氨基酸分析PPT课件.ppt

1,氨基酸分析,2,氨基酸分析在蛋白质化学和生物技术研究、临床诊断和细胞生理学研究、营养学与卫生保健、培育农作物优良品种、食品、制药等领域具有非常重要的意义。,3,第一节氨基酸的基本结构及性质,一、定义氨基酸是分子中含有氨基和羧基的一类化合物。组成蛋白质的氨基酸只有二十种。,4,二十种氨基酸中有八种为人体必需氨基酸。人体必需的氨基酸：人体内不能合成，只有靠食物供给的氨基酸。各种蛋白质含氨基酸的种类和数量都各不相同。,5,二、氨基酸的分类和命名,（一）分类1、根据氨基酸的酸碱性,6,酸性氨基酸,二个羧基一个氨基,天冬氨酸谷氨酸,碱性氨基酸,一个羧基二个或二个以上氨基,赖氨酸精氨酸组氨酸,中性氨基酸,一个羧基一个氨基,实际水溶液呈弱酸性：电离能力COOHNH2,7,2、化学特性,疏水性：AlaValLeuIlePheProMet带电：ArgLysAspGlu(His)极性：SerThrCysAsnGlnHisTyrTrp特殊：Gly(Pro),8,带电氨基酸,9,极性氨基酸,10,(二）命名,系统命名法：氨基作为取代基，羧酸为母体称为氨基某酸；习惯上：氨基的位置用、等表示2.俗名：多按其来源或某些性质而命名如氨基乙酸因其具有甜味而被称命名为甘氨酸,11,（三）氨基酸的立体化学,由蛋白质水解的氨基酸都为-氨基酸，除甘氨酸外，所有-C都为手性碳原子。天然的氨基酸均为L-氨基酸,12,在糖化学中，D、L构型的参照物为甘油醛：,L-甘油醛,D-甘油醛,L-氨基酸,D-氨基酸,13,三、氨基酸的化学性质,（一）氨基酸的两性电离和等电点1.两性电离：氨基酸分子中含有-NH2和-COOH；为简化起见可表示为：,14,它们发生分子内酸碱反应：,两性离子,从平衡式可知，氨基酸在溶液中的荷电状态与溶液的pH值有关。,15,正离子pHpI,两性离子pH=pI,H+,OH,H+,OH,16,2.等电点：,将氨基酸水溶液的酸碱度加以适当地调节，使氨基酸的酸性电离程度与碱性电离程度相等。此时，氨基酸带有的正电荷数目和负电荷数目相等，此溶液的pH值称为氨基酸的等电点，用pI表示。,氨基酸的带电状态和在电场中的状况：,pH=pI,净电荷为零,在电场中不移动,pHpI,带负电荷,等电点,17,要使氨基酸达到等电状态：中性氨基酸：pIpH7加碱,18,（二）与HNO2的反应,除脯氨酸外，其它氨基酸都具有-NH2，可与HNO2反应，定量放出氮气（N2）。,HNO2,N2,利用此反应可以测定蛋白质分子中的自由氨基及其水解氨基酸分子中氨基的含量。,19,（三）脱羧反应,Ba(OH)2,CO2,脱羧反应亦可在某些细菌的存在下，由于酶的作用发生，如：,精氨酸或鸟氨酸,腐胺,赖氨酸,尸胺,20,（四）与茚三酮的显色反应,水合茚三酮,CO2,21,蓝紫色化合物,根据CO2的量或蓝紫色的深浅程度作为-氨基酸定量分析的依据。,22,（五）氨基酸代谢,23,氨基酸的降解,24,1、脱氨基作用,1）氧化脱氨基作用2）非氧化脱氨基作用3）转氨作用4）联合脱氨作用,25,1）氧化脱氨基作用,-氨基酸在酶的作用下氧化脱氢生成-酮酸，并放出游离NH3的过程。2RCHCOO-+O22RC-COO-+2NH4+NH3+O,26,RRR氨基酸氧化酶H2OCHNH2C=NHC=O+NH3FADFADH2COOHCOOHCOOH-氨基酸-亚氨酸-酮酸FAD起着电子和质子的传递体作用。FAD+2H=FADH2O2过氧化氢酶FADH2H2O2H2O+O,27,氧化酶：a)L氨基酸氧化酶FMN（黄素单核苷酸）为辅基或FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）为辅基（最适pH=10，正常条件下活力低）b)D氨基酸氧化酶FAD为辅基（活力强、分布广、但D氨基酸不多，作用不大）,28,L谷氨酸脱氢酶(不需氧脱氢酶)NAD+或NADP+为辅酶，催化可逆反应NH3+OCH2COO-CCOO-+NAD+H2O+NADH+H+(CH2)2NADP+（CH2)2NADPH+H+COO-COO-,29,2）非氧化脱氨基作用,A、还原脱氨RCHNH2COOH+H2RCH2COOH+NH3B、水化脱氨RCHNH2COOH+H2ORCHOHCOOH+NH3,30,C、直接脱氨,31,3）转氨作用,A、概念:氨基酸的NH2转移到酮酸上，生成相应的另一种酮酸和氨基酸，这种作用称转氨作用。B、转氨酶50种GOT:谷草转氨酶；GPT：谷丙转氨酶辅酶：磷酸吡哆醛（PLP）C、转氨反应是可逆反应。,32,谷丙转氨酶,PLP,33,谷草转氨酶,PLP,34,转氨作用是连接糖代谢和氨基酸代谢的桥梁，除Lys、Thr外其余氨基酸均可参与，特别注意下面三种氨基酸的转化。丙酮酸丙氨酸（Ala）-酮戊二酸谷氨酸（Glu）草酰乙酸(OAA)天冬氨酸（Asp）（OAA：OxaloaceticAcid；Asp：AsparticAcid）,35,4）联合脱氨作用,转氨作用和L-谷氨酸脱氢酶的氧化脱氨作用联合进行，称作联合脱氨作用。,36,37,嘌呤核苷酸循环,38,2、脱羧基作用,1）直接脱羧脱羧酶RCHNH2COOHCO2+RCH2NH2磷酸吡哆醛,39,Glu-氨基丁酸（对中枢神经系统传导有抑制作用）Asp-丙氨酸（泛酸组分）Trp（脱氨、脱羧、氧化）吲哚乙酸（植物生长素）His组胺（降血压作用）Tyr酪胺（升血压作用）Ser（脱羧）乙醇胺（甲基化）胆碱二者分别合成脑磷脂和卵磷脂，可作为生物膜的成分。,40,2）羟化脱羧,41,酪氨酸（Tyr）多巴多巴胺多巴聚合黑素，它是土豆、梨、苹果切开后切口变黑的原因，人体毛囊和表皮细胞也可形成黑素，使毛发和皮肤变黑。多巴与多巴胺还可合成生物碱（植物）及动物中去甲肾上腺素和肾上腺素。,42,Lys尸胺Met亚精胺，精胺多胺Arg鲱精胺，腐胺植物适量吸收，刺激细胞分裂，生长和防止衰老等作用植物生长调节剂,43,3、氨基酸分解产物的代谢,NH3酮酸CO2胺（RCH2NH2）,氨基酸分解产物:,44,1)NH3的代谢,合成新的氨基酸及其他含氮化合物酰胺的生成储存氨的形成尿素的形成鸟氨酸循环生成铵盐,45,酰胺的生成储存氨的形成谷氨酰胺合成酶Glu+ATP+NH3Gln+ADP+Pi谷氨酸酶Gln+H2OGlu+NH3,46,天冬酰胺合成酶Asp+ATP+NH3Asn+ADP+Pi天冬氨酸酶Asn+H2OAsp+NH3,47,尿素的形成鸟氨酸循环,48,a)鸟氨酸+NH3+CO2瓜氨酸b)瓜氨酸+NH3精氨酸精氨酸酶c)Arg尿素+鸟氨酸H2O+2NH3+CO2+3ATPNH2-CO-H2+AMP+PPi+2ADP+Pi,49,2)酮酸的代谢,A、再合成氨基酸B、氧化成CO2+H2O,50,51,C、转变成糖和脂肪,生糖氨基酸：在体内可以转化成糖的氨基酸。生酮氨基酸：在体内可以转变成酮体的氨基酸。生糖兼生酮氨基酸：既可生糖，又可生酮的氨基酸。,52,第二节氨基酸的定量斑点分析,大多数氨基酸不含有特征发色基团。因此，氨基酸的分析依赖于衍生化反应。对衍生化试剂的要求是反应快，并且产物与试剂本身的光谱性质有明显的差异。,53,常用的衍生化试剂有2，4-二硝基氟苯、荧光胺及邻苯二甲醛等。根据产物性质的不同，衍生化试剂可分为显色剂及荧光衍生化试剂两大类。,54,一、斑点显色分析法,茚三酮是氨基酸的斑点显色分析中非常简单的衍生化试剂。它可以与一级和二级胺在酸性介质中（pH34）加热反应，反应产生氨、二氧化碳和蓝-紫色的络合物。,55,一级和二级胺的检测波长分别为570和440nm。若二者同时存在，一般在500nm处测定，灵敏度有所降低。另一种常用的显色反应试剂是2，4-二硝基氟苯，它可以与样品中氨基酸及一级和二级胺反应，生成黄色络合物，检测波长在420nm。该法测定的是氨基酸的总量。,56,二、斑点荧光分析法,荧光胺是用于氨基酸分析的高灵敏荧光衍生化试剂，可用于氨基酸的表面分析，如薄层色谱。邻苯二甲醛（OPA）是用于氨基酸荧光分析的另一种常见的衍生化试剂。,57,第三节色谱方法,氨基酸种类较多、结构相近，采用色谱分离时，由于等电点、极性和分子大小不同，组分洗脱顺序不同。,58,（一）离子交换色谱法,离子交换色谱的基本原理是基于带电荷的阴阳离子与带相反电荷的离子交换基团的相互作用。氨基酸、肽和蛋白质在溶液中带电荷，可与离子交换基团产生静电作用而保留。其固定相应具有分离效能高、物化性质稳定、柱容量大、分辨率高、能快速保持生物分子活性和构象完好。,59,离子交换色谱的填料及含盐的缓冲流动相系统类似于蛋白质稳定存在的生理条件，有利于生物分子活性的保持；因此它在解决生物学中许多难于分离且十分重要的课题上所起的重大作用（如氨基酸、蛋白质、核酸组成的分离）,受到了人们的普遍关注。,60,阳离子交换树脂：强酸型磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。阴离子交换树脂：只有在特殊情况下用于强酸性氨基酸的分析。,61,1、直接检测法,离子交换色谱法用于氨基酸分析时可在200nm处对各种氨基酸进行直接检测，检出限在110pmol之间。,62,（1）选择性差：生物样品中多种内源性成分在200nm处均有吸收；（2）背景高：HPIC常用的各种溶剂在200nm处也有吸收。,直接检测的缺点,63,离子交换色谱-积分脉冲安培法(HPIC-IPAD),该方法是基于阴离子交换分离，积分脉冲安培法检测无需将待测氨基酸转变成可被检测的化合物的衍生反应。该方法的灵敏度高，大多数氨基酸的最小检测限均小于1pmol，线性范围可以达到3个数量级以上。,64,2、柱后衍生化法,衍生化是将氨基酸衍生为有利于测定或分离的化合物。大多数氨基酸不含有芳香环等生色团，无法直接用紫外法检测，需要先将氨基酸衍生为具有较强紫外或荧光吸收的衍生物。,65,为了提高灵敏度及选择性，一般采用柱后衍生化，再用紫外或荧光法对产物进行检测。常用衍生化试剂：茚三酮、邻苯二甲醛、荧光胺。,66,离子色谱法采用柱后衍生化法的优点,1、几乎不需要样品处理步骤，蛋白质水解产物可以直接进样分析；2、反应产物与副产物的混合物无需分离；3、离子色谱柱的稳定性高，因而样品间的重现性好；,67,4、反应无需完成，产物也可以是多种。只要混合时间及反应产物的比例是一定的，则分析的重现性就不会受到影响。5、对反应产物的稳定性要求低，因为反应及检测几乎是同时进行的。,68,（二）反相色谱分析法,反相色谱法是以表面非极性载体为固定相，而以比固定相极性强的溶剂为流动相的一种液相色谱分离模式。反相色谱固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离。,69,在生物大分子分离中，多采用离子强度较低的酸性水溶液，添加一定量乙腈、异丙醇或甲醇等与水互溶的有机溶剂作流动相。反相色谱分析法的效率比离子色谱法高；用于氨基酸分析一般采用柱前衍生化。衍生化不仅可以提高氨基酸被检测的信号强度，而且可以提高氨基酸的疏水性，从而可以用反相色谱法进行分离。,70,（三）柱前衍生气相色谱法,气相色谱法分析氨基酸具有分离时间短、柱效高、容易和质谱联用等优点。氨基酸含有羧基、羟基、氨基和硫基等极性基团，需要先对其衍生化。,71,两步法是先将羧基用短碳链脂肪醇酯化，然后再用各种酸酐将N-（O、S）基团乙酰化。一步法是用烃基氯甲酰酯在水、醇类和吡啶介质中将氨基酸一步衍生化生成烃基碳氧酰烃基酯。,衍生化方法有两种,72,优点是可同时将极性基团衍生化，反应可以在水溶液中进行，反应速度快，仅需几秒，衍生试剂便宜；缺点是不能与胍基、吲哚基、咪唑基和羰基完全反应。,一步法的优缺点,73,毛细管电泳具有微量、灵敏和柱效高的特点，适合于氨基酸手性分离和复杂样品中的氨基酸分析。用于氨基酸分析的毛细管电泳主要采用两种分离模式：毛细管区带电泳和胶束电动毛细管电泳。检测方式主要有紫外法和荧光法。,（四）衍生化毛细管电泳法,74,衍生化毛细管电泳法可以进行柱前、柱内和柱后衍生化。柱内衍生化要求反应速度快，一般采用串联或“夹心饼”两种形式，具有试剂和样品用量少的优点。柱后衍生化可以避免柱前或柱内衍生化时其他化合物对衍生反应的干扰，缺点是柱后反应装置体积大，会引起色谱峰变宽而降低分离效果。,75,第四节基于氨基酸选择性反应的分析方法,1、显色分析法有几种显色试剂只有当干扰物预先除去后才有定量分析的价值。在有些情况下可以通过改变试剂的组成或反应条件以便进行某一种氨基酸的选择性测定。,76,2、荧光法,色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等在紫外光照射下会产生荧光，其它氨基酸与某些有机试剂反应之后其产物才会产生荧光。相对于显色法，荧光分析法的选择性和灵敏度要好。,77,3、微生物方法,微生物方法适合于各种生物样品，可用于大量样品的批量分析，而且分析耗费低。微生物方法用于氨基酸分析的原理是：有些微生物的生长和复制需要特定氨基酸的存在。因此，在有限量的