（环境科学专业论文）三尖杉宁碱的清洁纯化与综合利用.pdf

三尖杉宁碱的清洁纯化与综合利用复旦大学硕士学位论文 a b s t r a c t t a x o li saf a m o u sc o m p l e xn a t u r a l c o m p o u n dw i t hs p e c i a l a n t i t u m o r m e c h a n i s ma n dp r o m i n e n c ec u r a t i v ee f f e c t t h ed e p e n d e n c eo nb a r ka st h es o u r c e o fad r u gr e q u i r e si ne v e ri n c r e a s i n ga l n o u r l t sf o c u s e db o t hp u b l i ca n ds c i e n t i f i c i n t e r e s t so i lt h es e p a r a t i o nm e t h o do ft a x a n e sa n dt h ed i s c o v e r yo fa l t e r n a t e s o u r c e s i nt h i st h e s i s ，w ep r o v i d e das i m p l ea n de c o n o m i c a lm e t h o df o rt h es e p a r a t i o n o ft a x o la n dc e p h a l o m a r m i n ea n df o rt h ep r o d u c t i o no fp u r ec e p h a l o m a n n i n et h e n t h ec o n v e r s i o no fc e p h a l o m a n n i n et ot a x o lw a se x p e r i m e n t e ds u c c e s s f u l l y ，t h e m a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w i n g ： ( 1 ) a f t e rb r o m i n a t i n gt h ec r u d ee x t r a c to ft a x u s ，w es e p a r a t e dt h ep r o d u c t sb y c h r o m a t o g r a p h yo ns ig e lc o l u m nd i r e c t l y t h i sc l e a n e rp u r i f i c a t i o nm e t h o d w o r k e dv e r yw e l li nt h i st h e s i s ，f u r t h e r m o r e ，i tw a sp r o v e dt h a tt h i ss a m p l e m e t h o dc a l lb eu s e di nc o m m e r c i a lp r o d u c t i o ne f f e c t i v e l y ( 2 ) i nt h ep r o c e s so fc h r o m a t o g r a p h ys e p a r a t i o n ，a ne t o a c h e x a n ee l u t ew a s s u b s t i t u t e df o rt r a d i t i o n a lc h l o r i n es o l u t i o n b yu s i n gt h i se l u t e ，w er e a l i z e dt h e g r e e ns e p a r a t i o na n du l t i m a t e l yg o tt h ep r o d u c t s ( 3 ) w er e a l i z e dt h ee f f i c i e n tc o n v e r s i o n o f2 ”，3 ”d i b r o m o c e p h a l o m a n n i n et o c e p h a l o m a n n i n ew i t hu l t r a s o u n di r r a d i a t i o nf o rt h ef i r s tt i m e u l t r a s o u n d i r r a d i a t i o n ，af a v o r a b l ea c c e l e r a t i o ni nr e a c t i o nr a t e s ，s o l v e dt h ep r o b l e m so f i n c o m p l e t ec o n v e r s i o no f2 ”，y - d i b r o m o c e p h a l o m a n n i n et oc e p h a l o m a n n i n e ， t h eb y p r o d u c t sa n dl o n gr e a c t i o nt i m ew i t ht r a d i t i o n a ls t i r r i n gc o n d i t i o n ，t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tz i n c p o w d e ri s a ne f f e c t i v er e d u e e rw i t hu l t r a s o u n d i r r a d i a t i o na t2 0 u n d e rt h ec o n d i t i o nt h ed e b r o m i n a t i o ni sa na p p a r e n t s e c o n do r d e rr e a c t i o nw i t lr e s p e c tt o2 ”，3 - d i b r o m o c e p h a t o m a n r f i n e ，w h i l et h e r a t ec o n s t a n ti s0 8 8 91o m o l m i n ( 4 ) w i t ht h ec o n t r o lo fr e a c t i o nc o n d i t i o na n ds e p a r a t i o nm e t h o d ，w er e a l i z e dt h e c o n v e r s i o no fc e p h a l o m a n n i n et ot a x o i ，w h i c he n h a n c e dt h e r e s o u r c e u t i l i z a t i o no ft a x u s k e y w o r d s ：c l e a n e rp u r i f i c a t i o n ，c e p h a l o m a r m i n e ，2 ”，3 ”一d i b r o m o c e p h a t o m a n n i n e ， b r o m i n a t i o n ，u l t r a s o u n d ，r e s o u r c eu t i l i z a t i o n i i 三尖杉宁碱的清洁纯化与综合利用 复旦大学硕士学位论文 第一章紫杉醇研究进展 1 1 天然药物的研究与开发 由于人类自然生态环境的破坏，以及化肥、农药的大量使用，使人类健康受 到严重威胁。随着世人“回归自然”呼声的高涨，人们对天然药物的需求正在日 益扩大，天然药用植物资源的保护、研究与开发成为世界传统医药学术会议致力 于探讨的重要问题。据统计，目前世界药用植物及其制品、保健品、化妆品、香 料等成交额超过8 0 0 亿美元。中国被世界称为“植物药宝库”，我国约有中药品 种1 2 万种，而供国内和出口使用的只有1 0 0 0 1 5 0 0 种，资源潜力很大。 目前，由于经济利益的驱使，我国些地区在不同程度上对野生药用植物资 源进行掠夺式采收，加之违反自然规律的不适当垦殖和其他一些原因，致使一些 药用植物丧失了适宜的生态环境，减弱了资源的再生能力，甚至趋于衰退或濒临 灭绝。药用植物资源的开发利用与资源保护再生的对立和矛盾，只有通过深入研 究，合理利用，才能便药用植物资源得以可持续发展。 红豆杉是当前世界上研究最热门的药用植物之一。美国国家食品与药物管理 局( f d a ) 历经2 0 多年的努力从红豆杉树皮中发现和提取的抗癌药一紫杉醇， 以其独特的治癌机理和疗效显著而风靡全球，从而促成了世界性开发红豆杉和提 取紫杉醇的新潮流。但由此导致红豆杉野生资源的严重破坏、濒临灭绝的现象， 也不容忽视。 目前由于紫杉醇的原料主要来源于红豆杉树皮，加之红豆杉属植物生长缓 慢，国际上对紫杉醇的需求量又大，已导致野生资源紧张，甚至面临资源枯竭。 本文通过对种植红豆杉提取紫杉烷类物质的工艺的改进，利用紫杉醇伴生物三尖 杉宁碱半合成紫杉醇及其他类似物，对植物资源的综合利用，达到减少对生态环 境的危害的目的。 1 2 紫杉醇的研究历史 早在1 8 5 6 年l u c a s 就从浆果红豆杉( t a x u sb a c c a t al ) 的叶片中提取出粉末状 碱性部分，即紫杉碱( t a x i n e ) 。其后，日本、美国分别进行了多方面的研究。1 9 6 2 年美国农业部( u s d a ) 收集了大量的短叶红豆杉( t a x u sb r e v i f o l i an u t t ) 的树皮并 进行了研究，1 9 6 9 年确定了该树皮中对k b 细胞具有细胞毒性的有效成分为紫 杉碱( p a c l i t a x e l ，商品名t a x 0 1 ) 。w a l l 及其合作者于1 9 7 1 年首次从短叶红豆杉的树 皮中分离到紫杉醇。同年，w a l l ，w a n i 与m c p h a i t 合作，对紫杉醇进行x 射线 三尖杉宁碱的清洁纯化与综合利用 复旦大学硕士学位论文 衍射分析，确定了其结构1 1 ( 图1 一i ) 。 图1 1 紫杉醇的结构 分子式c 4 7 h 5 水0 1 4 ，分子量8 5 3 8 9 19 8 3 年美国国立癌症研究所( n c d 报告【2 1 紫杉醇对人乳腺癌、结肠癌等实体 癌有中等抗肿瘤作用。1 9 9 3 年，美国f d a 批准该药治疗对常规化疗，包括顾铂 在内无效的卵巢癌和乳腺癌，对肺癌及其它癌症的治疗进行临床试验。目前已有 1 3 个国家批准紫杉醇可用于癌症的治疗。紫杉醇被认为是近3 0 年来天然抗癌药 物研究领域最重大的发现，为广大癌症患者带来了福音。 1 3 紫杉醇自然资源状况 紫杉醇及其类似物迄今为止仅存在于裸子植物红豆杉科( t a x a c e a e ) 瓶杉 属( r a x u s ) 和澳洲红豆杉属口u s t r o t a x u s ) 中。红豆杉属植物全世界共有1 1 种，广泛 分布于欧亚大陆和北美的寒带、温带及亚热带地区。红豆杉植物的分布特点是天 然散生，无纯林，以“混生、复层、异龄”为主要存在特征，加之生长缓慢，自 然更新困难，因此资源很容易遭受严重破坏。故而，红豆杉属植物资源问题已经 引起各国政府和环保专家的高度重视，在我国云南等地区的红豆杉野生资源已经 受到严重的破坏，现属于控制采伐的树种。紫杉醇在红豆杉植物中含量普遍很低， 根据现有的资料表明，短叶红豆杉树皮中紫杉醇类化合物的含量最高，但也仅为 0 0 0 3 o 0 6 9 【3 】。但是，国际对其需求量相当大，按每个病人需要1 2 3 0 g 计算，全世界每年约需5 0 0 砖的紫杉醇才能满足广大患者的需求。若从树皮中 提取，每年需砍伐6 0 年生大树1 5 0 2 0 0 万棵左右。即使按全世界每年需5 0k g 紫杉醇计算，全世界红豆杉属植物也仅能够砍伐l o 1 5 年。如此大量的砍伐将 对红豆杉属植物的长期存留和地区分布带来威胁，对森林和人类环境以及生物多 2 箩：卜 瓠一伽 三尖杉宁藏的潦溢纯化与综合币j 用 复旦大学硕士学垃论文 样性，造成不可弥补的损失。 1 4 紫杉醇药源的研究与开发 由于紫杉醇在树皮中的含量低，所以用自然来源方式来获取临床所需的紫杉 醇，将给红豆杉属植物带来极大的威胁。目前太平洋紫杉等几种红豆杉属植物已 经被列为濒危树种。日益增长的需求与红豆杉资源的匮乏，推动了紫杉烷类化合 物的资源综合利用的研究。围绕这个问题，研究者主要从以下几个方面进行研究 以解决紫杉醇的资源问题。 1 4 1 植株裁培法 植株栽培法即通过杂交的方法，获得生长周期短，并与直接提取法相结合来 分离提纯紫杉醇，但是由于土地资源有限，而且受到土壤、气候、水分、季节等 因素的影响，使得该种方法的推广受到限制。 1 , 4 2 全合成法 迄今为止紫杉醇的化学全合成共有三条路线，即1 9 9 4 年h o l t o n l 4 1 、1 9 9 4 年 n i c o l o a u 【5 】、1 9 9 6 年d a n i s h e f s d y 6 相继报道的合成路线。然而紫杉醇结构异常复 杂因而合成路线太长，中间步骤的收率又相差很大，并且所用化学试剂昂贵且收 率低，使得这种方法目前仅具有研究意义，缺少实用价值。 1 4 3 真菌培养法 1 9 9 3 年美国蒙大拿州s t i e r l i 博士开始从该州北部杉林种的紫杉树上分离得 到种真菌，为t a x o m y c e sa n d r e a n e ，该真菌在半合成的液体培养基上能合成 紫杉醇，但产量极低，为4 5 “g l ，限制了该方法的应用。 1 4 4 植物细胞培养法 利用红豆杉细胞大量培养技术生产紫杉醇是扩大紫杉醇来源的重要途径之 一，1 9 8 9 年c h r i s t e n i s 首次报道了通过红豆杉植物细胞培养方法生产紫杉醇的研 究情况。虽然目前该方法的研究取得了可喜的进展，植物细胞培养方法又存在着 许多缺陷阻碍这类技术的实际应用，如：植物细胞较大，有纤维素的细胞壁；抗 剪切力差、植物细胞在培养过程中生长缓慢，易被其他微生物污染：培养细胞产 物滞留于细胞内，产量低；培养时需供养等。迄今为止，国内外红豆衫培养细胞 中紫杉醇产量通常都不高，即使偶有报道获得较高的产量也都存在产量不稳定的 问题p 1 3 1 。 1 4 5 半合成法 半合成法是指将红豆杉属植物中所含的紫杉醇类似物经过某些化学反应，将 三尖杉宁碱的清洁纯化与综合利用 复旦太学硕士学位论文 其转化为紫杉醇。紫杉醇前体药物1 0 乙酰基巴卡亭i i i ( 1 0 d a b ) ：f i 巴卡亭i 为原 料，通过选择性保护羟基，然后在c 1 3 羟基上接上合成的侧链，再去掉保护基 团得到紫杉醇【1 4 1 ”。1 0 乙酰基巴卡亭i i i ( 1 0 一d a b ) 和巴卡亭i 在红豆杉植物中的 含量较紫杉醇丰富，而且反复采集树叶不会影响植物资源的再生，更大限度地利 用植物资源，目前看来，半合成法是具有实用价值的制备紫杉醇的方法。 c o p h 1 0 d a bi i i 图1 2 1 0 一去乙酰基巴卡亭( 1 0 - d a b ) 和巴卡亭( b a c c a t i n1 1 1 ) 的结构 根据紫杉醇构效关系的研究成果，利用半合成法对红豆杉提取物中的紫杉烷 化合物进行结构改造，可以使某些难以与紫杉醇分离而本身利用价值又不大的紫 杉醇的类似物转化为具有紫杉醇类似活性的化合物，既解决了紫杉醇的分离提纯 难题，避免了色谱分离过程中大量有机溶剂的使用和浪费，实现了清洁生产；半 合成的产物本身具有高生物活性又实现了红豆杉植物资源的综合利用。 1 5 紫杉醇的清洁纯化方法 无论从天然红豆杉植物中还是从培养的植物细胞及微生物发酵液中提取紫 杉醇，或者研究各种紫杉烷类化合物的抗癌活性都涉及到如何提取和分离的问 题。据不完全统计，从各种红豆杉资源途径至少已分离获得3 0 0 多种紫杉烷类化 合物。开发出高效、快捷、经济实用的提取和分离手段，将直接影响到紫杉醇的 产量。 提取紫杉醇的工作十分复杂，难度较大。其主要原因是：紫杉醇在植株体内 的含量太低，存在大量的紫杉醇类似物。这些类似物的化学结构和性质均和紫杉 醇相近，致使紫杉醇与它们的分离十分困难，尤其是与三尖杉宁碱 ( e e p h a l o m a n n i n e ) 及其类似物的分离。 三尖杉宁碱的清洁纯化与综合利用 复旦夭学硕士学位论文 三尖杉宁碱最初是p o w e l l 等15 1 从三尖杉( c 印 d f 0 甜“5 ，l 彻f f ) 中分离到，后来 m i l l e r 等16 ，1 7 1 发现西藏红豆杉也含有这种物质。它对人体鼻咽癌( k b ) 细胞有细胞 毒活性，其e d 5 0 为3 8 x 1 0 “g m l 。对小鼠淋巴细胞白血病p 3 8 8 亦有显著的抑 制作用。缅胞培养实验也用作细胞毒索荆( c y t o t o x i c ) 。它的结构也是通过甲醇降 解( m e t h a n o l y s i s ) 和x 晶体衍射方法加以确定的( 图1 3 ) a 图1 3 三尖杉宁碱的结构 分子式c 4 5 h 5 3 n 0 1 4 分子量8 31 9 3 该化合物与紫杉醇结构相似，唯一的区别在于它的c 1 3 侧链末端是双键而 不是紫杉醇结构式中的苯环，曾被认为是与紫杉醇最难于分离的一个化合物。用 柱层析的方法，常压和低压层析得到紫杉醇和三尖杉宁碱的混合物，然后再用常 规的柱层析把紫杉醇分离出来，分离不完全b s 。用制各t l c ，h p l c 等方法以及 一些较先进的分离手段如h p l c ，h s c c ( 高速逆流色谱) 相结合的方法，同样 无法把紫杉醇与三尖杉宁碱完全分开u 剐。直到利用其端基双键可以被选择性氧化 的性质，才得以解决它们的分离问题。 国内外学者围绕紫杉醇的提取与纯化开展了大量卓有成效的工作。主要的分 离纯化方法有以下几种：溶剂萃取法1 1 9 吲】、薄层色谱法【2 0 ，2 2 ，2 、膜分离法 2 4 , 2 5 1 、 超临界流体萃取法 2 6 - 2 s 、离子交换树脂法1 2 4 ，2 9 】、柱层析法【3 2 1 、高速逆流色谱 法盼3 、药理作用靶点法【3 5 】以及化学反应法。化学法是目前常用的行之有效的 方法。下面主要介绍和本文工作关系密切的化学反应法的发展历程： k i n g s t o n 等口6 悃o s 0 4 处理紫杉醇与三尖杉宁碱的混合物，发现o s 0 4 能选 择性地氧化三尖杉宁碱c 。1 3 侧链末端的双键，使之形成二元醇 ( c e p h a l o m a n n i n e d i 0 1 ) ，而紫杉醇却不受影响。反应混和物经柱层析就可以将紫杉 醇和c e p h a l o m a n n i n e d i 0 1 分开。这种方法的主要缺点是：对底物的纯度要求高， 反应条件苛刻，不适宜氧化那些没有纯化的紫杉烷类化合物的混合物中的三尖杉 宁碱；氧化剂o s o 。毒性大、价格昂贵，缺乏实用性。 m u r r a y 等口7 i 发现用含1o 一1 0 的0 3 可氧化三尖杉宁碱中的某些烯键，而 三尖杉宁馘韵清洁纯化与练台乖j 用 复旦犬学硕士学位论文 对紫杉醇中的另一种烯键却不起反应。反应混和物经硅胶柱层析就可以使其中的 紫杉醇得到有效的纯化。但这一方法仍然需要采用硅胶柱层析才能把紫杉醇和其 它被氧化的紫杉烷类化合物分开，经济上还不是很合理。因此，m u r r a y 对上述 方法又进行了改进例：在经0 3 氧化后，再加入吉拉德氏酞肼a c o h 混合物，使 o z o c e p h a l o m a r m i n e ( 一- - 尖杉宁碱被0 3 氧化后的产物) 转变成o z o c c p h a l o m a n n i n e 吉拉德氏腙这一复合物，最后通过选择性沉淀或乙酸乙酯一水等萃取就可以把紫 杉醇分离出来。用甲醇水( 3 ：1 ) 选择性沉淀，乙酸乙酯- 水一甲醇( 1 0 ：2 ：1 ) 以及 乙酸乙酯水萃取，得到的紫杉醇的纯度分别可达到9 7 5 、9 0 和9 5 ，这使 该法有望成为大规模纯化紫杉醇的理想方法。 1 9 9 6 年k i n g s t o n 等人1 3 训用液溴或毗啶精过溴化物、四丁基三溴铵作为氧化 剂，室温下在氯仿中反应5r a i n ，可以使紫杉醇和三尖杉宁碱混合物中的三尖杉 宁碱转化为2 ”，3 - 二溴三尖杉宁碱( 2 ”，3 - d i b r o m o c e p h a l o m a r m i n e ) ，而紫杉醇 不受影响。反应混和物用二氯甲烷稀释后，依次用1 0 n a 2 s 2 0 3 水溶液、水和 盐水洗涤。硅胶柱纯化，可得纯度为9 5 的紫杉醇和2 ”，3 - 二溴三尖杉宁碱， 而2 ”，3 - 二溴三尖杉宁碱在乙醇中有搅拌条件下，用锌处理2h ，反应后的溶液 用乙酸乙酯稀释2 0 倍，依次用饱和n a h c 0 3 溶液、水和盐水洗涤后，经制备t l c 纯化，三尖杉宁碱收率可达9 2 ，纯度为8 8 。 p a n d e y 【4 0 4 l j 等也于1 9 9 8 年使用溴化法分离三尖杉宁碱获得成功，并且通过 药理实验证明2 ”，3 - 二溴三尖杉宁碱的两个非对映异构体都具有与紫杉醇相当 的抗髀瘤活性。该溴化反应是一个加成反应，本身严格按照化学计量比进行，是 原子经济性的反应，反应过程中不产生副产物，符合绿色化学的原则，这使得溴 化法成为既解决紫杉醇和三尖杉宁碱类似物分离这一难题，同时是实现红豆杉植 物提取物中紫杉醇类似物资源综合利用的最有效、最有价值的方法之一。 1 6 三尖杉宁碱的综合利用 尽管p a n d e y 的药理实验证明2 ”，3 - 二溴三尖杉宁碱的两个非对映异构体都 具有与紫杉醇相当的抗肿瘤活性。然而由于2 ”，3 ”二溴三尖杉宁碱的两种手性 异构体的分离非常困难 4 2 】。且毒性比紫杉醇大，缺乏实际应用价值。三尖杉 宁碱对人体鼻咽癌( k b ) 有细胞毒活性，对小鼠淋巴细胞白血病p 3 8 8 有显著的 抑制作用，配合地塞米松对粒细胞性白血病疗效较好1 1 7 1 ，已经作为临床制剂用 于白血病的治疗。所以将2 ”，3 - 二溴三尖杉宁碱还原成三尖杉宁碱后加以利用 具有特别重要的意义。在k i n g s t o n 等人【3 9 i 的溴化反应中已经尝试在室温下用z n 粉还原2 ”，3 - 二溴三尖杉宁碱，产率最高达到9 2 。 对于三尖杉宁碱向紫杉醇转化的研究，最早是通过将三尖杉宁碱转换为1 0 6 三尖钐宁碱鹊清洁纯化与综台乖j 用 复旦大学硕士学位论文 去乙酰基巴卡亭i l l 4 3 1 ，再采用紫杉醇的半合成方法【1 4 ，1 5 】实现的。这种方法反应 步骤多，影响得率，迭不到对资源充分利用的目的。基于三尖杉宁碱与紫杉醇在 结构上的相似性，自1 9 9 4 年k i n g s t o n 等人m 1 开始着手于由三尖杉宁碱直接转化 为紫杉醇的研究。1 9 9 7 年k i n g s t o n 等人【4 1 以o s 0 4 或0 3 氧化三失杉宁碱c 1 3 侧链朱端的双键，对产物o z o c e p h a l o m a n n i n e ，用苯甲酸使其c 一2 位上的羟基酰 化，进而脱去c 一3 n 位上的羰基，通过分子重排得到紫杉醇。由于每一步的产物 均通过t l c 纯化，产物得率低，缺乏实用价值。 1 7 在绿色化学思想指导下论文的研究内容 由于三尖杉宁碱与紫杉醇在结构上的相似性，以往只能使用反相色谱柱或者 通过多步柱分离才能实现两者的完全分离。导致了分离成本过高，设备投入大， 生产规模受到设备的限制，不适合进行大规模的商业生产。本论文采用柱溴化法， 操作简单，能够通过一次性反应处理大量原料，使溴化法分离紫杉醇与三尖杉 宁碱的工业化得阻实现。 本论文利用加成反应这种原子经济性反应，通过严格的计算，加入反应适量 的液溴，使原料分子中的原子更多进入最终的产品之中。采用直接滴加液溴的方 法，而非k i n g s t o n 3 9 】与p a n d e y 4 川等的滴加溴溶液的方式，减少了反应时间和试 剂的使用。整个溴化反应最大限度地利用了反应原料，节约了资源：最大限度地 减少了废物的排放；因而最大限度地减少了环境污染：适应可持续发展的要求。 绿色化学考虑到了能源的经济性。而化工过程中的分离、提纯是一个相当消 耗能量的步骤。通常的净化与分离可通过精馏、萃取、再结晶等操作实现，但均 需要大量的能量来实现产品从杂质中的分离。必须在化学过程的设计中充分考虑 能源的节约与最佳利用，要考虑能量的需求因素以让化学过程更有效。化学工业 节能的一个重要方法是通过优化过程设计，减少分离操作的需要，从而可大大降 低对能源的需要。 论文根据绿色化学的原理，尽可能减少分离步骤。通过对溴化反应产物的液 相直接上样，柱层析分离，减少了k i n g s t o n 使用的依次用1 0 n a 2 s 2 0 3 水溶液、 水和盐水洗涤，减压干燥在柱分离的多个步骤。柱层析使用的流动相通过回收循 环使用最大限度地利用资源减少了污染物的产生量、排放量，保护了生态环 境， 在柱层析过程中，本论文摒弃了以往的卤代物溶剂，采用低毒低害的溶剂乙 酸乙酯- 正己烷体系，达到溶剂的绿色化，以实现整个反应的绿色化，最后得到 绿色化的产品。 在2 ”，3 - 二溴三尖杉宁碱的还原中，突破原有的加温搅拌的反应条件。考 三尖杉宁碱的清洁纯化与综合利用复旦大学硕士学位论文 虑到金属参与的反应，超声辐射有较好的促进作用。利用清洁能源超声波，使 反应物质的局部环境得到改善以促进化学转化的发生。降低反应温度，从而优 化反应的能量需求。在本论文中，2 ”，3 - 二溴三尖杉宁碱的还原效率可以达到 9 8 以上，有效地阻止副产物的生成，提高反应的选择性，减少反应时间，进 一步提高红豆杉资源的利用率。 我们基于k i n g s t o n 等人【4 5 哿三尖杉宁碱转化为紫杉醇的方法，在反应条件、 产物的纯化方式上进一步改善，实现了三尖杉宁碱向紫杉醇转化。 综上所述，本论文依据绿色化学的原理，从节能、降耗、减污、资源的综合 利用角度改进条件，使原材料最大限度地转化为产品，把污染消灭在生产过程中； 通过改进设备，进一步提高能源的利用率，以最大限度地利用资源、能源。既减 少了污染物的产生量、排放量，保护了生态环境，又节约了资源、能源，用较少 的投入获得较大的产出，推动经济发展，满足了持续发展对资源永续利用和环境 容量的持续承载力的要求。 三尖杉宁碱的清洁纯化与综合利用 复旦大学硕士学位论文 第二章实验部分 2 1 原料与试剂 红豆杉粗提物( 主要含有紫杉醇，三尖杉宁碱，及少量7 表1 0 去乙酰基紫 杉醇) 。 氯仿、四氯化碳、甲醇、液溴、乙酸乙酯、正己烷、冰乙酸；1 0 0 2 0 0 目 柱层柝硅胶，无水n a 2 s 0 4 、n a 2 s 2 0 ”n a h c o 、分子筛、锌粉、铝粉( 1 0 0 2 0 0 目) 、铁粉、锡粒、镁粉，苯甲酸，甲苯4 一磺酸，n ，n 二环己基碳酰亚胺 ( d i c y c l o h e x y l c a r b o d i m i d e ，简称d c c ) ，二氯甲烷，以上所用试剂均为分析纯， 上海试剂公司出品。 正己酸，化学纯；邻苯二胺，化学纯，4 一二甲氨基毗啶 ( 4 一d i m e t h y l a m i n o p y r i d i n e ，以下简称d m a p ) ，化学纯：氢化钙，9 5 ：1 0 0 2 0 0 目2 柱层析硅胶；分子筛：上述试剂由上海试剂公司出品。 4 一p y r r 0 1 i d l n o p y i d i n e ( 吡咯嘧啶) ，9 8 ；t r i m e t h y l a c e t i ca c i d ( = 1 平基乙酸) ， 9 9 ，以上两者为进口试剂。 复旦泉蒸馏水。 高纯氧，纯度 9 9 9 9 9 ；高纯氮，纯度1 9 9 9 9 9 ，上海运光工业气体有 限公司。 h p l c 专用去离子水经过法国m i l l i p r o 公司m i i l i - qs a 6 7 1 0s h t e i m 滤水 器过滤制备。 进行h p l c 分析的流动相均为h p l c 纯度的甲醇、乙腈，上海试剂公司出 品。 2 2 仪器与设备 2 2 1 检测分析仪器 反相分析型高效液相色谱。美国惠普公司的a g i l e n t1 1 0 0 系列液相色谱，包 括：溶剂箱、四元梯度泵、真空脱气机、标准微量自动进样器、恒温柱温箱、可 变波长检测器( v w d ) 。赛洋1 2 g 台式计算机( a g i l e n tc h e m s t a f i o n4 0 9 0 1 色 谱工作站) 。日本s h i s e i d o 公司c a p c e l lp a kc 1 8 分析色谱柱( 4 6m l t l i d x 2 5 0m m ，5p m ) 。 反相半制各色谱为a g i l e n t1 1 0 0 系列液相色谱改装而成，加装一个定量环。 半制备色谱使用k r o m a s i lk r l 0 0 - 5c 1 8 半制备柱( 1 0m l t li d x 2 5 0m i l l ，5 岫) 。 9 三叁望! 堕塑望堕型些兰堡垒型旦 星呈查兰堡圭兰垡堡兰 正相制备色谱为大连依利特分析仪器有限公司的高效液相分离色谱装置， 包括：两个p 2 8 0 高压恒流泵和一台u v 2 0 0 i i 型紫外可变波长检测器。采用美国 m e r c k 自装正相硅胶制备柱( n w 5 0 ，5 0m l t li d x 2 5 0r ! l l n ，7g m ) 。 l c m s m s ( 液质联用) 。t h e r m of i n n i g a n 公司的l c qa d v a n t a g em s s y s t e r m ，包括t s p 高效液相色谱系统和l c qa d v a n t a g e 质谱检测仪， x c a l i b u r1 0 0 1 ，m e t a c h e m 公司的t a x s i l 一3 柱( 4 6m mi d x 2 5 0m m ，5g m ) 。 质谱分析条件为电喷雾化学解离( e s i ) 和大气压化学电离( a p c i ) ，e s i 壳气为7 0 单位，辅助气为1 5 单位，源电压为6 k v ，加热毛细管温度为2 5 0 ，蒸发器 温度为4 6 5 。a p c i 壳气为6 5 单位，辅助气为2 0 单位，源电压为4 5k v ， 加热毛细管温度为3 5 0 。 f t i r ( 傅立叶红外光谱检测) 。使用n i c o l e t a v a t a r3 6 0 型f t i r 仪，k b r 压片，m c t 检测器；红外光谱数据使用o m n i ce s p 软件进行采集和定性、定 量分析，典型的测量参数为：扫描范围6 5 0 - 4 0 0 0c m ：分辨率2c m - 1 ：扫描次 数1 0 0 次。 2 2 2 其它仪器 上海申生科技有限公司r 5 0 1 型旋转蒸发仪；河南省巩义市英予华仪器厂 s h z c 型循环水式多用真空泵；2 x z - 1 型旋片式真空泵；德国s t a r u t sb p 2 1 1 d 型 精密电子天平( o 1m g ) ；2 k - 8 2 a 型真空干燥箱：上海司乐仪器厂8 5 1 磁力搅 拌器。b r u k e r d m - 5 0 0 核磁共振仪。t 3 1 0 h 型超声波清洗仪( 德国f i s h e rs c i e n t i f i c t r a n s o n i c 公司) ；c a r o nm o d e l # 2 0 5 0 w 恒温循环冷却水装置；法国m i l l i p r o 公司m i l l i qs a 6 7 1 0s h t e i m 滤水器；上海威振环保设备厂，w f g 3 臭氧发 生器。 2 3 色谱条件 反相分析型h p l c ：1 ) 检测条件1 ，柱温为3 5 ；使用h p l c 级甲醇乙 腈- 水( 体积比3 0 ：3 0 ：4 0 ) 的流动相；流速为1 0m l d m i n ：紫外检测波长2 2 7n r n ； 每次进样量为1 0 此，柱压1 0 5 1 0 6b a r 。2 ) 检测条件2 ，柱温为3 5 ；使用 h p l c 级甲醇水( 体积比6 0 ：4 0 ) 的流动相；流速为1 0m l m i n ；紫外检测波长 2 2 7r i m ；每次进样量为1 0 血，柱压1 0 5 1 0 6b a r 。 反相半制备h p l c ：柱温为3 5 ；使用h p l c 级乙腈水( 体积比3 7 ：6 3 ) 的流动相；流速为5 0m l m i m 紫外检测波长2 2 7n l t l ；每次进样量为1 0 0 乩。 正相制备色谱：流动相为正己烷( 经无水n a 2 s 0 4 脱水) 乙酸乙酯( 经无水 1 0 三尖杉宁碱的清洁纯化与综合利用 复旦大学硕士学位论文 n a 2 s 0 4 脱水) 配成体积比为l ：l 溶液( p = 0 7 8 3g m l ) ；流速为5 0m l m i n ：紫 外检测波长2 5 4n l t l 。 反相制备色谱：流动相为甲醇水体积比为6 ：4 ( o = 0 8 9 1g m l ) ，流速为 5 0m l m i n ；紫外检测波长2 2 7n i l 2 。 质谱分析条件为电喷雾化学解离( e s i ) 乖i 大气压化学电离( a p c i ) ，e s i 壳气 为7 0 单位，辅助气为1 5 单位，源电压为6k v ，加热毛细管温度为2 5 0 ，蒸 发器温度为4 6 5 。a p c i 壳气为6 5 单位，辅助气为2 0 单位，源电压为4 5k v ， 加热毛细管温度为3 5 0 。液相色谱流动相为a c n ：h 2 0 = 5 1 ：4 9 ，流速为0 8 m l m i n ，柱箱温度为4 0 ，检测波长为2 2 7 蛳。质荷比用m z 表示，质量数 丰度用，表示。 2 4 实验过程 2 4 12 ”，3 - 二溴化三尖杉宁碱的制备 三尖杉宁碱与紫杉醇的混合物可以通过与液溴的反应，使三尖杉宁碱转 化成2 ”，3 ”二溴化三尖杉宁碱( 2 ”，3 ”一d i b r o m o c e p h a l o m a n n i n e ) ，紫杉醇的结构 不受影响。反应以及过程如下图2 1 所示。 b r 2 2 ”( r ) ，3 ”( s ) - c o p h 2 ”( s ) ，3 ”( r ) 一二溴代三尖杉宁碱 图2 1 三尖杉宁碱的溴化反应示意图 三尖杉宁藏的清洁纯化与综合利用复旦大学硕士学位论文 而反应产物2 ”，3 - 二溴化三失杉宁碱与紫杉醇的混合物可以通过色谱柱 正相分离，经过h p l c 检测，分段收集馏分，浓缩干燥、结晶，分别得到高 纯度的2 ”，3 ”二澳化三尖杉宁碱与紫杉醇。 2 4 22 ”，3 - 二溴化三尖杉宁碱的还原 取由上述制各过程得到的2 ”，3 ”二溴化三尖杉宁碱，溶解于乙酸乙酯中，以 少量冰乙酸调节酸度，加入金属粉末作为还原剂，在超声波作用下进行反应， 还原产物为三尖杉宁碱。在反应过程中用h p l c 跟踪检测，了解反应进程。 通过改变反应的温度、酸度( p h 值) 和分散条件以及选用不同的还原性金属， 探索最佳反应条件。 对反应产物进行过滤、蒸干，通过重结晶，通过h p l c 、l c m s m s 、 1 h n m r 等检测，与m i l l e r i ”1 、k i n g s t o n t 3 9 1 和p a n d e y 4 。1 等人的数据基本一致， 可以确定得到的产物是高纯度的三尖杉宁碱。 2 4 3 三尖杉宁碱向紫杉醇的多步转化 ( 1 ) 三尖杉宁碱的0 3 氧化。将三尖杉宁碱在氯代溶剂中溶解，低温下进 行0 3 氧化，得到氨基酮类产物3 ( 3 a & 3 b ) ：产物经过反相半制各h p l c 纯化。 ( 2 ) 氨基酮类产物3 的酰基化反应。产物3 与苯甲酸、n ，n 二环己基碳 酰亚胺、毗咯嘧啶在室温下反应4h ，其c 2 上的羟基与苯甲酸发生酯化反应， 得到产物4 ：产物4 经反相半制备i t p l c 分离纯化。 ( 3 ) 生成紫杉醇。产物4 与甲苯- 4 磺酸，邻苯二胺在苯溶剂中，8 0 下 回流反应1 2 1 8h ，通过分子重排，得到目标产物紫杉醇。 该多步反应的流程以及各个产物将在第五章中详细介绍。 2 三尖杉宁碱的清洁纯化与综合利用 复旦大学硕士学位论文 第三章2 ”，3 ”二溴化三尖杉宁碱的合成与分离 3 1 柱溴化法分离紫杉醇与三尖杉宁碱的原理 由于三尖杉宁碱与紫杉醇在结构上的相似性，以往只能使用反相色谱柱或者通 过多步柱分离才能实现两者的完全分离。导致了分离成本过高，设备投入大，生产 规模受到设备的限制，不适合进行大规模的商业生产。根据k j n g s t o n 3 9 - 与p a n d e y 【4 0 】 的研究结果，三尖杉宁碱在溴化过程中，c 1 3 侧链末湍的双键与溴发生反式加成反 应，生成极性较小的两个非对映异构体，为2 ”，3 ”二溴化三尖杉宁碱 ( 2 ”3 ”一d i b r o c c p h a l o m a n i n e ) 。 紫杉醇与三尖杉宁碱的结构式中都包含了多个碳一碳双键( 如图l 1 ，1 3 所 在：紫杉醇c 一1 3 侧链末端的两个p h 基团及c 1 l 与c 1 2 间的c - = c 上；三尖杉宁 碱c 一1 3 侧链末端的c - = c ，c 一3 所连的苯环及c 1 l 与c 1 2 间的c = c 上。p h 基 团是一个环闭的共轭体系，相当稳定，同烯烃相比，不易被氧化，不易被加成，而 容易发生取代反应。紫杉醇c 一1 3 侧链末端的有一个p h 基团所连的c 原子通过不饱 和键与电负性较强的氧原子相连，与苯环间能形成兀7 【共轭体系，对苯环起吸电子 作用，有利示) ，所以对于紫杉醇与三尖杉宁碱的混和原料，反应可能发生于发生亲 “， 核取代：而另一个苯环上连的是邻对位取代基( 一山) ，有给电子作用，对于亲电 取代反应，有使苯环活化的作用。而苯环的卤代反应是铁盐或铝盐作为路易斯酸与 卤素络合，而使卤素分子极化，然后此络合物作为亲电试剂，将带正电荷的卤素原 子转移给苯环。所以c - 3 上所连的苯环更容易发生取代反应。由于b r 原子比较大， 不容易与空间位阻大的c 原子发生加成反应，故而c 1 1 与c 1 2 间的c = c 不易被 氧化。而烯烃的加成，在常温下，非光照条件，就可发生。三尖杉宁碱c 一1 3 侧链末 端的c = c ，由于受到c 一1 ”_ n 的酰胺的影响，c 2 ”和c 3 ”的双键7 【电子云向c 一2 ” 乃至c 一1 ”方向偏移，有利于正溴离子的进攻。因此b r 2 最有可能与三尖杉宁碱c 1 3 侧链末端所连的c = c 发生加成反应，生成2 ”，3 ”二溴化三尖杉宁碱 ( 2 ”3 ”d i b r o c e p h a l o m a n i n e ) 。 2 ”，3 ”一二溴化三尖杉宁碱与紫杉醇可以通过柱层析的方法分离。本论文采用溴 化反应产物的液相直接上样，柱层析分离，减少了k i n g s t o n 使用的依次用1 0 n a 2 s 2 0 3 水溶液、水和盐水洗涤，减压干燥在柱分离的多个步骤。以干燥的硅胶装 三尖杉宁碱的清洁纯化与综合利用 复旦大学硕士学位论文 柱后直接加入溴化反应后的溶液，相较之下操作简单，简化步骤，减少试剂溶剂的 使用。 3 2 柱澳化法分离紫杉醇与三尖杉宁碱的实验室研究 3 2 1 柱溴化分离紫杉醇与三尖杉宁碱 将1 0 0 2 0 0 目的硅胶在1 1 0 下连续烘2 小时，取其中2 5 克装入2 0m m 3 0 0 m m 的玻璃层析柱中，填实，待用。 在5 0 m l 磨口带塞茄形瓶中称取1 0 0 0g 紫杉醇粗提物，如图3 1 所示( 以 h p l c 检测，测得原料中各物质的峰面积含量为：紫杉醇3 7 8 8 ，三尖杉宁碱 4 3 8 4 ，7 表一l o 一去乙酰基紫杉醇4 8 3 ) ，加5m l 氯仿完全溶解。通过冰盐水 浴将溶液冷却到一5 ，在冰水浴、避光、连续搅拌状态下，以0 1m l 的玻璃移 液管逐滴加入0 0 8m l 液溴，反应5r a i n 后，迅速将反应液倒入己填装好的硅胶 柱中。 t r a i n 图3 1 原料的h p l c 谱图 c ：三尖杉宁碱；t ：紫杉醇；b ：7 表1 0 去乙酰基紫 先用8 0m lc c l 4 试剂淋洗，带走反应中过量的溴，再用氯仿试剂洗脱。以 1 0m l 为一馏分分别收集，收集的各部分馏分用a g f l e n t1 1 0 0 系列h p l c 检测。 根据检测情况，将紫杉醇含量8 5 以上的馏分