（食品科学专业论文）“mEGFMelittin”嵌合基因构建及有关基因重组表达的研究.pdf

浙江大学 | ! ； 三物系统工程与食品科学学院 中又摘萤 以微生物为宿土匝组表达生物活性蛋 或多肷一血是生物技术研究的热 点。正电性抗蔚肽( c a t i o n i ca n t j m i c r o b i a lp e p t jd e s ，c a p ) 由于其独特 的细胞毒机制而目益引起人们注意。蜂毒溶血肽( m e it ti n ) 作为一种典型 的c a p 具有多种生理活性。小鼠表皮生长因子( m o u s ee p i d e r m a g r o w t h f a c t o r ，m e g f ) 作为种致细胞增殖因子在临床上也有广泛应用。本课题以 大肠杆菌( ec o i l ) 宿主重组表达m e l j t t i n 和m e g f ：以m c li t t i n 为毒性部 分、m e g f 为靶向部分，构建膜毒性免疫毒素；用定量竞争r t p c r 法测定m e g f 体内表达丰度；检验所构建的各重组菌株的遗传稳定性；采用摇瓶分析对各 重组菌株的发酵条件进行了初步优化。住要结果如下： 用t a qd n a 聚合酶进行r t - p c r 获得了中蜂( 加i sc e r a n a ) m e li t t i n 和 m e g f 成熟区的c d n a 克隆。与在3 7 4 2 用m u l v 或a m v 进行反转录相比，在 较高温度下( 7 2 ) 用t a q d n a 聚合酶进行反转录有利于正确、完整的e d n a ， 冈为在高温下m r n a 的二级结构被充分打开。 用由p u c l 8 载体衍生的p u c t 载体进行克隆了中蜂( 和i sc 口埘月a ) m e li t t i n 成熟区c d n a 。测序结果显示与意蜂( a p i sm e l l i f e r a ) m e l i t t i n 成熟区序列相比，中蜂( 和i sc e r a n a ) m e l i t t i n 成熟区序列在第3 3 位存在 差异( 意蜂为a ，中蜂为g ) ，但两者蛋白质一级结构相同，说明m e l i t t i n 作为蜜蜂一种重要的防御基因在进化上保守。 以ee o l i 为重组表达宿主，p e t 3 0 a 为表达载体，对中蜂( 和i sc e r a n a ) m o l i t t i n 进行了重组融合表达。活性检测显示m e l i t t i n 融合蛋白的细胞毒 活性很弱，仅在高浓度时方显示一定的细胞毒作用。但m e l i t t i n 融合蛋自表 达产物经c n b r 切割释放出的天然形态的m e i t t i n 届示出良好的细胞毒活性， 1 u l l 提物对正c o l id h 5 的l d 。值在1 6 u g m l ( 杀伤活性5 2 7 7 6 5 2 ) 与1 4 u g m l ( 杀伤活性4 7 1 4 5 1 6 ) 之间。这些结果表明表达产物呈正确 的空间折叠，而其中由2 个l y s 和2 个a r g 组成的正电区对m e l i t t i n 保持活 性不可缺少。 用p g e m t 载体克隆了m e g f 成熟区e d n a ，并采用定量竞争r t p c r 法测定 了m e g f 体内表达丰度。如以颌下腺中的相对表达丰度为1 ，则腮腺、肾脏、 肺和肝脏中的相对表达丰度分别为：0 8 6 0 1 4 、0 6 2 0 1 8 、0 1 4 0 0 3 和0 0 9 1 0 0 2 。心脏和骨骼肌中未检测到表达。由于e g f 在小鼠各器官中表 达的普遍性，可以推测e g f 的作用以旁分泌和自分泌作用为主，但它在颌下 博士学位论文“m e g f m e l i t t i n ”嵌合基因构建及有关基因重组表达的研究 等器官中的高表达表明其也具有内分泌作用。这一结果为今后对针对e g f r 的 抗肿瘤免疫毒素进行安全性评价提供了基础资料。 以ec o l i 为重组表达宿主，p e t 3 0 a 为表达载体，对m e g f 进行了重组融 合表达。表达产物m e g f 融合蛋白具有较好的活性，其粗提物的活性相当于标 准m e g f 的2 2 5 。预计今后在切除融合伴侣并经精细提纯后活性会进一步提 高。 将m e g f 和m e li t t ir l 的编码区通过一段寡核苷酸( 1i n k e r ) 连接成嵌合 d n a “m e g f m e l ”，并以叵c o l j 为重组表达宿主，p e t 3 0 a 为表达载体，对该嵌 合d n a 进行了重组表达。表达产物“m e g f m e l i t t i n ”是一种膜毒性抗肿瘤免 疫毒素，体外活性检测表明其对表面过度表达e g f r 的鳞状上皮癌凡。细胞表现 出显著的杀伤力，粗提物的l d 。值在5 i u g m l 与5 4 u g m l 之间。 在诱导表达各目的产物时诱导温度为3 0 。c 。更低的温度会影响生物量， 而更高的温度虽有利于获得更高的生物量，但目的产物形成包涵体的比例会变 大。选择3 06 c 为诱导温度既避免了产物变性后所必需的复性环节，又能获得 相对较高的生物量。 破壁后提取ec o l i 中的目的产物会由于菌体蛋白的大量搀杂而使提纯步 骤繁琐，降低得率。本课题采用冻融法( f r e e z i n g t h a w i r i g ) 对各表达产物 进行了初步提纯。结果显示该方法可在较大程度上避免菌体蛋白的大量混杂， 产物纯度达到4 0 以上有利于目的产物后续进一步纯化。今后通过进一步试验 以优化冻融程序，有望使目的产物的纯度达到8 0 以上。 遗传稳定性检验表明，三株重组菌株b l 2 1 一p e t m e l 、b l 2 卜p e t m e g f 和 b l 2 1 一p e t m e g f m e 经传代5 0 代后仍然保持原代细胞所含的外源插入的目的序 列，重组表达的目的产物的活性保持稳定，遗传稳定性良好。 通过摇瓶分析对三株重组菌株b l 2 卜p e t m e l 、b l 2 l p e t m e g f 和 b l 2 1 一p e t m e g f m e l 的发酵条件进行了初步优化。这三株菌株的最佳发酵条件基 本相同，即：装液量为1 5 0 m l ；接种量为1 5 ；培养基初始p h 值为7 o ；使 用乳糖作为诱导物并确定最适诱导浓度为1 0 0 0 0 u m o l l ，诱导效果优于i p t g ： 最适诱导温度为3 0 ；以甘油( 1 2 9 l ) 为c 源与以葡萄糖( 6 9 l ) 为c 源相 比，对数期末菌体浓度提高9 8 2 - 1 8 8 5 ，目的蛋白产率8 0 7 1 6 3 0 。 关键词：溶血肽；表皮生长因子：m r n a 表达丰废；膜毒性免疫毒素：遗传稳 l 定性；发酵 、 浙江大学 7 物系统工程与食品科学学院 a b s t r a c t e x p r e s s i n gh i o a c t i v ep r o t e i n so rp e p t i d e si nm i c r o o r g a n i s m sh a sb e e nah o t s p o t o fb i o t e c h n o l o g ya l lt h et i m e c a t i o n i ca n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s ( c a p ) a r e b e c o m i n gt h ef o c u so fp e o p l eo w i n g t oi t ss p e c i a lc y t o t o x i cm e c h a n i s mm e l i t t i n ， w h i c hi st a k e na sa t y p i c a lc a p , h a sm a n y k i n d so fb i o a c t i v i t i e s m o u s ee p i d e r m a l g r o w t hf a c t o r , m e g f , a saf a c t o rt os t i m u l a t ec e l lp r o l i f e r a t i o n ，a l s oh a sb e e n a p p l i e dw i d e l y i nc l i n i c a l p r a c t i c e ，t h i sp r o j e c t i sa i m e da t ：( 1 ) e x p r e s s i n g m e l i t t i na n dm e g fi n e c o # r e s p e c t i v e l y ；( 2 ) c o n s t r u c t i n gam e m b r a n e t o x i c i m m u n o t o x i nb y u s i n gm e l i t t i n a st o x i c p a r t a n dm e g fa s t a r g e tp a r t ；( 3 ) m e a s u r i n gt h em e g f m r n a e x p r e s s i o na b u n d a n c eb yq u a n t i t a t i v ec o m p e t i t i v e r t - p c r ；( 4 ) c h e c k i n g t h e g e n e t i cs t a b i l i t yo f t h e r e c o m b i n a n ts t r a i n sc o n s t r u c t e d i nt h ep r o j e c t ；( 5 ) o p t i m i z i n gt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h et a r g e ts t r a i n sb y f l a s ks h a k e t h em a i nr e s u l t sa r es h o w na sf o l l o w i n g ： t h em a t u r er e g i o no fm e l i t t i nf r o m a p sc e r a n aa n dm e g f w e r ec l o n e db y u s i n g 勋叮d n ap o l y m e r a s et od or t - p c r c o m p a r i n gw i t hu s i n gm u l v r e v e r s e t r a n s c r i p t a s eo ra m v r e v e r s et r a n s c r i p t a s et od or e v e r s et r a n s c r i p t i o na t3 7 4 2 。c ， m o r ea c c u r a t ea n dc o m p l e t ed n ac o u l db eg o t t e nb y u s i n gr a q d n a p o l y m e r a s e a t7 2 cs i n c ed i m e r i cs t r u c t u r eo fm r n aw a so p e n e df u l l ya th i g ht e m p e r a t u r e t h em a t u r e r e g i o n e d n ao fm e l i t t i no fa p j sc e r a n aw a sc l o n e d b yu s i n g p u c t - v e c t o rd e v e l o p e df r o mp u c l 8 v e c t o r t h es e q u e n c ew a s c o m p a r e dw i t h t h e c o r r e s p o n d i n gr e g i o n o fm e l i t t i no f a p i sm e l l i f e r ar e p o r t e d i n g e n b a n k ，t h e m u t a n ts i t ew a sf o u n di n3 3 r db a s e ( a ：a p i sm e l l i f e r a ；g ：a p i sc e r a n a ) ，b u tt h e p r i m a r ys t r u c t u r eo f t h et w o p r o t e i n sw e r ei d e n t i c a l ，w h i c hs u g g e s t e dm e l i t t i n ，a s a ni m p o r t a n td e f e n s i v eg e n e ，w a sv e r yc o n s e r v a t i v ei ne v o l u t i o n t h ef u s i o n p r o t e i n o fm e l i t t i no fa p sc e l c t n aw a se x p r e s s e db yu s i n g p e t 3 0 a a s e x p r e s s i o n v e c t o ra n de c o l ia s e x p r e s s i o n s t r a i n a c t i v i t y d e t e r m i n a t i o ns h o w e dt h ef u s i o np r o t e i no fm e l i t t i nh a dv e r yw e a kc y t o t o x i c i t y , o n l yi nv e r yh i g hc o n c e n t r a t i o ni t h a ds o m ee f f e c to f c y t o t o x i c i t y b u tt h en a t u r a l 博士学位论文 舭q t “m e g f m e l i t t i n ”嵌合基困构建及有关基因重组表达的研究 m e l i t t i n ，w h i c hi sf o r m e db yc u t t i n gt h eo r i g i n a lf u s i o np r o t e i nu s i n gc n b r , h a d s i g n i f i c a n tc y t o t o x i c i t y t h el d 5 0v a l u eo ft h ec r u d ee x t r a c t i o nt oe c o l id h 5 a w a sb e t w e e nl6 i _ t g m l ( k i l l i n ga c t i v i t y 5 5 7 7 ：t ：65 2 ) a n d l 4 b g m l ( k i l l i n g a c t i v i t y4 71 4 4 - 51 6 1 t h er e s u l t si n d i c a t e dt h es p a t i a ls t r u c t u r eo f t h ee x p r e s s e d p r o d u c tw a sc o r r e c t ，a n dt h ec a t i o n i cr e g i o nf o r m e db y t w ol y sa n dt w oa r gw a s n e c e s s a r yf o rk e e p i n g t h ea c t i v i t yo f m e l i t t i n t h em a t u r er e g i o nc d n ao fm e g fw a sc l o n e db yu s i n gp g e m t - v e c t o r , a n d t h em e g fm r n a e x p r e s s i o na b u n d a n c e w a sa l s om e a s u r e db yu s i n gq u a n t i t a t i v e c o m p e t i t i v er t - p c rt e c h n i q u e t h em r n a e x p r e s s i o no f m e g fw a st h eh i g h e s t i ns u b m a x i l l a r yg l a n d ，t h em e a nr e l a t i v ec o n t e n tf o rp a r o t i dg l a n d ，k i d n e y , l u n g a n dl i v e rw a so 8 6 4 - 0 1 4 ，06 2 + 01 8 ，01 4 4 - 00 3 ，a n d00 9 4 - 00 2 ，r e s p e c t i v e l y , c o m p a r e dt oam e a nr e l a t i v ec o n t e n to f1 0 0f o rs u b m a x i l l a r yg l a n d n om r n a e x p r e s s i o nw a sd e t e c t e di nh e a r ta n dm u s c l e o w i n g t ot h ec o m m o n e x p r e s s i o no f e g fi nv a r i o u so r g a n so fm o u s e i tc o u l db ed e d u c e dt h a tt h er o l eo fe g fw a s m a i n l ya u t o c r i n e a n dp a r a c r i n ea c t i o n s ，a n di t se n d o c r i n er o l e w a sa l s on o t e x c l u d e do w i n gt oi t s h i g he x p r e s s i o n a b u n d a n c ei ns u b m a x i l l a r yg l a n d t h i s r e s u l tc o u l do f f e rb a s i ci n f o r m a t i o n sf o re s t i m a t i n gt h es a f e t yo fa n t i - t u m o r i m m u n o t o x i na i m e da te g f r a st a r g e tb i n d i n gs i t e t h ef u s i o np r o t e i no fm e g fw a se x p r e s s e db yu s i n gp e t 3 0 aa se x p r e s s i o n v e c t o ra n de c o l ia se x p r e s s i o ns t r a i n t h ef u s i o np r o t e i np r o d u c th a ds i g n i f i c a n t a c t i v i t y , t h ea c t i v i t yo f c r u d e e x t r a c t i o nc o r r e s p o n d e dt o2 2 5 o f t h a to fs t a n d a r d m e g fi tc o u l db ee x p e c t e dt h ea c t i v i t yw o u l db ei m p r o v e df u r t h e ra f t e rc u t t i n g t h ef u s i o np a r t n e ra n dp u r i f y i n g m e g fa n dm e l i t t i nw a sl i n k e dt o g e t h e rb yal i n k e ri n t oa nc h i m e r i cd n 八 m e g f m e l ，a n dt h ec h i m e r i cd n a w a se x p r e s s e db yu s i n gp e t 3 0 aa se x p r e s s i o n v e c t o ra n de c o l ia s e x p r e s s i o n s t r a i n a n dt h e e x p r e s s i o np r o d u c tw a s a n m e m b r a n e t o x i ci m m u n o t o x i nt h ea c t i v i t yd e t e r m i n a t i o ni nv i t r oi n d i c a t e dt h e p r o d u c t h a d s i g n i f i c a n tk i l l i n g e f f e c tt o a 4 3 1 c e l lo f s q u a m o u se p i t h e l i u m c a r c i n o m aw h i c ho v e r e x p r e s s e se g f ro ni t ss u r f a c e ，t h el d s ov a l u eo fc r u d e e x t r a c t i o nw a sb e t w e e n5 0 p _ g m la n d5 4 u g m l 浙江大学 牛物系统工程与食品科学学院 3 0 。cw a ss e l e c t e df o ri n d u c i n gt a r g e tp r o t e i ne x p r e s s i o ni nt h i ss t u d yl o w e r t e m p e r a t u r ew o u l dr e d u c ep r o d u c te x p r e s s i o na m o u n t ，a n dh i g h e ro n ew o u l d m a k et h e p r o d u c t sf o r m i n gm o r ei n c l u s i o n b o d i e s a l t h o u g h i tc o u l di n c r e a s e e x p r e s s i o na m o u n t s o3 0 i ss e l e c t e di nt h i s s t u d yt o a v o i dt h er e n a t u r a t i o n p r o c e s so f i n c l u s i o nb o d ya n da l s oc o u l dg e tm o r e p r o t e i np r o d u c t s t h e t a r g e tp r o d u c t sw o u l db em i x e dw i t he c o l ip r o t e i n si fi tw a sp u r i f i e db y b r e a k i n gc e l lw a l l ，a n dt h ep u r i f i c a t i o np r o c e d u r ew o u l db e c o m ec o m p l i c a t ea n d t h ey i e l dr a t ew o u l db er e d u c e dal o th e r e f r e e i n ga n dt h a w i n gm e t h o d w a su s e d t op u r i f yt h ee x p r e s s e dp r o d u c t s t h er e s u l t ss h o w e dt h i sm e t h o dc o u l da v o i dt h e c o n t a m i n a t i o no fe , c o l ip r o t e i n si nl a r g ee x t e n t t h ep r o d u c tp u r i t yc o u l db eo v e r 4 0 b yt h i sm e t h o d w h i c hw o u l db eb e n e f i c i a lf o rf u r t h e rp u r i f i c a t i o n a n dt h e m e t h o dc o u l db ei m p r o v e db yf u r t h e re x p e r i m e n t ，i ti s h o p e f u lt h a tt h ep u r i t yo f t h et a r g e tp r o d u c t sw o u l dr e a c hm o r et h a n8 0 t h em e a s u r e m e n to f g e n e t i cs t a b i l i t ys u g g e s t e dt h et h r e er e c o m b i n a n ts t r a i n s ， b l 2 1 - p e t m e l ，b l 2 1 一p e t m e g ea n db l 2 1 p e t m e g f m e l ，c o u l dk e e pt h et a r g e t s e q u e n c ei n s e r t e di nv e c t o r , a n dt h ea c t i v i t yo ft a r g e tp r o t e i n sk e p ts t a b l e ，s ot h e g e n e t i cs t a h i l i t yw a sv e r ys a t i s f a c t o r y t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rb l 2 1 一p e t m e l ，b l 21 一p e t m e g f , a n d b l 2 1 一p e t m e g f m e l ，w e r eo p t i m i z e dr e s p e c t i v e l yb y f l a s ks h a k e t h eb e s t c o n d i t i o n sw e r eb a s i c a l l ys a m e ，iec u l t u r ev o l u m e15 0 m l ，s e e dd o s e1 5 ， m e d i u m o r i g i n a lp hv a l u e 70 ，l a c t o s ew a su s e da si n d u c e ra n di t sb e s t c o n c e n t r a t i o ni s10 0 0 0 9 m o l l ；i t si n d u c i n ge f f e c tw a sb e t t e rt h a nt h a to fi p t g ； t h eb e s tt e m p e r a t u r eo f i n d u c i n gw a s3 0 。c c o m p a r e dw i t hg l u c o s ea scs o u r c e ， g l y c e r o l a scs o u r c ec o u l di m p r o v eb i o m a s sa tt h ee n do fl o g a r i t h m i cp h a s e 98 2 1 85 5 a n dt h e y i e l dr a t eo f t a r g e tp r o t e i n s8 0 7 1 6 3 0 k e yw o r d s ：m e l i t t i n ；e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ；m r n ae x p r e s s i o na b u n d a n c e m e m b r a n e t o x i ci m m u n o t o x i n ；g e n e t i cs t a b i l i t y ；f e r m e n t a t i o n 博士学位论文“m e g f - m d i t t i n ”嵌合摹网构建及有关摹囡重组表达的研究 引言一本课题立题依据及研究思路简介 课题来源：浙江省自然科学基金( 编号：3 0 0 0 2 4 ) ；杭州市科技计划( 编号：2 0 0 2 1 2 1 8 0 8 ) 微生物对抗生素的耐药性及特异杀伤肿瘤细胞的药物的开发是当前医药 研究的两个热点问题。抗生素耐药性问题的产生主要是由于传统抗生素长期、 大量、广泛的使用。一些对人类健康造成严重威胁的微生物如g y c o b a c t e r f u m t 曲o p c u o s j s 、p s e u d o m o n a sa e d o s a 等已对临床应用的传统抗生素产生 广泛耐药性。解决这一问题的关键是探寻具有新的作用机制的抗微生物药物， 其作用机制与传统抗生素差别越大，产生耐药性的可能性越小。在特异杀伤肿 瘤细胞的药物的开发方面，免疫毒素( i m m u n o t o x i n ，i t ) 是一个非常有希望 的侯选者。i t 是指以抗体或细胞因子为导向载体( 该抗体或细胞因子能与肿 瘤细胞表面特异表达或过量表达的抗原或受体特异结合) 、同毒素相连、对肿 瘤细胞进行选择性特异杀伤的嵌合蛋白。目前参与i t 构建的毒素均为植物源 或微生物源，不仅免疫原性强，而且都需要有内吞环节才能发挥作用。 近年来发现在动植物体内普遍存在对微生物具有抑制或致死作用的多肽， 这些多肽都有一个带正电的区域，统称为正电性抗菌肽( c a t i o n i c a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ，c a p ) 。由于c a p 的抗菌机制与传统抗生索完全不问， 故对解决微生物耐药性问题具有积极意义。而且c a p 通过破坏细胞膜而杀伤靶 细胞，省略了内吞环节，适宜作为i t 的毒性部分而用于肿瘤治疗。来自蜜蜂 ( 和j sm e i f e r a ) 毒的蜂毒肽( m e l i t t i n ) 是种典型的c a p 。m e l j t t i n 的裂解活性与补体类似，在细胞表面破坏磷脂双分子层并形成异常离子通道而 致靶细胞死亡。 但由于m e l i t t i n 等c a p 均带净正电荷，对蛋白酶非常敏感，故重组表达 较困难。这也是c a p 迄今尚未投入临床的重要原因。本研究采用融合表达方式 重组表达m e l i t t i n 后再切除融合伴侣以获取天然形式的m e l i t t i n 。 本研究还以m e l i t t i n 为毒索部分、p a 4 , 鼠表皮生长因子( m o u s ee p i d e r m a l g r o w t hf a c t o r ，m e g f ) 为靶向部分构建免疫毒素。因为表皮生长因子受体 ( e p i d e r m a l g r o w t hf a c t o rr e c e p t o r ，e g f r ) 在许多种肿瘤细胞表面均过 浙江大学生物系统工程与食品科学学院 量表达，比具有异质性和调变性的肿瘤相关抗原( 肿瘤相关抗原的异质性和调 变性是指同一种肿瘤在不同个体或不同发展时期其表型会发生变异) 更易成为 特异攻击的目标。m e g f 分子的等电点为4 6 ，将m e g f 与m e l i t t i n 分子融合表 达，m e g f 将中和m e l i t t i n 的正电性，预计表达效率会大大提高。表达产物 m e g f - m e lit ti n 嵌合蛋白的m e g f 结构域能与表面过度表达e g f r 的肿瘤细胞特 异结合，使m e l i t t i n 结构域发挥杀伤作用，同时又中和了m e l i t t i n 结构域的 正电性，使m e g f - m e l i t t i n 嵌合蛋白不能与表面带负电的正常细胞结合而发挥 杀伤作用，是一种特异杀伤肿瘤细胞的膜毒性免疫毒素。 在以m e g f 为靶向部分、m e li t t i n 为毒素部分构建抗肿瘤免疫毒素时，体 内各正常组织e g f 及e g f r 的表达丰度对于判定该免疫毒素的安全性具有重要 参考价值。因此，本课题还采用定量竞争r t p e r 法测定小鼠体内m e g f 的表达 丰度。 在构建m e g f - m e l i t t i n 嵌合蛋白及测定m e g f 体内表达丰度的过程中势必 要克隆m e g f 基因，而m e g f 在临床上也是一种疗效显著的愈伤因子，故本研究 还对m e g f 进行了重组表达。 以ec o l l 为重组表达宿主时，破胞提取目的产物程序较复杂。本课题采 用冻融法对目的产物进行初提，程序简便。并采用摇瓶分析对发酵条件进行了 初步优化。 基于以上的研究思路，本课题将主要进行以下研究： 蜂霉溶血肽成熟区c d n a 的克隆和在大肠杆菌中的重组表达。 小鼠表皮生长因子c d n a 的克隆和在大肠杆菌中的重组表达，及在 体内各器官中表达丰度的研究。 m e g f m e l i t t i n 嵌合d n a 的构建及在大肠杆菌中重组表达的研究。 重组菌株的遗传稳定性研究。 重组菌株的摇瓶发酵工艺研究。 2 壁主堂堡笙壅 ：避窭生! ! ! ! 坚壁鱼苎旦塑至墨宣茎墨里重丝耋竺竺旦塞 第一章文献综述 1 1 抗生素耐药性问题 二十世纪四十年代开始抗生素的大规模临床应用曾使人们认为可以彻底 征服病原微生物。今天，其应用更扩大到了畜禽饲养、食品加工等领域，并不 断有新品种产生。但抗生素的作用机制仍然是破坏靶细胞壁生成、阻止靶细胞 蛋白质合成或d n a 合成等( 抑制细胞壁合成：c y c l o s e i n e 、v a n c o m y c i n 、 t e i d r o p l a n i n 、b a c i t r a c i n 、p e n i c i l l i n s 、c e p h a i o s p o r i n s 、m o n o b a c t a m s 、 c a r b a p e n e m s ；d n ag y r a s e 抑制剂：q u i n o l o n e s ；r n a 聚合酶抑制剂：r i f a m p i n ； 核糖体5 0 s 亚基抑制剂：e r y t h r o m y c i n ( m a c r o l i d e ) 、c h l o r a m p h e n i c o 、 c 1 i n d a m y c i n ；核糖体3 0 s 亚基抑制剂：t e t r a c y c l i n e 、s p e c t i n o m y c i n 、 s t r e p t o m y c i n 、a m i k a c i n 、g e n t a m i c i n 、t o b r a m y c i n ( a m i n o g l i c o s i d e s ) l ： t r n a 抑制剂：m u p i r o c i n ) 。令人始料未及的是，微生物通过多种方式( 染色 体基因突变、潜在耐药基因诱导表达、转化、转染、接合等。在 e u t e r o b a c t e r i a c e a e 、p s e u d o m o n a s 以及一些厌氧种类中，接合导致的质粒转 移最为常见) 而发展出耐药性( 产生降解或修饰抗生素而使之失活的酶、改变 靶位结构、阻止抗生素接近靶位、产生新的外排抗生素的途径等) ，且耐药性 可以通过转化、转染、接合等途径而转移扩散( 这种转移扩散一般发生于革兰 氏阳性菌之间，也可由革兰氏阳性菌传给革兰氏阴性菌，但革兰氏阴性菌之间 的互相转移较少见) “。3 。微生物获得耐药性的动力来自两方面：其自身拥有 或潜在拥有耐药性基因，或通过基因转移获得耐药性基因；人类滥用抗生素尤 其是广谱抗生素杀死了大量正常、有益的寄生菌，破坏了正常的微生物区系， 使耐药性微生物在生存竞争中获得优势而大量繁衍”。1 “。结核( t u b e r c u l o s i s ) 、 伤寒( t y p h o l df e v e r ) 、脑膜炎( m e n i n g i t i s ) 、肺炎( p n e u m o n i a ) 及败血 症( s e p i c e m i a ) 等重新成为人类大敌，这些致病菌种类与数十年前相比，主 要的区别是它们获得了对抗生素的耐药性“4 ”1 。1 9 4 1 年时世界范围内所有 s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 均对p e n i c i l l i ng 敏感，但三年后即发现了耐药性 s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s 。今天，9 5 的s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 对p e n i c i l l i n 、 h m p i e i l l i n 、a n t i d s e u d o m o n a sp e n i c i l l i n 产生了耐药性“。到了1 9 9 7 年， s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 对一向敏感的v a n c o m y c i n 也产生了抗性“”。近年来 头孢菌素( c e p h a l o s p o r i n ) 的广泛应用使肠道中的非病原菌e n t e ，o c o c c u s f a e c a h s 对头孢菌素产生耐药性而在其所在区系中占优，这在免疫力正常的 人群中尚不至于造成严重问题，但对免疫力低下的人而言，肋t e f o c o c c u s 浙江大学 生物系统工程与食品科学学院 伯e c n l i s 的大量繁殖会侵染心血管瓣膜及其它器官甚至致命“。一些对人类 健康造成严重威胁的微生物如m y c o b a c t o r i u mt u b e r c u l o s i s 、p s e u d o m o n a s a 盯钾j n 。船等已对几乎所有临床应用的抗生素产生耐药性，一些治愈率曾经 很高的传染病( 如结核病，t u b e r c u l o s i s ) 在免疫力低下的人群中重新具有了 致命性“1 2 2 1 。而近年来未研制出具有新型作用机制的抗生素，代表最新型抗生 素豹n a l j d i x i ca c i d 的诞生距今已有3 0 年，第三代和第四代c e p h a l o s p o r i n s 、 i m i p e n e m 和c i p r o f l o x a c i n 也仅是对已有类型的改进，这意味着已有的传统 抗生素已无法解决致病微生物的耐药性问题。而至今传染病仍然是发达国家中 排名第三、发展中国家中排名第一的致命性疾病。因此，解决抗生素耐药性问 题已迫在眉睫。解决这一问题的关键之一是杜绝抗生素的滥用。3 2 “，之二是发 展具有新的作用机制的抗微生物药物，其作用机制与已有的传统抗生索差别越 大，产生耐药性的可能性将越小“2 6 。3 “。 1 2 免疫毒素 目前，肿瘤治疗都是在手术切除的基础上进行化疗或放疗，或在不适宜手 术的情况下直接进行化疗和放疗。但化疗和放疗在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤 订三常细胞，故副作用很大，而且在多次使用后还使肿瘤细胞产生耐受性。使杀 伤具有高度特异性是肿瘤药物研制开发的一个重要方向”“。免疫霉索 ( i m m u n o t o x i n ，i t ) 就是类特异杀伤肿瘤细胞的药物。i t 是指以抗体或细 胞因子为导向载体( 该抗体或细胞因子能与肿瘤细胞表面特异表达或过量表达 的抗原或受体特异结合) 、同毒素相连、对肿瘤细胞进行特异杀伤的嵌合蛋白 。”。i t 所针对的靶位是肿瘤细胞表面的抗原表位或受体。”“1 。与化疗药物 不同，i t 既杀伤静止细胞也杀伤处于分裂状态的细胞，而化疗药物主要杀伤 后者“。除了应用于肿瘤治疗外，i t 还能应用于免疫系统疾病的治疗。例如， 针对t 细胞的i t 可以减弱宿主抗移植物反应和移植物抗宿主反应、减轻自身 免疫疾病症状，还可以杀死被h i v 感染的t 细胞。但总的来说，肿瘤治疗是