维生素的测定ppt课件.ppt

第三章维生素的测定,维生素广泛存在于各种生物体中，其种类繁多，化学结构与生理功能各异。因此无法按照结构或功能分类。按其溶解性可分为脂溶性(VA、VD、VE、VK)和水溶性(VBl、VB2、VB6、VBl2、VP、VPP、Vc)两大类。,1,维生素是人体生命活动不可缺少的营养物质，它们一般在动物和人体内不能合成或合成数量少，满足不了动物和人体的需要，必须依靠从食物中摄取。在食物中缺乏了任何一种维生素，人和动物都会发生特有的缺乏症状，如缺乏维生素A、B和C时，可分别引起夜盲症、脚气病和坏血病等，严重时足以致命。某些维生素含量的高低，是评价农产品品质的重要指标之一。,2,维生素是维持人体正常生理功能所必需的一类有机化合物。维生素按其溶解性可分为：水溶性维生素抗坏血酸（Vc）具有酸性和强还原性，水果中柑橘、柠檬含量较高，为40-50mg%，红果和枣的含量更高，枣中540mg%。,3,硫胺素（VB1）缺少，则神经组织功能不足，可出现相应的神经肌肉症状如多发性神经炎、肌肉萎缩及水肿。谷类、豆类及肉类含量较多，动物性食品中以肝、肾、脑含量较多。核黄素（VB2）需要量与能量代谢有关。动物性食品比植物性食品含量高，肝脏达2mg/100g烟酸（Vpp）可预防癞皮病发生。含量最多的是蘑菇、酵母等，肝脏为10mg/100g。叶酸叶酸为各种细胞生长所必需。动物肝脏、豆类、各种绿叶蔬菜和水果含量较多。,4,维生素B6可帮助糖类、脂肪和蛋白质分解、利用，也帮助糖元由肝脏或肌肉中释放热能。蛋黄、肉、鱼、乳，以及谷类、种子外皮、蔬菜含量丰富。维生素B12唯一含金属（钴）的维生素，机体中含量降至0.5mg/100g左右便会出现贫血，即恶性贫血。主要来源为肉类，以内脏、鱼类、蠔类及蛋类为多。泛酸（VB3）与糖类、脂肪和蛋白质代谢有密切关系。广泛存在于动、植物食品中。生物素参与体内的固定CO2（羧化）和转羧基作用。分布广泛，肠道细菌亦能合成。,5,脂溶性维生素VA具有促进正常生长与繁殖、维持上皮组织与视力正常的生理功能。只存在于动物性食品中，肝、肾鸡蛋、鱼卵和全奶等。植物则可提供作为维生素A元的类胡萝素或胡萝卜素，如菠菜、胡萝卜、红心甘薯、辣椒，以及水果如杏、柿子等。VD人体VD的主要来源并非食物，而是皮下7-脱氢胆固醇经紫外线照射转变而来。海水鱼的肝脏含量最为丰富。,6,VE具有抗氧化的功能，与机体的抗衰老有关。人体所需大多来自谷类于植物油。VK作用主要是促进肝脏生产凝血酶原，从而具有促进凝血作用。绿叶蔬菜含量最为丰富，蛋黄、大豆油和猪肝也是良好来源。,7,维生素的分析是一项比较复杂的工作。其样品分析的一般程序是：用酸、碱或酶分解样品，使其中的维生素游离出来；用溶剂进行提取；分离干扰物质，对样液进行分离提纯；用适当的方法进行定量等。维生素的分析方法很多，选用方法时应根据样品的品种、类型、待测维生素的性质、含量以及干扰物质多少等因素来决定。下面重点介绍维生素C、维生素B1和B2以及作为维生素A原的-胡萝卜素的测定。,8,一、维生素C的测定,维生素C又称抗坏血酸。（1）纯品为白色无臭结晶，熔点为190192。（2）溶于水或乙醇中，不溶于油剂。（3）在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件下较稳定。,9,10,11,总抗坏血酸包括还原型、氧化型抗坏血酸和2,3-二酮古乐糖酸。Vc测定主要有：测定还原型Vc和氧化型Vc的总含量（如荧光法，2,4二硝基苯肼法、高效液相色谱法等)及还原型Vc测定法(2,6二氯靛酚滴定法，电位滴定法，碘滴定法，钼蓝比色法，碘酸钾萃取分光光度法等)两类,其中,有些方法既可测定Vc全量,也可测定还原型Vc,如酶法。,12,高效液相色谱法、荧光法要求样品的纯度较高，高效液相色谱法可以同时测得抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的含量，具有干扰少，准确度高，重现性好，灵敏、简便、快速等优点，是上述几种方法中最先进、可靠的方法，但需要有昂贵的仪器，目前尚无法普遍采用。,13,2.6-二靛酚滴定法测定的是还原型抗坏血酸，该法简便，也较灵敏，但特异性差，样品中的其他还原性物质(如Fe2+、Sn2+、Cu2+等)会干扰测定，使测定值偏高。对深色样液滴定终点不易辨别，如山楂，树莓，草莓等。,14,2,4-二硝基苯肼比色法和荧光法测得的是抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量，操作麻烦，耗时较长。但也易受色素影响,当待测液本身有颜色时,消光值会受到影响,从而影响到测定结果的准确性。,15,钼蓝比色法则不然,该法不易受样品提取液颜色的影响。紫外分光光亮法是操作简便，不受样品提取液颜色的影响，但是重复间偏差较大。碘滴定法不适于花青素含量高的果蔬样品Vc测定。,16,17,18,19,20,（一）还原型维生素C的测定,维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。在食品中，这三种形式均有存在，但主要是前两者，故许多国家的食品成分表均以抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量表示。,21,22,1、方法原理抗坏血酸(Vc)结构中有烯二醇存在，因此具有还原性，能将蓝色染料2，6-二氯靛酚还原为无色的化合物，Vc则被氧化为脱氢Vc，反应式如下：,23,2,6-二氯靛酚具有酸碱指示及氧化还原指示的两种特性。氧化态时呈深蓝色(碱介质中)或浅红色(酸性介质，变色范围pH45)，还原态时为无色。根据这个特性用碱性蓝色染料的标准溶液滴定植物样品酸性浸出液中Vc到刚变浅红色为终点，由染料的用量即可计算Vc的含量。滴定终点的红色是刚过量的未被还原的(氧化型)染料溶液在酸性介质中的颜色。,24,2、注释,（1）偏磷酸是Vc的最佳稳定剂，且具有沉淀蛋白质的作用。但其价格较贵，在室温下放置易转化为正磷酸，降低对Vc的稳定性。草酸廉价易得,有与磷酸相近的稳定性。而醋酸适于浸提含有Fe2+的样品。根据Vc在酸性溶液中相对较稳定这一特性，历来采用的提取剂都是各种各样的酸性溶液,现在一般采用的主要是2%偏磷酸、2%草酸溶液，其次是8%醋酸、10%三氯乙酸及偏磷酸-醋酸混合液。,25,26,27,(2)所用的提取剂草酸、标定Vc用的碘酸液以及标准Vc液均不稳定，须避光、低温保存。碘酸液以贮备液保存（较高浓度，0.1molL-1）。Vc临用临配，不能加热配制。(3)样品采取后，应浸泡在已知量的2草酸溶液中，以防止抗坏血酸氧化损失。测定时整个操作过程要迅速，防止抗坏血酸被氧化。,28,(4)KIO3与还原Vc的主要反应如下：从上述反应式可知1mol(1/6KIO3)与1mol(1/2C6H8O6)完全反应，故1/2C6H8O6的摩尔质量为88gmol-1。,29,(5)2,6-二氯靛酚固体试剂有时含有分解产物，染料溶液长久贮存时也会生成分解主物，从而使滴定终点不敏锐，因此应在使用前检查。检查方法：取15mL染料溶液加入过量的Vc溶液，若还原后的溶液带有颜色，表示此溶液已不能使用。保存在棕色瓶和冰箱中。,30,(6)使用白陶土时，要对每批新的白陶土测定对Vc的回收率。(7)样品中可能有其它还原性物质也可使染料还原。但其还原染料的速度较慢，故滴定终点以浅红色在15s不褪色为准。(8)本法适用于测定还原型抗坏血酸，不适于有亚铁、亚锡、亚铜、亚硫酸盐或硫代硫酸盐共存的样品。,31,(9)样品切碎、缩分及称量等过程会使样品切口接触空气而促进维生素C氧化，应尽量动作迅速,Vc提取液对光敏感，操作室内应设置窗帘，以防加速Vc氧化。(10)所有试剂最好用重蒸馏水配制。(11)标定靛酚滴定液时与滴定样品液时，滴定终点的掌握应严格一致，否则将引起误差。(12)测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积。,32,(13)Vc的含量随样品个体或部位的不同差别很大，因此测定Vc时取样的代表性尤为重要。测定样品平均含量时，一般至少取均匀个体5个以上，纵切分成48等分，再分别取对角的2-4片，切碎，充分混合后四分法分取样。(14)滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考。(15)在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消除。（16）还原型Vc含量（mg.kg-1）100允许误差（mg.kg-1）5.0，100-1000允许10.0,33,（二）维生素C总量的测定(2，4二硝基苯肼比色法),1、方法原理：Vc总量包括还原型Vc、脱氢型Vc和二酮古乐糖酸，将样品中的还原型抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，进一步水解为二酮古乐糖酸。二酮古乐糖酸与2,4-二硝基苯肼耦联生成红色的脎。其呈色的强度与二酮古乐糖酸浓度成正比，可以比色定量。,34,2、操作步骤,称样加等量2%草酸于高速捣碎机捣碎取匀浆20g用1%草酸定容100ml过滤取滤液10ml加1%草酸10ml加少量活性炭摇1分钟静置过滤各取滤液2ml于样品管和样品空白管各管加入1滴硫脲溶液于样品管中加入2，4-二硝基苯肼0.5ml分别于两个管加盖于37保温箱3小时,35,保温箱3小时取出后样品管放入冰水中样品空白管取出后冷至室温在样品空白管加入2，4-二硝基苯肼0.5ml样品管和空白管都于冰浴中滴加91H2SO42ml于各管中边滴边摇防止温度升高炭化后呈黑色冰浴中取出室温下放置30分钟后，在540nm测消光值，从标准曲线上查出相应的含量。,36,3、注意事项（1）本法为国家标准方法，适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。（2）硫脲可防止Vc被氧化，且可帮助脎的形成，最终溶液中硫脲的浓度应一致，否则影响色度。（3）加入H2SO4(91)溶液后试管从冰水中取出，溶液颜色会继续变深，所以必须准确加入H2SO4后30min内比色(糖存在造成显色不稳定,颜色会逐渐加深)。,37,(4)活性炭对抗坏血酸的氧化作用，是基于其表面吸附的氧进行界面反应，加入量过低，氧化不充分，测定结果偏低，加入量过高，对抗坏血酸有吸附作用，使结果也偏低。活性炭须充分酸化，才能有较强的氧化能力，且具有除色素的双重作用。1molL-1HCl,100g于750ml，煮沸1-2h，沸水洗涤至无Fe2+，烘干。,38,(5)2,4-二硝基苯肼和氧化型Vc藕联形成脎在脱水氧化环境下才稳定。(6)溶液中其他的酮和酮衍生物和2,4-二硝基苯肼也形成脎，故须作空白试验（指没有Vc参与下形成脎的量）。(7)硫脲可防止抗坏血酸继续氧化，同时促进脎的形成。最后溶液中硫脲的浓度要一致，否则影响测定结果。,39,(8)测定波长一般在495540nm，样品杂质多时在540nm较合适，但灵敏度较最大吸收波长(520nm)下的灵敏度降低30。(9)加9:1硫酸溶液时，为防止溶液中的糖炭化而变黑色，需边滴加边摇试管。,40,二、维生素B1、B2测定,VB1又叫硫胺素，VB1是一种重要的维持人体代谢平衡的物质,缺乏时可能引起脚气病、多发性神经炎等疾病。VB1存在于糙米、酵母、谷类、肝、肉类、豆类及其他动植物组织中，动物组织不如植物含量丰富。测定VB1的方法有重量法、滴定法、荧光法、电位法及示波电位滴定法等。世界各国都用荧光法测定。,41,（一）VB1的性质,VB1在中性、碱性下不稳定，易分解；VB1在酸性条件下稳定，即使加热酸性也稳定；VB1为白色结晶，微溶于C2H5OH，不溶于乙醚或CHCl3，易溶于水。,42,（二）VB2（核黄素）的性质,VB2在中性水里溶解极少，呈黄绿色的荧光，在强酸性和强碱性溶液中则充分溶解。(2)橙黄色针状结晶，熔点为282的，耐热，对空气、氧气稳定。测定VB2的方法有光黄素荧光法、核黄素荧光法、高效液相色谱法。光黄素荧光法灵敏度和精密度都较高，适用于测定农产品中的VB2。高效液相色谱法测定维生素具有简便、快速，可同时进行多种水溶性维生素测定等优点，是近年发展较快的测定方法。,43,（三）VB1和VB2的测定（液相色谱法）,1、方法原理：样品在稀盐酸溶液中经消化，用淀粉酶和木瓜酶分解样液中的淀粉和蛋白质后，即得到VB2的测定样液。此溶液在碱性铁氰化钾溶液中氧化后用异丁醇提取所得VB1测定样液。然后用YWG-Cl8柱,乙腈磷酸盐缓冲溶液作流动相，以荧光检测器进行液相色谱法测定，求出样品中VB1和VB2的含量。,44,2、操作步骤,(1)样品处理固体样品粉碎过20目筛，果蔬、肉类及水产品经捣碎备用。称取试样1.00g(VB1和VB2含量不低于0.5g)于50mL棕色容量瓶中，加入0.1molL-1盐酸溶液35ml，在超声波浴中超声3min或转动摇匀，在高压灭菌锅内121保持2030min或置于沸水浴中加热30min，然后轻摇数次，取出，冷却至40以下，分别加混合酶液各2.5mL，摇匀，置于37下过夜或4243加热4h，冷却，用水定容。样液经3000r/min速度离心过滤，取约10ml，滤液备用。然后取滤液直接进行VB2测定。,45,取上述滤液5ml于60ml分液漏斗中，沿分液漏斗壁加碱性铁氰化钾溶液3ml(边摇边加)，继续振摇10s，立即加入异丁醇8ml，并猛烈振摇45s静置分层后弃去水层。有机相通过无水硫酸钠小柱，其收集液为VB1待测液。,(2)标准溶液制备。准确吸取2mgL-1VB1和VB2混合工作液0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00ml，于50ml棕色容量中，再加入与样品等量的0.1molL-1盐酸，以下操作同样品处理，得到VB2标准系列水溶液和VB1标准系列异丁醇溶液。(3)样品测定。,46,4、注释（1）VB2测定用消化后的滤液直接进样，处理后的标准和样品都有杂质峰，但能分离VB2，不影响测定。（2）由于VB1被碱性铁氰化钾氧化并不是定量产生硫色素，但在恒定条件下是一个恒量。用异丁醇萃取的VB1也是如此。因此本法采取等体积进样。（3）样品处理是能否获得满意结果的关键。,47,（4）液相色谱仪需有：a.荧光分光光度检测器及记录仪；b.色谱柱（5）VB1和VB2测定时所用的流动相不同。VB1：用流动相A，以磷酸盐缓冲液80份（0.025molL-1磷酸缓冲液，pH7.4）和乙腈20份相混而成；VB2：流动相B，以磷酸盐缓冲液82份和乙腈18份混合而成。,48,（6）碱性铁氰化钾溶液。吸取150gL-1氢氧化钠溶液97mL加入10gL-1铁氰化钾3mL混合而成。混合酶溶液（淀粉酶和木瓜酶各3g，用2molL-1醋酸钠稀释至100mL）（7）测时时仪器条件（参考）VB1：激发波长435nm，狭缝为10nm，发射波长为375nm，狭缝为12.5nm，灵敏度10。VB2：激发波长440，发射波长为565,狭缝为12.5nm，灵敏度3,其他同VB1。,49,50,51,52,53,54,55,56,三、纸层析法测定胡萝卜素,胡萝卜素原只存在于植物性食品中，但以含有胡萝卜为食物的家禽、兽类、水产动物及其加工产品，以及为着色而添加胡萝卜素的食品，也含有胡萝卜素。胡萝卜或浓缩胡萝卜汁中胡萝卜素含量的多少是评价其品质优劣的重要指标和开发利用的主要依据。胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。因属于脂溶性维生素，故可用有机溶剂从农产品中提取。,57,胡萝卜素是具有类似维生素A的生物活性和效力的物质，称维生素A原。胡萝卜素常有、几种异构体，其中以胡萝卜素的生理效能最大。在动物的小肠内、肝脏中转化为维生素A。结构式如下：,58,-胡萝卜素是植物色素，存在于谷物、蔬菜、水果等食物中。以每百克可食部分计，小米0.12mg、玉米0.34mg、玉米面0.13mg、黄豆0.40mg、黄豆粉0.48mg、绿豆0.22mg、毛豆0.23mg.因-胡萝卜素是有色色素，可采用直接比色法定量分析。但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取胡萝卜素时，这些色素也能被有机溶剂提取，因此在测定前，必须将胡萝卜素与其他色素分开。,59,目前测定胡萝卜素的方法主要有以下几种:纸层析法;薄层层析法;柱层析法;分光光度法;高效液相色谱法或液质联用法。,60,61,纸层析法：是一种操作方便且易于掌握，同时可测定多种样品，测定结果具有较高的准确度和精密度，线性相关极显著，不需要特定的设备，成本较低，适合条件较简陋，普通实验室均可采用的测定-胡萝卜素含量的方法。,62,(一)纸层析的原理,根据固定相的形式把固定相装于管子中的色谱称为柱色谱，把固定相成平面板状的色谱称为平板色谱，如纸层析、薄层层析。纸层析是以滤纸纤维及其结合水形成的复合物作为固定相。将待分离的样品溶液点在滤纸的一端，在密闭的容器中，用适宜的溶剂(展开剂)作为流动相，带动样品斑点，从滤纸的一端向另一端迁移，此称为展开。,63,由于样品中，各组分与滤纸亲和力的强弱差异，及在展开剂中溶解度的大小不同，在展开过程中，经过反复的吸附、解吸，经一定时间产生差速迁移，使样品中各组分得以分离。经显色剂显色，可在滤纸上看到分离的斑点。这些斑点就是通常所说的色谱。,在两相中，吸附力强、溶解度大的组分，迁移速度快，斑点离原点距离就大，反之距离就小。各组分在滤纸中的位置，可用比移值Rf来表示。根据Rf值可以定性，根据斑点大小及颜色深浅可以定量。,64,常用的展开剂有：正乙烷(石油醚)、正庚烷、环己烷、四氯化碳、甲苯、苯、乙醚、CH2Cl2、CHCl3、乙酸乙酯、吡啶、丙酮、丁醇、丙醇、乙醇、甲醇、乙酸、水、氨水。,65,(二)胡萝卜素的层析分离及定量测定,1、原理：以丙酮和石油醚提取农产品中的胡萝卜素及其他植物色素；以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离；剪下含胡萝卜素的区带、洗脱后于450nm波长下定量测定。,66,2、样品的采集和处理(1)粮食：样品用水洗3次，置60烤箱中烤干，磨粉，贮于塑料瓶内，放一小包樟脑精，盖紧瓶塞保存，备用。(2)蔬菜与其他植物性食品：取可食部用水冲洗3次后，用纱布吸去水滴，切碎，用匀浆器制成匀浆，贮于塑料瓶内冰箱内保存备用。,67,3测定步骤,以下步骤需在避光条件下进行。(1)样品提取：取适量样品，相当于原样15g(含胡萝卜素约2080g)的匀浆，粮食样品视其胡萝卜素含量而定，置100mL带塞锥形瓶中，加入丙酮20mL，石油醚5mL，振摇1min，静置5min，将提取液转入盛有100mL50gL硫酸钠溶液的分液漏斗中，再于锥形瓶中加入10mL丙酮+石油醚混合液，振摇1min，放置5min，将提取液并入分液漏斗中，如此提取23次，直至提取物无色为止。,68,植物油和高脂肪样品：需先皂化，取适量样品(小于10g)，加脱醛乙醇30mL，再加10mL氢氧化钾溶液，回流加热30min，然后用冰水使之迅速冷却，皂化后样品用石油醚提取，直至提取液无色为止。,69,(2)洗涤：将提取液3(1)静置分层，弃去下层水溶液，反复用50gL硫酸钠溶液振摇洗涤，每次约15mL，直至下层水溶液清亮为止。将皂化后样品提取液3(1)用水洗涤至中性。将或的石油醚提取液通过盛有10g无水硫酸钠的小漏斗，漏入球形瓶，用少量石油醚分数次洗净分液漏斗和无水硫酸钠层内的色素，洗涤液并入球形瓶内。,70,(3)浓缩与定容：将上述球形瓶内的提取液于旋转蒸发器上减压蒸发，水浴温度为60，蒸发至约1mL时，取下球形瓶，用氮气吹干，立即加入2.00mL石油醚定容，备层析用。,(4)纸层析：点样：点样在18cm30cm滤纸下端距底边4cm处点样，各点相距4cm，点样量0.1000.400mL样品浓缩液,形成的色斑应尽量