（环境工程专业论文）硝化细菌富集培养、保存及应用基础研究.pdf

青岛理工大学工学硕士学位论文 摘要 氨氮是水族箱和水产养殖系统的主要污染物，目前多采用生物法进行处理。在处 理过程中，氨氮在硝化细菌作用下被转化为硝态氮，后者进一步被反硝化细菌转化为 游离氮气，其中硝化过程是生物脱氮的限制性步骤。由于硝化细菌具有严格自养、生 长缓慢、对环境因子变化敏感等特性，使其在与异养菌的竞争中处于劣势，极易被系 统淘汰，造成水产养殖系统和水族箱中硝化菌群十分贫乏。因此提高处理系统中硝化 细菌的浓度对生物脱氮具有十分重要的意义。 本课题研究硝化细菌的富集培养和保存方法，确定了富集培养的硝化细菌制剂对 水族箱水质的净化效果，通过研究得到以下结论： 1 建立一种硝化细菌富集培养方法，在2 5 3 0 ，p h 7 0 8 5 ，d 0 2 6 m g l ，氨氮 浓度 0 0 m g l ，经过1 6 d 的培养，可以得到硝化速率为1 0 1 m g ( n h 4 + - n ) 。 g ( m l s s ) h i 。 的硝化细菌。在富集培养过程中s v 3 0 、s v i 、硝化强度、硝化速率等指标均出现规律 性变化。 2 研究在有氧低温、有氧常温、无氧低温、无氧常温4 种保存条件下硝化细菌 制剂活性变化情况，结果表明，经过1 8 0 d 的保存，在无氧低温条件下硝化细菌制剂 活性最高，为适宜的硝化细菌保存方法。 3 比较分析了富集培养的硝化细菌制剂与1 2 种硝化细菌产品对氨氮的去除效 果，结果表明自制硝化细菌制剂对氨氮的去除效果明显优于1 2 种硝化细菌产品。 4 富集培养的硝化细菌制剂对水族箱水质具有明显的净化效果。投加硝化细菌 制剂后，水族箱内氨氧化细菌、亚硝酸盐氧化细菌可在短时间内形成优势，使氨氮、 亚硝氮维持在较低浓度水平；在不投加菌剂的情况下，由于氨氧化细菌、亚硝酸盐氧 化细菌生长缓慢，水族箱中氨氮、亚硝酸积累问题严重，不利于水族生物的生长。 关键词：氨氮；硝化细菌；富集培养；水质净化；淡水水族 青岛理工大学工学硕士学位论文 a b s t r a c t i nr e c e n ty e a r s ，a m m o n i an i t r o g e n , t h em a j o rp o l l u t a n ti na q u a r i u ma n da q u a c u l t u r e s y s t e m ，i sm a i n l yt r e a t e db yb i o l o g i c a lm e t h o d i nt h et r e a t m e n tp r o c e s s ，a m m o n i ai sf i r s t l y c o n v e r t e di n t on i t r a t eb yn i t r i f y i n gb a c t e r i a , a n dt h e nt h en i t r a t ei sc o n v e r t e di n t on i t r o g e n g a sb yd e n i t r i f y i n gb a c t e r i 扎n i t r i f i c a t i o ni st h el i m i t i n gs t e po fb i o d e n i t r i f i c a t i o n b e c a u s et h ep h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f n i t r i f y i n gb a c t e r i ai ss t r i c t l yc h e m i l i t h o t r o p l f i c , l o wg r o w t hr a t ea n ds e n s i t i v e t oe n v i r o n m e n t a lf a c t o r s ，i ti sr e c e s s i v ew h e nc o m p e t i n g a g a i n s tt h eh e t e r o t r o p h yb a c t e r i aa n dc a nb ee l i m i n a t e de a s i l yf r o mt h es y s t e m , w h i c h m a k et h en i t r i f y i n gb a c t e r i al a c ki na q u a r i u ma n da q u a c u l t u r es y s t e m i ti si m p o r t a n tf o r b i o - d e n i t r i f i c a t i o nt r e a t m e n ts y s t e mt oi n c r e a s en i t r i f y i n gb a c t e r i ac o n c e n t r a t i o n i nt h i sp a p e r , t h ee n r i c h m e n ta n dc o n s e r v a t i o nm e t h o d so fn i t r i f y i n gb a c t e r i aw g r e s t u d i e da n di t se f f e c ti na q u a r i u mw a t e rp u r i f i c a t i o nw a sd e t e r m i n e d t h er e s u l t so ft h e i n v e s t i g a t i o na l ea sf o l l o w s ： 1 am e t h o do fn i t r i f y i n gb a c t e r i ae n r i c h m e n tc u l t u r ew a se s t a b l i s h e d u n d e rt h e c o n d i t i o no ft h e t e m p e r a t u r e2 5 - 3 0 c ，p i - 1 7 ，0 8 5 ，d 0 2 6 m g l , a m m o n i an i t r o g e n l o o m e c l ，c a r r i e ra d d i t i o n3 ，i tc o u l dg e tt h en i t r i f y i n gb a c t e r i ai n o e u l u mt h a th a dt h e n i t r i f i c a t i o na c t i v i t yo f1 0 1 m g ( n h 4 + - n ) g ( m l s s ) h i a f t e r1 6 1 9 da c c l i m a t i z i n gp e r i o d d u r i n gt h ea c c l i m a t i z i n gp r o c e s s ，s v 3 0 , s v i ，t h en i t r i f y i n gc a p a c i t ya n dt h en i t r i f i c a t i o n r a t ea l ls h o w e dr e g u l a rc h a n g e s 2 t h ec o n s e r v a t i o nm e t h o d so fn i t r i f y i n gb a c t e r i ai n o c u l u mw e r es t u d i e d n i t r i f y i n g b a c t e r i ai n o c u l u mw e r e p r e s e r v e d u n d e rf o u rc o n d i t i o n sa sf o l l o w s ：a e r o b i cl o w t e m p e r a t u r e , a e r o b i cr o o mt e m p e r a t u r e , a n a e r o b i cl o wt e m p e r a t u r ea n da n a e r o b i cr o o m t e m p e r a t u r e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tn i t r i f y i n gb a c t e r i ai n o e u l u mp r e s e r v e du n d e r a n a e r o b i cl o wt e m p e r a t u r eh a dt h eh i g h e s ta c t i v i t ya f t e rc o n s e r v e df o r1 5 0d a y s , a n dw a s t h ea p p r o p r i a t em e t h o do f n i t r i f y i n gb a c t e r i ac o n s e r v a t i o n 3 t h ee f f e c to fa m m o n i an i t r o g e nr e m o v a lw a sc o m p a r e db e t w e e nn i t r i f y i n gb a c t e r i a c u l t i v a t e db yo u r s e l v e sa n d1 2k i n d so f c o m m e r c i a ln i t r i f y i n gb a c t e r i ap r o d u c t t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ea m m o n i an i t r o g e nr e m o v a ie f f e c to fn i t r i f y i n gb a c t e r i ai n o c u l u mw a s i i 童墅至三奎茎三耋堡圭童堡篁圣 b e t t e rt h a n1 2c o m m e r c i a lk i n d so f n i t r i f y i n gb a c t e r i ap r o d u c t 4 t h en i t r i f y i n gb a c t e r i ai n o e u l u ms h o w e do b v i o u sp u r i f i e de f f e c ti na q u a r i u m a f t e r i n p u to fn i t r i f y i n gb a c t e r i ai n o c u l u m , a m m o n i a - o x i d i z i n gb a c t e r i aa n dn i t r i t e o x i d i z i n g b a c t e r i ai na q u a r i ai n c r e a s e dr a p i d l yi nas h o r tp e r i o do ft i m ea n dm a i n t a i n e da m m o n i a n i t r o g e n ，n i t r i t en i t r o g e na tl o w e rc o n c e n t r a t i o nl e v e l s h o w e v e r , a m m o n i an i t r o g e na n d n i t r i t en i t r o g e na c c u m u l a t e ds e r i o u s l yi nc o n t r o la q u a r i u mb e c a u s ea m m o n i a - o x i d i z i n g b a c t e r i aa n dn i t r i t e o x i d i z i n gb a c t e r i ag r o ws l o w l yu n d e rn a t u r a lc o n d i t i o n s k e yw o r d s ：a m m o n i an i t r o g e n ；n i t r i l y i n gb a c t e r i a ；e n r i c h m e n t ；w a t e rp u r i f i c a t i o n ； f r e s h w a t e ra q u a r i a f 青岛理工大学工学硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 课题来源 本研究为建设部资助项目“应用生态水处理技术净化海水养殖废水研究” ( 0 4 2 0 6 0 ) 的部分内容。 1 2 前言 随着我国国民经济的高速发展及农业结构的调整，水产养殖业也得到了迅猛地发 展，在新品种的引进和集约化水产养殖发展的同时，对水质的要求也越来越高。 当前，水体污染是水产养殖业面临的严重问题之一，工业废水、生活污水及农药、 化肥是其主要污染源；养殖过程中大量的残饵和养殖对象的排泄物和过量使用氨肥、 磷肥，也加剧了水体的污染【i j 。自然界水体的严重富营养化，使自然界的水体失去了 它自身的净化功能，引发赤潮、水华发生，生态被破坏。随之而来的是病害爆发和水 产品品质变坏。如1 9 9 3 年我国大面积爆发的对虾虾病使渤海、黄海、东海、南海的 对虾养殖几乎全军覆没。 病害的发生，往往是养殖生物本身、病原菌以及环境三重因子相互作用的结果， 当人们将注意力的焦点集中在病原菌的研究时，环境因子就经常被忽略。这也可能是 有时候，养殖池水中并无病原菌，但病害依旧发生，或者在有病原菌的情形下，病害 并未发生的原因。养殖环境包括放养的密度、浮游动植物种类和数量以及养殖环境水 质等。其中又以水质最为重要，正是由于水质变坏，使得病原菌、病毒、霉菌、病原 原生动物等协同作用，才导致养殖生物的疾病和死亡。水质和生物相的相对平衡，往 往受到养殖系统水中营养构成所影响，如氨、亚硝酸盐、硝酸盐和磷酸盐等。氨、亚 硝酸盐以及高浓度的硝酸盐和磷酸盐都是对养殖对象有害的物质，其中又以分子态的 氨毒性最大。养殖环境中，氨的来源主要是过量投放的饵料和养殖对象的排泄物。养 殖环境中氨浓度过高，易使鱼类等养殖对象产生的氨不能排放到水体中，而在鱼体内 积累，初期会有呼吸急促、体色异常等症状，若持续时间较长，易造成鱼类集体死亡， 尤其在集约化养殖环境中，该现象更容易发生f 2 捌。 青岛理工大学工学硕士学位论文 1 3 水产养殖中的主要污染物及危害 1 3 1 养殖水体的外部污染 水产养殖过程中，为了增加产量和防治各种病害常常旌用多种化学肥料和药物， 包括消毒剂、杀虫剂、抗生素等。这些物质不仅破坏了养殖水体的自然微生态区系， 加重了养殖水体自净的负担，同时对水生动物和其他生物包括水体中有益微生物均有 副作用，影响它们的正常生长、发育和繁殖，乃至间接的危害人类健康 4 1 。 氮是植物和微生物的主要营养性元素，过量氮元素持续排入湖泊、水库、河口、 海湾等自然水体后，会加速水体的富营养化进程。水体富营养化后，水生植物和藻类 迅速大量繁殖，密度过高，阻塞鱼鳃和贝类水孔，影响鱼类呼吸作用；同时，藻类覆 盖水面，降低水体的透明度和观赏价值，影响水中植物的光合作用，致使底层堆积的 有机物质在厌氧条件分解产生的有害气体，产生的生物毒素也会伤害鱼类。由于氮元 素的大量排入，造成我国近年来湖泊水华、海水赤潮现象严重。据中国环境状况公报 嘲显示，2 0 0 5 年我国海域共发生赤潮8 2 次，累计发生面积约2 7 0 7 0 平方公里，因赤 潮造成的直接经济损失逾6 9 0 0 万元。上述情况均加重了养殖水体外部污染的进程。 1 3 2 养殖水体的自身污染 传统的水产养殖是靠投饵或施肥来获得尽可能多的水产品，生产中的残饵、残核 和鱼体排泄物等使水产养殖产生自身污染，尤其是随着养殖方式向集约化、工厂化发 展，养殖密度和投饵量大大增加，残饵量和鱼体排泄物也相应增加，养殖污染更趋严 重，养殖中产生的所有残饵、残核和排泄物都要在水体中分解并消耗溶解氧，分解的 产物主要成分为氨氮，从而使水中溶解氧减少，氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐增加，水中 孳生积累大量病毒、细菌、浮游生物等微生物，引起水体自净能力降低，导致水体富 营养化或水质恶化，严重影响水产养殖的收益。概括来讲，水产养殖自身污染的类型 主要有以下几种： ( 1 ) 营养物污染 水产养殖大多采用投饲外源性饵料，高密度养殖势必采用过量投饵。大量残饵、 渔用肥料、养殖动物粪便等排泄物和生物残骸等所含的营养物质氮、磷以及悬浮物和 耗氧有机物等是主要污染物，并且这些营养物可能成为水体富营养化的污染源，养殖 水体的自净能力从而严重下降1 6 1 。海水养殖区大部分位于风平浪静的泻湖或港湾，水 2 青岛理工大学工学硕士学位论文 体交换条件差，易产生积累性污染。钱宏林等【7 1 对广东沿海1 9 8 0 1 9 9 2 年发生的6 6 起赤潮事件进行研究分析，指出海洋污染和海水养殖业自身污染是赤潮发生频繁的根 本原因；徐宁等【8 】也指出，陆源污染物排入及海水养殖业自身污染是近岸海域营养物 质输入的主要来源。淡水养殖方面，湖泊养鱼时粗放型人工投饵利用率仅为3 0 ，饵 料系数2 0 2 5 ，如草鱼增重l k g ，使用2 5 k g 配合饲料，搭喂2 1 5 k g 水草。产生的污 染物直接进入水体，沉入湖底，加速了水体小区域的富营养化【9 】。 ( 2 ) 药物污染 为了防治养殖水体生态破坏以及养殖动物疾病频发，养殖人员经常施用一些药 物。水产养殖中经常使用杀菌剂、杀寄生虫剂等防治水产动物疾病；使用杀藻剂、除 草剂控制水生植物；使用杀虫剂、杀螺剂等消除敌害生物，此外还使用麻醉剂、激素、 疫苗和消毒剂等药物，有时甚至人药鱼( 虾) 用，用药剂量越来越大，药物的毒性越 来越强。由于不规范用药或药物本身的特点等原因，使养殖水域出现药物残留进而对 水域生态系统造成危害。g o w e n 【呻】发现，在5 个养鱼网箱的下面，底泥的四环素残留 量为2 0 6 3 p g m g ，并可持续残留达7 个月，这些抗生素的存在肯定会减弱养殖水体 降解有机碳的能力。 ( 3 ) 底泥富集污染 研究表明，养殖区底泥中碳、氮和磷等的含量明显高于周围水体底泥中的含量， 而且底泥中经常有残饵富集，例如对虾的残饵、粪便沉积在池底形成有机污染，深度 可达3 0 - 4 0 c m ，并随池龄而增加【1 1 1 。林永泰等【1 习研究了黑龙滩水库网箱养鱼对水环境 的影响，指出一年沉积库底的残饵、粪便等达1 6 2 5 t ，构成了内负荷二次污染源，并 且网箱养鱼已经促进了网箱区水体富营养化。老化池塘中，残饵、粪便、死亡动植物 尸体以及药物等有毒化学物质在底泥中富集更为严重。这样，底泥中的微生物参与反 硝化和反硫化反应，产生n h 3 和h 2 s 等物质，恶化水产动物的生存环境；另外，在 适当条件下会释放氮、磷等到周围水体中去，促进藻类生长，引起水体的富营养化【埘。 不同的水产养殖系统排放废物的种类和数量的差异主要与养殖系统的形式和养 殖动物的种类有关。就集约化养殖水体而言，氨氮污染已成为制约水产养殖环境的主 要胁迫因子【1 4 1 。在亚太地区，人们普遍在近岸水域用鲜小杂鱼投喂网箱养殖各种非 蛙科鱼类，饵料浪费和污染非常严重【1 5 】。杨逸萍等1 6 1 报道人工投饵输入虾池的n 占 总输入的9 0 ，其中仅1 9 转化为虾体内的n ，其余大部分( 6 2 0 o - 6 8 ) 积累于虾 青岛理工大学工学硕士学位论文 池底部淤泥，此外尚有8 1 2 以悬浮颗粒n 和d o n 、d i n 等形式存在于水中。即 使是在管理得最好的养虾场，也仍有多达3 0 的饲料未被虾摄食。在东南亚对虾养殖 过程中，每年投入对虾半精养池塘的n 为5 0 0 k g h m 2 ，投入对虾精养池塘的n 为 1 8 6 8 k g h m 2 。在管理较好的半精养池塘仅有5 8 的n 以对虾产品形式收获，1 2 8 的n 排入海洋，其余部分沉积在池底；在精养池塘有约2 1 的n 以对虾产品形式 收获，8 4 的n 排入海洋【m 。 1 4 水产养殖中氨氮的产生、存在形式、危害及归宿 1 4 1 水产养殖中氨氮的产生 在自然状态下，水体中的氨是由于含氮有机物氧化不完全时腐化分解产生的，或 由反硝化细菌还原产生。另外，水生动物的最终代谢产物通常也以氨( n 地) 的形式 从鳃与体腔内排出。 ( 1 ) 水体中含氮物质转化为氨氮 细菌分解作用的初步产物是氨和氨盐，然后被氧化成亚硝酸盐( n 0 2 - ) ，再进一 步氧化成植物生长所需要的硝酸盐( n 0 3 ) 形式的氮。当水体缺氧时，反硝化细菌可 以把硝酸盐( n 0 3 ) 还原为亚硝酸盐( n 0 2 ) ，再还原为游离氮气。在交换性较差的 水体中，n h 3 - n 浓度较高，并可成为无机氮的主要形式。 ( 2 ) 氨氮为大多数水生动物的代谢产物 甲壳类每天分泌的氨氮量约为l m g g 体重。蚤状幼体每天每克干重可分泌5 1 t t g 氨氮。在一般情况下，浮游动物每日每平方米水面可排泄6 7 5 3 5 2 m g 的氮( 以每平 方米水面浮游动物生物量排氮总量7 5 m g 计) 。每当水体中浮游动物大量繁殖时，浮 游植物受到抑制数量极少，总氨量会居高不下，光合作用也受到限制，溶氧减少，进 而造成浮游动物的大量死亡，腐烂分解，导致氨的重复积累。另外水生浮游植物，特 别是一些固氮植物，其代谢产物和衰老藻类细胞的自溶及分解，使以颗粒状结合着的 有机氮以n h 3 - n 的形式释放到水体中。 ( 3 ) 水体中过多饵料等有机物质转化为氨氮 养殖水体中由于投放过量的投饵，造成有机物质的积累，生活污水和综合养殖中 畜禽污水及废弃料的引入也是有机物质的主要来源，氮素物质的过剩导致了水体循环 系统中分解环节受抑制，造成硝化反应不完全，产生氨、亚硝酸赫、硫化氢、甲烷等 有毒产物，致使水体污染和病害多发。 4 青岛理工大学工学硕士学位论文 1 4 2 氨氮在水中的存在形式 氨氮的毒性强弱不仅与氨氮含量有关，与其存在形式也有一定关系。氨氮在水中 以离子态( n f 4 + ) 和非离子态( n h 3 ) 两种形态存在，前者对鱼类无毒性，而非离子 态的氨( n h 3 ) 对鱼类有较强的毒性。氨主要以离子状态存在，并包括未电离的 n h 3 h 2 0 。用一般的化学分析方法( 纳氏试剂光度法) 测定的氨含量，实际上是离子 态铵( n h 4 + ) 和非离子态氨( n h 3 ) 二者的总和，也称总氨氮( t a n ) 。 氨极易溶解于水，并在水中建立如下化学平衡： n h 3 + 1 - 1 2 0 n h 3 且0 = n h 4 + o h 一 平衡时分子态氨( n i t 3 ) 在总氨氮量( t a n ：n h 3 + n i - h + ) 中所占的比率会受温 度及p h 的影响而改变1 1 8 】，其间关系见表1 1 。由表中可以看出，当p h 一定时，温 度越高，n h 3 在t a n 中所占的比率越高；当温度一定时，p h 越高，n h 3 在t a n 中 所占的比率也越高。p h 值大于l l 时几乎全以分子氨( n h 3 ) 的形式存在。 5 童星堡三奎耋三耋堡圭茎堡丝圣 表1 1 分子态氨( n h 3 ) 在不同p h 及水温下所占比率( ) 7 0 7 2 7 4 7 6 7 8 8 0 8 2 8 4 8 6 8 8 9 0 9 2 9 4 9 6 9 8 1 0 o l o 2 0 2 9 0 4 6 0 7 3 1 1 6 1 8 2 2 8 6 4 4 5 6 8 8 0 3 4 0 5 4 0 8 5 1 3 4 2 1 1 3 3 0 5 1 4 7 9 0 o 3 9 0 6 3 0 9 8 】5 6 2 4 4 3 8 l 5 9 0 9 0 4 0 4 6 0 7 2 1 1 4 1 7 9 2 ，8 l 4 3 8 6 7 6 1 0 3 l o 5 2 0 8 3 1 3 1 2 0 6 3 2 2 5 0 2 7 7 2 1 1 7 1 0 ，6 0 0 9 6 1 5 0 2 3 6 3 7 0 5 7 4 8 。8 0 0 6 9 1 1 0 1 7 3 2 7 l 4 2 3 6 5 4 9 9 8 0 8 00 9 l 1 2 61 4 4 1 9 82 2 6 3 】03 5 3 4 8 25 4 8 7 4 38 4 2 1 1 2 91 2 7 2 1 3 2 61 4 9 51 6 7 81 8 7 7 1 0 4 81 1 9 71 3 6 1 1 5 4 11 7 3 71 9 5 02 1 7 8 2 4 2 2 2 6 8 0 1 5 6 61 7 7 31 9 9 82 2 4 i 2 5 0 0 2 7 7 4 3 0 6 23 3 6 23 6 7 2 2 2 7 32 5 4 62 8 3 63 1 4 03 4 5 63 7 8 34 1 1 64 4 5 34 7 9 1 3 1 8 0 3 5 1 23 8 5 54 2 0 4 4 5 5 74 8 0 95 2 5 85 5 9 95 9 3 l 4 2 4 94 6 1 84 9 8 5 5 3 4 8 5 7 0 26 0 4 56 3 7 3 6 6 8 56 9 7 9 5 3 9 45 7 6 26 1 1 76 4 5 66 7 7 77 0 7 87 3 5 87 6 1 77 8 5 5 6 4 9 9 6 8 3 17 1 4 07 4 2 87 6 9 27 9 3 38 1 5 38 3 5 18 5 3 0 7 4 6 37 7 3 6 7 9 8 38 2 0 78 4 0 88 5 8 88 7 4 9 8 8 9 2 9 0 1 9 8 2 3 48 4 4 18 6 2 58 7 8 88 9 3 39 0 6 09 1 7 39 2 7 19 3 3 8 1 4 3 氨氮对养殖生物的危害 分子氨( n h 3 ) 与离子铵( n i - h + ) 在水中可以相互转化，但它们是性质不同的两 类物质。水合n h 3 h 2 0 能通过生物表面渗入体内，渗入的数量决定于水与生物体液 ( 如血液、水分) p h 值的差异。任何一边液体的p h 值发生变化时，生物表面两边 的未电离n h 3 的浓度就会发生变化。n h 3 总是从p h 值高的一边渗入到p h 值低的一 边。如n i t 3 从组织液中排出这是正常的生理排泄现象；相反，若鱼类等生物长期生 活在含n h 3 量较高的水体中，不利于体内氮废物的排泄，再若n h 3 从水体渗入组织 液内，就会形成血氨中毒。n h 4 + 不能渗过生物膜，因此它对生物无明显的毒害。以 前关于氨的毒性，常以总氨( n h 3 + n h 4 + ) 的浓度表示，然而在p h 值等水质条件不 6 青岛理工大学工学硕士学位论文 同时，即使总氨量一样，毒性也可能相差很大，用分子氨浓度表示毒性，就更为确切。 养殖水域中分子氨允许的最高浓度通常为每升o 1 毫克氮( o i m g n l ) 。 ( 1 ) 鱼类 n i t 3 具有较高的脂溶性，它通过鳃和皮膜进入鱼体，损伤鱼鳃表皮细胞，使血液 和组织中氨的浓度升高，降低血液的载氧能力，使血液p h 值升高，从而引起鱼体内 多种酶活力异常变化，反映为机体代谢功能失常或组织机能损伤，使鱼体不能正常反 应，甚至由于改变了内脏器官的皮膜通透性，造成渗透调节失调，引起充血，呈现与 出血性败血症相似的症状，并降低鱼体的免疫力，影响鱼类的生长，最终导致死亡。 即使是低浓度的氨，长期接触也会损害鳃组织，出现鳃小片弯曲、粘连或融合现 象。据实验，水中有o 1 m g l 的氨时，鳟鱼血液中氧减少1 7 ，c 0 2 增加1 5 ，严重 抑n t 鱼的生长。鱼越小，对氨越敏感，0 2 0 4 m g l 能使鱼苗急性氨中毒死亡，0 6 m g l 可使小鱼死亡，l m g i , 可使鳟鱼死亡。鳙鱼苗氨的安全浓度为o 0 9 m g n l ，对草鱼的 最大氨氮允许浓度为o 0 5 4 0 ，0 9 9 m g l 。研究表呀1 9 1 ，鳜鱼血清碱性磷酸酶( a k p ) 活性和分子氨浓度呈抛物线变化关系，鲫鱼血清溶菌酶( l s z ) 活性随分予氨浓度递 增而下降。保持鲫鱼a k p 和l s z 活力的n h 3 浓度临界值为0 7 0 m g l ( 7 2 h ) 、0 5 6 m g l ( 9 6 h ) ，而保持鳜鱼a k p 活力的n h 3 临界浓度为o 1 4 3 m g l ( 9 6 h ) 。n h 3 对鲢、 鳙鱼苗2 4 小时半致死浓度分别是1 1 0 6 m g l 和o 5 5 9 m g l ，随着鱼体的生长，氨的致 死浓度也逐渐增大1 1 9 1 。草鱼、杂交罗非鱼的最大允许n h 3 浓度分别为o 0 5 4 0 0 9 9 m g l 和o 0 3 5 0 1 7 1 m g l 。当n h 3 浓度超过0 6 6 m g l 时就会对鲤鱼产生毒性作用。 我国渔业水质标准中规定分子氨浓度卯0 2 m g l ，对鱼类生长、繁殖等生命活动 不会产生影响。在养殖水体中分子氨浓度介于0 0 2 - 0 2 m g l 的，仍在鱼类可忍受的安 全范围内，一般也不会导致鱼类发病。肥水鱼塘氨氮总量正常范围认为是 0 0 5 0 1 5 m g l ，超过o 3 m g l 时就构成污染。超过0 5 m g l 时对鱼类的毒性较大，在 高温及高密度条件下极易导致鱼类中毒、发病，甚至大批死亡。 ( 2 ) 河蟹 不同河蟹幼体对氨氮与亚硝氮的耐受浓度各不相同，江敏等f 2 川对河蟹幼体z 3 ， z 4 ，z 5 的研究表明，氨氮与亚硝氮的安全浓度分别为0 0 6 6 、0 1 9 6 、0 1 8 9 m g l 和0 7 1 3 、 1 3 8 4 、2 1 7 3 m g l 。王丹等【2 l 】认为氨氮对河蟹z l 幼体的安全浓度为0 0 5 2 m g l ，可见 分子氨的毒性高于亚硝酸盐，并且z 3 前各期幼体对亚硝酸盐与氨更为敏感。 青岛理工大学工学硕士学位论文 ( 3 ) 虾 对斑节对虾的幼体来讲，n h 3 - n 和n 0 2 - n 的安全浓度分别是0 0 1 m g l 和 0 1 m g l t 2 2 1 。对罗氏沼虾幼体来说，n h 3 - n 和n 0 2 - n 对毛，z 6 ，z 7 的安全浓度分别 为0 2 8 7 、0 3 1 8 、0 3 5 8 m g l 和0 6 4 、1 3 8 、1 6 8 m g l t 2 3 1 。可见n h 3 - n 和n 0 2 - n 对斑 节对虾和罗氏沼虾幼体均有毒性影响。 ( 4 ) 海参 在刺参育苗过程中，尤其是稚参投喂大量人工饵料，水温较高，易导致海水中氨 氮浓度升高，总氨浓度和p h 值发生很大变化，从而导致未解离氨氮的增加氨氮对刺 参浮游幼体的影响 2 4 1 见表1 2 。 表1 - 2 氨氮对刺参浮游幼体的影响 t a b 1 - 2t h ei n f l u e n c eo f a m m o n i a t o p l a n k t o n i cl a r v a e 分子态氨浓度为2 1 8 4 m g l 时，3 d 内幼体全部死亡。浓度为1 2 4 8 m g l 时，1 0 d 内幼体全部死亡。浓度为0 2 1 8 0 7 0 0 m g l 时，个体发育很小，且与对照组相比，存 活率较小。在浓度为o 0 7 0 1 2 5 m g l 时，第1 0 d 镜检，发现很多幼体出现畸形，且存 活率较少，仅达6 0 左右。由此可粗略推出，分子态氨氮对刺参耳状幼体的影响浓度 为0 0 7 m g l 。 8 青岛理工大学工学硕士学位论文 1 4 4 养殖水体中氨氮的归宿 对集约化养殖及水族观赏而言，水体中氨氮主要以下述途径循环、累积或脱除。 1 硝化和反硝化脱除水体 氨氮在水体中先被氨氧化细菌氧化成亚硝酸盐，距硝酸盐再被亚硝酸盐氧化细菌 氧化成硝酸盐。此过程( 即硝化作用) 消耗氧气，当水中溶解氧浓度低于1 - 2 m g l 时 硝化作用速率明显降低。在水中溶解氧缺乏的情况下，反硝化细菌能将硝酸盐还原为 n 2 或n 2 0 ，形成的气态氮作从系统中流失。 2 藻类和植物的吸收 藻类和水生植物能利用氨合成氨基酸，所以植物对氨氮的吸收是池塘中氨氮去除 的主要方法，冬天水生植物的减少和死亡会使水中的氨氮含量明显上升。 3 挥发及底泥吸收 在池塘中氨氮浓度高、高p h 值、采取增氧措施、搅动水流等情况下，都会有利 于氨氮的挥发。底泥土壤可以吸收氨，氨氮以有机物形式存在于底泥中。 4 矿化及回到生物体内 所谓矿化，即以有机物的形式存在于池底土壤中的氨氮，在有机物质分解后又回 到水中，分解速度依赖于温度、p n 、溶氧以及有机物质的数量和质量。当水中氨氮 浓度较高时，氨( n h 3 ) 能通过鳃进入水生动物体内，这样就会造成水生动物氨中毒。 1 5 水产养殖中亚硝氮的产生及危害 亚硝氮( n 0 2 - n ) 是水环境中有机物分解的中间产物，同时也是氨氮转化为硝氮 的中间产物，极不稳定，当氧气充足时，它可以在微生物作用下转化为对鱼毒性较低 的硝酸盐，但也会在缺氧时转化为毒性较强的氨氮。温度对水体中硝化作用有较大影 响，硝化细菌在温度较低时，硝化作用减弱，在冬季几乎停止，氨氮很难转化为 n 0 2 - n ，因而氨氮浓度较大。当温度升高时，硝化细菌开始活跃，硝化作用加剧，可 将氨氮转化为亚硝氮( n 0 2 - n ) 。 亚硝氮( n 0 2 - n ) 能与鱼体血红素结合成高铁血红素，使鱼体血液中含二价铁的 血红蛋白变成含三价铁的高铁血红蛋白，而高铁血红蛋白不能运载氧气，使血液携带 氧气的机能受到影响，造成组织缺氧，鱼群体质下降甚至影响生长，为病原的入侵创 造了条件。般而言，当亚硝氮( n 0 2 - n ) 浓度在鱼的安全浓度以下时，鱼类可以通 过自身的生理调节来补偿因高铁血红蛋白升高而引起的载氧能力不足问题。与氨氮相 9 青岛理工大学工学硕士学位论文 比，虽然亚硝酸氮对水生动物的毒性要低得多，但当集约化养殖池中亚硝酸氮浓度过 高，超过了鱼类的安全浓度时，鱼体自身的生理调节不能补偿因高铁血红蛋白的含量 升高而引起的鱼体组织缺氧，也可能引起水生动物发生亚硝酸氮中毒。相关试验表明， 鲤鲫鱼对亚硝酸态氮的耐受力较低，而罗非鱼对亚硝酸态氮的耐受力较强，这与鱼池 中出现的实际情况相吻厶【2 5 1 。鳗鱼发生亚硝酸盐中毒时，其症状为鳗鱼鳃丝充血、 肿胀、粘液增多，呈褐色或暗红色，食欲减退，甚至厌食。体表无光泽，皮肤粗糙， 胸鳍微发红。严重时，池水呈褐色，泡沫较多。病鳗游动无力，往往于傍晚前聚集于 水中央，浮于水面呈缺氧状，内脏往往表现为肝、胆囊肿大。鳗鱼就易发生烂鳃、细 菌性败血症等疾病。对虾发生亚硝酸盐中毒时，其症状主要表现为多数病虾在池塘表 面缓慢流动或紧靠浅水岸边，呈现空胃，触动时反应迟钝，尾部、足部和触须略微发 红。临死时体色逐渐变成青紫色，继而呈灰白色。多数病虾先在池塘表面缓慢游动， 继而转入中下层水体，最后静伏池底丽死。因此，需把亚硝酸盐控制在o o s m g l 以 内，亚硝酸盐浓度一旦超出此范围，鱼、虾、蟹血液运载氧能力会逐渐降低，造成鱼、 虾、蟹慢性中毒，摄食量降低甚至厌食，鳃组织出现病变，呼吸困难，骚动不安。当 水中的亚硝酸盐浓度达到0 3 m g ，l 时，鱼、虾、蟹某些新陈代谢功能失常，体力衰退， 此时鱼、虾、蟹就很容易患病，导致死亡 2 6 1 。 1 6 硝化细菌及其在水产养殖中的应用 为了减少氨氮、亚硝氮污染带来的危害，人们采用加注新水、曝气、漂白粉或臭 氧氧化、使用斜发沸石进行离子交换等方法，但这些方法有很大的局限性，脱氮效果 并不理想【2 7 2 8 】。因此，在水体氨氮污染控制中，人们开始研究采用生物处理法，如活 性污泥法、生物膜法和稳定塘法，但这些传统方法存在或伴有污泥产生、反应启动慢、 出水水质不稳定等问题f 2 9 , 3 们。随着研究的深入，从传统生物处理方法中延伸出来的生 物修复技术引起人们的关注。生物修复技术是利用自然环境中生息的微生物或使用特 定的微生物在人为促进工程化条件下，分解污染物，修复受污染的环境。一般采取向 水体中投加微生物制剂的方法。微生物制剂作为生物强化技术的核心手段之一，是利 用微生物问的互生关系、辅代谢等生理特性，将具有特定生物转化能力的菌株经过筛 选、扩增、放大培养制成菌剂，投放到受污染的环境中，对污染物进行原位降解和转 化。对养殖水体中去除氨氮所投加的微生物制剂通常是硝化细菌制剂。 l o 青岛理工大学工学硕士学位论文 1 6 1 硝化细菌种类 硝化作用( n i t r i f i c a t i o n ) 是氮素生物地球化学循环( b i o g e o c h e m i c a lc y c l e ) 中非 常重要的一个环节，也是废水生物脱氮的第一个步骤；可以分为氨到亚硝酸( 氨氧化) 和亚硝酸到硝酸( 亚硝酸氧化) 的两个转化过程，形成的硝酸盐进而通过反硝化作用 形成氮气逸出水体完成脱氮；因此硝化作用在生活污水、焦化废水、养殖循环水等的 生物脱氮处理中极为重要，其研究受到广泛关注1 3 1 1 。 硝化细菌( n i t r i f y i n gb a c t e r i a , o rn i t f i f i e r ) 是一大类在自然界氮素循环中十分重 要的菌群，它们能够通过硝化作用把氨氮转化为亚硝酸盐，再进一步把亚硝酸盐转化 为硝酸盐。硝化细菌是历史上最早发现的表现为化能无机自养型的微生物。在伯杰氏 细菌鉴定手册( b e r g e y sm a n u a lo f d e t e r m i n a t i o nb a c t e r i o l o g y ) 第8 版中将硝化细菌统 归于硝化杆菌科7 个属：硝化杆菌属( f f 阳6 把r ) 、硝化刺菌属( n i t r o s p i n a ) 、硝 化球菌属( n i t r o c o c c u s ) 、亚硝化单胞菌属( n i t r o s o m o n a s ) 、亚硝化螺菌属 ( n i t r o s o s p i r a ) 、亚硝化球菌属( n i t r o s o c o c c u s ) 和亚硝化叶菌属( n i t r o s o l o b u s ) ， 共1 4 种。在伯杰氏细菌鉴定手册第9 版中收录了除上述7 属外还有另外2 属，硝化 螺菌属( n i t r o s p i r a ) 和亚硝化弧菌属( n i t r o s o v i b r i o ) ，共2 0 种 3 2 1 。这些微生物广 泛分布子土壤、湖泊及底泥、海洋等环境中。相关硝化细菌菌属的形态结构特征表如 下( 见表1 3 和表1 - 4 ) 。 表1 3 氨氧化细菌的种属特征 t a b i - 3c h a r a c t e r i s t i c so f a m m o n i a - o x i d i z i n gb a c t e r i ag e n e r a 青岛理工大学工学硕士学位论文 所有自养型氨氧化细菌( 也称亚硝酸细菌、亚硝化细菌) 都是革兰氏染色阴性细 菌，自养生长时，以氨为唯一能源，以c 0 2 为唯一碳源；混合营养生长时，可同化 有机物质。适合大多数氨氧化细菌的生长条件是：温度2 5 - 3 0 c ，p h 7 5 8 0 ，氨浓度 2 1 0 m m o i l 。 亚硝酸盐氧化细菌( 也称硝酸细菌、硝化细菌) 是革兰氏染色阴性细菌。自养生 长时，以亚硝酸盐为难一能源，以c 0 2 为唯一碳源；混合生长时，可同化有机物质。 适合大多数亚硝酸盐氧化细菌生长的条件为：温度2 5 3 0 c ，p h 7 5 8 0 ，亚硝氮浓度 2 3 0 m m o 儿。 除了上述专性化能自养微生物外，有些异养微生物也能进行硝化作用。如恶臭假 单胞菌( p s e u d o m o n a sp u t i d a ) 、脱氮副球菌( p a r a c o c c u sd e n i t r i f i c a n s ) 、粪产碱杆 菌( a l c a l i g e n e s f a e e a l i s ) 等。这些微生物可以在低碳条件下进行硝化作用，也可以在 有机土环境中进行硝化作用。 基于1 6 sr r n a 基因序列同源性( 相似性) 的系统发育分析表明，所有的自养氨 氧化细菌( 亚硝酸细菌) 系统发育比较单一，它们均属于变形菌纲( p r o t e o b a c t e r i a ) y 亚纲和b 皿纲( 见图1 - 1 ) 3 3 l ，其中属于p 亚纲的亚硝化细菌又可以分为两个类群： 亚硝化单胞菌群( n i t r o s o m o n a s ) ，包括欧洲亚硝化单胞菌( n i t r o s o