（微生物学专业论文）毕赤酵母Δ12ω3脂肪酸脱氢酶功能与结构的研究.pdf

中文摘要 中文摘要 巴斯德毕赤酵母g s l l 5 ( p i c h i ap a s t o r i s ) 作为一种能够产生多不饱和脂肪 酸亚油酸和q 亚麻酸的酵母菌株，是构建产多不饱脂肪酸的基因工程菌株的较 好选择。因此，有必要对毕赤酵母多不饱和脂肪酸的合成途径及其合成途径中 相关酶类进行系统的研究。 为研究巴斯德毕赤酵母中多不饱和脂肪酸的合成机制，根据已报道的真菌 来源的0 3 脂肪酸脱氢酶和毕赤酵母1 2 脂肪酸脱氢酶同源序列中保守的氨基酸 序列设计简并引物进行p c r ，结果得到全长为5 6 4 b p ，编码1 8 7 个氨基酸的片 段。通过其编码的氨基酸序列的相似性搜索表明，所扩增片段为新的潜在的 0 3 脂肪酸脱氢酶基因的部分d n a 序列。在此基础上，采用接头p c r 的方法共 得到全长为2 2 5 9 b p 的核苷酸序列信息，其中包括1 2 4 8 b p 的氨基酸编码区和 9 2 4 b p 的潜在上游启动子区。同其他已报道的f 0 3 - 脂肪酸脱氢酶氨基酸序列对比 的结果和系统进化分析结果都表明：该序列可能编码一个完整的0 3 脂肪酸脱 氢酶。为了验证所获得序列的功能，将潜在的编码序列转化到i n v s c l 受体菌 中进行表达。通过气相色谱( g c ) 和气质联用( o c m s ) 分析表明：该序列所编码 的蛋白具有0 3 脂肪酸脱氢酶活性，能催化外源性底物亚油酸转化成c t 亚麻 酸。该基因序列已经注册到n c b i 的g e n b a n k 中( 序列接收号为e f l1 6 8 8 4 ) 。 为进一步验证该3 脂肪酸脱氢酶的底物特异性，分别加入不同的1 1 6 类不饱和 脂肪酸作为底物进行诱导表达。结果发现p p c 0 3 不仅能够识别亚油酸作为底物 进行催化，也能够催化丫亚麻酸、二高丫亚麻酸和花生四烯酸生成相应的n 一3 类产物，且催化活性大致相同。这说明毕赤酵母一脂肪酸脱氢酶对于十八碳 和二十碳底物的有着同等的利用能力。 利用同源重组介导敲除的办法构建了巴斯德毕赤酵母1 2 一脂肪酸脱氢酶基 因缺失突变株和c 0 3 - 脂肪酸脱氢酶基因缺失突变株，并对缺失突变株的总脂肪 酸进行了g c 分析和s o u t h e r n 杂交验证。分析结果证明1 2 脂肪酸脱氢酶是巴 斯德毕赤酵母中唯一催化油酸生成亚油酸的酶类，巴斯德毕赤酵母中只有3 一 脂肪酸脱氢酶一种催化亚油酸生成a 亚麻酸的酶类。因此我们可以进一步推断 出巴斯德毕赤酵母体内多不饱和脂肪酸的代谢途径是：首先由a 1 2 脂肪酸脱氢 酶催化油酸生成亚油酸，然后1 0 3 脂肪酸脱氢酶催化亚油酸最终生成a 亚麻 中文摘要 酸。分别将巴斯德毕赤酵母1 2 脂肪酸脱氢酶基因和一脂肪酸脱氢酶基因转入 相应的缺失突变株中进行表达，总脂肪酸成分分析结果发现1 2 脂肪酸脱氢酶 基因和一脂肪酸脱氢酶基因的表达不仅可以弥补脱氢酶基因缺失突变株中相 应基因的缺失，而且回补株中缺失基因的产物占总脂肪酸的百分含量都相应的 有所提高。因此认为：通过缺失多不饱和脂肪酸脱氢酶基因构建突变株，然后 再将相应多不饱和脂肪酸脱氢酶基因置于强启动子后回补其突变，从而获得高 产相应多不饱和脂肪酸脱氢酶产物的工程菌株，是一种值得尝试的构建产多不 饱和脂肪酸基因工程菌株的方法。 利用膜蛋白结构预测系统t m h m ms e r v e rv 2 对巴斯德毕赤酵母的一脂 肪酸脱氢酶和1 2 脂肪酸脱氢酶进行结构分析，并且参照前人对膜整合的脂肪 酸脱氢酶结构与功能关系的研究结果，确定眩脂肪酸脱氢酶中三个组氨酸 保守区所在的亲水区和c 端游离区所在的位置。构建将0 3 脂肪酸脱氢酶基因 的该部分序列替换成1 2 脂肪酸脱氢酶基因中相应序列的嵌合体，并将其转入 酿酒酵母中进行表达，发现以0 3 3 - 脂肪酸脱氢酶为母体的嵌合体失去了0 3 _ 脂肪 酸脱氢酶的活性，反而具有了1 2 脂肪酸脱氢酶的催化功能。因此推断出决定 巴斯德毕赤酵母膜整合的0 3 _ 脂肪酸脱氢酶脱氢机制的氨基酸序列属于脂肪酸 脱氢酶中三个组氨酸保守区所在的亲水区和c 端游离区。进一步的比对巴斯德 毕赤酵母和克鲁维氏酵母中处于三个组氨酸保守区所在的亲水区和c 端游离区 的0 3 3 - 脂肪酸脱氢酶1 2 脂肪酸脱氢酶氨基酸序列，选出酵母中具有0 3 脂肪酸 脱氢酶1 2 脂肪酸脱氢酶酶种类保守性的7 个氨基酸位点和处于c 端的2 2 个极 不保守的氨基酸位点进行突变。利用搭桥p c r 的方法构建突变体，将其转入酿 酒酵母中进行表达，发现以0 3 脂肪酸脱氢酶为母体的突变体同样失去了0 3 3 - 脂 肪酸脱氢酶的活性，反而具有1 2 脂肪酸脱氢酶的催化功能。可以得出结论： 对于膜整合的巴斯德毕赤酵母0 3 3 脂肪酸脱氢酶而言，具有酶种类保守性的7 个氨基酸位点和处于c 端的2 2 个极不保守的氨基酸位点对于决定脱氢机制起 主要作用。 关键词：巴斯德毕赤酵母，f d 3 脂肪酸脱氢酶，1 2 脂肪酸脱氢酶，克隆和表 达，缺失突变株，膜整合脂肪酸脱氢酶，脱氢机制 a b s t r a c t a b s t r a c t o u re a r l ya n a l y s i so ff a t t ya c i dc o m p o s i t i o ni nm e t h y l o t r o p h i cy e a s tp i c h i ap a s t o r i s g sl15i n d i c a t e dt h a ti tp r o d u c e ss e v e r a lp o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ( p u f a s ) ， i n c l u d i n gl i n o l e i ca c i d ( l a ；c 18 ：2 ) a n da - l i n o l e n i ca c i d ( 地；c18 ：3 ) f o rt h e p u f a sc o m p o s i t i o n , p i c h i a p a s t o r i sg s l 15m i g h tb eab e t t e rc h o i c ef o rc o n s t r u c t i n g at r a n s g e n i cs 嘶nf o rt h ep r o d u c t i o no fp u f a s ad n a s e q u e n c ee n c o d i n gao a 3 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n ew a si s o l a t e df r o mp i c h i a p a s t o r i sg s 115 t h ec o n s e r v e da m i n oa c i ds e q u e n c ef o u n di nr e p o r t e df u n g a lc o - f a t t ya c i dd e s a t u r a s e sa n dp p a s t o r i sa 1 2 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s e sw e r eu s e da sb a s i sf o r t h ed e s i g no ft w od e g e n e r a t ep r i m e r sf o rp c r af r a g m e n to f5 6 4b pw a sg e n e r a t e d f r o mg e n o m i cd n ao f 只p a s t o r i s ，u s i n gt h ed e g e n e r a t ep r i m e r st h a ta n n e a l e dt o s e q u e n c e si nc o n s e r v e dh i s t i d i n e - r i c h b o x e s1a n d3o ff u n g a lo a 3 - f a t t ya c i d d e s a t u r a s e sg e n e s t h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c eo ft h ed n ap r o d u c th a dh i g h i d e n t i t yt oo t h e rf u n g a l0 3 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s e s i n d i c a t i n gt h a tap a r t i a lp u t a t i v e - f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n ew a si s o l a t e df r o mpp a s t o r 妇t h ef r a g m e n tw a st h e nu s e d t od e s i g ng e n es p e c i f i cp r i m e r sf o rt h ec l o n i n go f5 、u p s t r e a ma n d3 d o w n s t r e a m s e q u e n c e s a2 2 5 9 b pd n as e q u e n c ec o n t a i n e da l lo p e nr e m i n gf r a m eo f 12 4 8b pw a s i s o l a t e db yl i n k e rm e d i a t e dp c r t h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c eo ft h i so p e n r e a d i n gf r a m es h o w e dh i g hi d e n t i t yt ok n o w nf u n g a l0 3 - f a t t y a c i dd e s a t u r a s e s ， i n d i c a t i n gt h a tap u t a t i v e l yc 0 3 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n ew a si s o l a t e d f u n c t i o n a l i d e n t i f i c a t i o no ft h i sg e n eh e t e r o l o g o u s l yi i ls a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a es t r a i ni n v s c l s h o w e dt h a tt h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c ee x h i b i t e d0 3 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s e a c t i v i t y t h en e w l yi d e n t i f i e d0 3 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s ei sn o v e lb e c a u s ei ts h o w e d b r o a dn - 6f a t t ya c i ds u b s t r a t es p e c i f i c i t yb yi t sa b i l i t yt oc o n v e r ta l lt h e18 - c a r b o na n d 2 0 一c a r b o nn - 6s u b s t r a t e se x a m i n e dt ot h ec o r r e s p o n d i n g1 1 3f a t t ya c i d s ，w i t ha l l a p p r o x i m a t e l ye q u i v a l e n th i g hc o n v e r s i o nr a t e i ti st h ef i r s tk n o w ny e a s tr 0 3 - f a t t y a c i dd e s a t u r a s et oa c to nl o n g - c h a i nn 一6f a t t ya c i ds u b s t r a t e s t h i sn o v e lg e n eh a s b e e na s s i g n e di ng e n b a n k , t h ea c c e s s i o nn o i se f116 8 8 4 i i i a b s t r a c t w eh e r er e p o r tg e n e t i c a l l ym o d i f i e d 尸p a s t o r i ss t r a i n sw i t hd i s r u p t e da 1 0 咖a c i d d e s a t u r a s e g e n ea n dc o l f a t t y a c i dd e s a t u r a s e g e n er e s p e c t i v e l yb yk n o c k - o u t t e c h n i q u e s s o u t h e r nb l o t sa n dg ca n a l y s i sw e r ep e r f o r m e dt o c o n f i r mt h e d i s r u p t i o n s g ca n a l y s i sa l s op r o v e dt h a t t h ea 1 2 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s ew a s r e s p o n s i b l ef o ra l l t h el i n o l e i ca c i dp r o d u c t i o n , a n da l lt h ea l i n o l e n i ca c i dw a s s y n t h e s i z e db yo ) 3 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s ef r o ml i n o l e i ca c i d t h ea 1 2 - f a t t ya c i d d e s a t u r a s eg e n ea n da ) j - f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n ew e r es u b c l o n e di n t ot h ee x p r e s s i o n v e c t o rp p i c 3 5 kt o g e n e r a t er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw h i c hw e r es u b s e q u e n t l y t r a n s f o r m e di n t oc o r r e s p o n d i n ga 1 铀a c i dd e s a t u r a s eg e n ed i s r u p t i o ns t r a i na n d 0 3 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n ed i s r u p t i o ns t r a i nf o re x p r e s s i o n g ca n a l y s i ss h o w e d t h a tt h ee x p r e s s i o no f a l 2 - - f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n ea n dc 0 3 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n e u n d e rt h ea o x p r o m o t e rr e s u l t si nn o to n l yc o r r e s p o n d i n gc o m p l e m e n t a t i o nb u ta l s o a l li n c r e a s eo fl i n o l e n i ca c i da n da - l i n o l e n i ca c i d p r o d u c t i o n t h e r e f o r et h e c o m b i n a t i o no fi n t e g r a t i o na n dd i s r u p t i o no ff a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n es h o w sa s y n e r g i s t i ce f f e c to nt h ep r o d u c t i o no fp u f a si n 尸p a s t o r 括 t oi n v e s t i g a t et h es t r u c t u r a le l e m e n t st h a td e t e r m i n er e g i o s e l e c t i v i t yi nt h ef a t t ya c i d d e s a t u r a s e so fy e a s t ，t r a n s m e m b r a n eh e l i xp r e d i c t i o n so fo ) 3 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s ea n d a 1 2 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s eo fpp a s t o r i sw e r ep e r f o r m e dw i t ht h ec o m p u t a t i o n a l m e t h o du s i n gt h et m h m ms e r v e rv 2 0 w er e p l a c e dh i s t i d i n e - r i e hb o x e sa n dt h e c a r b o x y lt e r m i n a lr e g i o no fc 0 3 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s ew i t ht h ec o r r e s p o n d i n gd o m a i n s f r o mt h ea 1 2 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s eo f p p a s t o r i s c h i m e r i cf a t t ya c i dd e s a t u r a s e sw e r e c l o n e di n t o p y e s 2 0a n de x p r e s s e di n t h esc e r e v i s a es t r a i n i n v s c i ，t h e r e c o m b i n a n ty e a s tc e l l sw e r ea n a l y z e df o rf a t t ya c i d s ，a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r e p l a c e m e n tw a sf o u n dt or e s u l ti nac h a n g eo fr e g i o s e l e c t i v i t yf r o mo d l f a t t ya c i d d e s a t u r a s et oa 1 2 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s e f u r t h e rm o r e ，t h ea m i n oa c i ds e q u e n c ei n r e p l a c e dd o m a i no fr 0 3 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s ea n da 1 2 - f a t t ya c i dd e s a m r a s ef r o mp p i c h i nw a sc o m p a r e dw i t h ( o l f a t t ya c i dd e s a t u r a s ea n da 1 2f f l t t ya c i dd e s a t u r a s ef r o m & m u y v e r i t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e r ew e r es e v e nc o n s e r v e da m i n oa c i d sw i t h i n e a c h0 3 3 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s ea n da 1 2 - f a t t ya c i dd e s a m r a s eb u td i f f e rb e t w e e nt h et w o i v g r o u p s u s i n gs i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ，w ef u r t h e rd e m o n s t r a t e dt h a tt h es e v e n c o n s e r v e da m i n oa c i d so fo _ 3 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s ew i t h i nt h eh i s t i d i n e - r i c hr e g i o i l s a n dt h el a s t2 2a m i n oa c i d so ft h ec a l b o x y lt e r m i n a la ler e s p o n s i b l ef o rt h e r e 百o s e l e c t i v i t ys w i t c h t h e r e f o r e ，t h er e g i o s e l e c t i v i t yo ff a t t ya c i dd e s a t u r a s e sm a y b eb e t t e ru n d e r s t o o db yi n v e s t i g a t i n gt h ee v o l u t i o n a r yr e l a t i o n s h i p so fd i f f e r e n tf a t t y a c i dd e s a t u r a s e s k e y w o r d s ：p e h ap a s t o r i s ，日0 3 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s e ，a 1 2 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s e ， c l o n i n ga n de x p r e s s i o n , g e n ed i s r u p t i o n , m e m b r a n e - b o n df a t t ya c i dd e s a t u r a s e s ， r e g i o s e l e c t i v e l y v 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：张叨钦 砌8 年5 月矽日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：箬斯而欠 娜8 年支月易日 第一章引言 第一章引言 第一节多不饱和脂肪酸合成途径的研究概况 1 1 1 多不饱和脂肪酸的基本概念 多不饱和脂肪酸( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ，p u f a s ) 是指含有两个或两 个以上顺式双键、碳原子数为1 6 至2 2 的直链脂肪酸【l 】。p u f a s 一般采用 x ：y 妣的方式表示其基本结构，x 代表脂肪酸碳链中碳原子的数目，y 表示双 键的个数；后的数字表示从脂肪酸链羧基端计数时引入双键的位置，n - z 表 示脂肪酸在p u f a s 中的类别或者合成途径。比如18 ：2 9 ，1 2n 6 表示其含有l8 个 碳原子，两个双键，分别位于脂肪酸链羧基端计数时第九、第十二位，且属于 n 6 类多不饱和脂肪酸。 自然界中p u f a 主要有两大类：n 6 和n 3 ，n 6 类p u f a 是指从甲基端计 数时第一个双键位于第六位的一类多不饱和脂肪酸；而n 3 类p u f a 是指从甲 基端计数时第一个双键位于第三位的多不饱和脂肪酸。n 6 和n 3 类分别以亚 油酸( l i n o l e i ca c i d ，l a ，18 ：2 a 9 , 1 2 n 6 ) 和a 亚麻酸( a l i n o l e n i ca c i d ，a l a ， 1 8 ：3 a 9 , 1 2 , 1 5 n 3 ) 为底物合成的。在生物体中主要存在的这两种多不饱和脂肪酸如 表1 - 1 所示。 表1 - 1 主要的多不饱和脂肪酸 t a b l e1 - 1m a i np o l y u n s a t u r a t e df a t r ya c i d s f o r m u l ac o m m o nn a l n e sc h i n e s en a m e sa b b r e v i a t i o n 18 ：2 倒1 勺一6l i n o l e i ca c i d 亚油酸 l a 18 ：3 0 芦l z n 一6 7 - l i n o l e n i ca c i dy 亚麻酸 g l a 18 ：3 a 9 , 1 2 , 1 5 n 一31 2 l i n o l e n i ca c i d a 亚麻酸 a l ，a 1 8 ：4 a 6 , 9 , 1 2 , 1 5 n 一3* o c t a d e a c a t e t r a e n o i ca c i d 十八碳四烯酸 o t a 2 0 ：3 郜 ii ，m n - 6 d i h o m o 一l i n o l c n i ca c i d二高丫一亚麻酸d h g l a 2 0 ：4 a 5 , 8 , 1 1 , 1 4 n - 6a r a c h i d o n i ca c i d 花生四烯酸 a r a 2 0 ：5 a 5 , 8 , 1 1 , 1 4 , 1 7 n 3 e i e o s a p e n t a e n o i ca c i d三十碳五烯酸 e p a 2 2 ：6 4 ，7 ，1 0 ，1 3 ，1 6 ，1 9n - 3d o c o s a h e x a e n o i ca c i d二十二碳六烯酸d h a * o c t a d e a c a t e t r a e n o i ca c i d = s t e a r i d o n i ca c i d 1 1 2 多不饱和脂肪酸的生物学活性 第一章引言 多不饱和脂肪酸是以多种形式存在于细胞中如细胞膜、储存脂、甘油三酯 磷脂、鞘脂和脂蛋白等。作为生物膜结构中磷脂的重要成分之一，p u f a s 的种 类、数量、饱和度的改变会直接影响生物膜的刚性结构，因此影响了与刚性结 构相关的各种生理功能【2 3 】。比如，细胞膜上磷脂分子中缺少相当数量的不饱和 脂肪酸时，细胞膜的完整性与流动性降低，细胞功能减退【4 】。p u f a s 还能调节 膜结合蛋白如a t p 酶、转运蛋白、组织相容性复合物的功能，并能控制与脂 肪酸结合蛋白的反应【5 ，6 1 。 经过研究发现p u f a s 与包括心血管疾病阴，糖尿病引、关节炎【9 1 、牛皮癣 【l o 】、溃疡性结肠炎【】在内的多种慢性疾病相关，并且可以通过影响细胞的增殖 和信号传导途径来影响癌症的发生和发展情况【1 2 , 1 3 , 1 4 。最近的研究表明， p u f a s 还能影响骨骼的生长与修复过程【1 5 , 1 6 , 1 7 】。不仅如此p u f a s 还能作为一种 重要的生理活性物质影响胎儿的发育1 8 , 1 9 , 2 0 2 1 捌。 值得一提的是，在哺乳动物体内n 6 类p u f a s 与n 3 类p u f a s 不仅有着不 同的代谢途径，也有着截然相反的生理功能。例如：n 6 类p u f a s 花生四烯酸 ( a r a ) 会促使人体血管血管收缩，而n 3 类p u f a s 如二十碳五烯酸( e p a ) 却是引发血管扩张的原因之一田】。因此，在人类膳食中维持n 6 类p u f a s 与n 3 类p u f a s 的合理配比十分重要。 1 1 3 多不饱和脂肪酸的生物合成途径 由于p u f a s 是生物膜的基本成分之一，因此它广泛的分布在包括动物、植 物、真菌、原生生物、深海细菌等几乎所有的生物体内。到目前为止，只是在 大肠杆菌中还没有发现多不饱和脂肪酸。为了适应不同的自然界环境，不同的 物种在基本的合成途径基础之上又衍生出了各种不同p u f a s 合成机制。p u f a s 的合成主要是由碳链的延长和脱氢两个主要反应组成，合成的最初底物是饱和 脂肪酸软脂酸( p a l m i t i ca c i d ，1 6 ：o ) 和硬脂酸( s t e a r i ca c i d ，1 8 ：0 ) 。 软脂酸( p a l m i t i ca c i d ，1 6 ：0 ) 不同的脱氢酶作用下脱氢成为棕榈油酸 ( p a l m i t o l e i ca c i d ，1 6 ：1 9n 7 ) 或( c i s 7 h e x a d e c e n o i ca c i l 6 ：1 7n 9 ) ，然后再次 脱氢生成不同种类的多不饱和脂肪酸( 图1 1 a ) 。软脂酸( p a l m i t i ca c i d ，1 6 ：0 ) 也 有可能在延长酶的作用下生成硬脂酸( s t e a r i ca c i d ，1 8 ：0 ) ，进而参与到以硬脂酸 ( s t e a r i ca c i d ，1 8 ：0 ) 为起始底物的多不饱和脂肪酸的合成代谢中。 硬脂酸( s t e a r i ca c i d ，1 8 ：o ) 脱氢成为油酸( o l e i ca c i d ，o a 1 8 ：1 9n 一9 ) ，然 2 第一章引言 后继续脱氢转化成亚油酸( l i n o l c i ca c i d ，l a 1 8 ：2 9 l zn 6 ) 。l a 是n - 6 和n 3 两 类多不饱和脂肪酸的共同前体，在不同的脱氢酶和延长酶的作用下l a 转化成 n - 6 和1 1 3 两类不同的多不饱和脂肪酸( 图1 1 b ) 。 1 1 3 1 植物中p u f a s 的生物合成 植物中c 1 8 ：0 和c 1 6 ：0 都是在叶绿体和其它质体中合成 2 6 】，植物脂肪酸的 脱氢过程是通过两种途径在两个不同的细胞器中配合完成。种称之为“原核 途径( p r o k a r y o t i cp a t h w a y ) ，在叶绿体中c 1 8 ：0 一a c p 脱氢形成c 1 8 ：1 a c p 而 后硬脂酸被转移到磷酸甘油的s n - 1 位上，同时软脂酸从c 1 6 ：0 a c p 被转移到 s n - 2 位形成磷脂酰甘油，在磷酸水解酶的作用后接受半乳糖残基形成单或者二 半乳糖二酰基甘油脂( m g d g 或者d g d g ) ，进一步的脱氢形成q 亚麻酸 ( q l i n o l c n i ca c i d , 地1 8 ：3 a 9 1 2 1 5n - 3 ) 和c 1 6 ：3 a 7 ，1 0 ，1 3 ，叶绿体中的不饱和脂 肪酸的脱氢大都是以这种形式进行的。另一种途径是“真核途径 ( e u k a r y o t i c p a t h w a y ) ，在叶绿体中合成的的硬脂酸被运送到内质网中酯化主要形成卵磷 脂，在脂肪酸脱氢酶催转化成l “2 7 】，含有两个l a 的二酰基甘油的进一步脱氢 多数是在叶绿体中形成m d g d 后进行的。光合组织中都有这两条途径，而非 光合组织如含油种子中只有真核途径。 1 1 3 2 动物中的p u f a s 的生物合成 动物体内一般缺乏催化合成l a 和u a 所需的1 2 和( i ) 3 脂肪酸脱氢酶， 因此需要从食物中获得这两种必需脂肪酸( e s s e n t i a lf a t t ya c i d s ，e f a ) 。l a 和 a l a 在内质网经一系列的延长和脱氢作用转化成不同的长链多不饱和脂肪酸 【2 8 2 9 3 0 3 l 3 2 】。 尽管人们已经基本弄清楚了动物体内二十碳p u f a s 的合成途径，但是从二 十二碳五烯酸( d o c o s a p e n t a e n o i ca c i d ，d p a 2 2 ：5a5 ，8 1 1 ，1 4 ，1 7 n - 3 ) 到d h a 的生物 合成途径却还不确定。由于人们已经在海洋原生生物t h r a u s t o c h y t r i u ms p 体内克 隆到了4 脂肪酸脱氢酶【3 3 】，所以一种推断是：二十碳p u f a s 首先在延长酶的作 用下延伸两个碳原子，然后在4 脂肪酸脱氢酶的作用下将二十碳p u f a s 转化为 二十二碳p u f a s 。但是哺乳动物细胞内的放射性标记研究显示，d h a 的合成是 3 4 3 5 d p a 首先经碳链延长转化成c 2 4 ：5 n 3 ，在微体内经6 脂肪酸脱氢酶催化脱 氢合成c 2 4 ：6 n 3 ，然后c 2 4 ：6 n 3 被运送到过氧化物酶体内经b 氧化合成d h a 。 第一章引言 因此，现在人们普遍接受的观点是不依赖于4 一脂肪酸脱氢酶的途径是哺乳动物 体内d h a 的主要合成途径。 a t 6 ；丽1 6 ：| d o _ 百广j 6 ：) a 9 - 1 2 j ，鲫 a 1 2 - d e j t t u r m e u l ”l d c - d 旧 。瑚ti c l d - 丽i 丽汀 1 8 ：i a 9 k 。 y - l i n o l e n i ea c i d 1 9 ：3 a 6 9 1 2 g l a 嚣竽上 e n z y m t d i h o m o y - l i n o l e u i ci e i d z 口：3 a 抗1 1 1 d g l a 删d o n i ca d d 2 0 ：4 5 ，8 1 1 1 4 a r a a - l i n o l v a i va c i d i g ：3 a 0 1 2 15 a i 1 l 罅 s 协吐d o n i o - c i d 1 8 ：4 ，a 6 ，9 ，1 2 ，1 5 s d le l o n g a t i n g e 1 1 2 q l n c d 竺m 霉3 - 凇黜， f r a 壬e j 2 e 螂o s a 闯p e n t s 舯e n o i e 上厶5 如瞰岫嘲 e p a 图1 1 多不饱和脂肪酸合成途径 f i g 1 1b i o s y n t h e s i sp a t h w a yo fp u f a s i nl o w e re u k a r y o t e s t h ec o m m o np a t h w a yf o r s y n t h e s i so f n - 6a n dn - 3l o n gc h a i nf a t t ya c i d si ss h o w n 1 1 3 3 真菌中和藻类的p u f a s 的生物合成 真菌和藻类是自然界中p u f a s 的主要生产者，许多真菌和藻类都能以c 1 6 ：0 和c 1 8 ：0 为起始，经过脱氢和延长合成大量的二十碳或二十碳以上的p u f a s 3 6 】。 酿酒酵母( & c e r e v i s i a e ) 体内只能合成单不饱和脂肪酸1 6 ：l n 7 和1 8 ：i n 9 。正因 如此，酿酒酵母常常被选为多不饱和脂肪酸代谢途径中酶类功能验证的受体菌 株。大多数常见多不饱和脂肪酸合成途径与动物的合成途径相同。与前面所提 到的p u f a s 合成途径不同的是，在一些海洋原核微生物和真核微生物中存在着 4 啦一 晦一 第一章引言 一个全新的p u f a s 合成途径多肽合成酶( p r o k a r y o t i cp o l y k e t i d es y n t h a s e ， p k s ) 途径【3 7 1 。已经在高产二十二碳六烯酸( d i - i a ) 的海洋真菌裂殖壶菌 ( s c h i z o c h y t r i u ms p ) 中证实了这种途径的存在3 引。 第二节脂肪酸脱氢酶的基因的研究进展 1 2 1 脂肪酸脱氢酶的基本概况 脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪肪酸的合成代谢中的关键酶类。一般来讲， 脂肪酸脱氢酶是一种能够催化脂酰链上相邻的碳原子之间的单键转化成双键的 酶类【3 9 ，4 0 】。酶促反应所形成的双键叫做不饱和键，因此发生的反应经常被称为 去饱和反应。从本质上来讲，脂肪酸脱氢酶催化的反应是一种氧化反应，除了 分子氧之外它还需要两个电子】。不同的去饱和酶系具有不同的电子供体，在 由酰基a c p 脂肪酸脱氢酶、蓝细菌的酯酰- - l i p i d 脂肪酸脱氢酶、和植物质体中 的酯酰- l i p i d 脂肪酸脱氢酶所催化的脱氢反应中，电子供体是铁氧还原蛋白 4 2 , 4 3 】。而位于植物细胞质中的酯酰1 i p i d 脂肪酸脱氢酶、真菌和动物的脂酰 c o a 脱氢酶却使用细胞色素b 5 作为电子供体【4 4 , 4 5 】。 虽然到目前为止，所知的在甘油三酯上的碳链中形成的双键都是顺式结 构，但并不是所有的脂肪酸脱氢酶在碳链上形成的双键都是顺式构象，比如在 某些植物中就发现了反式的双键，但是这些单不饱和脂肪酸不能进一步被脱 氢酶催化而再次脱氢，这些特异的不饱和脂肪酸的功能还有待于进一步的研 究。 在脂肪酸脱氢酶的分类方面，由于分类标准的不同而有不同的结果。根据 细胞内定位和酶作用的底物的脂酰载体的不同，脂肪酸脱氢酶可以分为三种： 1 ) 脂酰a c p ( a c y l a c p ) 脂肪酸脱氢酶，这类酶只存在于植物质体中，是一 种可溶性的脱氢酶，它催化与脂酰载体蛋白( a c y lc a r r i e rp r o t e i n , a c p ) 结合的 脂肪酸脱氢，同时这类酶也是唯一一类可溶性的脱氢酶；2 ) 脂酰c o a ( a c y l c o a ) 脂肪酸脱氢酶，这类酶属于膜整合蛋白，它催化与c o a 结合的脂肪酸脱 氢，目前发现主要存在于动物、酵母和真菌细胞中f 4 7 】；3 ) 脂酰脂( a c y l 1 i p i d ) 脱氢酶，这类酶催化甘油脂中的脂肪酸脱氢，它也是一种膜整合蛋白， 存在于植物、真菌和蓝细菌中【4 8 1 。 可溶性的脂肪酸脱氢酶只分布于植物质体中，具有两个保守的离子结合序 第一章引言 列( i r o n b o n d i n gm o t i f ) 【( d e ) x 2 h 【4 引，它包括9 硬脂酰a c p 脱氢酶、4 软脂酰a c p 脱氢酶、6 软脂酰a c p 脱氢酶和9 豆蔻酰a c p 脱氢酶等，脂 酰a c p 脱氢酶需要n a d p h 、铁氧还蛋白：铁氧还蛋白氧还酶和分子氧共同完成 催化功能。 膜整合的脂肪酸脱氢酶，基本上以n a d h ：细胞色素b 5 ( c y tb 5 ) 氧化还 原酶和c y t b 5 作为电子供体催