（影像医学与核医学专业论文）超支化聚砜胺作为细胞内输送载体的实验研究.pdf

超支化聚砜胺作为细胞内输送载体的实验研究 摘要 超支化聚砜胺( p s a ) 是一种新颖的纳米材料，能够简单一步合 成并具有三维立体高度支化结构和末端丰富的氨基功能基团。本课题 的目的是通过研究p s a 生物相容性、细胞对其内吞作用和在小鼠体内 的生物分布，以探讨p s a 作为载体将药物等生物活性分子进行体内输 送的可行性。 采用a 。+ 船。单体共聚法制备p s a ，通过m t t 法比较不同孵育时间 对多种细胞的生物相容性，并与第四代树状大分子聚酰胺一胺 ( p a m a m - g 4 ) 进行了比较；在碱性条件下共价结合p s a 与异硫氰酸荧 光素( f i t c ) ，形成荧光标记的超支化聚砜胺聚合物( p s a f i t c ) 。将 聚合物与细胞孵育后，在不同时间点通过激光共聚焦荧光显微镜 ( c l s m ) 分别检测在3 7 和4 孵育条件下细胞对聚合物的内吞作用 并作比较；通过流式细胞术( f a c s ) 量化聚合物进入细胞的效率；以 细胞器特异的荧光染料处理细胞后，c l s m 观察在不同时间点 p s a - f i t c 于细胞内的分布情况；为证实c l s m 所观察到的结果，将p s a 以纳米金颗粒标记后给予细胞，制作标本后于透射电镜下观察纳米颗 粒在细胞内的分布；利用小动物活体分子成像系统研究正常b a l b c 裸鼠尾静脉注射p s a f i t c 后的聚合物的生物分布，并进行量化；为 进一步研究p s a 作为药物输送载体的可行性，将p s a 共价连接化疗药 物甲氨喋呤( m t x ) 及配体叶酸( f a ) 以达到靶向于肿瘤细胞表面表 达的叶酸受体。 结果发现，p s a 于生理环境p h 条件下( p h = 7 4 ) z e t a 电位为 - 1 8 5 士7 6m v ，其生物相容性良好，与细胞孵育7 2h 后细胞半抑制 浓度 1m g m l ；细胞摄入p s a f i t c 高效快速，且具有时间依赖性； 在4 。c 的孵育条件下亦能进入细胞；c l s m 及t e m 均观察到于孵育3h 后线粒体中有p s a - f i t c 的聚集，于1 2h 则转而聚集至高尔基体；在 正常小鼠体内，p s a 在各主要脏器或组织中无明显特异性浓聚；1 hn m r 显示p s a 与m t x 及f a 能够有效连接；细胞实验证明载药系统具有叶 酸靶向性和药物细胞毒性。 一一般认为，阴离子聚合物由于与细胞膜的负电荷静电相斥而无法 穿膜或入胞效率低下。本课题研究发现，生理环境p h 条件下可呈负 电性的超支化聚合物超支化聚砜胺具备高效细胞内转运特点并 有良好的生物相容性。由于其表面携带丰富氨基功能基团，容易改性， 作为载体通过连接配体或抗体，于肿瘤主动靶向治疗领域具有广阔的 应用前景。 关键词：超支化聚砜胺，细胞内输送，载药系统，叶酸靶向，细胞毒 性 i n v e s t i g a t i o n0 fh y p e r b ran c h e d p o l y ( s u l f o n e a m i n e ) a s a ni n t r a c e l l u l a r d e l i v e r ys y s t e mi nv i t r 0an di nv i v 0 a bs t r a c t h y p e r b r a n c h e dp o l y ( s u l f o n e a m i n e ) ( p s a ) i s an o v e lc l a s so f h y p e r b r a n c h e dp o l y m e r t h ei nv i t r ob i o c o m p a t i b i l i t yp e r f o r m a n c eo f ps ai sd e s c r i b e da n dt h er e s u l t ss h o wn on o t a b l ee f f e c to nb i o a c t i v i t yo f k ba n d3 t 3c e l l l i n e s ，d i s p l a y i n gi c 5 0 v a l u eo f1 m g m la f t e r a c o n t i n u o u si n c u b a t io nf o r7 2h i no r d e rt oa s s e s si t sf e a s i b i l i t yo fu s i n g p s aa sa ni n t r a c e l l u l a rd e l i v e r ys y s t e m ，p s a f i t ci ss y n t h e s i z e db y c o n ju g a t i n gaf l u o r e s c e n td i a g n o s t i ca g e n t f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e ( f i t c ) t ot h et e r m i n a l a m i n og r o u p so fp s ac o v a l e n t l y a n dt h i s h y p e r b r a n c h e dp o l y m e ri sa l s ol a b e l e dw i t hg o l dn a n o c r y s t a l s c e l l u l a r i n t e r n a l i z a t i o na n ds u b c e l l u l a rd i s t r i b u t i o no fp s aa r es t u d i e db y c o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y ( c l s m ) ，f l o wc y t o m e t r y ( f a c s ) a n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) i ti sr e v e a l e dt h a tt h e t r a n s l o c a t i o no fp s ai n t ot h ec e l l si st i m ed e p e n d e n ta n df i t cl a b e l e d i v - p o l y m e rl o c a l i z e si nt h ec y t o p l a s ma n dc e l l n u c l e ia tb o t h37 a n d4 i np a r t i c u l a r , t h e i rs p e c i f i ca c c u m u l a t i o ni nm i t o c h o n d r i ai so b s e r v e d f i t c p s aw a si n je c t e di v i n t on o r m a ln u d em i c e a n dt h eo p t i c a l i m a g i n go fn o r m a lm i c ea n dt h e i rd i s s e c t e dm a j o ro r g a n s t is s u e sr e v e a l s n op r e f e r e n t i a la c c u m u l a t i o ni ns p e c i f i co r g a n s i no r d e rt oa c h i e v es i t e s p e c i f i cd e l i v e r yo fa n t i c a n c e rd r u gm e t h o t r e x a t e ( m t x ) t ot u m o rc e l l s 。 o v e r e x p r e s s i n g f o l a t er e c e p t o r s ( f r ) ，f o l i ca c i d ( f a ) m o l e c u l e sa r e c o n j u g a t e dt op s a t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tp s a h a sc h a r a c t e r i s t i c so f g o o db i o c o m p a t i b i l i t y ，h i g he f f i c i e n c yo f c e l l u l a ru p t a k ea n dm o d i f i a b l e s u r f a c ef u n c t i o ng r o u p sa sw e l l ，w h i c hc a ns e r v ea se x c e l l e n tp l a t f o r m s f o rav a r i e t yo ft h e r a p e u t i ca n di m a g i n ga g e n t s i tc a nb et a k e na sa n a t t r a c t i v ed r u gc a r r i e rs y s t e mf o ri m r a c e l l u l a rd e l i v e r y k e yw o r d s ：h y p e r b r a n c h e dp o l y ( s u l f o n e a m i n e ) ，i n t r a c e l l u l a rd e l i v e r y , d r u gd e l i v e r ys y s t e m ，f o l i ca c i d ，c y t o t o x i c i t y v 符号说明 符号 意义 p s a超支化聚砜胺 f i t c 异硫氰酸荧光素 f a叶酸 m t x甲氨喋呤 c p p s细胞穿透肽 p a m a m 聚酰胺胺 d a b 聚丙烯亚胺 c l s m 激光共聚焦荧光显微镜 f a c s流式细胞术 t e m透射电子显微镜 n m r 核磁共振 e p r 增强的渗透及滞留效应 d v二乙烯基砜 心1 ( 2 一胺乙基) 哌嗪 d m s o二甲亚砜 d n n ，n 一二甲基甲砜胺 1 一( 3 二甲氨基丙基) 3 乙基碳二亚胺 e d c h c l 盐酸盐 p b s 磷酸盐缓冲液 m w c 0截留分子量 d a p i4 ，6 一联脒一2 一苯基吲哚 h b s sh a n k s 平衡溶液 r o i 感兴趣区 ，一一，j ，。，一一一一一，一 肼 3 4 孓二甲蓑镒害幺5 c 苯基 一二一一一j 一一一一， w v 重量体积比 上海交通大学上海父逋大莩 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本 文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：汾哥勃 喻矽彳年月侈日 上海交通大学上海父遗大罕 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在一年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上方框内打“ ) 学位论文作者虢讶葑缶 日期：。7 年r 月b e t 舯撕签名：凇磅 醐：干川阳 1 绪论 近几年来纳米技术蓬勃发展，不但研究设计出许多新型的纳米材料，同时也 带动了许多产业技术的新革命。由于纳米材料所具备的独特性质及特殊反应性， 目前已有许多纳米材料被广泛应用于生物医学领域，包括药物输送系统，基因转 染载体等。 普通抗肿瘤药物对正常组织细胞有着明显的毒副作用。一个理想的药物输送 系统能有效改善药物动力学、增加药物水溶性并提高药物治疗指数。肿瘤组织生 长快速，有独特的e p r 效应( e n h a n c e dp e r m e a t i o na n dr e t e n t i o ne f f e c t ) “3 3 ，一 些分子量较大的载体容易渗透并滞留于肿瘤组织，从而促进该类物质在肿瘤处的 选择性分布，在得到相同的治疗效果的同时可减少用药剂量并降低全身性不良反 应引。 然而只是简单的将药物或其它生物大分子带至肿瘤间质还不足以达到治疗 目的。真核生物的细胞膜是细胞与周围环境发生信息、物质与能量交换的重要通 道，同时为保证细胞内环境的相对稳定，它也是防止细胞外物质自由进入细胞的 屏障。这层特殊的膜只允许具有特定尺寸、极性、电荷的物质通过，其他如离子、 糖或氨基酸等则需借助特殊的通道或细胞膜转运体得以进入细胞。因此多数以细 胞内物质为作用点的药物或者大分子探针因难以通过这层屏障而无法进入细胞。 另外，肿瘤耐药细胞蓄积储存和保持药物的能力降低，药物即使进入细胞后也往 往通过某些流出转运体如p 一糖蛋白( p g p ) 、多药耐受蛋白( m r p ) 从细胞内 流出佑3 。因此有效的细胞内药物输送对细胞内靶向性治疗物质发挥效用起着决定 性作用。这些药物的作用靶点可位于胞质( 如糖皮质激素受体、蛋白质、s i r n a ) ， 细胞核( 如d n a 、反义寡核苷酸、d n a 嵌入式药物如阿霉素) ，线粒体( 如抗 氧化剂) 或其他细胞器。 1 1 传统细胞内输送载药系统 细胞内输送载体的研究为疾病的生物治疗提供了崭新的有效手段，目前已有 多种聚合物作为药物输送载体。1 9 6 5 年，英国学者b a n g h a m 和s t a n d i s h 将磷脂 分散在水中进行电镜观察时发现了脂质体。1 9 7 1 年人们开始将脂质体作为药物 载体进行研究，由于其组成和结构的特点，脂质体用作药物的载体使药剂学的研 究领域进入靶向给药的新天地，同时也更新了给药途径 6 - 8 。经过几十年的发展， 脂质体己广泛应用于细胞生物学、基因工程、临床医学等各个领域，已有多个药 物脂质体经f d a 批准上市，如d o x i l t m 。另外聚合性纳米颗粒或两亲性纳米胶 束9 1 、碳纳米管等应用于载药研究也均有报道。 一般认为，传统药物输送系统通过细胞主动内吞方式即与细胞膜识别融合并 内陷形成内涵体进入细胞。也可将载体连接有靶向性抗体配体后，与细胞膜表 面特异性抗原受体识别，通过配体受体介导的细胞主动内吞作用增加载体的入 胞率。然而这些靶向性或非靶向性的载药系统需要穿越一系列屏障才能到达药物 的作用位点。每个穿越的过程都会损失一部分药物，导致最终到达其作用位点时 只剩下一小部分药物切实地发挥治疗作用n 。这些屏障包括了细胞内吞过程中的 胞膜组合内陷、细胞内运输过程、药物或载药系统释放至胞浆的过程、进入细胞 质的药物或载药系统转移至细胞核或细胞器的过程、胞核或细胞器的摄取等。图 1 描述了纳米颗粒或胶束性纳米载药系统细胞内运输的经典途径。于整个过程中 影响载药系统有效性的两个最主要因素为载体与细胞膜的相互作用及逃离溶酶 体的行为。因此，设计新型载体使其逃离溶酶体或通过其他方式进入细胞以提高 细胞内药物输送的有效性成为载药系统研究的热点。 f i g u r e1 s c h e m a t i cd r a w i n go fs t e p si n v o l v e di nc y t o s o l i cd e l i v e r yo ft h e r a p e u t i c s u s i n gp o l y m e r i cn a n o p a r t i c l e s ( n p s ) ( 1 ) c e l l u l a ra s s o c i a t i o no f n p s ，( 2 ) i n t e r n a l i z a t i o no f n p si n t ot h ec e l l sb ye n d o c y t o s i s ，( 3 ) e n d o s o m a le s c a p eo f n p s ，( 4 ) r e l e a s eo ft h e r a p e u t i ci nc y t o p l a s m ，( 5 ) c y t o s o l i ct r a n s p o r to ft h e r a p e u t i ca g e n t ， ( 6 ) d e g r a d a t i o no fd r u ge i t h e ri nl y s o s o m e so ri nc y t o p l a s m ，( 7 ) e x o c y t o s i so fn p s m a j o rb a r r i e r si n c l u d e ：( a ) c e l l u l a ru p t a k eo f n p s ，( b ) e n d o s o m a le s c a p eo f n p s ，( c ) c y t o p l a s m i ct r a n s p o r to ft h e r a p e u t i c n p s ，( d ) s u s t a i n e dt h e r a p e u t i cb e n e f i t p e ： p r i m a r ye n d o s o m e s ，r e ：r e c y c l i n ge n d o s o m e s ，e n d o - l y s ：e n d o l y s o s o m e s ，l y s ： l y s o s o m e s ，s o l i dc i r c l e sr e p r e s e n tp o l y m e r i cn p s 】 1 1 1 图1 纳米颗粒载药系统细胞内输送过程示意图：( 1 ) 细胞膜融合内陷； ( 2 ) 纳米颗粒的细胞内吞；( 3 ) 溶酶体逃逸；( 4 ) 释放药物进入细胞质；( 5 ) 治 疗性物质于细胞质内的运输过程；( 6 ) 溶酶体或胞浆内的药物降解；( 7 ) 纳米 载体的胞吐作用。主要屏障包括：( a ) 纳米颗粒的细胞内吞；( b ) 溶酶体逃逸； ( c ) 纳米颗粒或治疗物质的胞质内运输；( d ) 持续t g , = a 疗效果。( p e ：初级内 体，r e ：再循环内体，e n d o - l y s ：初级溶酶体，l y s ：溶酶体，图中黑色圆点代 表纳米颗粒) 3 1 2 细胞穿透肽细胞内输送载药系统 十余年前，人们发现h i v 病毒的反式作用因子具有8 6 个氨基酸残基的 h i v 1t a t 蛋白质能够以受体无关的方式有效穿过细胞膜，并证明其中9 个氨基 酸的短肽序列( t a t4 9 5 7 ；r k k r r q r r r ；t a t 肽) 为该蛋白质穿膜所必需【l2 1 。 同时于其他蛋白质也有类似发现，如触角基因的同源结构域蛋白，a n t p ( 4 3 5 8 ； r q i k i w f q n r r m k w k k ) n3 1 ，单纯疱疹病毒1 型转录因子h s vv p 一2 2 肽 ( 2 6 7 3 0 0 ；3 4a a 残基) 【1 4 1 ，核定位信号序列( n l s ) 1 5 1 等。这些能够直接穿过细 胞膜进入胞浆的多肽一般称为细胞穿透肽( c e l lp e n e t r a t i n gp e p t i d e s ，c p p s ) ，蛋 白质转导区( p r o t e i nt r a n s d u c t i o nd o m a i n s ，p t d s ) 或膜移位序列( m e m b r a n e t r a n s l o c a t i n gs e q u e n c e ，m t s ) 。一般分为三类：碱性肽女i j t a t ，碱性两亲性肽 女l j a n t p ，疏水性肽如m t s 【1 6 】。 t a t 与其他细胞穿透肽及其类似物具有共同的显著的结构特征，包括表面正 电荷或含有丰富的碱性氨基酸如赖氨酸、精氨酸。f u t a k i 等【1 刀发现与t a t 相似的 富含精氨酸的多肽与荧光探针连接后给予鼠巨噬细胞r a w2 6 4 7 ，共聚焦荧光显 微镜发现与t a t 肽有着相似的穿膜效率，并发现当精氨酸数量在8 9 个时可达到 最佳效果。研究人员发现将t a t 肽类似物中的精氨酸均以丙氨酸替代后，入胞率 明显降低，说明多肽的阳离子残基在进入细胞过程中起着决定性作用 1 8 a 9 。然而 只是电荷因素还不足以使这些t a t 类似肽高效穿越细胞膜进入细胞，在合成了阳 离子型氨基酸组氨酸、赖氨酸或鸟氨酸的寡聚体后，实验证明其穿膜效率不如 t a t 肽，而9 个精氨酸的寡聚体( a r 9 9 ) 能比t a t 肽的穿膜效率高2 0 倍以上。因 此精氨酸的胍基被认为是其穿膜的主要决定因素。研究证明，聚胍基的类肽衍生 物与t a t ( 4 9 5 7 ) 和a r 9 9 相比有着更高的入胞效率1 8 1 9 】。 c p p 的穿膜机制至今尚不明确，不同的c p p 可能通过不同的途径进入细胞。 这种穿膜机制不仅决定于c p p 本身的理化性质与结构，还与其携带的物质大小、 分子量等因素有关 2 0 , 2 1 】。女i i t a t 与大分子或纳米颗粒连接后通过能量依赖的胞饮 方式进入细胞，而装载着小分子的时候则通过不依赖于能量的方式穿膜2 2 1 。尽 管其细胞内摄机制尚未明了，已有多个研究小组尝试使用富含精氨酸的寡合物作 为药物输送载体。例如，将c p p 用于一些小分子、蛋白、核酸或基因药物后可提 高其药理性质 2 3 - 2 5 1 。然而这些d a c r , r , 为基础的药物输送系统也存在着一系列问 题，包括体内肽酶引起的多肽类载体降解，体内运输效率的不确定性，潜在细胞 毒性、神经毒性和免疫原性等。 1 3 非肽类细胞内药物输送系统 如图2 所示，树状大分子是一种水溶性的聚合物，具有高度支化、精确的分 子结构、大量的末端功能基团。其分子内部存在空腔，分子质量高度可控，是单 分散性、精细对称、呈辐射状的新型功能高分子。由于高度支化的结构和单分散 性，这类化合物具备特殊的性质和功能如低粘度、独特的流体力学性z f j - * 匕l 和易修饰 性，目前被广泛应用于多种诊疗试剂的输送。如阳离子型树状大分子聚酰胺胺 ( p a m a m ) 及聚丙烯亚胺( d a b ) 能够与核酸的阴离子磷酸基团静电吸附进行 包装，增加核酸的细胞内输送2 6 , 2 7 。因此，q i a g e n 公司将其作为转染试剂命名 为s u p e r f e c t t m 和p o l y f e c t t m 进行销售。由于其能穿越小肠上皮屏障，并携带药物 躲避p 糖蛋白对药物的流出作用，树状大分子作为口服给药的载体系统的研究 也受到了密切的关注 2 8 , 2 9 】。k e l l y 等将p a m a m 与异硫氰酸荧光素( f i t c ) 连接 后给予细胞，发现2 0m i n 后即能分布于细胞内 3 0 o 更有报道将d a b 末端功能 氨基胍基化后以增强其跨膜效率 3 1 , 3 2 。 。且。一心一辱避 f i g u r e2 d i a g r a ms h o w i n gs c h e m a t i c a l l yd e n d r i t i ca r c h i t e c t u r e so fp a m a ma n d d a b f 3 3 1 图2 树枝状是分子聚酰胺一胺( p a m a m ) 与聚雨烯亚胺( d a b ) 的结构概略图”。 另外模仿c p p s 的非肽类细胞内输送性载体也有报道。c h i t o n 等研究了n 取 代的甘氨酸寡聚物作为基因的细胞内输送载体，发现有着1 2 个氨乙基侧链的3 6 体类似肽有着较高转运活性删。g i r a l t 等合成了杂环胍基寡聚物，发现其lh 即 能进入h e l a 细胞，其细胞内摄效率与温度相关，在线粒体亦有发现该载体的踪 迹。 1 4 存在问题 作为能够被广泛运用于药物输送的载体，除无免疫原性、生理环境下结构稳 定、足够的水溶性等要求外，还需满足合成制备过程简单经济，能够与较多生物 活性分子通过共价键或其他方式简易连接，具备亲一疏水平衡等特性。理想的载 体还应能够同时携带多个分子，包括治疗药物、靶向配体或显像分子等”l ，在 单个载体上携带多个分子，通过协同效应可增强其生物活性田3 踟。随着研究的深 入，人们发现依据表面正电荷或胍基所设计合成的这些肽类或非肽类细胞内输送 载体及其他传统的阳离子载体虽然具有有效的穿膜功能，但也存在着诸多问题。 阳离子载体可通过在细胞膜上打孔方式进入细胞而导致明显的细胞毒性3 9 1 ，并 由于静电吸引易与血液中蛋白结合导致穿膜功能低下加1 ，其应用往往只能局限 于无血清的培养液。富含精氨酸的载体则存在潜在的神经毒性及免疫原性等问题 【4 。因此，设计并合成无毒且能够高效穿膜的载体己成为药物研究领域的首要 发展方向。 1 5 本论文的主要内容 本研究采用了一种新型的细胞内输送载体超支化聚砜胺( p s a ) 。作为 超支化聚合物的一种，它具有三维立体高度支化结构和丰富的末端功能基团的特 性。与传统聚合物相比，p s a 能够一步合成，得率较高，成本相对低廉。更值 得关注的是，与其他具备表面氨基基团的阳离子载体不同，p s a 于生理条件p h 值下呈现负电性。 目前认为，载体的化学性质及组份对其跨膜及胞内运输过程起了决定性的作 用4 2 1 。上述被广泛研究的载体都具有突出的结构特征，包括表面正电荷或含有 丰富的碱性氨基酸如赖氨酸、精氨酸，说明载体的阳离子表面或胍基在细胞膜穿 透过程中起了关键的作用【4 3 舶】。相反，负电荷聚合物由于与细胞膜的负电荷静电 相斥，一般认为无法穿膜或入胞效率低下m 】。本研究将荧光显像分子及纳米金 颗粒标记p s a ，用c l s m ，f a c s 及t e m 方法观察细胞的内吞作用及载体于细 胞内的转运情况；通过尾静脉注射荧光标记的聚合物后，观察其在正常小鼠体内 的生物分布；同时对p s a 的细胞生物相容性进行了研究。为进一步观察p s a 作 为药物载体的可行性，本研究通过共价键将p s a 与f a 及m t x 进行连接，对 p s a 装载药物的能力、对肿瘤细胞的杀伤作用等作了探索。结果证明，p h 值中 性条件下带负电荷p s a 无明显细胞毒性，能够高效快速进入细胞，并于线粒体、 高尔基体及细胞核有较多分布，且能有效装载药物。在正常小鼠体内，p s a 在 各主要脏器或组织中无明显特异性浓聚；p s a 与m t x 及f a 能够有效连接，载 药系统具有叶酸靶向性并能维持药物的细胞毒性。 2 1 材料与方法 2 p s a 衍生物的合成与鉴定 2 1 1 试剂与仪器 二乙烯基砜( d v ) 、1 ( 2 一胺乙基) 哌嗪( a p ) 、异硫氰酸荧光素( f i t c ) 均购自s i g m a 公司，其中d v 在使用前真空蒸馏纯化；氯仿、甲醇、二甲亚砜 ( d m s o ) 、n ，n 。二甲基甲砜胺( d 心) 、l 一( 3 二甲氨基丙基) 3 乙基碳二亚 胺盐酸盐( e d c h c l ) 从a m r e s c o 公司购得；碳酸氢钠、碳酸钠、磷酸盐缓 冲液( p b s2 0m o l l ) 购自上海生工生物工程有限公司；再生纤维素透析袋 ( m w c o ：1 0 0 0 0 ) 购自s p e c t r u m 公司。 g p c m a l l s ( w a t e r s 除气剂，w a t e r s5 1 5 泵，7 1 7 自动迸样器，w y a t to p t i l a b d s p 差示折光探测器，和w y a t td a w n e o sm a l l s 探测器) ，1 ha n d1 3 cn m r ( v a r i a nm e r c u r yp l u s - 4 0 0 ，o x f o r dm a g n e t ) ，真空冷冻干燥仪( c h r i s t t x l 一2 1 d p l u s ，m a r i nc h r i s t ) ，z e t a s i z e r ( m o d e l2 0 0 0 ，m a l v e mi n s t r u m e n t s ) ，紫 外分光光度计( d u 6 0 0 ，b e c k m a n ) 。 2 1 2p s a 的鉴定 本实验所采用的载体p s a 是由上海交通大学化学化工系采用a 2 + b b 2 单 体共聚法制各并提供 4 s , 4 9 。即在1 0 0m l 洁净干燥的反应瓶中加入2 0m m o d v ( 2 3 6 3g ) 及2 0m r n o la p ( 2 5 8 4g ) ，再加入1 5m l 氯仿，充氮气5 1 0m i n 后于4 0 c 下加热搅拌反应1 2 0h 。反应结束后，以5 0 0m l 甲醇沉淀，沉淀物以 甲醇、丙酮洗涤3 5 次。真空干燥后得白色粉末状固体4 5g 。得率约9 3 。 g p c m a l l s 显示p s a 平均分子量为1 5 7 x 1 0 4g m o l ，多分散性为2 3 7 。p s a 结 构以1 h 和1 3 cn m r 进行表征。 2 1 3 p s a - f i t c 的合成与鉴定 在1 0 0m l 洁净反应瓶中加入0 0 7 9g 碳酸钠及o 1 4 7g 无水碳酸氢钠，再加 入5 0m l 双蒸水充分溶解以配置碳酸氢钠缓冲液( o 1t o o l l ) ，p h 试纸测得缓 冲液p h 值为9 6 。将1 6 5m gp s a 与3 0m gf i t c 分别以1 0m l 碳酸盐缓冲液溶 解后混匀，避光室温搅拌1 2h 以上。然后将反应液装入m w c o1 0 0 0 0 的透析袋 中，以透析袋夹夹紧，置于1l 烧杯内透析多次。先以p b s 作为透析液进行透 析，一边观察透析液中颜色，直至完全澄清，接着用双蒸水作为透析液透析多次。 最后真空冻干，得1 5 3m gp s a - f i t c 粉末。将p s a 溶解于碳酸盐缓冲液中，分 成多管后，每管加入不同f 1 t c 量，紫外分光光度法4 8 8n m 处制作标准曲线。 以碳酸盐缓冲液溶解p s a f i t c ，并通过测试聚合物吸光度以判断聚合物中f i t c 含量。全程注意避光。另外以1 h 偶进行表征以证实两者的有效连接。 2 1 4p s a - a u 的合成 按照文献方法5 0 1 制备枸橼酸保护的纳米金颗粒。取0 0 1 h a u c l 4 水溶液 1 0 0m l ，一边剧烈搅拌一边加热煮沸，加入1 枸橼酸三钠水溶液3 7 5m l ，加 热煮沸3 0m i n ，冷却至4 ，溶液呈红色。最终得到直径为1 0 - - - 4 0n m 金颗粒。 称取1 2 0m g p s a ，加入1 5m l 双蒸水充分溶解。然后将lm l 纳米金颗粒水溶液 ( 1m m 0 1 ) 加入p s a 水溶液中。搅拌1 2h 后，可通过螯合氮将金颗粒标记在p s a 上。 2 1 5z e t a 电位的测定 配置不同p h 值( 1 9 l 7 8 5 ) ，浓度为lm o l l 的p b s 缓冲液。将p s a 以 1m g m l 浓度溶解于缓冲液中，通过z e t a s i z e r 在2 5 。c 下进行z e t a 电位的测定， 并绘制p s a 的z e t a 电位曲线。 另将p s a 溶解于无血清r p m i1 6 4 0 培养液中，p s a f i t c 则分别溶解于p b s 缓冲液( 1m o l l ，p h = 7 4 ) 和无血清培养液中，终浓度均为1m g m l 。p s a 、 p s a f i t c 检测液和金颗粒标记的p s a ( p s a a u ) 水溶液通过z e t a s i z e r 在2 5 下进行z e t a 电位的测定。 2 2 结果与讨论 2 2 1p s a 、p s a - fit c 、p s a - a u 的合成与鉴定 近年来，阳离子型树枝状聚合物及其胍基化的衍生物由于其高效的细胞内摄 而受到广泛关注及研究4 3 , 4 4 , 4 6 。树状大分子作为树枝状聚合物的亚类尤其引人注 目。它具有高度支化结构，构型对称，单分散性，从中间的核伸展出多个支化单 元，并最终以功能基团作为末端，同时树状大分子内部存在纳米空腔，使它可以 在外部功能基团上共价连接又能将药物包入其空腔内部。然而树状大分子合成步 骤非常繁复，成本高昂【5 。树枝状聚合物的另一重要成员超支化聚合物同 样有着三维支化结构，内部纳米空腔，及大量的末端官能团。与树状大分子不同 的是，超支化聚合物结构较不规则且呈现多分散性。然而其优势在于能够一步聚 合，成本低廉。 本论文由已商品化且价格便宜的单体通过a 2 + b b 2 的方法一步合成了超支 化聚砜胺。可通过控制反应温度、单体量等对其支化度进行控带l j 4 8 , 4 9 。最终得到 的p s a 产物有着丰富的功能基团，能够反应结合多种生物活性分子如药物、多 肽、抗体等。图式1 给出了p s a 的合成历程，d v ( a 2 单体) 及a p ( b b 2 单体) 经迈克尔加成法合成p s a 。在4 0 反应条件下混合d v 与a p ，伯胺与仲胺之 间的不同反应很快形成了一个a a b b 2 型的中间体。进一步的聚合反应最终得到 超支化聚合物。n m r 证实了该产物的高度支化结构，于文献【4 8 , 4 9 中已有详细叙 述。图3 给出了p s a 的1 h 及1 3 cn m r 谱图。所有图式1 中的基团标识都能在 图3 的氢信号及碳信号中分辨出来。根据核磁氢谱及定量碳谱的积分面积，利用 以下公式可以测定p s a 的支化度( d b ) ： d b = ( d + t ) ( d + t + l ) 式中：d ，t 和l 分别代表支化单元、末端单元和线性单元的含量 计算得p s a 支化度为0 4 l ，平均每重复单元含有0 1 2 个伯胺基团。g p c 。m a l l s 测得终产物的平均分子量为1 5 7 1 0 4g m o l ，多分散性为2 3 7 。p s a 含有丰富的 氨基和砜基基团( 图式2 ，表1 ) ，因此p s a 具有较高水溶性。 m 一十一： ( a p ) +h 仁- - c h 厂伽厂2 ( d v ) m i c h a e la d d i t i o n 1 h 厂需 s c h e m e1 s y n t h e s i sr o u t eo fh y p e r b r a n c h e dp o l y ( s u l f o n e a m i n e ) 图式1 超支化聚砜胺的合成历程 3 23 13 02 92 82 72 62 5 2 4 p p m 6 26 0 5 8 5 6 5 4 5 2 5 0 4 84 64 44 24 0 p p m f i g u r e3 n m rs p e c t r ao fp s a i nc d c l 3 ：a ) 1 hn m r ；b ) 1 3 cn m r 图3 p s a 的n m r 谱：a ) 1 hl q m r ；b ) 1 3 cb i m r 2 2 h t n m u 删” m - 肌 h 4 e c ， t l i n e a r a l i n e a r b b r a n c h e d t e r m i n a la t e r m i n a lb n o tf o u n d r e p e a t i n gu n i t s 一十啦c 一 m c c 心：| j o 一 穹iil - - c h i c h 黍g h 2 g h 2 l 睾k 删扭一 q 。l 、， l， 一 一c 卜够嗨8 c | 1 1 2 c 嘞 q j t e r m i n a lu n i t s 一 n h l _ 一 l e h = c h 2 s c h e m e2 t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fh y p e r b r a n c h e dp o l y ( s u l f o n e a m i n e ) 4 8 ，4 9 1 图式2 超支化聚砜胺的分子结构 4 8 , 4 9 t a b l e1 r a t i oa n dm o l a rm a s sf o rv a r i o u ss t r u c t u r eu n i t so fp s a 4 8 , 4 9 1 表1 超支化聚砜胺各结构单元的比9 , 1 2 l 分子量h8 删 f i t c 借助异硫氰基( n c s ) 与p s a 的氨基共价结合。先以p b s 作为透析 液进行透析，不会破坏p s a f i t c 之间的共价键，随后用双蒸水作为透析液的目 的是除去p b s 残留的盐分。以u v v i s4 8 8n m 处检测p s a f i t c 聚合物吸光度， 由f i t c 标准曲线计算得到p s a f i t c 中f i t c 的含量约为每个p s a 的重复单元 连接o 0 9 个f i t c 。1 hn m r 证明了p s a 。f i t c 的有效连接( 图4 ) 。f i t c 芳香 环上的c h 峰出现在6 2 5 3 - - 一7 9 0 4p p m 。金颗粒标记的p s a ( p s a a u ) 则是通 过p s a 的螯合氮与金颗粒结合。 8765 4321 p p m f i g u r e4 1h n m r s p e c t r ao fp s a f i t ci nc d c l 3 图4 p s a f i t c 的1 hn m r 谱 2 2 2z e t a 电位 图5 显示了p s a 的z e t a 电位值随着溶液p h 值的增高而降低。当溶液p h 值 为5 3 3 时，p s a 的z e t a 电位接近0 ；于生理条件p h 值条件下即溶液p h 值为7 4 左右时，p s a 呈现较高负电性。 1 5 r丁 1 0 卟、 5 一 0 。 e -一 j1 。1 。二i)24 6 詈- 5 。 火入 c 旦 - 1 0 g 舟1 5 2 0 一 - 2 5 3 0 一 o hv a l u o f i g u r e5 x - p o t e n t i a l ( m v ) o fp s ad i s s o l v e di np b sw i t hv a r i o u sp hv a l u e s 图5 溶解于不同p h 值p b s 中p s a 的z e t a 电位 如表2 所示，p s a 、p s a f i t c 和p s a a u 于生理条件p h 值条件下电荷值呈 现从1 4 1 + 4 1 1m v 到2 6 5 7 士2 9 1m v 的负电荷。 t a b l e2 一p o t e n t ia l ( m v ) o fp s a ，p s a f t ca n dp s a a u 表2 p s a 、p s a - f i t c 及p s a - a u 的z e t a 电位( m v ) s o l v e n t s；psa p s a f i t c p s a a u 口 阳脑i - 1 4 1 + 4 1 1l - 1 3 7 士1 6 s e r u m f r e em e d i u m - 2 3 7 7 3 1 8 - 2 6 5 7 2 9 1 a p s a a ui na q u e o u ss o l u t i o n - 1 3 3 细胞内摄过程及细胞内分布研究 3 1 材料与方法 3 1 1 试剂与仪器 盖玻