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上海海洋大学硕十学位论文 中国沿海5 个不同地理群体长蛸的遗传多样性研究 摘要 长蛸( o c t o p u sv a r i a b i l i s ，s a s a k i19 2 9 ) 隶属于头足纲( c e p h a l o p o d a ) 、八腕目( o c t o p o d a ) 、 蛸科( o c t o p o d i d a e ) 、蛸属( o c t o p u s ) ，在我国南北沿海的渤海、黄海、东海、南海和朝鲜西 海岸以及西太平洋的日本列岛海域。长蛸蛋白质丰富，含脂率高，长蛸不仅有很高的食用价值， 也有相当的药用价值，是一种重要的经济头足类。目前，在沿海地区己逐渐开展了长蛸的人工 养殖。本文主要对分布于中国沿海的5 个地理群体长蛸的遗传分化、群体遗传多样性以及不同 群体之间的遗传分化及亲缘关系进行了研究，以期为长蛸的种质资源保护、群体演化关系的分 析、品种的选育以及开发利用提供理论依据。 对我国沿海5 个自然群体长蛸的线粒体细胞色素氧化酶亚基i ( c o i ) 部分序列进行了测定 和分析，经比对获得6 5 8 b p 核苷酸片段，其中碱基t 、c 、a 和g 的平均含量分别为3 7 0 2 、 1 8 4 6 、3 0 1 5 和1 4 3 5 ，a t 的含量明显高于g c 的含量。5 个自然群体的长蛸中共发现1 8 个变异位点，得到1 5 个单倍型，包括4 个共享单倍型，其中青岛群体的核苷酸差异数k 以及平 均核苷酸多样性指数p i 最高，烟台群体最低；群体间，青岛群体在群体间核菅酸差异数k 、群 体间平均每位点核苷酸替代数d x y 和群体间每位点净核苷酸替代数d a 三个指标上都表现出比 其它群体之间较高的水平，说明青岛群体具有最为丰富的遗传多样性。m e g a3 1 软件计算5 个群体间的k i m u r a2 - p a r a m t e r 遗传距离，大连群体和青岛群体之间的遗传距离最远为0 0 0 7 7 ， 而大连群体与烟台群体之间的遗传距离最低，为0 0 0 2 9 。a m o v a 分析表明，五群体间总遗传 分化系数f s t = 0 1 7 4 1 0 ( p 3 4 ，腕吸盘2 行。雄性右 侧第3 腕茎化，甚短，仅约为左侧对应腕长度的二分之一，端器匙形，大而明显， 约为全腕长度的六分之一；舌叶长，为腕长的1 7 1 4 ，顶端圆，凹槽深，具1 0 1 4 个横脊；交接基相对较大，圆锥形，顶端钝。 1 3 生活习性及生活史 长蛸为暖温性肉食动物，主要栖居于温带偏南海域，在内湾和内海生活，栖 息水深至2 0 0 m ，是盐卤性海滩动物区系中的重要成员，在较多淡水注入的海滩很 少见踪迹。食性凶猛，夜间摄食，食物种类较广，主要摄食虾、蟹、贝、鱼类等， 尤其以虾、蟹较多，也摄取多毛类为饵料；暂养长蛸在饵料不足时，会出现自食 现象，通常以自食腕尖为主，偶尔有自食整条腕，甚至自食内脏。长蛸主要营底 栖生活，在繁殖期间有短距离的洄游移动。在深浅水间的集群与洄游不明显，而 在内湾和内海潮问带的上下移动比较显著。冬季在朝下带泥中深潜，春季水温上 升，渐向干潮线以上移动，夏秋季更向上移动，可上至潮间带中区；晚秋水温下 4 上海海洋人学硕+ 学位论文 降，又渐向潮下带移动。 在山东青岛沿岸的繁殖期约为4 6 月。生活场所多为泥底，以长而有力的腕部 挖穴栖居，岩礁间也有采获，在沙砾油底较少发现。长蛸雌体怀卵量一般在1 4 0 1 6 0 个左右，卵子分批成熟，分批产出，雌性通常将卵产在洞穴内，孵化前的卵子略 成长茄形，卵径2 1 0 2 2 i m m x 7 0 7 9 m m 。刚孵出的稚仔，全长3 0 m m 左右，与成 体特征已很接近，生长迅速，半年后全长可达2 0 0 m m 。 1 4 渔业 长蛸为次要经济种，年产约1 0 0 t ，在日本本州岛为重要的经济渔业。在我国 黄渤海也有一定的产量，是小型渔业的捕捞对象。肉质较硬，鲜食较干，干制较 佳。由于生命力较强，多用作捕鲷类、鳗鱼、鲨鱼和其他经济鱼类的重要饵料。 渔场比较零星，主要在我国的黄渤海、日本的濑户内海和朝鲜西海岸。挖捕和定 置网的渔期在春季；青岛胶州湾内的钓捕长蛸渔业，渔期在秋冬季，主要以大眼 蟹为饵料，夜间作业。 2 长蛸的理论研究和经济价值 2 1 理论研究 目前，有关长蛸的研究主要集中在生物学、人工育苗与养殖、渔业资源和生 理生化及组织学的研究上，分子遗传学方面的研究较少，有关长蛸群体遗传特性 的研究未见报道。 吴常文等【l 】对长蛸的钻穴、摄食等行为习性以及对干露、温度、盐度、p h 、 溶氧等的耐受性进行了研究，研究发现长蛸具有很强的环境适应能力，对胁迫条 件的耐受能力高。 郑志峰，刘瑞义等【2 3 】分别进行了长虫| i 的网箱养殖和装瓶养殖技术的研究，探 索了长蛸的养殖模式，取得了较好的经济效益。 v i l l a n u e v a 等【4 】对长蛸进行人工饲养，观察了幼体从孵化到定居阶段的生长情 况；w e l l s 5 】研究了长蛸在周围环境氧气缺乏时对呼吸的控制和心脏的反应；r i a d 6 1 报道了地中海水域长蛸的胚胎发育；o g d e n 7 】讨论了角质颚在属间分类上的作用； c a v e r i v i e r e 8 】报道了温度对塞内加尔长蛸胚胎发育时间的影响。 崔龙波等【9 】以组织学和组织化学方法，研究了长蛸的唾液腺和消化腺。结果发 现，前唾液腺腺细胞含团状糖蛋白性质的分泌颗粒。后唾液腺有两种腺管，i 型腺 5 上海海洋大学硕+ 学位论文 管由i 型腺细胞和黏液细胞组成。肝细胞含大量的分泌颗粒，呈现强的蛋白酶及弱 的非特异性酯酶和脂酶活性。胰脏腺细胞呈非特异性酯酶和弱的蛋白酶和脂酶活 性。 高强等【l0 】采用水平淀粉凝胶电泳技术对莱州、烟台和大连三个地理群体的长 蛸等位基因酶的遗传变异进行了研究。通过筛选建立了适合长蛸等位基因酶的水 平淀粉凝胶电泳系统，研究表明长蛸群体呈现出较低的遗传多样性。 迄今为止，由于缺乏有关我国沿海蛸类的遗传学研究资料，无法了解它们的 遗传规律，很大程度限制了遗传育种、种质鉴定、系统分化和资源保护等诸多方 面的研究。因此，对我国沿海蛸类遗传多样性进行研究，了解和掌握其遗传变异 情况、种群之间以及种内的遗传差异程度、群体结构，不仅可以填补我国在此领 域的研究空白，而且对于其资源多样性的保护和管理、合理的开发以及永续利用、 避免过度捕捞都有着相当重要的现实意义和指导价值，同时为其它头足类物种的 遗传学研究奠定坚实的理论基础，并为进一步的育种和遗传改良工作提供理论指 导。 2 2 经济价值 国外对于章鱼的研究较深入，章鱼是含牛磺酸最高、脂肪最低的海洋食品之 一。 蛸类还具有较好的药用价值，据本草纲目记载：“甘成，寒，无毒”， “养血益气 之说，药用鲜肉和干肉，沿海民间用作补益强壮药，催乳，治疟疾 等。目前认为章鱼具有消炎、活血、抗癌等作用。 从蛸类肉的煮汁中，可提取牛磺酸( t a u r i n e ) ，为止虚汗剂和特殊兴奋剂，用 于治疗结核病、关节炎、神经病、腺质病和血液障碍等【1 1 1 。 章鱼视紫质中糖蛋白的n 连接糖链的结构特性与功能是一个很大的发现，现 己用于老人视力障碍的治疗【1 2 】。 章鱼毒素，又称头足毒素( c e p h a l o t o x i n ) ，存在于多种章鱼的唾液腺中。自 从1 9 1 3 年以来许多国外学者对章鱼的唾液腺各种提取物有过多方面研究，现已分 离出酪胺、组胺和章鱼胺等低分子胺类。不同种类的章鱼毒素成分不同，毒性也 不同。章鱼毒素对许多生理系统均有强烈效应，初步认为有希望制成中枢神经系 统药物【1 3 】。 6 上海海洋火学硕七学位论文 3 生物的遗传多样性 3 1 概述 多种多样的生物资源是人类赖以生存的基础，因为人类活动的扩展，以及对 生物资源需求的不断增加，引起了全球环境的逐渐恶化，导致越来越多的物种资 源遭受破坏、物种生存受到了威胁，因此，最大限度地保护生物多样性己经成为 国际社会广泛关注的热点问题。当f j ，世界各国政府及科学家已达成共识，即开 展生物多样性的起源、功能、组成和维持等基础性的研究工作，争取实现对生物 资源的科学管理以及可持续利用。 生物多样性( b i o d i v e r s i t y ) 是指一定空间范围内多种多样活的有机体有规律 的结合在一起的总称，包括陆地、海洋和其它水生生态系统及其所构成的生态综 合体。它涵盖所有不同种类的动物、植物、微生物及其所拥有的基因以及与生存 环境形成的复杂的生态系统【1 4 1 。通常认为，生物多样性有三个水平的多样性，即 生态系统多样性、物种多样性和遗传( 基因) 多样性，其内容涉及了生物多样性 的形成、现状及其评价、生物多样性消失的原因及其深远影响以及生物多样性的 保护与保存等。对于生物多样性的检测和认识，是对生物多样性进行全面系统理 论研究的前提和基础。随着生物科学领域各项技术的进步和完善，生物多样性的 检测手段趋于成熟和多样化，我们可以从不同角度和层次柬揭示物种的变异性。 目前，遗传多样性被认为可能是生物多样性的核心问题。生物种内或种间的遗传 变异，是遗传多样性的基础和物种保持进化潜能的基本条件，而且与生物多样性 的形成、消失和发展有着密切关系。遗传多样性的研究将有助于人们更清楚的认 识生物多样性的起源与进化的问题，为动植物分类及进化研究提供了有益的资料， 并为动植物遗传育种和遗传改良提供依据。因此，遗传多样性研究在生物多样性 研究中己经成为一个发展较快的领域。 遗传多样性在广义上是生物种内或种问在分子、细胞、个体三个水平的遗传 变异度，它不仅指遗传变异程度的高低，而且包括遗传变异的分布格局，即群体 的遗传结构。物种的多样性不能包含基因多样性或遗传多样性的内容，但足物种 的存在与发展是在群体中进行的，个体基因库只有在群体中才能有意义，才能进 行交流，才具有自然选择和进化的价值。 遗传多样性，又称基因多样性，是指种内不同群体之间或一个群体内不同个 体的遗传变异的总和。与物种多样性和生态系统多样性相比，基因的不可视性使 得人们辨别遗传水平的多样性比较困难。但它不仅是生物多样性的重要组成成分， 7 上海海洋人学硕士学位论文 而且是物种多样性和生态系统多样性的基础，也是生命进化和物种分化的基础， 更是评价自然生物资源的重要依据。因为遗传多样性的降低可减低一个物种对环 境改变的适应能力，降低生态系统中物种的丰富度，导致生态系统的崩溃，甚至 物种的灭绝【1 5 】。 我国的海洋生物中有很多特有种或世界珍稀物种，不仅具有世界性的自然保 护价值，而且还是我国人民长期开发利用的重要自然资源。由于开发利用强度的 加剧，我国海洋生物多样性受到了各种威胁，包括过度捕捞、环境污染、生境破 坏和丧失、全球变暖、生态入侵如外来品种有意( 放流) 和无意( 逃逸) 地进入 海区以及养殖品种的单一化，这些可能会使海洋生境彻底丧失，使海洋生物和生 态系统受到严重干扰。许多珍稀海洋生物被毒死或受到了伤害，或者导致基因突 变或因排挤而消失，出现种质同质化，引起经济性状衰退，其利用的可持续性遭 到了严重破坏，从而直接影响到人类的生存。 3 2 遗传多样性研究方法 遗传多样性主要是通过遗传标记的多态性来反映的。而遗传标记( g e n e t i c m a r k e r ) 是指与目标性状紧密连锁，同该性状共同分离且易于识别的可遗传的等位 基因变异，可通过某个形态特征、特异的蛋白质及同功酶带型或特异的d n a 片段 作为目的基因间接或直接的标记形式，来研究基因遗传和变异规律。在经典遗传 中，遗传多态性是指等位基因的变异，在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组 中任何座位上的相对差异。遗传标记是随着分子生物学技术的发展而出现的遗传 学标记技术，它突破了形态和细胞水平上遗传标记的局限性，发挥着独特的优势。 自8 0 年代d n a 聚合酶链式反应( p c r ) 技术出现后，r a p d 、a p l p 和微卫 星d n a 等分辨率更好、信息量更大的分析技术相继出现，这些技术一般都是通过 电泳后以一定的方法来检测某种变异特征的d n a 片段来分析遗传变异情况。遗传 标记技术目前已出现了几十种，同工酶、m t d n a 、r f l p 、s s r 、r a p d 、a f l p 等 分子标记技术应用广泛，在物种分类与鉴定、物种遗传多样性及系统演化研究、 基因定位与克隆、标记辅助选育、遗传图谱构建等方面都得到广泛应用。 遗传标记的发展经历了形态标记( m o r p h o l o g i c a lm a r k e r ) 、细胞学标记 ( c y t o l o g i c a lm a r k e r ) 、生化标记( b i o c h e m i c a lm a r k e r ) 及分子标记( m o l e c u l a r m a r k e r ) 四个阶段。 上海海洋人学硕士学位论文 3 2 1 形态标记 形态标记是指生物的外部特征特性，包括质量性状和数量性状做遗传标记。 它是与目标性状紧密连锁，表型上可识别的等位基因突变体。广义的形态标记还 包括那些借助于简单测试即可识别的某些性状如生理特性、生殖特性、抗病特性 等等。形态标记对经典遗传学的建立具有重要的意义。1 8 6 5 年，孟德尔通过对豌 豆七种形态标记为基础的杂交试验的结果，提出了“遗传因子 的假说，创建了 遗传学的基本定律分离规律和独立分配规律。1 9 1 0 年，摩尔根通过对果蝇白 眼突变体的研究发现了遗传的连锁规律，并创立了基因学说，把抽象的基因概念 落实在染色体上，从而为遗传标记的广泛应用奠定了基础。 自然界的生物存在着许多非常明显的形态标记，如贝类的贝重、壳长、壳高、 壳宽等，它是最早被使用和研究的一类遗传标记。利用形态标记，从表型上观察 就可选择到与之连锁的目标个体。目前人们已建立了许多物种的形态标记遗传图 谱并在育种实践上得以应用。形态性状是分类学的主要研究手段，早期的生物学 主要是依据形态性状的差异对物种进行分类和描述的【1 6 】，至今依然是生物分类的 主要指标。 形态标记是表型标记，物种的表型受基因型决定，但同时受到环境因素的影 响。生物体就基因因素来说，它存在“一基多效 和“多基一效 的现象，基因 的相互作用更为复杂；就环境因素来说，它也有较大的影响，甚至起决定作用； 并且形态性状大多易受生理因素和发育阶段等影响，有些性状要到个体成熟时才 能表现出来。形态标记的最大缺点在于可用作遗传标记的形态性状相当有限，利 用形态标记检测亲缘关系很近的基因型时往往不能获得令人满意的结果；同时， 由于形态标记数量少，可鉴别标记的基因有限，因而难以建立饱和的遗传图谱。 3 2 2 细胞学标记 细胞遗传学的发展使遗传标记进入了细胞水平，核型分析或染色体组型分析 以及染色体分带技术能够对物种的亲缘关系、起源演化和遗传多样性提供染色体 水平上的遗传标记。细胞标记主要指对处理过的动物个体染色体数目和形态进行 分析，主要包括：染色体核型和带型及缺失、重复、易位、倒位等。这种方法通 过比较细胞分裂时期染色体的形态参数，如相对长度、着丝点指数臂比等将每条 染色体按各自的特征区分开，得到一定的染色体组型。同时染色体显带技术可以 利用差异染色，借助特殊处理，使染色体显示特定的带纹以便进行更细致的染色 体带型分析。根据带型和常规组型的分析的指标识别染色体的异同，这是细胞水 9 上海海洋大学硕士学位论文 平上分类的主要标准。 在同一物种群体的各个个体之间呈现出一定程度的染色体带型差异，在鉴定 品种( 系) 和遗传多样性方面的灵敏度远非一般表型特征观察所能达到。应用染 色体标记技术对近缘物种亲缘关系的分析、系统发育等方面均取得了不同程度的 进展【1 7 】。近年来，用原位杂交( i ns i r eh y b r i d i z a t i o n ) 技术与染色体分带技术相结 合方法研究染色体的基因定位也有不少成功的报道。王泽群等【l8 】用地高辛标记的 鲤鱼基因组d n a 重复顺序c r i 对兴国红鲤的染色体进行原位杂交，将c r i 基因 定位于兴国红鲤一些染色体的着丝粒区。 3 2 3 生化标记 生化标记主要指蛋白质标记，通常可分为酶蛋白质和非酶蛋白质二种，在非 酶蛋白质中，用得较多的是种子贮藏蛋白，在小麦、大麦、玉米、水稻等作物上 的研究工作比较深入。 酶作为遗传标记是在提出了同工酶的概念后迅速发展起来的。同工酶 ( i s o z y m e s ) 是指具有相同催化功能而结构及理化性质又不同的一类酶，其结构差 异来源于基因类型的差异，并不一定是同一基因的产物。每一个酶的不同的酶谱 表现型可能是由于不同的基因座引起，也可能是同一基因座上的不同的等位基因 引起的，后者又叫等位酶( a l l o z y m e s ) 。蛋白质是基因表达的产物，本质上仍是 表型标记，但与形态性状、细胞学特征相比，数量上更丰富，受环境影响更小， 能更好地反映遗传多态性。 同工酶技术是生物化学和分子生物学不断发展的产物。1 9 5 0 年m e i s t e r 报道从 牛心中提取的乳酸脱氢酶l d h 有异质性，两年后n e i l a n d s 证实结晶的l d h 有两 种类型1 9 5 7 年h u n t e r 和m a r k e r ( 发明了酶谱技术。即将凝胶电泳与组织化学染色 方法相结合鉴定分离酶类，这种技术的特点是对多种酶的同工酶的鉴定具有很强 的解析能力。它打开了真f 认识同工酶的大门，促进了各国学者对同工酶的广泛 研究。由于同工酶是d n a 编码的蛋白质的表现形式，因此对它们的分析可以判断 生物种群繁育系统的性质，尤其适合对种群遗传结构进行分析，了解种群内外乃 至种间的遗传多样性。若结合生态条件进行分析，则还可了解生物适应环境的遗 传学基础。因此，同工酶的研究对于重建系统发生的关系，对生物多样性的保护 和研究，对生物种质资源的调查和利用，都有一定的意义。尤其是对了解濒危动 植物、遗传污染动物及养殖退化种类的遗传结构，提出有效的保护和复壮方案将 起到重要的作用。 1 0 上海海洋大学硕+ 学位论文 同工酶标记已被广泛应用于水生生物种群遗传结构分析【i9 】、原种鉴别和系统 分类【2 0 1 、个体发育分化【2 1 1 以及杂交子代分析【2 2 】等等；用同工酶标记进行连锁图谱 的构建在d n a 分子标记出现之前也有广泛的应用，f o l t z 等1 2 3 j 用同工酶标记建立 了牡蛎( c r a s s o s t r e av i r g i n a c a ) 的两个连锁群，分别含有4 个和3 个标记，其它如 罗非鱼、鲇鱼、鳟鱼、剑鱼等都有同工酶遗传图谱的报道【2 4 _ 5 1 。当然，用同工酶 标记建立的遗传图谱含有的标记非常有限，与用分子标记建立的图谱无法相比。 至今已经发展了5 7 种酶系统，大约可鉴定1 0 0 个左右的基因座位，但对某个 特定的物种，仅有1 0 - 2 0 种同工酶，大约3 0 4 0 个等位基因表现多态性，这样的数 目不能完全满足标记辅助育种、饱和遗传图谱构建等需要。 3 2 4 分子标记 分子标记主要指d n a 标记，d n a 标记是d n a 水平上遗传多态性的直接反映， d n a 水平上的遗传多态表现为核苷酸序列的差异，甚至是单个核苷酸的变异。十 多年来，在人类基因组研究计划( h u m a ng e n o m ei n i t i a t i v e ，h g i ) 的推动下，分 子标记的研究与应用得到了迅速的发展。 与上述3 种标记相比，分子标汜具有以下优越性： ( 1 ) 直接以d n a 的形式表现，无表型效应，不受环境限制和影响等； ( 2 ) 数量极多，遍及整个基因组； ( 3 ) 多态性高，自然存在许多等位变异，一般不需要专门创造特殊的遗传材 料； ( 4 ) 表现为“中性 ，即不影响目标性状的表达。 目前d n a 标记已广泛应用于种质资源研究，遗传图谱构建、目的基因定位和 分子标记辅助选择等各个方面。 表1 - 1 常h j 分子标记技术 t a b l - 1t h em a i nt y p e so f d n a m o l e c u l a rm a r k e r s 以s o u t h e r n 杂交为基础的分子标记技术 限制性内切酶片段艮度多态性标记( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 单链构象多态性r f l p ( s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m r f l p ，s s c p r f l p ) 变性梯度凝胶电泳r f l p ( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s - r f l p ，d d g g e r f l p ) 原位杂交( ns t uh y b r i d i z a t i o n ) 以p c r 为基础的分子标记技术 随机扩增多态性d n a ( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a , r a p d ) 上海海洋人学硕士学位论文 序列标记位点( s e q u e n c et a g g e ds i t e ，s t s ) 序列特征化扩增区域( s e q u e n c ec h a r a c t e r e da m p l i f i e dr e g i o n ，s c a r ) 技术 随机引物p c r ( r a n d o mp r i m e r - p c r , r p - p c r ) 任意引物p c r ( a r b i t r a r yp r i m e r - p c r , a p - p c r ) 寡核营酸引物p c r ( o l i g op r i m e r - p c r , o p - p c r ) 单链构象多态性p c r ( s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m p c r , s s c p - p c r ) 小核苷酸d n a 分析( s m a l io l i g od n aa n a l y s i s ，s o d a ) d n a 指纹技术( d n af i n g e r p r i n t i n g ，d a f ) 扩增片段艮度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) g 1 ) 相关序列扩增多态性( s e q u e n c e - r e l a t e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ，s r a p ) 靶位区域扩增多态性( t a r g e tr e g i o na m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ，t r a p ) 插入缺失多态性( i n s e r t i o n d e l e t i o np o l y m o r p h i s m ，i n d e lo r 加) 以重复顺序为基础的标记技术 卫星d n a ( s a t e l l i t ed n a ) ：重复单位为几百至几千碱基对 微卫星d n a ( m i c r o s a t e l l i t ed n a ) ：重复单位为2 5 个碱基对 小卫星d n a ( m i n i s a t e l l i t ed n a ) ：重复单位大予5 个碱基对 简单重复序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) 或简单序列k 度多态性( s i m p l es e q u e n c el e n g t h p o l y m o r p h i s m ，s s l p ) 短重复序列( s h o r tr e p e a ts e q u e n c e ，s r s ) 串珠式重复序列( t a n d e mr e p e a ts e q u e n c e ，t r s ) 以m r n a 为基础的分子标记技术 差异显示( d i f f e r e n t i a ld i s p l a y , d d ) 逆转录p c r ( r e v e r s ew a n s c r i p t i o n ) 差异显示逆转录p c r ( d i f f e r e n t i a ld i s p l a yr e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r , d d r t - p c r ) 特征性分析( r e p r e s e n t a t i v ed i f f e r e n c ea n a l y s i s ，r a d ) 表达顺序标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et a q s ，e s t ) 序标位( s e q u e n c et a g g e ds i t e s ，s t s ) 基冈表达系列分析技术( s e r i a la n a l y s i so f g e n ee x p r e s s i o n ，s a g e ) 以单核苷酸多态性为基础的分子标记技术 单核茴酸多态性( s i n