（食品科学专业论文）紫外诱变及电融合法构建赤藓糖醇高产菌株的研究.pdf

吉林农业大学硕士学位论文 紫外诱变及电融台法构建赤藓糖醇高产菌株的研究 摘要 赤藓糖醇( e r y t h r i t 0 1 ) 是一种天然存在的四碳糖醇，化学名1 ，2 ，3 ，4 一 丁四醇，分子式c 4 h 。0 ，分子量12 2 1 2 ，熔点1 2 6 ，沸点3 2 9 3 3 1 ，外观为白 色粉状结晶，粉碎性好，溶于水会吸收较多能量，溶解热为- 9 7 4 j g ，使用时有 一种凉爽的口感特征。 赤藓糖醇，在自然界中的分布十分广泛，海藻、磨菇类以及甜瓜、葡萄、桃等 水果中均舍有赤藓糖醇，由于细菌、真菌和酵母也能产生赤藓糖醇，所以赤藓糖醇 也存在于果酒、啤酒、酱油等发酵食品中。赤藓糖醇是一种适度的甜味增量剂， 甜度为蔗糖的6 0 一7 0 ，不被突变链球菌利用，抗龋齿，不参加糖代谢矛口血糖变 化，适宜糖尿病、肥胖病和心脑血管病人食用。具有酷似蔗糖的口味而发热量却 接近零，生理耐受量高，可作为低热量功能性保健食品配料，应用前景十分广泛。 本研究旨在运用紫外诱变方法从实验室筛选到赤藓糖醇产生茵中选育优良 菌株，进而采用原生质体电融合技术将同种不同株的较高产赤藓糖醇的高渗假丝 酵母菌株进行融合，得到赤藓糖醇高产工程菌，并对该菌株的生长条件进行深入 研究。 在菌种活化采集和筛选的同时，对赤藓糖醇的检测方法进行了比较，摸索出 了一种利用特殊显色剂的薄层层析检测方法，即通过标准样品的梯度定量点榉， 制作出一张标准薄层板，在实验中样品只需将薄层板层析结果与标准板对照，就 可以对样品中的赤藓糖醇进行初步定性、定量分析。这样极大方便了在诱变菌株 中高产赤藓糖醇菌株的检出及细胞融合实验时在大量的融合菌株中目的融合子 的检出。 对紫外诱变高产赤藓糖醇茵进行了正交实验，确定紫外诱变何光复活交替 进行的诱变育种条件；将原生质体电融合获得的高产菌株从温度、培养时问开口 p h 等生长条件进行了研究，最后确立高产赤藓糖醇茵株r h u v l 4 一f 9 培养条件 为培养温度3 0 ，培养时间6 d ，初始培养基p h 为5 6 ，葡萄糖浓度为3 0 ，氮 源为0 5 酵母膏与0 1 脲。经上述条件培养后发酵液中赤藓糖醇含量为 1 2 0 6 r a g m l ，比出发茵株提高了3 。6 1 倍。 对在实验过程中影响原生质体形成率、再生率的各种因素以及影响电融合 的各项参数进行研究。结果证明酶浓度、酶解时问、最适温度、p h 值、渗透压 稳定剂选择等对原生质体形成率、再生率都有很大影响，在对每一个影响因素做 单因素实验基础上，确定了原生质体形成率、再生率都较高的最佳条件。同时由 吉林农业大学硕士学位论文紫外诱变及电融合法构建赤藓糖醇高产值株曲研究 于本研究使用电融合技术进行原生体质融合，避免了采用化学融合方法产生毒害 细胞现象的发生，提高了反应可控性和融合率，为进一步深入研究，构建高产赤 藓糖醇生产菌奠定了良好基础。 关键词：赤藓糖醇高渗酵母紫外诱变电融合 吉林农业大学硕士学位论文 紫外诱变及电融合法构建赤藓糖醇高产菌株的研究 a b s t r a c t e r y t h r i t o li s an a t u r a le x i s t e df o u r - c a r b o ns u g a rp o l y o l s ，c h e m i c a lr a i t l ei s 1 , 2 ，3 ，4 - b u t a n e t e t r o l ，m o l e c u l a rf o r m u l ai sc 4 h l 0 0 4 a n dm o l e c u l a rw e i g h ti s1 2 2 2 2 ， b o d i n gp o i n ti s3 2 9 - 3 3 1 ，m e l t i n gp o i n ti s1 2 6 c ，i t sa p p e a r a n c ei sw h i t ea n d c r y s t a lp o w d e r i tc a na b s o r bm o r ee n e r g yw h e ni ti ss o l u t e di nw a t e r , d i s s o l u t i o ni s 一9 7 4 j g ，e r y t h r i t o lh a sap o s i t i v ee n t h a l p yo fs o l u b i l i z a t i o n ，t h u sp r o v i d i n gas t r o n g c o o l i n ge f f e c ti ni n g e s t i o n i tc a ng i v eab e t t e rt a s t y e r y t h r i t o lo c c u r sw i d e l yi nn a t u r ea n d h a sb e e nf o u n dn a t u r a l l yi ns e v e r a l f o o d si n c l u d i n gm u s l l r o o m ，w a t e r m e l o n ，p e a r , g r a p e ，w i n e ，s a k e ，b e e r ，s o ys a n s ea n d f e r m e n t e df o o d s i th a sa6 0 一7 0 s w e e t n e s sr e l a t i v et os u c r o s ea n di ti sag o o d l o w - c m o f i es w e e t e n e r i tc a nn o tb eu s e db ym u t a t i o ns t r e p t o c o c c u s e r y t h r i t o lh a s b e e nu s e ds a f e l ya san o n c a r i o g e n i cs w e e t e n e ri nm a n yc o u n t r i e s ，o w i n gt oi n a b i l i t y o fe r y t h r i t o lm e t a b o l i s mi n c a r i o g e n i co r g a n i s m s m o r et h a n9 0 o fi n g e s t e d e r y t h r i t o li sn o tm e t a b o l i z e db yt h eh u m a nb o d ya n di se x c r e t e du n c h a n g e di nt h e u r i n ew i t h o u tc h a n g i n gb l o o dg l u c o s ea n di n s u l i nl e v e l s t h e r e f o r e ，i tc o u l db eu s e d a d v a n t a g e o u s l y i n s p e c i a lf o o d sf o rp e o p l ew i t hd i a b e t e sa n df a t n e s s i t i sa n o n - - c m o f i ea n dn o n - c a r i o g e n i cs w e e t n e r , e r y t h r i t o lh a sg r e a tp o t e n t i a lf o ra p p l i c a t i o n i n f o o d t h en a t u r ed e t e r m i n a t i o no fh i i 曲e r y t h r i t o l - p r o d u c e r sw a so b t a i n e df r o m e r y t h r i t o l p r o d u c i n g s t r a i n st h a tw e r ei s o l a t e di nl a bb yu l t r a v i o l e tr a d i a t i o n t r e a t m e n t d i f f e r e n ts t r a i n sw e r ef u s e db ym e a n so fp r o t o p l a s tf u s i o n h i g h - p r o d u c i n g e n g i n e e r i n gm i c r o o r g a n i s m sa n dt h eg r o w t hc o n d i t i o no ft h es t r a i nw e r es t u d i e d d e e p l yi nt h ee x p e r i m e n t e x a m i n a t i o n sw e r ec o m p a r e du n d e rv a r i o u 8c u l t i v a t i o nc o n d i t i o ni nt h ew h i l eo f a c t i v a t i n g ，c o l l e c t i o na n ds c r e e n i n go nt h ee r y t h r i t o l p r o d u c i n gs t r a i n s p l o b i n g a m e t h o dw i mas p e c i a lc o l o r i n g m a t t e ro ft c l ，t h a ti s ，m a d eap i e c eo fn o r m a lt c l t h r o u g ht h en o r m a ls a m p l es p o t i n gs a m p l e sw i t hg r a d i e n ta n dc e r t a i nq u a n t i t y i n t h ei n v e s t i g a t i o n ，j u s tr e q u i r i n gar e s u l to ft c lw i t hs a m p l e st h a tc o m p a r i n gw i t h n o r m a l ，b o a r d s ow ec a na n a l i z e dt h ee r y t h r i t o lt h a te a r d _ ef r o mt h es a m p l ew i t ht h e q u a l i t a t i v ea n dq u a n t i t i v em e t h o d s w ed e s i g n e dai n f i n i t eh i g h w a yt os e l e c tt h eh i g h - p r o d u c i n ge r y t h r i t o ls t r a i n si n t h em u t a b l es t r a i n sa n ds e l e c t i n ga i m i n g f u s a n t sa m o n gt h ep l e n t i f u li n o s c u l a t es t r a i n s i nt h ee x p e r i m e n t f i x i n go nt h ec o n d i t i o no fh i g h - p r o d u c i n ge r y t h r i t o ls t r a i n si nt h e 吉林农业大学硕士学位论文紫外诱变及电融奋法构建赤藓糖醇高产菌株的研究 t r e a t m e n to fu v t h eg r o w t h - c o n d i t i o no ft h eh i 【g h p r o d u c i n ge r y t h r i t o l s t r a i n s a c h i e v e df r o mt h ep r o t o p l a s tf u s i o nw e r e i n v e s t i g a t e d o nt h e t e m p e r a t u r e ， c d t u r m t i m ea n dp h a tl a s t ，m a k i n gac e r t a i no nt h ec u l t i v a t e c o n d i t i o no ft h e h i g h - p r o d u c i n ge r y t h r i t o l s t r a i n s o f c a n d i d a r h - u v - l 4 - f 9a n di t s c u l t i v a t e - t e m p e r a t u r ei s3 24 c ，c u l t i v a t e - t i m e ：6d a y s ，t h ep ho fi n i t i a l c u l t u r ei s5 6 t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no fg l u c o s ei s2 0 ，n i 仃o g e n s o u r c e ：0 5 y e a s te x t r a c t a n d0 1 c a r b a m i d e 1 1 1c o n c l u s i o n 、t h ec u l t u r ec o n d i t i o no fm i c r o z y m ei ss t u d i e d ， e r y t h r i t o lc o n t e n ti nt h ec u l t i v a t e ds u p e r n a t a n ti s1 2 0 6 m g g , w h i c hi n c r e a s e d 3 6 1 t i m e st h a nt h ei n i t i a ls t r a i n i nt h ee x p e r i m e n t ，w em a k es o m eb r e a k t h r o u g hi nt h ef a c t o r so f e f f e c tf o r m a t i o n o f p r o t o p l a s t , r e g e n e r a t i o na n dp a r a m e t e r so fe l e c t r o f u s i o n t h eo u t c o m ep r o v e st h a t e n z y m e sc h r o m a , t h et i m eo fd i s p o s a lb ye n z y m e ，t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r e p h o s m o t i cp r e s s u r e ，t h ec h o i c eo fs t e a d ym a t t e rh a v eag r e a te f f e c ti nt h ef o r m a t i o no f p r o t o p l a s t sa n dr e g e n e r a t i o n o nt h eb a s eo fe v e r ye f f e c tf a c t o r s ，w ed os i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n t ，a n de m p l yo r t h o g o n a lt e s t t oe n s u r et h eo p t i m a lc o n d i t i o ni nt h e f o r m a t i o no fp r o t o p l a s t sr e g e n e r a t i o n a tt h es a m et i m e ，t h i ss t u d ye m p l o y st h e m e t h o do fe l e c t r o f u s i o nt oc o m p l e t ep r o t o p l a s tf u s i o n , a n dt h i sa v o i d se m p l o y i n g c h e m i c a lm e t h o do ff u s i o np r o d u c ep o i s o nc e l l ，a n di n c r e a s et h ec o n t r o lo fr e a c t i o n a n dt h er a t eo ff u s i o n ，t h i sm a k eas o l i dg r o u n di nf u r t h e rs t u d ya n dh i g h - p r o d u c t i o n e r y t h r i t 0 1 h o w e v e r , i fw ew a n tg e tm o r ee r y t h r i t o lf r o mi t ，i tm u s tb es t u d y 矗m h e r i naw o r d ，t h i ss t u d ym a k eas t e a d yb a s i sf o rc o n s t r u c t i n gg e n e e n g i n e r r i n g e r y t h r i t o lw h i c h c a l lp r o d u c ep l e n t yo f e r y t h r i t 0 1 k e y w o r d ： e r y t h r i t o l o s m o p i l i ey e a s t t r e a t m e n to fu v ek c t r o f u s i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其他教育机 构的学位证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：真? ，j 瓮球手 签字日期：矽纡年月矿日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即 吉林农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阒。本人授权吉林农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等；复制手段保存、汇编学 位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：壹7 砷受j 歹晦 签字目期：艘月矿日 学位论文作者毕业去向 工作单位： 通讯地址： ，。? 导师蟹缸j 翻 签字日期：7 垂! 梅 电话： 邮编； 穗 吉林农业大学硕士学位论文 紫外谤变及电融合法构建赤藓糖醇高产菌株的研究 第一章前言 赤藓糖醇( e r y t h r i t 0 1 ) 是一种天然存在的四碳糖醇，在自然界中的分布十分广泛， 海藻、磨菇类以及甜瓜、葡萄、桃等水果中均含有赤藓糖醇，由于细菌、真菌和酵母也 能产生赤藓糖醇，所以赤藓糖醇也存在于果酒、啤酒、酱油等发酵食品中“。33 。赤藓糖醇 结晶性好，在相对湿度9 0 以上环境中也不吸湿，易于粉碎制得粉状产品“。赤藓糖醇 对热和酸十分稳定，在一般食品加工条件下，几乎不会出现褐变或分解现象，能耐硬糖生 产时的高温熬煮而不褐变。赤藓糖醇属于填充型甜味剂，甜度是蔗糖的6 0 7 0 ”。溶 于水时会吸收较多的能量，溶解热一9 7 4 j g ，使用时有一种凉爽的1 3 感特性。其甜味纯 正，与蔗糖的甜味特性十分接近，无不良后苦味。与糖精、阿斯巴甜、安赛蜜共用时的甜 味特性也很好，可掩盖强力甜味剂通常带有的不良味感或风味“”“。由于赤藓糖醇具有良 好的特性，除在食品工业中广泛应用以外，在医药、化妆品、化工等许多方面也有广阔 的应用前景。 自赤藓糖醇被发现以来，已经对其物理化学性质、生理功能及其作用机理、代谢途 径和在食品中的应用等方面进行了较为深入的研究，近年来，对其分子生物学方面的研 究也引起了科技界的广泛关注。 1 1 赤藓糖醇生产方法 1 1 1 生物抽提法 赤藓糖醇可以从海藻、苔藓及某些草类中提取“。 1 1 2 化学合成法 用化学法，氢化还原合成，可由丁烯二醇与过氧化氢反应，其中丁烯二醇是由乙炔和 甲醛先制成2 一丁炔一1 ，4 一二醇，然后将其水溶液与雷氏镍混合并加入阻化剂氨水，在 0 5 m p a 左右通氢，氢化后得赤藓糖醇产品“。 1 1 3 发酵法生产 用一定基质培养微生物，通过微生物发酵生产赤藓糖醇。如将淀粉乳经酶解成葡萄 糖后，由微生物在高浓度条件下发酵后提纯精制、浓缩、结晶、分离、干燥而得“。 上述三种方法，其中，生物抽提法成本相当高，得率极低；化学合成法污染严重、 产品质量不稳定，食用安全系数较低。因此，发酵法是最为理想的生产方法。 1 2 赤藓糖醇研究进展 1 9 5 6 年，加拿大s p e n c e r j f t “”等在研究高渗酵母产生甘油时，发现因菌种生长 速度、培养条件不同，可产生赤藓糖醇。8 0 年代，日本农水省食品综合研究所与日研化学 ( 株) 共同研究开发成功赤藓糖醇生产技术，并有产品上市“。从9 0 年代起，日本在克服 吉林农业大学硕士学位论文 紫外诱变及电融合法构建赤藓糖醇高产菌株的研究 以往赤藓糖醇发酵研究中存在的菌种耐糖性差、发泡性强、发酵产率低以及副产品多等 问题的情况下，率先实现了赤藓糖醇的工业化生产。其他一些工业发达国家如法国 c e r e s t a r 公司也有赤藓糖醇产品“。国内目前只有山东宝龄宝公司采用发酵法生产赤藓 糖醇，但因规模和技术等因素尚不能满足市场的需求。 近几年，国内外为获得赤藓糖醇的生产而进行了利用高渗酵母生产赤藓糖醇研究， 但多数还停留在生产菌株的分离筛选、培养条件优化以及赤藓糖醇的分离纯化技术等实 验室研究阶段，菌种的生产性能较低，产量一般在2 4 8 5 4 6 m g m 之间，难于进行大 规模生产。 1 3 本研究的意义 赤藓糖醇作为一种添充型甜昧剂，在医药、食品、化妆品及化工等领域均有广阔的 应用前景，对它的研究目前已成为国际上一个备受关注的热点。我国特别是吉林省淀粉 资源十分丰富，采用发酵法生产赤藓糖醇，只要有优秀的菌株，产品将具有原料易得、工 艺简单、生产成本低等特点，必将在国内外甜味剂市场上具有较强的竞争能力1 “。 同时，赤藓糖醇的研究与应用推广，不仅提高人民的健康水平、推动我国的功能性 食品行业的发展，而且可加速吉林省玉米的高产值转化，为吉林省的农产品加工开辟出 一条新路。 长期以来，赤藓糖醇因受到生产菌种性能及提取工艺的限制，成本高，价格昂贵， 限制其广泛应用。因而高产赤藓糖醇菌种是赤藓糖醇生产的关键，从而构赤藓糖醇高产 工程菌株成为研究的热点。本研究的目标是采用现代生物学方法构建一株高产赤藓糖醇 菌株，使赤藓糖醇的产量大幅提高，降低赤藓糖醇的生产成本，使这一功能性甜味剂得 到广泛合理的应用的同时，推进吉林省玉米产业科技进步和发展速度。 2 吉林农业大学硕士学位论文 紫外诱变及电融合法构建赤藓糖醇高产菌株的研究 第二章材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 菌株 菌种分离样本分别采自：长春郊区蜜蜂园中生产的蜂蜜、糖厂的废液及腐烂的水果，经 实验室筛选得到三株耐高渗假丝酵母，分别为：l - 4 、l - 9 、f - 9 ； 经实验室紫外诱变得到两株耐高渗酵母菌株，分别为：u v - l 一4 、u v f 一9 表l 本研究所用菌种 t a b l e 1s l r a i n su s e di nt h es t u d y 2 1 2 试剂： 所用主要试剂种类见表2 ： 表2 本研究所用试剂 ! ! 坐：! 坠竖堕! 塑! 垫些兰! 堑 试弃i j购于 葡萄糖 酵母膏 脲 玉米浆 二硫苏糖醇 高碘酸 联苯胺 e d t a 等 变色酸、高碘酸钠、硫酸等 上海生工生物公司 北京鼎国生物公司 北京鼎国生物公司 北京鼎国生物公司 上海生工生物公司 北京化工公司 b 京化工公司 宝泰克生物公司 均为分析纯试剂 2 1 3 标准品 赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇均为美国s i g m a 公司产品；丙三醇( g r ) 。 吉林农业大学硕士学位论文紫外诱变及电融合法构建赤搏糖醇高产菌株的研究 2 1 4 培养基 分离培养基：葡萄糖： 5 0 酵母膏： 琼脂粉：2 ( 固体) p h ： 5 o 6 0 斜面培养基：葡萄糖： 2 酵母膏： 琼脂粉：2 ( 固体) d h ： 5 o 6 0 0 5 脲：0 1 m g s o t 7 h ：o ：0 0 5 0 5 脲：0 1 m g s o 。7 h 。o ：0 0 5 发酵培养基：葡萄糖： 3 0 酵母膏：0 5 脲：0 1 m g s 0 4 7 h 2 0 ：0 0 5 p h ： 5 o 6 0 种子培养基：葡萄糖： 2 0 酵母膏：0 5 脲：0 1 m g s o 一。7 h 2 0 0 0 5 p h ： 5 o 6 0 y e p d 培养基：葡萄糖： 2 蛋白胨：1 酵母膏：0 5 k h 。p o 。：0 5 m g s o a 7 也o ：0 0 2 琼脂：2 液体完全培养基：蛋白胨：2 葡萄糖： 2 酵母膏： 1 p h ： 7 2 固体完全培养基：液体完全培养基加2 琼脂粉 再生完全培养基：固体完全培养基加入0 8 m o l 几甘露醇 再生完全培养基软琼脂：液体完全培养基加入0 7 5 琼脂粉 基本培养基；葡莓糖：2 酵母氨基( y n b ) ：0 6 7 m l 琼脂：2 p h ：6 0 再生基本培养基：固体基本培养基加入0 8 m o l l 甘露醇。 上述培养基均为0 1 m p a1 2 1 灭菌2 0 r a i n 。 2 1 5 仪器设备 ( 1 )电热恒温培养箱h g 3 0 3 型 南京实验仪器厂 ( 2 )电热恒温干燥箱h g 2 0 2 型南京实验仪器厂 ( 3 )手提式压力蒸汽消毒锅y x q s g 4 1 2 8 0上海华线医用核子有限公司 ( 4 ) 电热恒温水浴箱 h i v s y北京市长风仪器仪表公司 ( 5 )水浴恒温振荡器p s h z - 3 0 0 江苏太仓市实验设备厂 ( 6 ) 分光光度计7 2 2 型山东高密分析仪器厂 ( 7 ) 恒温水浴锅 h h s y l 卜n i 北京市长风仪器仪表公司 ( 8 )倒置显微镜 n i k o n 日本 ( 9 )光学显微镜 o l y m p u s 日本 ( 1 0 ) 酸度计p h s 一3 c上海雷磁仪器厂 ( 1 1 ) 高速离心机l 6 1 0 2 4 a北京医用离心机厂 吉林农业大学硕士学位论文 紫外诱变及电融合法构建毒藓糖醇高产菌株的研究 ( 1 2 ) 电子分析天平a l c 一1 1 0 4 ( 1 3 ) 电吹风 r c t _ x t 1 ( 1 4 ) 磁力搅拌器8 5 2 型 ( 1 5 ) 超净工作台s w - c j l f ( 1 6 ) 循环水真空泵 s h b b 9 5 ( 1 7 ) 层析缸 ( 1 8 ) 移液器 2 0 0 1 0 0 0 ul ( 1 9 ) 振荡式恒温培养箱 ( 2 0 ) 电融合仪c r y - 3 型 2 2 实验方法 2 2 1 从样本中分离高渗透酵母菌 德国 广州西特尔电吹风厂 上海仪表( 集团 供销公司 苏净集团安泰公司 郑州长城科工贸有限公司 荷兰进口 哈尔滨市东联机械厂 宁波新芝科器厂 将采来的样本稀释1 0 0 倍，取悬浮液l m 涂布于分离培养基，在3 0 。c 恒温培养3 4 d 后，待长出酵母菌落，挑选出来接种到斜面上，于3 0 培养2 3 d ，置于冰箱保存。 2 2 2 培养方法 采用高渗透性的分离培养基，进行富集培养，在3 0 x 2 下培养2 3 d ，然后进行不同 梯度稀释平板培养分离菌株。”。 2 2 2 1 菌种活化及纯化 从保藏的斜面种子中取- d , 环接入到装有斜面培养基的平板中，画线分离单菌落， 3 0 培养2 4 小时”“。 2 2 2 2 种子培养 接一环活化好的种子于已灭过菌的装有2 5 m 1 种子培养基的l o o m l 三角烧瓶中， 3 0 。c ，1 2 0 r p m m i n ，置于振荡式恒温培养箱中，培养2 小时”。 2 2 2 3 细胞培养 种子培养好后，按接菌量5 ，接入已灭过菌的装有2 5 0 m 1 液体完全培养基的5 0 0 m l 三角烧瓶中，在3 0 条件下，1 8 0 r p m m i n 摇床培养2 4 小时口6 1 。 上述操作均在无菌条件下进行。 2 2 3 菌种发酵培养 在发酵培养液中( 在2 5 0 m i 三角瓶中装液量为2 0 r a l ) 接一环斜面菌种，于3 2 。c 、 1 8 0 r p m 下摇瓶振荡培养三天，按接种量5 移种于同一发酵培养液中( 5 0 0 m l 三角瓶中装 液量为5 0 m 1 ) ，于3 2 。c 、1 8 0 r p m 下摇瓶震荡培养三天取出发酵液分析。 2 2 4 菌种初筛 ( 1 ) 采用高渗透性的分离培养基，进行选择性筛选。 吉林农业大学硕士学位论文 紫外诲变及电融合法构建赤藓糖醇高产菌株的研究 ( 2 ) 将所分离的高渗透性酵母进行细胞形态观察，用乳酸棉兰染色”，显微镜下 观察，选出带有菌丝体的假丝酵母。 ( 3 ) 将保存到斜面上的假丝酵母接种在发酵培养基中，于3 04 c 摇瓶培养6 d ，然后 1 0 8 灭酶3 0 m i n ，6 0 0 0 r p m 离心l o m i n ，取上清液，用薄层层析标准板初步定性糖醇的 种类并确定其含量o ”。 2 2 5 菌种复筛 ( 1 ) 将初筛得到的几株产赤藓糖醇的菌株进行摇瓶发酵，发酵方法采用2 2 3 。 ( 2 ) 用薄层层析定性定量方法确定三株产赤藓糖醇的菌株，进行紫外诱变选育较高 产量的赤藓糖醇菌株时作为出发菌株。 ( 3 ) 紫外诱变获得的较高产菌株作为亲本，采用原生质体电融合法构建一株高产赤 藓糖醇菌株，并进行发酵工艺条件的初步摸索。 2 2 6 紫外诱变处理 ( 1 ) 采用1 5 w 紫外灯，在照射前，先开灯预热2 0 m i n ，使波长稳定。然后将3 m l 出发菌株的菌悬液途布在直径为9 c m 的无菌培养皿中，在无菌条件下距紫外灯1 5 c m 、3 0 g i l l 、4 5 c m 处分别照射l o m i n 、2 0m i n 、3 0m i n ，分别进行增殖培养，每隔6 h 后，经光 复活，再处理，反复次数不同，处理后的菌悬液按浓度梯度稀释。 ( 2 ) 吸取1 0 一、1 0 一、1 0 。7 浓度的照射后的细胞培养稀释液分别涂布于盛有y e p i ) 培 养基的平皿中，避光条件下，3 2 。c 培养4 8 7 2 小时。挑取符合条件( 致死率8 0 以上) 的大小不同菌落进行中间培养后，保存到斜面培养基上”。 2 2 7 原生质体电融合 原生质体融合就是把二个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，使在高渗环境 中释放出只有原生质体膜包被着的球状原生质体，然后将二个亲株的原生质体在高渗条 件下混合，在一定条件下，使它们相互凝集，通过细胞质融合，接着发生二套基因组之 间的接触、交换，从而发生基因组的遗传重组，就可以在再生细胞中获得重组子“1 。 电融合过程首先是原生质体在电场中极化成偶极子并沿电力线排列成串，然后在短 时间强电场( 高压脉冲电场，场强为k v c m 量级，脉冲宽度为l as 量级) 的作用下。原 生质体膜发生可逆性电击穿，瞬时地失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟内恢复 原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时即可诱导它们的膜相互融合，从而 导致融合的发生3 。此法直观、定向、高效。 2 2 7 1 菌体前处理 ( 1 ) 从两亲本菌种斜面各挑取一环菌种分别接种于装有5 0 m 完全培养基的2 5 0 m l 三角瓶中，3 2 震荡培养2 4 小时。 重! ! ! 坠查兰堡主兰堡笙奎 苎盐堡壅墨皇壁鱼鲨塑垄查茎塑曼壹兰堕鳖箜兰查 ( 2 ) 分别取出l m l 菌液，用无菌水离心洗涤一次，用装有9 m l 无菌水的试管稀释至 l o 。 ( 3 ) 分别取1 0 。3 菌液0 1 m l ，于完全培养基平板上，用玻璃刮棒进行涂布，于3 0 。c 培养4 6 天。 ( 4 ) 取出平板，分别挑取生长的菌落接种于斜面培养基上进行保存。 2 2 7 2 生长曲线的测定 按5 的接种量接入完全培养基，3 2 。c 培养，用7 2 2 分光光度计( 6 7 0 n m ) ，每隔2 小时测一次。测定时的菌体用无菌水离心洗涤一次，洗去其他杂质，用无菌水溶液为原 菌液浓度，以无菌水为空白，进行吸光度的测定。 2 2 7 3 菌体前培养 从两亲株新鲜斜面菌分别取一环接入装有液体完全培养基的试管中，3 0 。c 振荡培养 1 8 h ，分别取l m l 菌液接入装有2 0 m l 液体完全培养基的2 5 0 m 1 锥形瓶中，3 09 c 振荡培养， 培养至细胞进入对数生长期。 2 2 7 4 总菌数测定 ( 1 ) 取菌液用无菌离心管离心洗涤一次，将菌体悬浮于无菌水中，振荡均匀，取 0 5 m i ，用无菌水稀释至1 0 1 。 ( 2 ) 取1 0 一、1 0 。6 、1 0 1 稀释度菌液各0 1 m l ，于相应编号的完全培养基平板上( 每 个稀释度做三个平板) ，用玻璃刮棒进行涂布，进行总菌数测定。 2 2 7 5 原生质体制备 ( 1 ) 分别取对数生长期菌体离心( 4 0 0 0 转分1 0 分钟) 收集菌体，用无菌水离心 ( 4 0 0 0 转分，1 0 m i n ) 洗涤菌体二次，尽可能除去杂质。 ( 2 ) 将菌体分别悬浮于蜗牛酶液中，在一定的温度下反应，随时用显微镜观察细 胞形成原生质体情况。 2 2 7 6 原生质体形成率和再生率测定 ( 1 ) 分别吸取0 5 m l 菌液( 经酶处理) 放入4 5 m l 高渗缓冲液中。 ( 2 ) 经高渗缓冲液稀释至1 0 “；取1 0 1 、1 0 一、1 0 “稀释度菌液各0 1 m l ，于相应编 号的再生完全培养基平板上，迅速倒入冷却至3 0 4 0 。c 的再生完全培养基软琼脂，进行 再生培养基上的总菌数测定。 ( 3 ) 分别取0 5 m l 菌液( 经酶处理) 至无菌水试管中，稀释至1 0 一。 ( 4 ) 取1 0 一、1 0 、1 0 。5 稀释度菌液各0 1 m l ，于相应编号的完全培养基平板上，进 行经酶处理未脱壁菌数测定。 ( 5 ) 根据未经酶处理总菌数、再生培养基平板上总菌数和经酶处理后完全培养基 吉林农业大学硕士学位论文 紫外诱变及电融合法构建赤藓糖醇高产菌株的研究 上剩余菌数计算原生质体形成率及再生率。 原生质体再生率( ) = a b c 1 0 0 原生质体形成率( ) = a b d 1 0 0 = a b d b x l 0 0 a ：再生培养基平板上总菌数； b ：经酶及低渗处理后剩余菌数； c ：原生质体数； d ：未经酶处理细胞总数； 2 2 7 7 电场诱导原生质体融合 ( 1 ) 取两亲本原生质体各2 m l ，以1 ：l 比例混合于灭菌小试管中，离心弃上清液 ( 除酶) ，用电脉冲缓冲液离心洗涤一次，原生质体浓度为1 0 8 1 0 。m r l 左右。 ( 2 ) 用无菌移液器取少量混合原生质体悬浮液，于电极杯或融合室中，然后接通 融合仪，先用交变电流使原生质体形成沿电力线方向排列成串的偶极子，接着加上高压 直流脉冲瞬间击穿相邻的原生质体质膜，发生融合。 ( 3 ) 将小池置于倒置显微镜的载物台上，接通成串高频电场及高频电流，持续几 分钟，经电解质电泳使原生质体形成稳定的串珠状。 ( 4 ) 接通直流融合电流，输入单个脉冲，作可逆电击穿，触发原生质体融合。将 融合小池取下，放入无菌操作台内，静止1 5 m i n ，将原生质体融合液洗下，倾入再生完 全培养基，倒入3 0 4 0 。c 软琼脂，3 2 c 培养4 6 天。 ( 5 ) 计算再生菌落数和再生率，并从完全再生培养基上分离融合体。 2 2 7 8 融合予检出 ( i ) 挑取平板上生长的菌落，分剐接种于完全培养基平板上，3 2 培养4 6 天， 进行产物测定。 ( 2 ) 计算融合率 融合率( ) = a b 1 0 0 a ：融合子数； b ：完全培养基平板上再生原生质体数。 2 2 8 检测分析 2 2 8 1 残余葡萄糖含量测定( d n s 法) ( 1 ) 将少许分析纯葡萄糖烘干恒重，取出后放在一个小干燥器内，冷却。准确称重 2 0 0 m g 葡萄糖，用蒸馏水溶解、稀释，并定容到1 0 0 m l ，即含葡萄糖为2 0 m g m l 。 ( 2 ) 取9 支血糖管，分别依次加入葡萄糖溶液，在上述试管中分别加入2 0 m l3 ，5 一二硝基水杨酸溶液，充分混合，沸水浴反应2 m i n 进行显色，迅速冷却，各加入蒸馏 亘签壅些查兰堡圭堂竺堡壅 苎丛堡壅墨皇壁鱼鲨塑蕉查苎塑壁堕兰堕堡塑塑塞 水8 m l ，在5 4 0 h m 波长处测定其吸光度。以2 o m l 蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色 作为空白调零点。以葡萄糖含量( m g ) 为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 ( 3 ) 分别取样品2 o m l ，加入2 o m l 3 ，5 一二硝基水杨酸溶液，其余操作均与制作 标准曲线时相同。测定后，取样品平均值在标准曲线上查出相应的糖量”73 。 2 2 8 2 赤藓糖醇定性 将薄层板用剪刀剪成5 c m 7 c m 大小，放入干燥箱1 0 5 。c 活化1 5 m i n 后，置于干燥器待用。 ( i ) 取浓度为0 4 m g m l 的待测溶液依次点在薄层层析板上，点样量为1ul ，经展 开剂展开，显色剂充分显色，然后用制作好的薄层标准板初步定性定量。 ( 2 ) 将赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖酵标品及样品分别溶于甲醇溶液中， 浓度均为0 4 m g m l ( 样品除外) 。 ( 3 ) 配制专用醇类显色剂。 ( 4 ) 点样：点样距底边1 c m 左右，边点样边吹干，点样点直径不超过2 r r 。 展开：先将展开剂倒入层析缸中使之饱和，再将薄层板置于层析缸进行展开，展开剂前 沿到距板l c m 时停止展开，记录展开时间和展开剂前沿位置。 ( 5 ) 显色：经展开过的薄层板自然晾干后，快速浸入盛有显色剂i 的容器中，取出、 晾干后置于显色剂l i 中，快速取出后6 0 c 加热烘干使之显色。”。 2 2 8 3 赤藓糖醇定量 ( 1 ) 将少许赤藓糖醇标品放在小表面皿放入干燥箱内，7 0 ，于燥2 小时，取出后放 在一个小干燥器内，冷却。准确称重l o o m g 赤藓糖醇，用蒸馏水溶解、稀释，并定容到 1 0 0 m l 。 ( 2 ) 在5 0 m l 的容量瓶中，分别依次加入( 0 、0 2 、0 4 、0 ，6 、0 8 、t o m l ) 赤藓 糖醇标准溶液，加入l o m o l m 硫酸溶液0 5 m l ，摇匀，加入0 i m o l m l 的高碘酸2 5 m l 进行反应，然后加入i m o l m l 的亚砷酸钠( 氯化亚锡) 2 5 m l 终止反应，用水定容至刻 度，取上述混合液i m ，加入l o g l 的变色酸试剂5 m l ，沸水浴反应1 5 m i n ，冷却至室温 后用分光光度计于5 7 0 h m 下测定其吸光度。以1 o m l 蒸馏水按同样方法显色作为空白调 零点。以赤藓糖醇含量( g ) 为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 ( 3 ) 取适当稀释样品l m ，其余操作均与制作标准曲线时相同，测定后，按光吸收 值与标准样品浓度的回归方程计算钏。 9 吉林农业大学硕士学位论文 紫外诱变及电融合法构建赤藓糖醇高产菌株的研究 第三章结果与分析 3 1 耐高渗酵母产赤藓糖醇菌株 由于采用的分离培养基中葡萄糖浓度高达5 0 ，这样在培养基上长出的菌将是耐高 渗透性的。本研究从各样品中共分离得到耐高渗透压菌株近3 0 0 株，对这些菌株进行摇 瓶试验后，离心取发酵液进行薄层层析，发现有3 株菌株产赤藓糖醇，同时有微量副产物 ( 甘油) 产生。经紫外诱变获得两株较高产赤藓糖醇菌株u v - l 一4 、u v f 一9 ，进行原生 质体电融合后得到一株高产目的菌株u v l 4 一f 9 ，比原出发菌株产量扩大3 6 1 倍。发酵 液的薄层层析图见图1 、2 。 1 多元醇混台标样；2l - 4 ；3l 一9 ；4f - 9 ；5u