（食品科学与工程专业论文）龙头鱼中内源性甲醛产生的生物化学机理的研究.pdf

圭塑塑鲎奎堂堡主堂垡堡壅删 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名相舢 日期：易d 年厂月7 日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口 ，在年解密后适用本版权书 本学位论文属于 不保密日 学位论文作者签名： 日期护o 年月1 日 燧名国埒 日期：刎库6 月7 日 上海海洋大学硕士学位论文 龙头鱼中内源性甲醛产生的生物化学机理的研究 s t u d yo nt h eb i o c h e m i c a lm e c h a n i s mo fe n d o g e n o u s f o r m a l d e h y d ep r o d u c t i o ni nh a r p a d o nn e h e r e u s 学位论文完成时间：2 4lq ：幺：鱼 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： n 上海海洋大学硕士学位论文 龙头鱼中内源性甲醛产生的生物化学机理的研究 摘要 甲醛( f o r m a l d e h y d e ，f a ) 是一种原生质毒，对人体健康有极大的危害。天然 f a 是生物体新陈代谢过程中的一种中间产物，但是含量极低。作为有毒化学物质， 我国食品相关法律禁止将f a 添加到食品中。国内外大量研究证明许多水产品中 存在内源性f a ，而我国关于水产品中内源性f a 的研究还处于起步阶段，有关其 产生机理论述更是鲜有报道，因此，我国目前的水产品中f a 含量标准的制定在 科学性和实用性方面都存在较大问题，甚至对有关行业的健康发展产生了负面影 响。同时鉴于目前市场上依然存在人为添加f a 的现象，如何分辨水产品中的f a 是人为添加的还是自身产生的，也是摆在质监部门面前的一道亟待解决的难题。 本论文的研究目的就是探索内源性f a 产生的机理、影响因素等，以期为水 产品中f a 限量标准的制定和完善提供科学依据。在确定龙头鱼能够产生内源性 f a 的基础上，本论文进行了一系列实验，得到以下结果： 1 2 0 贮藏过程中龙头鱼样品中f a 和二甲胺( d i m e t h y l a m i n e ，d m a ) 不断增 加，证明龙头鱼中内源性f a 的存在；相对于龙头鱼的幽门盲囊、肝脏以及肌肉 本身，肾脏更能促进内源性f a 的产生，说明肾脏中的促进f a 和d m a 产生的活 性成分要高于其他内脏，因此可以选用肾脏作为提取的基质能更容易获得理想的 活性成分： 2 从龙头鱼肾脏中获得的提取物能够分解体外模拟反应体系中的氧化三甲胺 ( t r i m e t h y l a m i n en o x i d e t m a o ) 生成f a 和d m a ，且在不同条件下生成的f a 和 d m a 为等物质的量，为辨别市场上水产品中的f a 是人为添加还是自身产生提供 了理论依据； 3 龙头鱼肾脏提取物在反应过程中呈现酶的特性，在不同p h 和温度作用下 具有钟形曲线，在蛋白质变性剂作用下失去催化活性；其最适反应条件是p h = 7 ， 温度为5 0 ；证明龙头鱼肾脏提取物中的活性物质是一种蛋白质酶或者酶系；龙 头鱼肌肉浸出液在肾脏提取物作用下f a 和d m a 含量均出现增长，证明龙头鱼 肌肉中的成分能够在龙头鱼自身酶的作用下产生内源性f a ； 4 通过实验发现e d t a 对龙头鱼肾脏提取物中的t m a o a s e 存在抑制作用， 提示提取物中的t m a o a s e 是一种或者一类以金属离子为激活剂的酶，这种金属 i i i 上海海洋大学硕士学位论文 离子是f e 2 + ；不同浓度的f e 2 + 对体系中的d m a 和f a 含量影响极大，直至体系中 的底物t m a o 接近完全分解；而c a 2 + 、m 9 2 + 等二价金属阳离子对体系中f a 和 d m a 含量无影响；还原剂抗坏血酸对含有0 0 1m m o l l - 1f e 2 + 反应体系的作用效 果与f e 2 + 基本一致，提示我们是f e 2 + 而不是还原剂本身对d m a 和f a 含量有影响； 5 探索性地测定多种包括含有内源性f a 的水产品样品以及不含有内源性f a 的水产品样品中的总铁含量，发现含有内源性f a 的样品中的总铁含量明显要高 于不含有内源性f a 的样品，排除不含有t m a o 的淡水水产品样品，2 8 种海水水 产品样品中总铁含量与内源性f a 含量之间存在显著的正相关，进一步提示了f e 2 + 在内源性f a 产生之间的密切关系。 本论文初步探讨了龙头鱼中内源性f a 产生的生物化学机理和影响因素，为 今后水产品中内源性f a 产生机理的进一步研究以及其甲醛限量标准的科学制定 奠定了基础。 关键词：内源性甲醛，二甲胺，龙头鱼，氧化三甲胺酶，机理 i v 一 圭塑塑堂奎堂堡主堂垡笙茎 一 _ _ - _ - _ l _ - _ _ _ _ - - _ - - _ l _ _ _ _ _ l _ _ - _ - _ - _ _ _ - _ _ 一一 s t u d yo nt h eb i o c h e m i c a l m e c h a n i smo fe n d o g e n o u s f o r m a l d e h y d ep r o d u c t i o ni nh a r p a d o n n e h e r e u s a b s t r a c t f o r m a l d e h y d e ( f a ) i sap r o t o p l a s mp o i s o nw h i c hc o u l dd oag r e a t h a r mt oh u m a n h e a l t l l n a t u r a lf ai sa ni n t e r m e d i a t em e t a b o l i t ei nt h eo r g a n i s mm e t a b o l i s mw i t ht r a c e a m o u n t a sap o i s o n o u sc h e m i c a ls u b s t a n c e ，f aw a sf o r b i d d e nt oa d d t of o o d s t u f f sb y f e l a t e df o o dl a w si nc h i n a ag r e a tn u m b e ro fs t u d i e sa th o m e a n da b r o a dc o n f i r m e d t h ee x i s t e n c eo fe n d o g e n o u sf ai nf i s h e r yp r o d u c t s t h es t u d i e so fe n d o g e n o u sf a i n f i s h e r yp r o d u c t so fc h i n aw e r es t i l li nas t a r t - u pp e r i o d ，l i t t l ew a sr e p o s e da b o u tt h e f ap r o d u c t i o nm e c h a n i s m ，t h e r e f o r e ，t h e r ew e r ep r o b l e m sw i t ht h es c i e n t i f i c a l n e s sa n d p r a e t i c a b i l i t y o ft h el i m i t a t i o ns t a n d a r d sm a d ef o rf ai nf i s h e r yp r o d u c t s t h e d e v e l o p m e n to fs o m ef i s h e r yp r o d u c t sp r o c e s s i n gi n d u s t r i e sw a sc o n f i n e db yt h o s e i n a d e q u a t es t a n d a r d s m e a n w h i l e ，d u et ot h e e x i a e n c eo fa r t i f i c i a l l ya d d e df ai n f i s h e r yp r o d u c t s a sb e f o r e ，t h e r ew a sad i f f i c u l t y f o r t h eq u a l i t ys u p e r v i s i n g d e p a r t m e n t st ov e r i f y w h e t h e rt h ef ai nf i s h e r yp r o d u c t sw a se n d o g e n o u s o r a r t i f i c i a l l y a d d e d t h i sp a p e ra i m e da te x p l o r i n gt h ee n d o g e n o u sf ap r o d u c t i o nm e c h a n i s ma n d e f f e c t i n gf a c t o r se t c i no r d e rt op r o v i d es c i e n t i f i cf o u n d a t i o nf o rt h ef o r m u l a t i o na n d r e f i n e m e n to ff i s h e r yp r o d u c t s f as t a n d a r d s w i t hab a s i so fc o n f i r m i n ge n d o g e n o u s f ae x i s t e n c ei nh a r p a d o nn e h e r e u s , as e r i so fe x p e r i m e n t sw e r ed e s i g n e da n dc a r r i e d o u tt oc o m et ot h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n s ： 1 w i t ht h ec o n t i n o u si n c r e a s eo ff aa n dd i m e t h y l a m i n e ( d m a ) c o n t e n ti n 2 0 c s t o r e dh a r p a d o nn e h e r e u ss a m p l e s ，t h ee x i s t e n c e o fe n d o g e n o u sf aw a s c o n f i r m e d ；k i d n e y , c o m p a r e dw i t hp y l o r i cc a e c u m ，l i v e ra n d m u s c l ea sc o n t r o l ，w a s m o r ec a p b l eo fi n c r e a s i n gt h ef ac o n t e n t ，w h i c hm e a n sk i d n e yc o n t a i nh i g h e rc o n t e n t o fa c t i v ei n g r e d i e n tt h a ti n c r e a s ef aa n dd m a c o n t e n tt h a no t h e ro r g a n s ，t h e r e f o r e ， u s i n gk i d n e ya st a r g e to r g a nw a s e a s i e rt oe x t r a c tt h ea c t i v ei n g r e d i e n t 2 t r i m e t h y l a m i n en - o x i d e ( t m a o ) i nt h e i nv i t r or e a c t i o ns y s t e mc a nb e v d e c o m p o s e dt of aa n dd m ab ye x t r a c to b t a i n e df r o mh a r p a d o nn e h e r e u sk i d n e y , a n d t h ef o r m e df aa n dd m aw e r ee q u a li nm o l a r i t y ；t h i sc o n c l u s i o np r o v i d e dt h e o r e t i c a l g r o u n df o ri d e n t i f y i n gt h ef ao r i g i n 3 e n z y m a t i cc h a r a c t e r sw e r es h o w ni nt h er e a c t i o n sc a t a l y z e db yt h eh a r p a d o n n e h e r e u sk i d n e ye x t r a c t ：b e l l - s h a p e dc u r v e st o o ko nd u r i n gt h er e a c t i o nw i md i f f e r e n t p ha n dt e m p e r a t u r ec o n d i t i o n s ，a n dt h ek i d n e ye x t r a c tl o s ti t sc a t a l y z i n ga c t i v i t ya r e r b e i n gt r e a t e db yp r o t e i nd e n a t u r a n t ；t h ea p p a r e n to p t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o nw a st e s t e d t 0b ep h = 7 ，5 0 ；s ot h ea c t i v ei n g r e d i e n ti nt h ek i d n e ye x t r a c tw a sp r o b a b l yap r o t e i n e n z y m eo ra ne n z y m es y s t e m ；c a t a l y z e db yt h ek i d n e ye x t r a c t ，a l li n c r e a s eo ff a a n d d m ac o n t e n ti nh a r p a d o nn e h e r e u sm u s c l ee x t r a c tw a sf o u n dw h i c hp r o v e dt h a t e n d o g e n o u sf a c a l lb ep r o d u c e df r o mt h em u s c l ei n g r e d i e n t s 4 i n h a b i t i o ne f f e c to fe d t at ot r i m e t h y l a m i n en - o x i d ed e m e t h y l a s e ( t m a o a s e ) i nk i d n e ye x t r a c tw a sd i s c o v e r e di n t h ee x p e r i m e n t s ，i m p l y i n gt h et m a o a s ei nk i d n e y e x t r a c tw a sa ne n z y m eo re n z y m e sw i t hm e t a li o i l s 嬲a c t i v a t o r , t h em e t a li o nw a s c o n f i r m e dt ob ef e 2 + ( f e r r o u si o n ) w i t he x p e r m e n t s ；g r e a td i f f e r e n c eo fd m aa n df a c o n t e n ti nt h er e a c t i o ns y s t e mw a sm a d eb yd i f f e r e n tf e z 十c o n c e n t r a t i o n , a n dt h e s u b s t r a t en 江a ow a st o t a l l yd e c o m p o s e d ；o t h e rb i v a l e n tm e t a lc a t i o n sl i k ec a 计，m g 什 a l m o s th a v en oe f f e c t st ot h ed m aa n df ac o n t e n ti nt h es y s t e m ；r e d u c t a n ta s c o r b a t e a c i dh a st h es a m ee f f e c t st ot h er e a c t i o ns y s t e mc o n t a i n g0 01m m o l l 。1f e z + 嬲f e z 十 i t s e l fd i d ，w h i c hi m p l i e di tw a sf e z + t h a te f f e c tt h ed m aa n df ac o n t e n t ，n o tr e d u c t a n t 5 a ne x p l o r a t a r ys t u d yh a sb e e nm a d eb yd e t e r m i n i n gt o t a li r o nc o n t e n ta n df a c o n t e n ti nd i f f e r e n tf i s h e r yp r o d u c t sa n dc o m p a r i n gt h er e l a t i o nb e t w e e nt h e m i tw a s d i s c o v e r e dt h a tt h et o t a li r o nc o n t e n ti ns a m p l e sw i t l le n d o g e n o u sf ap o s i t i v ew e r e h i g h e rt h a nt h o s e 、 ，i t l ln oe n d o g e n o u sf a ；a f t e re x c l u d i n gf r e s hw a t e rf i s h e r ys a m p l e s w h i c hc o n t a i nn ot m a o ，s i g n i f i c a n tp o s i t i v ec o r r e l a t i o nw a sf o u n db e t w e e nt o t a li r o n c o n t e n ta n de n d o g e n o u sf ai n2 8m a r i n ef i s h e r ys a m p l e s ，w h i c hf u r t h e rt e s t i f i e dt h e r e l a t i o nb e t w e e nf e 2 + a n de n d o g e n o u sf a b i o c h e m i c a lm e c h a n i s ma n de f f e c t i n gf a c t o r so fe n d o g e n o u sf ap r o d u c t i o ni n h a r p a d o nn e h e r e u sw a sp r e l i m i n a r ys t u d i e di nt h i sp a p e r l a y i n gaf o u n d a t i o nf o rt h e f r r t h e rs t u d yo fe n d o g e n o u sf ai nf i s h e r yp r o d u c t sa n ds c i e n t i f i cf o r m u l a t i o no ff a s t a n d a r d sf o rf i s h e r yp r o d u c t s k e yw o r d s ：e n d o g e n o u sf a ，d m a 。h a r p a d o nn e h e r e u s ，t m a o a s e ，m e c h a n i s m v i 上海海洋大学硕士学位论文 目录 弓i言1 0 1 水产品中的甲醛。l o 1 1f a 的物理化学性质。l o 1 2f a 的毒理学性质2 o 1 3 水产品中f a 的来源3 o 1 4f a 在水产品中的存在方式及测定方法。3 0 2 龙头鱼及龙头鱼内源性f a 研究状况4 o 2 1 龙头鱼简介。5 0 2 2 龙头鱼中内源性f a 的研究状况5 0 3 氧化三甲胺酶。6 o 3 1 水产品中的t m a o 7 0 3 1 1t m a o 在海洋生物中分布7 0 3 1 2 海洋生物中t m a o 的生理作用9 0 3 2 与t m a o 代谢相关的酶1 0 0 3 3 内源性氧化三甲胺脱甲基作用1 1 o 3 3 1t m a o a s e 活性测定方法。1 3 o 3 3 2t m a o a s e 的纯化1 3 o 3 3 3t m a o a s e 的鉴定1 4 0 4 本论文的研究目的和意义18 第一章龙头鱼样品在贮藏过程中f a 含量的变化小1 9 1 1 材料与方法1 9 1 1 1 仪器与设备1 9 1 1 2 材料与试剂1 9 1 1 3 方法2 0 1 1 3 1f a 标准储备溶液的标定2 0 1 1 3 2d m a 标准储备溶液的标定2 0 1 1 3 3 标准曲线的绘制2 l 1 1 3 4 龙头鱼肌肉样品的制备2 2 1 1 3 5 龙头鱼肌肉中f a 的测定2 2 1 1 3 6 龙头鱼肌肉中d m a 的测定2 3 1 1 3 7 数据处理2 4 1 2 结果与讨论2 4 1 2 1 龙头鱼样品在贮藏过程中f a 和d m a 含量的变化2 4 1 3 小结2 8 第二章龙头鱼肾脏提取物对氧化三甲胺反应体系的作用2 9 2 1 材料与方法2 9 2 1 1 仪器与设备。2 9 2 1 2 材料与试剂2 9 上海海洋大学硕士学位论文 2 1 3 方法3 0 2 1 3 1 提取缓冲液的配制3 0 2 。1 3 2t m a o 底物缓冲液的配制3 0 2 1 3 3 龙头鱼肾脏提取物的制备3 0 2 1 3 4 龙头鱼肌肉提取液的制备3 0 2 1 3 5t m a o 反应体系3 0 2 1 3 6 反应体系中f a 和d m a 的测定3 l 2 1 3 7 肌肉提取液与肾脏提取物的反应3 1 2 1 3 8 肌肉提取液中f a 和d m a 的测定3 1 2 1 3 9t c a 对肾脏提取物灭活作用3 1 2 1 3 1 0 响应面设计和数据处理3 1 2 2 结果与讨论3 l 2 2 1 单因素实验以及反应体系中d m a 与f a 的含量关系3 1 2 2 2 提取物最适条件的确定3 6 2 2 3 响应模型的分析与验证3 7 2 2 4 最适条件下肾脏提取物对肌肉浸出液的作用3 8 2 2 5t c a 对龙头鱼肾脏提取物的灭活作用。3 9 2 3 小结4 0 第三章亚铁离子等对肾脏提取物活性的影响4 l 3 1 材料与方法4 l 3 1 1 仪器与设备4 1 3 1 2 材料与试剂4 1 3 1 3 方法4 2 3 1 3 1 样品的湿法消化4 2 3 1 3 2i c p a e s 工作参数以及铁标准曲线4 3 3 1 3 3 样品水分的测定。4 3 3 1 3 4t m a o e d t a 缓冲体系4 4 3 1 3 5t m a o e d t a 缓冲体系中f a 和d m a 的测定4 4 3 2 结果与讨论“ 3 2 1e d t a 对反应体系的作用以及金属离子辅因子的确定4 4 3 2 2f e 2 + 和抗坏血酸对反应体系的作用4 6 3 2 3 水产品中总铁含量与f a 含量的相关性4 8 3 3 小结。5 l 结j 沧5 2 参考文献5 4 致谢6 2 上海海洋大学硕士学位论文 o 1 水产品中的甲醛 引言 水产品一直深受广大消费者喜爱，随着市场经济的迅速发展，人们生活水平 的提高以及保健意识的增强，水产品的需求越来越大，要求也越来越高。但是近 年来，一些不法经营者为了保持水产品的新鲜外观，延长保存期，增加重量，不 顾人民群众的身体健康，用甲醛( f a ) 浸泡处理水产品，造成了水产品不同程度 的f a 污染，极大地损害了消费者的利益，严重威胁着广大人民群众的身体健康。 但是大量研究和检测结果表明许多水产品中还存在内源性f a ，如鳕形目的多种鳕 鱼、鱿鱼以及狗母鱼科的龙头鱼等等。本论文对以龙头鱼为代表的一些水产品中 内源性f a 产生的机理，包括生物化学本质，影响因素等进行了初步的探索。 0 1 1f a 的物理化学性质 天然f a 是生物细胞在丝氨酸，甘氨酸，甲硫氨酸以及胆碱代谢的中间产物【l 】。 f a 本身是一种无色的刺激性气体，其水溶液( 体积比4 0 或者质量比3 7 ) 称 为福尔马林，医学上用作防腐剂和消毒剂。 f a 的物理化学性质如表o 1 所示： 表o 1 f a 的物理化学性质【2 】 t a b 0 1t h ep h y s i o c h e m i c a lp r o p e r t i e so ff o r m a l d e h y d e 英文名称 f o r m a l d e h y d e 化学式 结构简式 分子量 外观 自燃点 爆炸极限 溶解性 沸点 熔点 c h 2 0 h c h o 3 0 0 2 6 9 m o l 无色气体 4 3 0 7 - 7 3 易溶于水 2 1 ( 纯溶液) ，9 6 ( 3 7 溶液) 9 2 ( 纯溶液) ，- 1 5 ( 3 7 ) 上海海洋大学硕士学位论文 0 1 2f a 的毒理学性质 f a 具有原生质毒性，按其毒性分级，f a 属于中等毒性物质，在我国有毒化 学品优先控制名单上f a 高居第二位【3 1 。 f a 对人体的急性毒性主要表现在对上呼吸道，眼睛和皮肤的刺激作用。因为 f a 的水溶性极高，在没有到达肺部以前已基本被上呼吸道粘膜吸收，所以吸入性 f a 能够引起上呼吸道，主要包括鼻腔，咽，气管和支气管的损伤；眼部暴露于 f a 的主要表现是灼热感和流泪；而皮肤直接接触f a 可以引起过敏性皮炎、色斑， 甚至坏死1 4 1 。 f a 的慢性毒性涉及对免疫、神经系统的影响，遗传生殖毒性和致癌作用也有 相关文献报道。淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞等可介导生物体内的体液和细胞 免疫反应，f u j i m a k i 等人【5 】将雌性c 3 h h e 大鼠暴露于0 ，8 0 ，4 0 0 和2 0 0 0 p p bf a 浓度下1 2 周发现，暴露于2 0 0 0 p p b 下的大鼠体内的巨噬细胞和嗜酸粒细胞比0 p p b 大鼠要明显增多，但是白细胞介素1 b 却显著减低；在体外试验中，2 0 0 0 p p b f a 暴 露下脾脏培养液上清液中脂多糖刺激产生的丫干扰素明显下降，而卵清蛋白刺激 下生成的单核细胞诱导蛋白1 显著增加。4 0 0 p p bf a 暴露水平的大鼠中发现抗卵 清蛋白i g g l 和i g g 3 两种抗体明显下降，而i g e 数量没有发现变化。f a 对神经 系统有明显的作用。将麻醉的大鼠置于l p p m 的f a 下暴露1 h 其鼻腭神经对戊 醇刺激的反应明显降低，用f a 刺激大鼠鼻粘膜处的三叉神经末梢。可抑制受试 大鼠的呼吸率。抑制作用与f a 浓度成正比，这在动物自我保护上有积极意义。 但随f a 浓度的增加易使受刺激神经产生耐受性。三叉神经在2 8 p p m 的f a 作用4 天后，可产生持续l 周的耐f a 现象，而在低于此浓度的f a 作用下则无这种耐受 性 6 1 。 研究表明f a 在哺乳动物细胞的体外试验中能表现出遗传毒性【_ 7 1 。f a 可以导 致动物细胞不同水平上的d n a 损伤，如染色体畸变，碱基突变等等，其导致d n a 损伤的机理是由于羰基亲电性和较小的空间位阻作用，并可以诱发自由基效应， 因而可以攻击核酸和蛋白质等生物大分子而引起一系列反应。王丽等人【8 】从d n a 水平证实了低浓度f a 可以诱导h e l a 细胞d n a 断裂，高浓度则可以诱发d n a 交联。f a 生殖毒性的研究主要集中在试验动物上，易建华等人【9 】通过人工注射方 式对小鼠进行f a 暴露，发现高剂量组的小鼠精子数量显著降低，精子活力与畸 形率与剂量的关系存在统计学意义。f a 能够引起试验动物发生癌变，有人怀疑白 2 上海海洋大学硕士学位论文 血病与f a 有关，北京儿童医院血液病研究中心发现，在我国一些大气污染严重 的城市，大约有9 0 的白血病患儿家中短期内装修过房屋；哈尔滨市第一医院血 液病研究所也发现1 0 0 0 多名白血病患儿中，4 6 7 的家庭在发病前半年内进行过 装修【1 0 1 。但是f a 对人类的致癌作用还没有确切证据。 0 1 3 水产品中f a 的来源 马敬军等人【1 1 】认为水产品中的f a 的可能来源主要有以下5 个方面： 1 ) 作为养殖场和一些加工场所设施、工具等消毒作用使用的f a ： 2 ) 以f a 为原料生产的塑料制品在接触食品或水产品而发生的游离f a 的迁 移； 3 ) 水产品养殖过程中，f a 作为杀虫渔药使用而造成在鱼体内的残留； 4 ) 为了较长时间保持水产品新鲜外观，延长货架期，增加水产品的持水量而 人为地向水产品中添加的f a ； 5 ) 在酶和非酶作用下水产品自身产生的内源性f a 。 其中人为添加的f a 和自身产生的内源性f a 是目前水产品中检出f a 的主要 原因。 0 1 4f a 在水产品中的存在方式及测定方法 f a 在水产品中的存在方式如图1 1 所示： 曲噙甲醛 f r e ef o r m a l d e h y d e 司硅舶甲醪 r e v e r s i b l yb o u n d f o r m a l d e h y d e 结台甲醛 b o u n df o r m a l d e h y d e 3 通迓：澳l 定d m a j 臣篝 为f a 上海海洋大学硕士学位论文 图0 - 1 水产品中f a 存在状态和测定方法【1 2 】 f i g 0 - 1e x i s t i n gs t a t eo ff o r m a l d e h y d ei nf i s h e r yp r o d u c t sa n dd e t e c t i o nm e t h o d s 水产品中的游离f a 是指在室温下处于游离态，能够用高氯酸溶液或三氯乙 酸溶液提取的一部分f a ；可逆结合f a 是指除去游离f a ，在酸性条件下通过水 蒸气蒸馏法能够蒸馏出来的一部分f a t l 3 1 ；通过蒸馏法测定的f a 一般要比游离f a 含量大得多，所以可逆结合态f a 在存在本地f a 含量的水产品中占较大部分。考 虑到在水产品中f a 和d m a 是等量存在的，试验测定的d m a 的量要大于f a ， 所以水产品中还有一部分f a 不能通过水蒸气蒸馏的方法提取出来，这部分f a 被 称为不可逆结合f a 。不可逆结合的f a 不能直接测定，只能通过测定d m a 含量 而推算出来【l a l 。 有人认为水产品中游离f a 的含量与水产品对人体毒理学作用相关，而结合 f a 的含量则是表征水产品质构变化的重要参数【1 2 1 。 f a 检测方法最大的问题出现在样品基质中f a 的提取过程，即前处理中【i 引， 由于f a 能够与鱼肉中的蛋白质、核酸以及许多小分子物质如游离氨基酸，胺类， 肌氨酸，核苷酸等发生反应，f a 的高反应活性导致了其添加实验的回收率很低【1 6 j 。 提取过程中，游离f a 可以通过以下3 种方法提取：1 ) 室温条件下水或者缓冲溶 液提取【1 7 】：2 ) 低温条件下酸溶液提取【1 3 】；3 ) 中性或者碱性条件下蒸馏提取【1 引。 结合f a 方面，f a 与鱼肉组织等通过稳定的化学键结合，这些化学键，如在赖氨 酸与精氨酸、天冬氨酸或谷氨酸等氨基酸之间的亚甲基桥，能够在酸性条件下通 过高温过程断裂；但是有些亚甲基桥是酸稳定性的，比如赖氨酸与酪氨酸以及其 他与甲基基团与赖氨酸之间的亚甲基桥对酸水解作用稳定旧；由于f a 反应的多 样性，样品中f a 总含量测定的难度和不确定度都非常高。目前广泛接受的是研 究冷冻鳕形目鱼类中f a 总含量的测定方法，即根据对应关系测定以d m a 含量 推算出f a 含量【l 引。 提取液中f a 的定量方法主要是分光光度法，通过f a 显色产物与吸光值的线 性关系对f a 定量，主要分为n a s h 试剂法和变色酸法。n a s h 试剂法的原理是乙 酰丙酮与f a 在过量铵盐作用生成黄色3 ，5 二乙酰基1 ，4 二氢吡啶，在4 1 2 n m 下 比色定量：变色酸法是1 ，8 二羟基萘3 ，6 二磺酸与f a 反应生成紫色化合物，在 5 7 8 n m 处比色定量。 0 2 龙头鱼内源性f a 研究状况 4 上海海洋大学硕士学位论文 0 2 1 龙头鱼简介 龙头鱼( h a r p a d o nn e h e r e u s ) 俗称豆腐鱼、九吐鱼、水潺，属于硬骨鱼纲， 灯笼鱼目，狗母鱼科，龙头鱼属，是温热带海洋沿岸中小型底栖型肉食性鱼类， 在我国黄海、东海、南海均有分布，主要产区集中在浙江和福建沿海，尤以舟山 等地最多；主要以小型鱼类及甲壳类为食【1 9 1 。 图0 - 2 龙头鱼外形 f i g 0 2t h ec o n f i g u r a t i o no fh a r p a d o nn e h e r e u s 龙头鱼鱼体长形，略侧偏质柔软；头部稍圆，中等大，鼻孔较大，距眼近， 眼很小，距吻较近，眼间隔宽，脂眼睑发达；身体呈乳白色，透过皮肤中部轴下 肌清晰可见；臀鳍末端到尾鳍之间的尾部两侧有细小圆鳞，侧线鳞4 0 4 4 ，身体 其他部位鳞稀少而近乎裸露，各鳍鳍式为背鳍1 1 1 2 ，臀鳍1 4 1 5 ，胸鳍1 0 1 2 ， 腹鳍9 ；背鳍鳍点与腹鳍起点相对：侧线管发达，鳔退化【2 0 1 。 龙头鱼水分高达8 7 9 2 ，因此肉质细嫩多水，不易贮藏和运输，冷冻对鱼体 组织影响明显，一般直接鲜销。龙头鱼中含有丰富的蛋白质、钙、铁、磷等，是 良好的蛋白质、钙、铁来源f 2 l j 。 0 2 2 龙头鱼中内源性f a 的研究状况 由于龙头鱼水分很高而保存期短的特点，在销售过程中常有不法商贩为了延 长货架期而向龙头鱼中添加f a 。然而在确定没有人为添加f a 的情况下仍发现龙 头鱼中存在f a ，钟惠英等人【2 2 1 对龙头鱼中f a 含量作了较为系统的调查，他们分 别从市场、刚靠岸的渔船以及确实未加f a 的张网或丝网渔货物中获取龙头鱼样 品，用水蒸气蒸馏乙酰丙酮分光光度法测定f a 。结果发现龙头鱼死亡后肌体自 5 上海海洋大学硕士学位论文 身能产生大量f a ，其含量随鱼体鲜度的下降而升高，但在鱼体高度腐败时急剧下 降。鱼体死亡后低温保存3 4 天f a 含量高达2 0 0m g k g 。1 以上。于2 0 保存1 8 0 天，f a 含量高达5 0 0 m g k g 1 以上。市售干制的龙头鱼不论咸品还是淡品，f a 值 高达8 7 1 3 1 3 5 7 2m g k 岔1 ，张网获取的样品不去内脏整尾阴干，f a 值高达2 0 0 0 m g k g 1 。柳淑芳等人【矧也报道了龙头鱼中存在本底f a 含量的现象。 0 3 氧化三甲胺酶 一些鱼类，包括鳕形目的多种鳕鱼，在冷冻保藏过程中质量稳定性非常差， 主要表现在快速的质构改变，导致鱼肉失水发硬。为了解释这一现象研究人员作 了大量研究工作。大约4 0 多年前有人发现一些鱼类，尤其是冷冻时质量下降的鱼 类在冷冻过程中出现f a 和d m a 的积累【2 4 1 。日本的一些学者在2 0 世纪六七十年 代在这方面做了许多工作，他们研究了大量鱼类品种和不同组织，认为d m a 和 f a 含量最高的组织往往是在内脏 2 5 - 2 9 。同时