环节和两个决定因素,31,1、免疫小鼠和脾细胞的制备,免疫动物：68周龄BALBc小鼠免疫抗原：各种病毒、细菌、细胞或可溶性抗原。一般可溶性抗原用完全佐剂效果较好。免疫途径：皮下、腹腔或静脉注射免疫程序：基础免疫2次，静脉再加强免疫1次。免疫后35天解剖，取脾细胞配制成适量浓度细胞悬液用于融合。,32,2、骨髓瘤细胞的准备,常用骨髓瘤细胞系有NS1、SP2/0、X63等。选择要点：稳定易培养、自身不分泌抗体、融合率高、HGPRT缺陷株（8-氮鸟嘌呤定期筛选）。融合条件：对数生长期，良好的细胞形态，活力细胞达95%。,33,3、饲养细胞的准备,在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞（Feedercells）。机制尚不明了，一般认为：可能释放非种属特异性的生长刺激因子；也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。,34,常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。其中小鼠腹腔巨噬细胞使用最为普遍，因其来源及制备较为方便，且有吞噬清除死亡细胞及其碎片的作用。饲养细胞的制备：细胞融合前一天，从同系正常小鼠腹腔取巨噬细胞，加入培养板，96孔板每孔细胞数为2104；24孔板，每孔为1105个，置37培养。,35,4、50%PEG配制,称2050gPEG15004000粉剂，放于玻璃瓶中，高压灭菌（121132）20min，溶化呈液状，PEG尚未凝固时，加入RPMI-16402050ml（与PEG重量相当）立即充分混合。此为50%PEG保存于室温，呈碱性，不必调节pH。,36,5、细胞融合,（1）SP2/0细胞和免疫脾细胞按1:4的比例放于一个50ml离心管中，充分混匀，离心后尽量吸尽上清，置于37玻璃杯水浴中。（2）用1ml吸管将1ml37预热的50%PEG溶液，逐滴缓慢加入混合细胞管中（1min以内加完），边加边轻轻搅拌。（3）继续搅动团块1分钟，目的使所有的细胞尽可能地与PEG接触。,37,（4）慢慢加入预热的无血清16401ml，1min，目的是稀释PEG；再加入1ml，1min。最后加入7ml，2-3min内加完，并持续轻轻搅动，此时细胞对机械损伤非常敏感。（5）离心1000rpm，室温10min，去上清。（6）取预热的15%牛血清1640，先加10ml，对准细胞团加液，使细胞颗粒均匀分布于悬液中；再加入90ml。（7）加入已含有饲养细胞的96孔板或24孔板（每孔加入细胞数分别为2105和1106）。,38,6、HAT和HT选择培养,（1）接种24h后加入HAT选择培养液。（2）融合后710天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加一半新的)，以后每23天半量换液一次。（3）两周后换HT培养液（目的是洗出残留于细胞内的氨基喋呤），以后每34天换液一次。（4）再维持培养两周改用一般培养液。,39,7、抗体的筛查,细胞融合后两周即可筛查抗体。选择检测方法以快速、简便、特异、敏感和便于一次处理大量样品为原则。常用的方法有：ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb的检测。RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。IFA用于细胞和病毒McAb的检测。FACS(流式细胞术)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。,40,8、克隆化,由于在一个培养孔内不能保证只存在一种杂交瘤细胞系，因此必需克隆化。一般需克隆化35次，才能获得稳定型基因和稳定分泌特异性抗体的细胞。要尽早克隆化，以防止单克隆抗体细胞系被竞争淘汰。分泌抗体的克隆一般生长较慢。克隆化后的杂交瘤细胞也需定期再克隆，以防突变和染色体丢失。,41,克隆培养方法,有限稀释法（较常用）：使96孔板上其中36孔每孔5个细胞，另36孔每孔1个细胞，余下24孔每孔0.5个细胞；亦有经连续稀释成最终30个/ml，每孔0.1ml接种48孔。软琼脂平板法FACS选取法显微挑选法,42,克隆化培养后，通常在1014天测抗体进行阳性克隆的筛查。取抗体阳性的克隆，可继续克隆化或进一步扩大培养。阳性杂交瘤细胞应及时冻存，以防染色体丢失、变异及污染。,43,9、抗体大量生产,方法主要有两种：体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为1060gml，如果大量生产，费用较高。体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。腹水可达每毫升几毫克抗体。,44,10、杂交瘤细胞的保存,因为细菌的污染和细胞的突变，使杂交瘤难以维持，冻存几批早期杂交细胞，预防意外是必要的。无菌DMEM含20%牛血清加10%DMSO（二甲基亚砜）配成冻存液，21065106细胞加入1ml冻存液，于液氮中贮存。,45,11、细胞复苏,冻存管由液氮中取出，即刻投入37水浴中，很快融化，用吸管吸出细胞到50ml离心管，内有50ml细胞生长液，1000rpm，10min，去上清，细胞沉淀物，再悬浮于10ml生长培养液，室温静止10min