（化学工艺专业论文）秦皮有效成分的合成及其在化妆品中的应用研究.pdf

摘要摘要本课题主要研究了传统中药秦皮中有效的止汗、美白、抗衰老活性成分的确定，以及对秦皮活性成分一秦皮甲素进行化学合成，并对合成出的秦皮甲素进行性能测试。将秦皮用甲醇提取后，依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇四种溶剂萃取，得到的四种萃取物进行一系列性能测试。通过荧光分析发现石油醚萃取物具有与a c h 极相似的荧光作用效果；通过紫外一可见光分光光度法测定四种萃取物对酪氨酸酶的抑制率、对超氧自由基的抑制率，发现石油醚萃取物对酪氨酸酶活性的抑制率、对超氧自由基的抑制率最高，抑制率最高分别达7 9 1 4 和7 0 1 2 。经过h p l c 分析发现石油醚萃取物中最主要成分为秦皮甲素，含量达4 3 5 0 ，初步确定秦皮甲素为秦皮有效的止汗、美白、抗衰老成分。以b d 一五乙酰葡萄糖和a d 溴代四乙酰葡萄糖为糖基给体进行秦皮甲素的合成。用无水乙酸钠做催化剂，无水葡萄糖和醋酸酐反应得到b d 一五乙酰葡萄糖，经单因素实验优化后收率达到了8 8 1 8 。b d 五乙酰葡萄糖和溴试剂作原料反应可得到a d 溴代四乙酰葡萄糖，收率为9 3 。通过h e l f e r i c h 、k o e n i g s k n o r r 、相转移催化三种路线合成秦皮甲素，其中以秦皮乙素、a - d 溴代四乙酰葡萄糖为原料，四丁基溴化铵为催化剂进行相转移催化合成，能够得到秦皮甲素。对相转移催化合成工艺条件进行优化，经h p l c 分析秦皮甲素的含量达到4 1 5 2 。通过熔点、瓜、h p l c 、e s m s 、1 h n m r 鉴定柱分离产品为秦皮甲素，纯度9 7 1 7 。相转移催化法合成秦皮甲素的总收率为2 3 8 5 。优化后的相转移催化合成路线可控性好，操作较简便，为工业化大规模合成秦皮甲素提供了可能。目前尚无用相转移催化法合成秦皮甲素的报道。研究了秦皮甲素产品在降低体表温度、对酪氨酸酶活性的抑制、对超氧自由基的抑制三方面的作用。与秦皮石油醚萃取物作用效果相似，秦皮甲素能够显著地降低体表温度，1m m l 时丙二醇体系降温可达2 2 2 ，丁二醇体系降温达2 1 3 ，对酪氨酸酶活性、超氧自由基具有明显的的抑制作用，最高抑制率分别达6 9 1 3 和6 0 2 3 ，证实秦皮甲素就是是秦皮中止汗、美白、抗衰老的主要成分。因此，秦皮甲素可作为天然安全的止汗剂、美白剂和抗衰老成分在化妆品中使用。关键词：秦皮；秦皮甲素；止汗；美白；抗衰老；合成；相转移催化；化妆品江南大学硕士学位论文a b s t r a c t1 1 1 es c r e e n i n go fa i l t i p e r s p i m t o r y ，l i g l l t e n i n ga n da n t i a g i n ge f f e c t i v ei n 孕e d i e n to fa s hb 盯k ，a n dt h es y n t h e s i so fe s c u l i nw l l i c hi st h ee f c t i v ei n 擎e d i e n to fa s hb a r k ，a sw e ua st h ep e r f o 册a n c ei d e n t i f i c a t i o no fe s c u l i nw e r es t u d i e di nt h i st h e s i s a s hb a r k ，a 虹n do fc h i n e s et m d i t i o n a lh e r bm e d i c i n e ，w a se x t r a c t e db vm e t h a n 0 1 t h ee x t r a c t ，a f t e rr c m o v a lo ft h es o l v e n tm a t h a n o l ，w a sd r i e da i l df i l n h e re x t r a c t e db yu s i n gp e t r o l e u me t h e ra ss o l v e n t ，a n dt h er e s i d u ew a se x t t a c t e ds t e p w i s eb yc h l 0 t o f o m ，e t h y la c e t a t ea n dn - b u t a o lr e s p e c t i v e l yt h ec o r r e s p o n d j n ge x t r a c t sw e r es t u d i e du s i n gn u o r e s c e n c e 卸a l y s i sm e t h o d t h ec o m p a r i s o no ft h en u o r e s c e n c ea n a l y s i sr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep e t r o l e u me t h e re x t r a c t 丘d ma s hb a r kh a dt h es i m i l a re f ! l e c ta st h ea l u m i n u mp o l y c h l o r i d e b yu s i n gu v v i ss p e c t r o p h o t o m e t r ym e t h o dt od e t e m l i n et l l ei n h i b i t o r yr a t e so ft h ee x t r a c t sa g a i n s tt y r o s i n a s ea l l ds u p e r o x i d er a d i c a l ，i tw a sf o u n dt h a tt h ep e t m l e u me t h e re x t r a c tf 如ma s hb a r kh a dt h eh i g h e s ti n l l i b i t o r yr a t ea g a i n s tt y r o s i n a s ea ds u p e r o x i d er a d i c a l ，t h eh i g h e s ti n h i b i t o r ym t er e a c h e d7 9 1 4 a n d7 0 1 2 r e s p e c t i v e l y t h eh p l cm e t h o dw a su s e dt oa n a l y z et h ep e t m l e u me t h e re x t r a c tf r o ma s hb a r k ，t h ec o n d u s i o ns h o w e dt h a te s c u l i nw a st h eu p m o s ti n 掣e d i e n t ，t h ec o n t e n tr e a c h e d4 3 5 0 s oi tc o u l db ec o n c l u d e dt h a te s c u l i nw a st h ea n t i p e r s p i m t o r y ，l i g h t e n i n ga 1 1 da n t i a g i n ge a - c d i v ei n 伊e d i e n to f a s hb a r k b d p e n t a a c e t o g l u c o s ea n da d a c e t o b m m o 出u c o s ew e r eu s e da ss u g a rd o n o r st os y n t h e s i z ee s c u l i n b yu s i n gs o d i u ma c e t a t ea n h y d r o u sa sc a t a l y s t ，b d p e n t a a c e t o 百u c o s ew a sp r o d u c e df r o m 舀u c o s ea n da c e t i ca h y d r i d e ，a n dt h eh i 曲e s ty i e l dr e a c h e d8 8 1 8 b ys i n 出ef a c t o ro p t i m i z a t i o ne x p e r i m e n t sa d a c e t o b r o m o 酉u c o s ew a sp r e p a r c db yt h er e a c t i o no fb d p e n t a a c e t o 出u c o s ea n db r o m i n er e a g e n ta n dt h ey i e l dw a s9 3 t l l r e er o u t e s h e l f e r i c h ，k o e n i g s k j l o r ra n dp h a s e1 h n s f e rc a t a l y s i s ( p t c ) w e r eu s e dt os y n t h e s i z ee s c u l i n b yu s i n gb u 4 n b ra sp t cc a t a l y s t ，e s c u l i nw a sp r o d u c e d 仃o ma d a c e t o b r o m o 出u c o s ea i l de s c u l e t i n ，a n dt h eh i 曲e s tc o n t e n to fe s c u l i n ( b yh p l c ) r e a c h e d4 1 5 2 b ys i n 酉ef a c t o ro p t i m i z a t i o ne x p e r i m e n t s t h m u g hs e p a r a t i n go ns i l i c o nc 0 1 u m n ，t h ep r o d u c tw a so b t a i n e da n di d e n t i a e db ym p ，瓜，h p l c ，e s - m s ，1 h n m r a ut h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ep r o d u c tw a se s c u l i n 蛐e rb e i n go p t i m i z e d ，t h ep t cr o u t eb e c 锄ee a s yc o n t r o la n ds i m p l em a n i p u l a t j o nt h a tc o u l db e 印p l i e dt os ) r i l t h e s i z ee s c u l i no nal a r g es c a l ei ni n d u s t r y n e r ew a sn or e p o na b o u tp t cs y l l t h e s i so fe s c u l i n t h ee f f e c t so fe s c u l i np m d u c to nl o w e r i n gb o d ys u - a c et e m p e r a t u r e ，i n h i b i t i n gt h ea c t i v i t yo ft y m s i n a s ea n ds u p e r o x i d er a d i c a lw e r ea l s os t u d i e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ti l摘要e s c u i i nh a dt h es l m l l a re f f e c t sa st h ep e t r o l e u me t h e re x t r a c tf m ma s hb a r k 1 tc o u hr e m a r k a b l yl o w e rb o d ys u a c et e m p e r a t u r e ，b o d ys u r f a c et e m p e r a t u r ed e c r e a s e d2 2 2 a n d2 1 3 r e s p e c t i v e l yi nt h et e s ts y s t e m so f1 ，2 一p r o p y l e n eg l y c o la n d1 ，3 一b u t y l e n eg l y c o la tt h ec o n c e n t r a t i o no f1m m l e s c u l i nh a dt h eo b v i o u si n h i b i t o r ye f f e c t so nt y r o s i n a s ea n ds u p e r o x i d er a d i c a l ，t h eh i g h e s ti n h i b i t o r yr a t er e a c h e d6 9 1 3a n d6 0 2 3r e s p e c t i v e l y a 1 1t h er e s u l t sc o n f i m e dt h a te s c u l i nj u s tw a st h ec h i e fa n t i p e r s p i r a t o r y ，l i 曲t e n i n ga n da 1 1 t i a g i n ge f c t i v ei n g r e d i e n to fa s hb a r k s oe s c u l i nc o u l db eu s e di nc o s m e t i c sa sn a t u r a ls a f ea i l t i p e r s p i r a i l t ，s k i n l i 曲t e n i ga n da i l t i _ a g i n ga g e n t k e y w o r d s ：a s hb a r k ；e s c u l i n ；a n t i p e r s p i r a t o r y ；l i g h t e n i n g ；a n t i a 百n g ；s y n t h e s i s ；p h a s et r a l l s f e rc a t a l y s i s ；c o s m e t i c sl i i独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。签名：查墼垒日期：旃年月萏日关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后也遵守此规定。签名：j 雌导师签石- 三匦日期：? 垂年年月万日第一章综述1 引言第一章综述人们对于美总是趋之若骛，因此化妆品行业是永不衰退的行业。2 0 世纪末期，皮肤学、药理学、生理学、生物学等已经开始渗透到化妆品科学中，高安全性并具有一定生理功效的化妆品正逐步被消费者接受【“。2 1 世纪的化妆品是2 0 世纪的延伸，将进入化妆品与使用化妆品的人类相互融合的人类科学阶段。在过去的几年里，中国的化妆品市场平均每年以2 0 以上的速度快速递增，但销售总额及人均消费水平与发达国家比还存在很大差距，因此我国的化妆品消费市场具有巨大的上升空间。社会各方面的发展和进步伴随着中老年人口的快速递增，这预示着未来若干年内与增龄相关的皮肤问题会越来越多，皮肤老化现象也越来越普遍。因此，皮肤的老化作为人类衰老的一种外部特征和表现已经成为美容界关注的焦点，延缓皮肤老化的研究仍是人类社会永恒的主题之一，也是未来世界美容及化妆品发展潮流中的主流之一【2 1 。当今世界化妆品发展的新趋势是绿色、环保、安全、功效。“组分天然化”、“回归大自然”的呼声已成为世界化妆品工业的潮流。当今国际化妆品的品味已经由天然成分所占的比例来决定。高档化妆品无一不是以其化学成分少为荣。据报道，目前日本天然化妆品已占整个化妆品市场的6 0 以上，欧美市场上含天然物质的化妆品也占到5 0 。虽然我国是中草药王国，有着得天独厚的中草药资源，发展天然化妆品具有很大的市场潜力。但是，过度采挖，势必造成资源枯竭和生态破坏。因此，“如何处理好人们对天然产物的渴求与保护自然的关系”成了化妆品行业需要解决的难题。本课题正是在这样的前提下，经过大量化妆品市场调研后确立的。通过对中药秦皮中温和、安全、有美白、抗氧化、抑汗效能的活性成分的提取和结构确定，然后用化学合成与天然结构和性能相同的物质，以满足人们对天然产物的渴求，避免对大自然掠夺性的开发，保护我们赖以生存的地球。2 秦皮甲素一中药秦皮的有效成分2 1 中药秦皮简介秦皮1 ( 英文名：赴hb a r k ，拉丁名：c o r 舰f ，甜协f ) 为木樨科植物白蜡树等植物的干燥枝皮或树干皮，是我国一味常用中药，历代本草均有记载，其药用价值早己为人们所熟知。近代所用者，因资源及产地变异，植物种类虽有不同，但均属于棒属，其形态特征和气味与本草所载类似。商用秦皮的植物来源很多，主要有尖叶白蜡树皮( 陕西秦皮) 、苦枥白蜡树皮( 东北秦皮) 、白蜡树皮( 四川秦皮) 、宿柱白蜡树皮( 陕西白点秦皮)四个种类。秦皮中主要成分为香豆素类( 秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素、宿柱白蜡苷、6 ，7 一二甲氧基一8 一羟基香豆素等) ，此外，尚含有酚型、皂苷和鞣质等。秦皮江南大学硕士学位论文中不同部位秦皮甲素含量不同，其含量细枝皮 粗枝皮 树干皮。中国药典规定秦皮枝皮和树干皮均可人药，要求秦皮甲素( e s c u l i n ) 含量不得少于1 3 6 。秦皮具有清热燥湿，收敛，明目的功能。现代药理实验表明，秦皮具有抗菌、消炎、镇静、镇痛、利尿、镇咳、祛痰和平喘等作用，另外对心血管、消化系统也有影响【引。由此可见，秦皮是一种重要的中药材，具有很多的生物活性，因此很有必要对其化学成分进行系统研究。2 2 秦皮甲素简介秦皮甲素( 6 0 b d 葡萄糖基7 羟基香豆素，e s c u l j n ) 是中药秦皮的主要成分，又名：七叶树苷、马栗树皮苷、七叶树素，为秦皮乙素( 6 ，7 一二羟基香豆素，e s c u l e t i n ) 的6 o 一葡萄糖苷，虽然为秦皮的主要有效成分，但并不是秦皮的专属成分，在其他天然植物中分布很广，如七叶树科植物欧洲七叶树( 马栗树) 0 船c h m s 确，p d c 口s 船n h m ) 树皮，菊科植物菊苣( c i 曲d r f “胁夸1 6 “s ) 全草，茜草科植物土连翘( 邱，m e n o 哦c 钞铡托e 厶“m ) 树皮，大戟科植物续随子( 凸砷d 而妇肠奶，r 括) 种子，木犀科植物苦枥白蜡树僻m i h “5砌 c 印砂胁) 树皮，花白蜡树僻d 肋“5 ) 树皮、花，茄科植物曼陀罗( d 口m ，口s 打w m f “) ，蔷薇科植物英国山楂( c m 缸呼d 砂口c n r 珐口) 树皮，木犀科棒属c f r “咖“5 ) 植物树皮，海桐花科植物b “m 口，缸印胁a 叶【6 j 。秦皮甲素的分子式为c 1 5 h 1 6 0 9 ，分子量3 4 0 2 8 ，通常为倍半水合物，为白色结晶，无气味，昧苦，m p 2 0 4 2 0 6 ，旋光度【a 】d ”7 8 4 。( c = 2 5 ，5 0 二氧六环) ，难溶于冷水，溶于沸水、热乙醇、甲醇、吡啶、乙酸乙酯、氯仿及醋酸，极微溶于醚【7 】a秦皮甲素2 3 秦皮甲素的药理作用作为秦皮的主要活性成分之一，秦皮甲素有很多的生物活性，其药理作用如下阳】：( 1 1 抗病原微生物秦皮甲素对内脏器官细菌具有抑制作用m ，对福氏、宋氏、志贺氏痢疾杆菌有抑制作用阳1 。( 2 ) 消炎、镇痛作用秦皮甲素具有明显的抗炎作用。秦皮甲素1 0m g 瓜g 腹腔注射，能抑制大鼠角叉菜胶、右旋糖苷、5 h t 、组胺、甲醛性足肿胀及棉球肉芽肿。且对早、中、晚期炎症均有效。秦皮甲素对豚鼠紫外线照射背部引起的红斑反应也有抑制作用，还有显著抑制组胺第一章综述引起的毛细血管通透性的作用。秦皮甲素还有微弱的镇痛作用( 小鼠热板法1 ，如以吗啡皮下注射5 m 眺g 的效力作为1 0 0 ，则秦皮甲素口服1 0 m 眺g 之效力为1 4 8 。f 3 1 利尿秦皮甲素在大鼠及兔的试验中，各种给药途径均可增进尿酸的排泄。利尿的作用原理在于秦皮甲素兴奋了交感神经系统，而且对肾脏也有直接作用，抑制了对尿酸的重吸收。( 4 ) 抗凝和抗过敏秦皮甲素的化学结构与双香豆素相似，故有某些抗凝血作用。其4 溶液能吸收紫外线，故能保护皮肤，免受日光照射之损伤。( 5 ) 止咳去痰平喘秦皮甲素3 2 0 m 班g 腹腔注射对小鼠氨雾法均有显著镇咳作用；酚红法证明其有明显的祛痰作用。( 6 ) 中枢抑制作用。秦皮甲素1 0 0 m 班g 腹腔能延长小鼠巴比妥睡眠时间。( 7 ) 排泄、吸收及一般毒性秦皮甲素口服后在小肠上部吸收，胃与大肠不吸收；大鼠无论口服或静脉注射，尿中及大便中皆有排出，以原形为主，豚鼠则主要在体内破坏。秦皮甲素3 眺g 腹腔注射于小鼠，不致死，故毒性很低。2 4 秦皮甲素的应用2 4 1 在化妆品中的应用秦皮甲素为美国c t f a 化妆品原料手册( c o s m e t i ct 0 i l e t r ya n df r a g r a i l c ea s s o c i a t i o nc o s m e t i c si n 夸e d i e n th a n d b o o k ) 录用的天然物质。在化妆品中使用可以起到美白、防晒、抑汗等作用。2 4 1 1 防晒秦皮甲素可强烈地吸收紫外线，将其用于防晒化妆品中已有近百年的历史。1 9 1 1 年，p a u lu n n a 【1 2 】首次将秦皮甲素用于防晒用途，市售的“z e o z o n ”，“u l t r a z e o z o n 化妆品被证实具有非常好的防晒效果，其主要的防晒成分就是3 和7 秦皮甲素。同年，k o d o l df r e u n d 【1 3 】通过实验证实，u 皿a 发明的秦皮甲素系列能够最有效防止紫外线照射所引起的皮肤晒斑。秦皮甲素如果与碱性氨基酸如精氨酸或赖氨酸共用，可以将紫外吸收区域更移向a 区，在皮肤上的保留时间增长，可以作为抗水型防晒剂【1 4 】。2 4 1 2 美白秦皮甲素可抑制黑色素细胞活性，体外试验表明：秦皮甲素1 5 m o l l 的抑制率为江南大学硕士学位论文6 3 7 ，在增白型护肤用品中用量2 ：还具有皮肤保护作用，在化妆品中配合其它活性物质使用能够起到美白防晒的效果。2 4 1 3 抑汗与中药秦皮的清热燥热功能相同，秦皮甲素与其它活性物质配合，外用可镇静抑汗。2 4 2 在医疗保健中的应用由于秦皮甲素具有抗炎平喘【”】、抑菌、抗过敏、利尿、镇咳去痰等药效，因而其在医药上的应用非常早且很广泛。秦皮甲素作为秦皮胶囊的主要成分，起到抗炎和降低血尿酸的作用【1 6 】。在用于治疗痛风及高血尿酸症的接骨胶囊【1 7 】、息痛宁胶囊【1 8 】中，秦皮甲素起到镇痛和降低血尿酸的作用。在整肠舒颗粒中，秦皮甲素为有效成分，主要功效是改善肠道微环境，消炎抗病毒【1 9 】。用于治疗婴幼儿腹泻的儿复康口服液中，秦皮甲素为抗菌消炎的主要成分【2 0 】。将秦皮甲素的抑菌、镇痛、防御紫外线烧伤、保护血管渗透性等作用应用于秦皮滴眼液中，则可以治疗结膜炎、角膜炎、电光性眼炎等疾病，临床效果良好【2 l 】。2 5 秦皮甲素的合成研究进展二十世纪初期人们就开始对合成秦皮甲素进行研究。合成秦皮甲素的一般程序是由葡萄糖和秦皮乙素在适当的保护后，进行糖苷化反应，然后脱保护而得整个过程如图1 。r = 一h ，一0 a c ，_ o b z 或一o b “图1 秦皮甲素的化学合成葡萄糖一般采用全乙酰化保护的葡萄糖或葡萄糖基溴苷进行反应。秦皮乙素具有两个酚羟基，为了避免双糖基化产物，一般用乙酰基、苯甲酰基或苄基等保护其中一个羟基也有些情况直接用过量的秦皮乙素。糖苷化反应是秦皮甲素合成的关键，根据反应中糖基给体的不同，可以分为两类合4第一章综述成方法：( 1 ) 以酰基为给体的合成方法( h e l f e r i c h 法) ：乙酰化醛糖中c 1 乙酰基比其他乙酰基活泼，不仅易被卤原子取代，在加热和酸性催化剂存在下还易被苯氧基取代。反应产物究竟是a 一还是b 型，与反应条件关系很大，否则会产生相当大量的两种异头物。h e l f e r i c h 法糖苷化方法最初是用五乙酰葡萄糖和苯酚在氯化锌或对甲苯磺酸作用下和酚进行的苷化反应【2 “。后来经过对反应条件和催化剂的不断改进，该方法成为合成酚类糖苷的好方法。五乙酰葡萄糖一般使用b 型，异头碳上的乙酰氧基在酸的作用下易于离去，形成环状的正离子，并被酚羟基的氧原子捕获生成糖苷。各种酸是最广泛使用的的催化剂，如磺酸、杂多酸、三氟化硼乙醚和四氯化锡等。由于糖环2 位酰基保护基的邻基参与效应( 图1 ) ，其产物一般为b 型。但是目前还没有使用该法制备秦皮甲素的报道。( 2 ) 以糖基溴苷为给体的合成方法( k d e n i g s k n o r r 法) ：卤化乙酰糖的卤原子可被烷氧基、芳氧基和酰氧基取代，反应过程中c 1 的构型发生w a l d e n 转换，原来是a 构型的卤化乙酰糖，反应后生成b 构型的糖苷，故本法适于制备b 一糖苷。以溴苷为糖基给体合成糖苷是一类重要的糖苷化方法。k w m e r z 【2 3 1 及g a m i a r d 2 4 】均采用该法合成出秦皮甲素。但是在这两种路线中均采用了苄基保护，最后用催化加氢的方法脱去苄基的保护路线，反应步骤较多且复杂，并且最后一步催化加氢的成本也比较高，因此如果使用上述的两种方法进行合成，产品的成本必然较高。相转移催化法是有机合成中的重要方法之一，在糖化学中已应用于氧苷、硫苷、氮苷、糖酯和寡糖的合成，相转移催化法是在经典的k o e n i g s k n o r r 法上发展起来的，而后被应用于天然黄酮苷、酚性糖苷等的合成，由于其反应体系简单、条件温和、操作简便、立体选择性好、收率高等优点而日益受到重视。但是目前还没有使用该法制备秦皮甲素的报道。3 结论和立题依据“绿色”是二十一世纪化妆品的主题，天然活性化妆品顺应了回归大自然的发展潮流和人们的消费心理。随着我国加入w 1 d ，国产化妆品与国外化妆品的竞争日益加剧，天然活性化妆品特别是中草药化妆品是我国化妆品取胜的法宝。而从销售额和人均消费水平看，我国的天然化妆品有很大的发展空间和潜力瞄】。社会的发展和科技的进步，使得人们的物质、精神和文化生活水平发生了巨大的变化，而且人口的健康状况和年龄结构也在出现惊人的改变，特别是中老年人口已经成为整个人类社会人群中增长最快的一个部分。这预示着未来若干年内与增龄相关的皮肤问题会越来越多，皮肤老化现象也会越来越普遍。因此，皮肤老化作为人类衰老的一种外部特征和表现已经成为美容界关注的焦点，如何有效地延缓皮肤老化也成为许多学者和研究人员标新立异的热门课题。过去，人们一直在皮肤的老化、抗衰老基础和应用性研究以及产品研制等方面进行江南大学硕士学位论文着大量卓有成效地工作，并在一些相关领域取得了可喜的成就。近1 0 年来，国内外有关对抗或延缓皮肤老化方面的文章屡见不鲜，技术方法、科技成果和实用产品也不断涌现、更新和发展。而有关“抗衰老”或“延缓衰老”的字样和功效作用在一些美容和平包装或宣传材料上随处可见，出现了空前的皮肤抗衰老或延缓皮肤衰老的热潮f 2 1 0如前所述，秦皮甲素具有美白防晒等作用，作为化妆品助剂很好地迎合了“天然抗衰老”化妆品发展趋势。在医药上对秦皮甲素地研究和应用非常早且很广泛，目前已将其应用到了化妆品中。由于其毒性极低，对皮肤无副作用，因而具有很大的开发价值。国内外早已从植物中提取分离出了秦皮甲素，用化学方法合成秦皮甲素的研究也很多。国内已有天然提取的秦皮甲素出售。一般采用醇提取和碱提取法从秦皮中提取秦皮甲素。但是由于植物中的天然成分很复杂，而且秦皮甲素的含量很低，所以从植物中提取秦皮甲素步骤多、周期很长，需要使用大量的有机溶剂，由此带来的污水等废物很多，想得到纯品比较难，因此纯度高的提取产品价格很高。如果将它们添加到化妆品中必然使得化妆品的成本大副提高，价格上涨，普通消费者很难承受的起，所以限制了它们在化妆品中的广泛应用。鉴于以上所述，本课题主要从事以下几方面的研究：首先，对中药秦皮进行溶剂提取，用荧光分析法分析提取物的止汗功能，用紫外一可见光分光光度法测试提取物对酪氨酸酶活性的抑制率以及对超氧自由基的抑制率，以表征其美白和抗氧化效能；对有效的止汗、美白、抗氧化提取物进行高效液相色谱分析，确定其主要的有效成分。其次，对秦皮中有效的止汗、美白、抗氧化成分一秦皮甲素进行化学合成。用三种方法合成秦皮甲素：h e l f e r i c h 、k o e l l i g s k n o r r 、相转移催化法，其中相转移催化合成路线还未曾有过报道。同时对相转移催化合成条件进行优化，对产物的分离纯化也进行了相应的研究。最后，对合成出的秦皮甲素产品进行性能测定，通过体表温度的测定验证秦皮甲素的止汗功效；通过测试秦皮甲素对酪氨酸酶活性的抑制率以及对超氧自由基的抑制率验证秦皮甲素的美白和抗氧化功效。第二章秦皮中有效成分的提取及性能测定第二章秦皮中有效成分的提取及性能测定中药秦皮具有清热燥湿，收敛，明目的功能。现代药理实验表明，秦皮具有抗菌、消炎、镇静、镇痛、利尿、镇咳、祛痰和平喘等作用，另外对心血管系统、消化系统也有影响【5 】。通过不同的提取方法，经过性能测定，确定秦皮中具有抑汗、美白、抗氧化的作用部分。第一节秦皮提取物止汗功能研究5 i 吾排汗是一种会影响个人卫生和社会审美的生理现象 ，除有损形象外，往往会带来气味的产生。而止汗剂则正是用来减少人身汗分泌物的数量，同时能阻止臭味产生的化妆品。化妆品中通常采用的止汗剂是无机物碱式氯化铝及其衍生物，但碱式氯化铝( a c h )对人体有一定的损伤【2 7 】，刺激性大，长期使用会使毛囊粗化，进而加深皮肤的皱纹。将天然提取物用作止汗剂既避免了无机止汗剂的损伤又适应了人们回归自然的心理，是目前化妆品行业研究的热点。国外特别是日本大力开展植物药( 汉药) 提取物的止汗研究。近几年来，西方各公司就有不少将植物提取物用于止汗配方的报道。秦皮具有清热、燥湿、收敛的功效，因而具有止汗的功能。采用荧光分析方法，研究了无机止汗剂碱式氯化铝( a c h ) 与粗略表征人体皮肤蛋白结构的角蛋白、胶原蛋白和白蛋白这三种蛋白的荧光作用；同时研究了秦皮与三种蛋白的荧光作用。将秦皮经甲醇提取后再使用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取得到的不同溶剂萃取部分，用荧光光谱法来分析其与粗略表征人体皮肤蛋白结构的角蛋白、胶原蛋白、白蛋白这三种蛋白的荧光作用，无机止汗剂碱式氯化铝( a c h ) 与皮肤蛋白的作用来对照，以此来筛选秦皮中的有效的止汗部分。1 1 试剂与仪器r f 一5 3 0 1 p c 型荧光分光光度计碱式氯化铝( 3 5 ，化妆品级)角蛋白( 3 5 ，m w9 0 0 0 )胶原蛋白( 8 8 ，m w 95 0 0 )白蛋白( 9 1 秦皮( 中药)甲醇，石油醚m w8 00 0 0 )氯仿，乙酸乙酯，日本岛津上海利盛化学品有限公司自制四川铭让生物科技公司国药集团化学试剂有限公司无锡市荣康药店正丁醇均为分析纯，实验用水为超纯水。江南大学硕= l 学位论文1 2 实验方法1 2 1 秦皮不同组分的提取在索式提取器中加入秦皮，用甲醇提取3h 后蒸馏出提取液中的甲醇，将提取物进行干燥。取干燥的甲醇提取物于试管中加入石油醚振荡2 0m i n ，取其滤液：在滤渣中加入氯仿振荡2 0m i i l ，取其滤液；在上述滤渣中加入乙酸乙酯振荡2 0m i i l ，取其滤液；再在上述滤渣中加入正丁醇振荡，取其滤液。1 2 2 荧光测定在1 9 号试管中加入5 m l 角蛋白水溶液，1 0 1 8 号试管中加入5 m l 胶原蛋白水溶液，1 9 2 7 号试管中加入5m l 白蛋白水溶液。再在1 ，1 0 ，1 9 号试管中加入1m l 超纯水；2 ，1 1 ，2 0 号试管中加入1 m l 7 a c h 溶液；3 ，1 2 ，2 1 号试管中加入1 m l l 4 a c h 溶液；4 ，1 3 ，2 2 号试管中加入1m l 3 5 a c h 溶液；5 ，1 4 ，2 3 号试管中加入1m l 秦皮甲醇提取物水溶液；6 ，1 5 ，2 4 号试管中加入1m l 秦皮甲醇提取物的石油醚萃取物；7 ，1 6 ，2 5 号试管中加入1m l 秦皮甲醇提取物的氯仿萃取物；8 ，1 7 ，2 6 号试管中加入1m l 秦皮甲醇提取物的乙酸乙酯萃取物；9 ，1 8 ，2 7 号试管中加入1m l 秦皮甲醇提取物的正丁醇萃取物。试管于3 7 恒温3 0 m i n ，取适量于石英比色皿中，在 。；= 2 9 5n m 时进行荧光测定。1 3 结果和讨论1 3 1a c h 与三种蛋白的荧光作用人体皮肤的蛋白质主要由角蛋白，胶原蛋白和白蛋白构成【2 吼。因此，可以用这三种蛋白来粗略表征人体皮肤的蛋白质结构。荧光分析方法具有灵敏度高、选择性强、用量少、方法简便以及能提供较多的物理参数等优点。因而，它被广泛的应用于各个研究领域其中包括用于研究溶液中的蛋白质分子构象的变化【2 9 i 。蛋白质中主要的荧光发射基团是色氨酸及酪氨酸。a c h 是一种铝盐，根据色氨酸及酪氨酸的结构我们推测铝盐可能与蛋白质形成了络合物f3 0 】，从而引起蛋白质荧光强度的变化。角蛋白的荧光光谱表现为：当加入纯水时，在3 0 5n m 4 1 0m 出现一宽而强的峰，最大吸收在3 4 8 啪处，强度为7 00 0 0 ：加入质量分数为7 、1 4 和3 5 的a c h 水溶液时，峰形与纯水一致，但是3 4 8n m 处的峰强分别降低至6 00 0 0 、5 5 0 0 0 、5 00 0 0 ，如图2所示。胶原蛋白的荧光光谱表现：当加入纯水时，3 2 0 n m 3 4 0 n m 出现一窄而弱的峰，最大吸收在3 2 8m 处，强度为48 0 0 ；加入质量分数7 、1 4 和3 5 的a c h 水溶液时，峰第二章秦皮中有效成分的提取及性能测定形与纯水一致，但是3 2 8n m 处的峰强分别增强至58 0 0 ，52 0 0 ，51 0 0 。白蛋白的荧光光谱表现：当加入纯水时：在3 0 5n m 4 5 0n m 出现一宽而强的峰，最大吸收在3 4 8n m 处，强度为5 50 0 0 ；加入质量分数7 、1 4 和3 5 的a c h 水溶液时，峰形与纯水一致，但是3 4 8n m 处的峰强分别降低至2 50 0 0 ，1 8 5 0 0 ，1 75 0 0 。图2a c h 与角蛋白的荧光作用由以上的图谱分析可知：在3 4 8 n m 处，无机止汗剂对角蛋白及白蛋白均有荧光猝灭的作用，并且这种作用随着加入的无机止汗剂质量分数的增加而增强；而在3 2 8n m 处，对胶原蛋白则有荧光增强的作用，而这种作用与止汗剂质量分数无关。由于无机止汗剂的止汗功能已经得以确认，如果天然植物提取物与蛋白的荧光作用效果与a c h 相似，也可认为该提取物具有止汗功能。1 3 2 秦皮甲醇提取物与三种蛋白的荧光作用中药秦皮中含有香豆素类药物。香豆素类衍生物如秦皮甲素等能使皮肤蛋白质发生“交互”作用，具有6 、7 、8 一位羟基结构的香豆素类衍生物有明显的抑制皮肤过敏的作用 3 l l 。秦皮类植物如a e s c u l u sh i p p o c a s t a n u ml ( 国外的一个亚种) ，含有许多有效成分，其中秦皮甲素有毛细管穿透效应，化妆品中即应用此性能 3 2 】。因此可以初步确定秦皮中的秦皮甲素具有止汗的作用。秦皮本身具有荧光物质，在4 6 0n m 处有荧光吸收，根据文献报道，此处出峰的物质为秦皮乙素【3 3 l 。因此秦皮的甲醇提取物与蛋白的荧光作用光谱中不可避免地在4 6 0 n m处出现吸收峰。如秦皮甲醇提取物与角蛋白的荧光作用：除了在3 0 5n m 4 1 0n m 处有一宽吸收峰，在4 1 0 m 5 8 0 n m 范围内出现一个更强的吸收峰，且最大吸收在4 6 0 n m ，这是秦皮自身的荧光吸收，如图3 所示。江南大学硕：e 学位论文? 键g 糕2乏宦堡梦、图3 秦皮甲醇提取物与角蛋白的荧光作用为了排除秦皮乙素的影响，即秦皮自身荧光的影响，实验中又用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇这几种溶剂，对秦皮甲醇提取物进行萃取，观察它们与三种蛋白质的荧光作用。1 3 3 甲醇提取物的不同溶剂萃取物与蛋白的荧光作用1 3 3 1 石油醚萃取物与蛋白的荧光作用石油醚萃取物与角蛋白作用的荧光光谱：3 0 5m 4 1 0m 范围内宽而强且最大吸收在3 4 8 舳处的吸收峰，经该萃取物作用后强度由9 0 0 0 0 降低至8 0 0 0 0 ，如图4 所示。l j o掣1 0 05 0瑚j ( ) 04 0 0j 0 06 0 0j ， l m图4 石油醚萃取物与角蛋白的荧光作用石油醚萃取物与胶原蛋白作用的荧光光谱：3 2 0n m 3 4 0i i i n 范围内的窄而弱且最大吸收在3 2 8 衄处的吸收峰，经该萃取物作用后强度由2 50 0 0 增强至4 00 0 0 ，如图5所示。图5 石油醚萃取物与胶原蛋白的荧光作用1 0第二章秦皮中有效成分的提取及性能测定石油醚萃取物与白蛋白作用的荧光光谱：3 0 5m 4 5 0 岫范围内的宽而强且最大吸收在3 4 8n m 处的吸收峰，经该提取物作用后强度由1 2 00 0 0 降低至6 00 0 0 ，如图6所示。15 ( im 0蕃蒙5 0厂、置自水溶液从尸、絮婺黧鬈a2 ( x )：【k 卓m5 “h 1 0图6 石油醚萃取物与白蛋白的荧光作用由此可以看出：在4 6 0n m 处均没有出现秦皮自身的荧光吸收，并且，石油醚萃取物与三种蛋白的荧光作用均与a c h 相似，即对角蛋白与白蛋白具有荧光猝灭的作用，而对于胶原蛋白则具有荧光敏化的作用。因此，从作用效果上看，秦皮中有效的止汗成分可能溶于甲醇提取物的石油醚萃取物中。1 3 3 2 氯仿萃取物与蛋白的荧光作用氯仿萃取物与角蛋白作用的荧光光谱：3 0 5n m 4 1 0n m 内出现宽而强且最大吸收在3 4 8n m 处的吸收峰，经该提取物作用后强度由8 50 0 0 增强至2 5 00 0 0 ，同时在4 1 0n m 5 8 0n m 范围内出现一个更强的吸收峰，且最大吸收在4 6 0n m 。由此可见在4 6 0n m处出现了秦皮自身的荧光吸收。在3 4 8n m 处氯仿萃取物对角蛋白具有荧光敏化作用，这与a c h 的作用效果相反。从作用效果上看，可认为氯仿萃取物中基本不含有止汗成分。1 3 3 3 乙酸乙酯萃取物与蛋白的荧光作用乙酸乙酯萃取物与胶原蛋白作用的荧光光谱：3 2 0n m 3 4 0n m 内的窄而弱且最大吸收在3 2 8m 处的吸收峰，经该萃取物作用后强度由2 50 0 0 降低至1 50 0 0 ，同时在3 5 0n m 6 0 0n m 范围内出现一个更强的吸收峰，且最大吸收在4 6 0 衄。由此可见，与氯仿萃取物相似，在4 6 0n m 处出现了秦皮自身的荧光吸收。而且在3 2 8n m 处对胶原蛋白具有荧光猝灭的作用，而不是如a c h 般的荧光敏化作用。从作用效果上看，可以认为乙酸乙酯萃取物中基本不含有止汗成分。1 3 3 4 正丁醇萃取物与蛋白的荧光作用正丁醇萃取物与胶原蛋白作用的荧光光谱：3 2 0n m 3 4 0n m 范围内的窄而弱且最大吸收在3 2 8n m 处的吸收峰，经该萃取物作用后强度由2 50 0 0 降低至30 0 0 ，同时在江南大学硕：l 学位论文3 6 0m 6 0 0m 范围内出现一个更强的吸收峰，且最大吸收在4 6 0 姗。由此可见，在4 6 0n m 处仍然存在秦皮的自身的荧光吸收，而且在3 2 8 n m 处对胶原蛋白存在着荧光猝灭的作用而不同于a c h 的荧光敏化作用。因此，从作用效果上看，也可以认为正丁醇萃取物中基本不含有止汗成分。1 4 小结通过与无机止汗剂一碱式氯化铝( a c h ) 和粗略表征人体皮肤蛋白的的三种蛋白一角蛋白，胶原蛋白，白蛋白间的荧光作用相比较，得出：用甲醇提取秦皮后，再用石油醚进行萃取的部分具有与a c h 极相似的荧光作用效果。从荧光分析来看，秦皮中的止汗成分主要存在于其甲醇提取物的石油醚萃取物中。第二章秦皮中有效成分的提取及性能测定第二节秦皮提取物美白功能研究引言美白剂功效的评价方法可分为化学分析方法、细胞生物学方法、动物实验方法和人体试验法等，前两种方法用于评价美白添加剂的功效，而后两种方法对美白添加剂和美白化妆品的功效均可评价【3 4 】。在黑色素的形成过程中酪氨酸酶是一主要限速酶，该酶活性大小决定着黑色素的数量。所以当前的皮肤美白剂中几乎绝大多数是通过抑制酪氨酸酶活性，减少黑色素的生成而起到美白效果的，并且每年以较快的速度开发出新的此类美白剂3 “。因此，对酪氨酸酶活性抑制率的高低就成为了衡量此类物质美白效果的主要指标。而化学分析方法就是用于测定美白剂对酪氨酸酶活性的抑制率，且其测定时间短、操作简便、所需费用低，因而适用于美白剂进行大面积的初步筛选。本节主要测定秦皮甲醇提取物依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取后的四组分在丙二醇体系中对酪氨酸酶活性的抑制率。2 1 试剂与仪器7 5