（外科学专业论文）内毒素致肾集合管上皮细胞损伤与水通道蛋白2表达变化的实验研究.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要”4 二、英文缩略语7 三、论文 论文一 前言”8 一目u 舌” 材料与方法“9 结果12 讨 仑? l5 结论18 论文二 前言1919刖舌 材料与方法”l9 结果21 讨论2 7 结 仑3 2 论文三 前言3 3丽舌3 3 材料与方法3 4 结果3 6 讨论3 8 结论4 0 四、本研究创新性的自我评价4 1 五、参考文献“4 2 六、附录 综j 丕4 5 致谢5 8 个人简历5 9 中文论著摘要 内毒素致肾集合管上皮细胞损伤与水通道蛋白2 表达 变化的实验研究 目的 内毒素血症是梗阻性黄疸时肾功能损害的重要的病理生理机制之一。之前本 课题组通过研究大鼠梗阻性黄疸动物实验时发现，梗阻性黄疸时，肾集合管上皮 细胞中a q p 2 的表达显著降低。本实验拟在大鼠内毒素血症模型及细胞水平上明 确内毒素对大鼠肾集合管上皮细胞的作用，以及水通道蛋白2 表达的变化。 方法 选w i s t a r 大鼠用腹腔注射方法建立内毒素血症大鼠模型，根据l p s 的作用 时间处死取肾髓质，用免疫荧光及w e s t e r nb l o t 方法检测a q p 2 表达。培养并传 代大鼠肾髓质上皮细胞系m l m c d 3 ，选取处于指数生长期的细胞制作细胞爬片， 免疫组化d a b 染色法检测水通道蛋白2 在大鼠肾髓质上皮细胞m l m c d 3 的表达。 分别用终浓度为o 1 ，0 5 ，1 ，5 ，1 0 r t g l 的内毒素与大鼠肾髓质上皮细胞m l m c d 3 培养4 h ，8 h ，1 2 h ，2 4 h 后用c c k 8 检测吸光度，计算细胞抑制率。选取作用明 显的终浓度为1 0 i _ t g l 的内毒素分别作用于m l m c d - 3 及a q p 2 质粒转染后的 m l m c d 3 ，在作用4 h ，8 h ，1 2 h ，2 4 h 后流式细胞仪检测凋亡。所有计数资料均用 均数4 - 标准差形式表示，运用统计软件s p s s l 3 0 进行分析，p 0 0 5 为差异有统计 学意义。 结果 免疫组化和d a b 染色可见，细胞胞浆中大量棕红色颗粒，呈片或呈堆积状排 列，证明m l m c d 3 表达a q p 2 。 l p s 抑制肾髓质上皮细胞m l m c d 3 增殖。浓度低于5 p g l 时，l p s 的浓度变 化对细胞增殖的抑制作用差别不大，增大浓度梯度时，l p s 对细胞的抑制作用明 显增强，具有浓度依赖性。浓度为0 1 “g l 的l p s 在对细胞作用的早期，对细胞 l 不仅没有抑制，反而有增殖的作用。当作用时间增加到2 4 小时时，相邻浓度组间 的比较不具有统计学差异，各组间细胞的抑制率无差别。不同时间组分别行单因 素方差比较，具有统计学差异( p n 卿。证明浓度低于1 p g l 时，细胞的抑制率随时间变化不大。 浓度大于等于5 , g l 时，任意两两组间对比均具有统计学差异。l p s 对m l m c d 3 的抑制作用具有时间依赖性。 l p s 诱导肾髓质上皮细胞m l m c d 3 凋亡。将终浓度为1 0 9 9 l 的l p s 溶液 作用于肾髓质上皮细胞m l m c d 34 h ，8 h ，1 2 h 和2 4 h 后，经流式细胞仪检测，结 果表明，l p s 对m l m c d 3 的抑制作用主要表现为细胞凋亡，随作用时间的延长， 细胞凋亡率增加。 对肾髓质上皮细胞m l m c d 3 行组化染色可以看出，l p s 作用于m l m c d 3 后， a q p 的表达下调，细胞中棕黄色颗粒变稀疏，且颜色变浅。浓度为1 0 9 9 l 的l p s 作用细胞4 小时，8 小时，1 2 小时和2 4 小时的平均光密度分析，作用时间4 小时 和对照组比较，不具有统计学差异，作用时间达到8 小时后随作用时间延长a q p 2 表达逐渐下调。证明在短时间内，时间小于4 小时，l p s 对a q p 2 表达的变化没 有影响，但随l p s 作用时间的延长，a q p 2 的表达下降。 结论 l p s 可以造成肾髓质的损伤。l p s 可以早期导致大鼠肾髓质a q p 2 表达下调， 并且作用强度随时间延长而增加。l p s 能够抑制m l m c d 3 增殖，具有时间依赖性 和剂量依赖性。l p s 对细胞增殖的抑制作用主要表现为诱导细胞凋亡。随作用时 间延长，细胞凋亡率增加。a q p 2 高表达的细胞在l p s 作用后凋亡率较正常细胞 降低，a q p 2 的高表达可以抑制m l m c d 3 的凋亡。 2 关键词 大鼠内毒素血症模型；大鼠肾集合管上皮细胞；l p s ；水通道蛋白2 ；流式 细胞术； 3 英文论著摘要 l p s - i n d u c e di n j u r yo fk i d n e yc o l l e c t i n gd u c te p i t h e l i a l c e l la n d p r e s s i o no ft u a p o r i n 2 ( a q p 2 ) c e l l a n e x p r e s s l o no ta qu a p o r l n 2 t 2 o b j e c t i v e t h ef o r m e rs t u d yh a v ec o n f i r m e dt h a ti nr a tm o d e lo fo b s t r u c t i v ej a u n d i c e ，t h e m o s ti m p o r t a n tp a t h o p h y s i o l o g i c a lc o u r s ei st h ed a m a g eo fc o l l e c t i n gd u c tc e l l sw h i c h m a i n l yp e r f o r md o w n - e x p r e s s i o no fa q u a p o r i n2 ( a q p 2 ) t h em a i nm e c h a n i s mo fr e n a l i n j u r yi st h ee n d o t o x i nd a m a g e w et a k et h ef o l l o w - u ps t u d yt or e s e a r c ht h ee f f e c to f e n d o t o x i nt om o u s ei n n e r m e d u l l a r yc o l l e c t i n g d u c tc e l l s ( m i m c d 3 ) a n d c o r r e s p o n d i n gc h a n g e so fa q p 2 m e t h o d s t r a i n e da n d p a s s a g e m i m c d - 3c e l l st o p r o d u c e c l i m bf i l m s i m m u n o h i s t o c h e m i c a is t a i n i n gw a su s e dt ot e s tt h ee x p r e s s i o na n dl o c a l i z a t i o no f a q p 2 c e l l sw e r es e e d e di n9 6 - w e l lp l a t e sa n di n c u b a t e df o r4 2 4 hw i t l ld i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o no fl p s t h ec c k 一8w a su s e dt od e t e r m i n et h ei n h i b i t o r ye f f e c t s e l e c t i n gt h ef i n a lc o n c e n t r a t i o no f10 9 m o l lo fl p st ob ec u l t u r e d 、析t l lc e l l sf o r 4 - 2 4 h ，f l o wc y t o m e t r yw a su s e dt oc a l c u l a t ei n h i b i t o r yr a t e t h ee x p r e s s i o no fa q p 2 w a sd e t e c t e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y 。 r e s u l t s m i m c d 3e x p r e s s e da q p 2 a f t e ri m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n go fc l i m bf i l m ，a l a r g en u m b e ro fb r o w n r e dp a r t i c l e sp i l e du pl i k ep l a t e sc o u l db es e e ni nt h ec y t o p l a s m i tp r o v e dt h a ta p q 2l o c a l i z e di nt h ec y t o p l a s mi nt h eb a s i cs t a t e a tt h es a m et i m e ， n e g a t i v ec o n t r o lc e l l sw h i c hd i d n o ta d df i r s ta n t i b o d y ，s h o w e dn o n eo fb r o w n - r e d p a r t i c l e sg e n e r a t e di nt h ec y t o p l a s m t h ee n t i r ec y t o p l a s mw a ss t a i n e dl i g h tb l u e l p si n h i b i t e dm l m c d - 3p r o l i f e r a t i o n o n e - w a ya n o v aw a su s e dt oa n a l y s i st h e s i g n i f i c a n c eo fc o n c e n t r a t i o n ，t h er e s u l t sh a ds t a t i s t i cs i g n i f i c a n c e ( p o 0 5 ) i tp r o v e dt h a tw h e nt h ec o n c e n t r a t i o nw a sl e s st h a n5 1 x g l ，t h e i n h i b i t i o no fc e l lp r o l i f e r a t i o nw a sn o tv e r ya p p a r e n t w h e nt h ec o n c e n t r a t i o ng r a d i e n t i n c r e a s e d , t h ei n h i b i t o r ye f f e c ti n c r e a s e dw i t l ld o s e - d e p e n d e n tm a n n e r w i t ht h e c o n c e n t r a t i o no fo 1 嵋l t h ec e l l sd i dn o ti n h i b i t ，b u tp r o l i f e r a t e d w h e nt h et i m e w a su pt o2 4h o u r s ，t h ea d ja c e n ti n t e r - g r o u pc o m p a r i s o nh a dn o n - s t a t i s t i c a ld i f f e r e n c e s i th a ds t a t i s t i c a ld i f f e r e n c e ( p ad 髟i t p r o v e dt h a tw h e nt h ec o n c e n t r a t i o nw a sl e s st h a nlg g | l ，t h ei n h i b i t o r yr a t ec h a n g e d l i t t l eo v e rt i m e o n c eg r e a t e rt h a no re q u a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no f5 9 9 | l ，t h ec o n t r a s t s b e t w e e na n yt w og r o u p sw e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t i ts h o w e dat i m e - d e p e n d e n t m a n n e r l p s - i n d u c e da p o p t o s i s f l o wc y t o m e t r yr e s u l t ss h o w e dt h a tt h e i n h i b i t i o no f l p so nm l m c d - 3w a sm a i n l ye x p r e s s e di nt h em a n n e ro fa p o p t o s i s w h e nt i m e e x t e n d e d , a p o p t o s i sr a t ei n c r e a s e d 妒 o 01 ) a q p 2e x p r e s s e dm a i n l yi nt h ec y t o p l a s ma se v i d e n c e dl a r g ep i l e so fb r o w n - r e d p a i t i c l e s n ee x p r e s s i o no fa q p2r e d u c e dw h e nl p sj o i n e d t h eg r a n u l e sb e c a m e s p a r s eb r o w n , l i g h t e ri nc o l o rb yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y b ya n a l y z i n ga v e r a g e o p t i c a ld e n s i t y ，t h er e s u l t sh a ds t a t i s t i c a ld i f f e r e n c e ( p o 0 1 ) h o w e v e r ，i th a dn o s t a t i s t i cs i g n i f i c a n c eb e t w e e n4 - h o u rg r o u pa n d0 - h o u rg r o u p 俨= o 8 9 7 ) b u ti th a d o b v i o u s l ys t a t i s t i c a l l yd i f f e r e n tb e t w e e n2 4 一h o u rg r o u pa n d4 - h o u rg r o u p ，2 4 - h o u r g r o u pa n dt h e8 - h o u rg r o u p ( p o o o i tp r o v e di nas h o r tp e d o do fe f f e c tt i m e ，l e s s t h a n f o u rh o u r s ，t h ee x p r e s s i o no fa q p 2d i dn o ta p p a r e n t l yc h a n g e w h e nt i m e e x t e n d e d ，t h ee x p r e s s i o no fa q p 2d e c r e a s e d c o n c l u s i o n m l m c d 3e x p r e s s e sa q p 2w h i c hm a i n l yl o c a l i z e si nt h ec y t o p l a s mi nt h eb a s i c s t a t e l p si n h i b i t st h e p r o l i f e r a t i o n o fm i m c d 一3 诵t t lat i m e - d e p e n d e n ta n d d o s e - d e p e n d e n tm a n n e r 1 1 1 ei n h i b i t o r ye f f e c to fl p so nc e l lp r o l i f e r a t i o ni sm a i n l y e x p r e s s e di nt h ei n d u c t i o no fa p o p t o s i s w i t ht h et i m ee x t e n d i n g ，t h ea p o p t o s i sr a t e i n c r e a s e sw h i c hh a sal i n e a rc o r r e l a t i o n a q p 2 p l a y s a n i m p o r t a n t r o l ei n l p s - m e d i a t e da p o p t o s i so fm o u s ei n n e rm e d u l l a r yc o l l e c t i n gd u c tc e l l s 5 k e y w o r d s m i m c d - 3 ；e n d o t o x i n ；a q u a p o r i n2 ；c c k 8a s s a y ；f l o wc y t o m e t r y ；r e a l t i m ep c r 6 英文缩略词 7 论文一 l p s 致大鼠肾髓质损伤与水通道蛋白2 表达变化 刖吾 梗阻性黄疸是胆道外科常见基本疾病，临床上8 左右围手术期出现急性肾功 能不全，且一旦出现，死亡率超过6 8 。目前梗阻性黄疸肾功能损伤病理生理 机理目前主要存在3 种理论，即缺血再灌注损伤、胆红素直接损伤及肠屏障损伤导 致内毒素( e n d o t o x i n ) 入血损伤2 巧】。1 9 9 1 年世界上首先提出内毒素性疾病( e t d ) 概念。内毒素性疾病均可出现内毒素血症，临床表现复杂而严重，并且和原发疾病密 切相关，内毒素可导致心血管、肝胆胃肠、胰腺、肾、凝血系统等多系统多脏器损 害甚至功能衰竭，而肾脏往往是最先受累的器官之一。内毒素血症时肠粘膜屏障 功能受损，肠道内革兰氏阴性细菌可透过肠屏障入血，崩解后产生产生大量内毒 素，即脂多糖( l p s ) 。l p s 可抑制肾脏细胞线粒体功能及线粒体内a q p s 合成【6 7 1 ，从而导致水代谢平衡紊乱，引发肾功能不全。肾功能衰竭( a c u t er e n a lf a i l u r e ， a r e ) ，是指各种原因在短期内引起肾脏泌尿功能急剧障碍，以致机体内环境出现 严重紊乱的病理过程。按其病因急性肾功能衰竭可分为肾前性、肾实质性及肾后 性三大类，而其临床表现也直接与病因相关，如尿量、血浆及尿电解质水平变化 及代谢性毒物储留等。由于肾脏近曲小管的钠水重吸收相对恒定，且很少受激素 等影响，而远端肾单位( 包括远曲小管、连接管和集合管) 的钠水重吸收或分泌 则受激素等调控，因而各种肾脏疾病伴有的不同程度水、电解质代谢紊乱，主要 与远端肾单位a q p s 等蛋白水平及细胞定位变化所致的钠水重吸收异常有关。目 前对内毒素性肾损害尚无良好的、有效的预防措施，治疗上陷于被动局面，增加 了预后不良的风险，间接增加医疗风险。 水分子的快速跨膜运输是通过细胞膜上的一种水通道蛋白( a q u a p o r i n ，a q p ) 实现的。水通道蛋白是肾脏水代谢依赖的一类细胞膜蛋白，既是结构蛋白又是功 能蛋白。第一个水通道蛋白于1 9 8 8 年由a g r e 等偶然发现，是一个2 8 k d 的疏水 性膜蛋白，称为c h i p 2 8 ，后来命名为a q p l 。在提纯并鉴定a q p l 蛋白之后，在 8 哺乳动物体内陆续发现了多种不同的水通道蛋白，这些蛋白被分为a q p 0 - - - a q p l 0 共1 1 类，这1 1 类水通道蛋白构成了该家族的主要框架。这些水通道蛋白分部在 不同组织中，并在多种生理活动中发挥重要作用。a q p s 在肾脏的研究对于揭示 肾脏的病理生理改变具有重要作用【8 】。a q p 2 原名为集合管水通道，( w a t e rc h a n n e l o ft h ec o l l e c t i n gd u c t ，w c h c d ) ，主要表达于集合管主细胞的顶端膜和顶端小泡 内。对a q p 2 的细胞和亚细胞定位及集合管水通透性和a q p 2 表达两者之间的关 系进行研究，证实a q p 2 是血管加压素调节集合管水通透性的靶点，也是唯一受 激素调控的水通道蛋白。存在于肾脏中的水通道蛋白为a q p l a q p 4 。a q p 2 是只 存在于肾脏的水通道蛋白，位于远曲小管和集合管上皮细胞中，肾脏水重吸收和 尿液浓缩的主要调节部位在肾集合管，其水通道蛋白表达的变化对于肾脏水代谢 功能的作用至关重要。a q p 2 是集合管水代谢调节的主要蛋白，在肾脏疾病研究 中占有重要地位，也是目前研究的热点。a q p 2 主要分布于集合管主细胞管腔膜及 细胞内囊泡中，是一种a d h 敏感性水通道蛋白，a q p 2 表达及穿梭调节与集合管 水重吸收量密切相关。a q p 2 在体内受到a d h 调节，通过g s 蛋白与膜内的腺苷酸 环化酶( a d e n o c y c l a s e ，a c ) 耦联作用，从而提高管腔膜对水的通透性。当血浆a d h 水平降低时，集合管主细胞管腔膜出现胞吞作用，又形成含a q p 2 囊泡迁移到管腔 膜下的胞浆内。此时主细胞管腔膜上的a q p 2 数量相应地减少，管腔膜渗透性水的 通透性也相应地降低。近期针对药物性、缺血性肾功能衰竭时a q p 2 变化的研究屡 见报道。前期动物实验发现梗阻性黄疸肾脏损伤主要是内毒素性肾损伤，血内毒 素水平明显增加，伴随着肾脏a q p 2 表达降低及细胞凋亡异常增高。因而可以设想， 如能通过调控细胞凋亡，从而稳定肾脏集合管细胞膜a q p 2 的表达，会使肾脏功能 得到较好的保护，减少肾功能不全的发生。 有研究表明大鼠急性内毒素血症肾髓质v 2 抗利尿激素受体下调，a q p 2 的表 达下调i 纠。本课题组前期动物实验发现，梗阻性黄疸时，肾集合管上皮细胞中a q p 2 的表达显著降低，是内毒素性肾损害的重要机制之一【i o l 。 本实验用l p s 重现梗阻性黄疸时的内毒素血症，研究l p s 对大鼠肾髓质的损 伤，以及l p s 对肾髓质a q p 2 表达的影响。 材料和方法 9 ( 一) 实验材料和试剂 雄性w i s t a r 大鼠4 8 只( 盛京医院实验动物中心) ，l p sf r o me s c h e r i c h i ac o l i 0 2 6 ：b 6 ( s i g m a 公司，美国) ，兔抗鼠a q p 2 抗体及山羊抗兔二抗( 博士德，武汉) ， 免疫荧光试剂盒( b i y o t i m e ) ，膜蛋白提取试剂盒( p i e r c e ，美国) ，a a 2 5 0 分析 天平( d e n v e ri n s t r u m e n tc o m p a n y ) ，超速低温离心机( e p p e n d o r f ) ，酶标仪， 组织超声匀浆器，电泳仪( b i o r a d ) ，垂直电泳槽，转印电泳槽( 百晶生物) ， 凝胶扫描成像系统。 ( 二) 实验方法 1 、分组 雄性w i s t a r 大鼠4 8 只，体重2 0 0 2 5 0 9 ，实验前适应性饲养2 周，采用随 机数字表法分为c o n t r o l 组( 对照组) 和l p s 组( 内毒素组) ，每组按照4 ，8 ，1 2 ， 2 4 小时时间段分为l p s 4 h 、l p s 8 h 、l p s1 2 h 、l p s 2 4 h4 个亚组，每组6 只。 2 、大鼠内毒素血症模型的建立 实验前晚大鼠禁食水1 2 小时，l p s 组大鼠腹腔注射l p s 0 1 l u k g 1 l l p 对照组 腹腔注射等量生理盐水。按照4 ，8 ，1 2 ，2 4 小时时间段分别处死大鼠，取左肾髓 质组织液氮冷冻，右肾髓质组织4 多聚甲醛固定，并石蜡包埋切片备用。 3 、免疫荧光方法检测肾髓质中水通道蛋白2 的表达 石蜡切片常规脱蜡，蒸馏水冲洗，采用酶消化法进行抗原修复，( o 1 胰蛋白 酶消化5 分钟) 。固定液固定3 0 分钟，去除固定液，t b s t 洗涤3 次，每次3 分钟， 封闭液封闭6 0 分钟，滴加按照l ：1 0 0 稀释的一抗，4 1 2 孵育过夜。去除一抗，洗 涤液洗3 次，每次3 分钟。滴加1 ：1 0 0 0 浓度稀释的荧光标记二抗，作用6 0 分钟， 洗涤3 次，每次3 分钟，荧光显微镜下观察，阳性结果判定：阳性判断标准以出 现绿色荧光为阳性。 4 、w e s t e r nb l o t 方法检测肾髓质a q p 2 表达变化 ( 1 ) 配液： 浓缩胶缓冲液0 5 m o l 1t r i s h c lp h 6 8 分离胶缓冲液1 5 m o l 1t r i s h c lp h 8 8 l o 5 x t b s t r i s 6 0 5 9 ；n a c l7 3 1 9 加2 0 0 m l 蒸馏水，h c l 调p h 至7 5 ，加蒸馏 水至5 0 0 m l , 1x t b s1 0 0 m 1 5 x t b s 加蒸馏水至5 0 0 m l t 1x t b s t 每5 0 0 m l1x t b s 中加0 2 5 m lt w e e n 2 0 l 电泳缓冲液：而s3 0 3 9 ，g l y c i n e l 4 4 9 ，s d s l 0 9 ，加去离子水至1 0 0 0 m l ； l 转印缓冲液：t r i s5 8 9 ，g l y c i n e 2 9 9 ，甲醇2 0 0 m l ( 现用现加) 封闭液：5 脱脂奶粉5 9 ，1 x t b s t1 0 0 m l 10 s d s5 9 s d s 加蒸馏水至5 0 m l 3 0 a c r b i s1 4 5 9 丙烯酰胺，o 5 9 亚甲双丙烯酰胺，加蒸馏水至5 0 m l 终体积； 配胶： 1 0 分离胶( m 1 )5 浓缩胶( m 1 ) ( 2 ) 膜蛋白提取：使用p i e r c e 公司膜蛋白提取试剂盒提取膜蛋白。 ( 3 ) b r a d f o r d 法测定蛋白含量，调节各样品蛋白浓度。 ( 4 ) 加5 样品缓冲液，样品与m a r k e r 共同煮沸5 m i n ，按顺序电泳，转 膜，扫描。实验重复4 次，用q u a n t i t yo n e 软件进行图像灰度值的分析。 ( 三) 统计学处理 所有计量数据均采用均数4 - 标准差形式表示，运用统计软件s p s s l 3 0 进行分 析，尸 o 0 5 为差异有统计学意义。 圣士里 = 口7 卜 ( 一) 免疫荧光 图1 - 6 为肾髓质组织切片在l p s 作用下不同时间组的a q p 2 免疫荧光结果， 片中的绿色荧光部分为a q p 2 阳性，可以看到，随着l p s 作用时间的延长，肾髓 质a q p 2 的表达有逐渐减少的趋势，与对照组比较( 图1 ) ，4 小时及8 小时组免 疫荧光片中绿色荧光部分亮度减弱，至1 2 小时( 图4 ) 及2 4 小时( 图5 ) 荧光明 显减少。 ( 二) 各组a q p 2 表达( w e s t c mb l o t ) ： 从w e s t e r n 结可以看到，l p s 作用4 小时后a q p 2 蛋白表达已经出现明显下 调，至8 、1 2 、2 4 小时作用更加明显( 图6 ) 。表l 为各组w e s t e r nb l o t 图像灰度 值，数值用目的蛋白条带灰度值相应的i - a c t i n 条带灰度值表示。l p s 4 h 组与对 照组比较具有统计学意义( p 0 0 5 ) ；l p s 8 h 、l p s l 2 h 、l p s 2 4 h 组与对照组及l p s 4 h 组比较均有显著统计学意义( p 0 0 5 ) 。 图1 ，对照组免疫荧光照片( x 4 0 0 ) ，绿色荧光为a q p 2 阳性。 1 2 明显减弱。 l p s 4 hl p s 8 hl p s12 hl p s 2 4 h - _ 带 c 0 n 天、a q p 2 - _ _ _ ， - 1 1 a c t i n 图占各组a q p 2 表达变化( w e s t e r nb l o t ) ，a q p 2 表达l p s 4 h 组较对照组条 带变浅，l p s 8 h 、1 2 h 及2 4 h 组更加明显。 表1 ，各组灰度值比较 c o nl p s 4 hl p s 8 hl p s12 hl p s 2 4 h 4 0 1 2 7：t o 1 0 l 4 - 0 0 9 2士0 1 0 9士0 0 8 8 注ll p s 4 h 组与对照组比较具有统计学恿义( p 0 0 5 ) ： l p s 8 h 、l p s l 2 h 、l p s 2 4 h 组与对照组及l p s 4 h 组比较均有显著统计学意义( p 0 0 5 ) 。 讨论 a q p 2 位于肾集合管主细胞管腔侧和靠近管腔侧的囊泡内，是调节肾脏集合管 对水通透性的主要水通道蛋白，在调节肾脏水平衡中起重要作用。关于内毒素对 肾脏功能的影响，国内外已有不少研究。大量的研究已经报道l p s 注射后肾小管 功能改变，如在肾血流没有改变的条件下谷氨酰胺重吸收和尿氨排泄的降低。l p s 通过降低肾小管转运l 系统的亲和力和容量降低了肾小管的分泌。抑制升髓袢的离 子流量。l p s 导致的内毒素血症降低了肾素在小鼠肾近球细胞上的表达，同时降 低了其转录抑制介导的作用。g r i n e v i c hv 等制造大鼠l p s 模型证明腹腔注射细菌 l p s f l 邑导致迅速显著的尿渗透压的降低【9 】，导致肾功能的损伤。肾脏是水代谢的主 要器官，a q p 2 在肾脏中的研究对于揭示肾脏的病理生理改变具有重要作用。有报 道显示药物、缺血等引起的肾功能衰竭中a q p 2 表达明显下调，a q p 2 的这一变化 15 与肾髓质上皮细胞损伤的程度密切相关。王勇等研究梗阻性黄疸大鼠模型发现， c r e a 、b u n 水平在实验观察期间无明显变化，肾集合管a q p 2 表达出现明显异常， 解除梗阻可以使肾a q p 2 表达上调【l o l 。近期有大量文献报道，药物、缺血引起的急 性肾功能衰竭中水通道蛋白2 表达明显下调【l2 1 。这些发现使通过水通道蛋白变化 探讨肾功能损伤的研究成为可能。研究表明内毒素评价水通道蛋白在内毒素所致 肾功能损伤中的诊断价值，对早期发现肾功能损伤，进而早期诊断和治疗、减少 并发症和降低死亡率，都有重要理论和实践意义。 肾脏对水的重吸收依赖分布于肾小管的水通道蛋i 兰t ( a q p s ) 。肾脏调节体液平 衡是通过血管加压素调节集合管的水通道蛋白完成的。a q p 2 的表达与血管加压素 依赖性调节和非血管加压素依赖性调节有关。在a q p 2 基因5 端含有一个c a m p ， 调节a p q 2 基因转录可增j j i a q p 2 的含量。具有高c a m p 磷酸二脂酶活性和低c a m p 的小鼠，a q p 2 表达水平较低，并出现严重多尿。说明c a m p 参与a q p 2 表达水平的 调节。a q p 2 在胞浆c 末端包含一个p k a 磷酸化位点( s e t 2 5 6 ) 。对转染的细胞用血管 加压素处理，使a q p 2 的膜表达和水通透性增加了，表明对血管加压素诱导a q p 2 从胞内小泡穿梭至细胞膜，p k a 介导的s e r 2 5 6 磷酸化非常关键。a q p 2 的磷酸化或 去磷酸化参与调节a q p 2 在细胞膜与胞内小泡之间的穿梭。小泡靶向受体，即 s n 6 眦蛋白，在突触小泡靶向作用，对接和融合中起重要作用。v a m p 2 ，是一种 小泡s n a r e ，与a q p 2 胞内小泡有关。s n a i 砸小泡靶向受体可能在血管加压素调 节的a q p 2 穿梭中起作用。血管加压素对水通道蛋白的调节主要有两种方式，即瞬 时调节和长期调节。瞬时调节主要是水通道蛋白在细胞内与细胞膜之间的穿梭。 长期调节包括蛋白含量的改变和穿梭。由于a q p 2 是唯一在细胞内分布受激素调节 的水通道蛋白，也是血管加压素调节集合管水通透性的靶点，所以，血管加压素 调节水通道蛋白，主要是对a q p 2 的调节。 n i e l s e n 等应用免疫电子显微镜观察灌流固定的内髓集合管，发现在血管加压 素的刺激下，a q p 2 在胞内小泡和细胞膜的分布发生了明显变化，去除血管加压 素可引起a q p 2 在细胞膜的表达减少，在胞内小泡的表达增加，为血管加压素调 节穿梭提供了直接证据。还有研究证实，血管加压素处理的大鼠，a q p 2 在集合 管主细胞顶端膜表达增加。用血管加压素v 2 受体拮抗剂处理的大鼠，a q p 2 发生 1 6 了内化，从顶端膜内化到胞内小泡。集合管对水的通透性有一种适应性调节，这 种调节与每个细胞a q p 2 数量的变化有关。断水或长期血管加压素处理大鼠引起 a q p 2 的增加并伴有集合管水通透性增加。相反，大量给水或用v 2 受体拮抗剂处 理大鼠，使a q p 2 的含量降低。a q p 2 含量的变化可影响a q p 2 在细胞膜和细胞 内之间的穿梭，说明瞬时调节对维持体液平衡是有效的。d e e n 等针对a q p 2 异常 引起的体液平衡失调的研究证实，a q p 2 在尿液浓缩中的重要作用。a q p 2 突变可 引起人遗传性肾性尿崩症，较少见。比较常见的是获得性肾性尿崩症。许多研究 集中于尿液增多是否与a q p 2 的表达和膜定位减少有关。长期给予大鼠锂可导致 a q p 2 的表达下调9 5 ，a q p 2 的膜定位水平出现了相同的改变，证实a q p 2 失调 在获得性肾性尿崩症多尿发展过程中起主要作用。低钾血症和高钙血症引起的获 得性肾性尿崩症，也与a q p 2 的表达和膜定位下调有关。 从本次免疫荧光实验结果可以看到，与对照组比较( 图1 ) ，随着l p s 作用时 间的延长，肾髓质a q p 2 的表达有逐渐减少的趋势，至1 2 d , 时( 图4 ) 及2 4 d 时( 图 5 ) 明显减少。从之后的w e s t e r n 实验结果也可以看出，a q p 2 的表达在l p s 作用早 期4 d , 时已经有明显下降，而随l p s 作用时间的延长，a q p 2 表达下调愈趋明显。 目前已知的a q p 2 调节机制为加压素，其通过两条途径调节集合管对水的通透性。 首先加压素对含有a q p 2 的载体从细胞内向管腔膜转运有影响，使集合管主细胞 膜a q p 2 数量在短时间内迅速增加，主细胞膜对水的通透性增大。其次，加压素可 长期刺激主细胞的a q p 2 合成，从而增大主细胞的转运能力。而l p s 使内毒素血症 大鼠肾髓质a q p 2 表达下调，其可能机制为：一方面通过激活t n f a 、i l 1 、i l 6 等炎性介质引发全身炎性反应综合症及感染性休克，使肾髓质有效循环血量减少， 而机体通过加压素调控a q p 2 的表达，调整水在肾脏远曲小管和集合管的重吸收； 另外，l p s 可能直接通过细胞膜的相应受体作用于细胞，调控a q p 2 的表达。近来 部分研究表明，内毒素可以通过作用于细胞膜t o l l 样受体导致细胞毒性作用，而 t o l l 样受体可能与水通道蛋白的调节有关m 川。关于l p s 调控肾集合管a q p 2 表达的具体机制目前尚未明了，有待进一步的研究。 研究表明，a q p 在肾脏的表达变化，不仅对维持肾脏正常的尿液浓缩功能有重 要作用，而且许多肾脏疾病均与a q p 的原发性或继发性异常有关。研究发现，在常染 1 7 色体显性遗传性多囊肾中，a q p i 和a q p 2 广泛存在于病变的。肾小管上皮细胞内，促 进了液体进入囊泡及病变的发展。而新近的研究也表明，肾性尿崩症的分子基础在 于a q p 2 基因突变，a q p 2 的合成改变及分布改变与获得性尿崩症有关。此外，资料 显示，水通道功能紊乱与泌尿道梗阻、急性肾功能衰竭时尿液浓缩缺陷、稀释性低 钠血症以及顺铂导致的尿液浓缩功能障碍相关。进一步研究在这些病理情况下 a q p 的改变，无疑将有助于从分子水平了解这些疾病的病理机制，从而为今后以 a q p 为靶点的临床治疗提供更有效的方法。 结论耋i 目f 匕 通过大鼠内毒素血症模型的建立，证实了l p s 可以造成肾髓质的损伤，而l p s 可以早期导致大鼠肾髓质a q p 2 表达下调，并且其作用强度随时间延长而增加。 1 8 论文二 内毒素对大鼠肾集合管上皮细胞的作用 月u罱 细胞凋亡是机体清除多余、变异或恶化细胞的一种主动，程序化生理过程。 该过程的正常与紊乱与机体进行新陈代谢，保持自身相对稳定以及肿瘤发生等密 切相关。细胞凋亡在急性肾功能衰竭( a r f ) 中起重要作用。既往研究认为，急 性肾小管上皮细胞坏死、梗阻、小管液回漏是a r f 发生的主要机制。但经临床肾 脏活检和实验研究证实的轻度或少量的急性肾小管坏死常常与病人所表现出的严 重肾功能障碍相矛盾。在急性缺血和毒性肾损伤的a r f 动物模型中，细胞凋亡发 挥重要作用【1 5 】。在甘油、缺血等f 1 6 ，1 7 】致大鼠肾功能衰竭实验及临床肾功能衰竭病 人肾活检标本中，均观察到肾脏细胞凋亡现象，提示细胞凋亡在肾功能损害过程 中发挥重要作用。临床急性肾功能损害的病人的肾脏活检示肾小管坏死的同时亦 伴有细胞凋亡【1 8 , 1 9 。有研究表明肾小管细胞凋亡与血浆内毒素水平变化成显著正 相关，并推测内毒素是导致肾脏细胞发生凋亡的直接原因，保护性凋亡相关蛋白 表达下降及促凋亡蛋白表达增加可能是细胞凋亡发生的生物学因素1 2 0 2 1 1 。大量研 究表明，细胞凋亡过程中，一些基因家族及其产物起着十分重要的作用，但有关水通 道蛋e t ( a q u a p o r i n s ，a q p s ) 对细胞凋亡的作用尚不清楚。细胞凋亡期间水的运动主 要是通过a q p s 实现的，而且a q p s 在细胞凋亡的启动