（参考课件）生物技术制药-生物技术药物的开发和质量控制.ppt

生物技术制药BiotechnologicalPharmaceutics,第二课生物技术药物的开发和质量控制,生物技术药物的开发和质量控制,主要内容生物药物开发的基本流程生物药物的毒理学简介生物药物常用的分析检测方法生物技术药物的质量控制要求掌握生物技术药物常用的分析检测方法了解生物技术药物质量控制的主要内容,生物技术药物的开发和质量控制,新药开发的一般流程,新药发现,体外试验,专利申请,临床试验,审批和认证,生物技术药物的开发和质量控制,新药发现的技术组合化学（combinatorialchemistry）方法组合化学是一门将化学合成、组合理论、计算机辅助设计及机械手结合一体，并在短时间内将不同构建模块根据组合原理，系统反复连接，从而产生大批的分子多样性群体，形成化合物库（compoundlibrary），然后运用组合原理，以巧妙的手段对库成分进行筛选优化，得到可能的有目标性能的化合物结构的科学。组合化学能够大大加快化合物库的合成及筛选速度，从而大大加快了新药的研制速度,生物技术药物的开发和质量控制,新药发现的技术基因组学基因组学是对一个生物体的整个基因组的系统性研究。核心目标是将细胞的全部DNA进行测序，绘制基因组排序的物理图谱，对各种基因和非编码区在基因组中精确定位基因组提供了机体可能产生的各种蛋白质的全套序列信息蛋白质组学蛋白质组是指由一个细胞或组织的基因组在某一特定环境下的某一时刻所表达的全部相应的蛋白质目的是提供正常人和病体中总体蛋白质的结构、功能及调控的详细信息,生物技术药物的开发和质量控制,临床前试验动物试验给药途径研究口腔、肺部、黏膜系统、皮肤药物代谢动力学研究药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄的过程药效学研究药物对不同细胞/器官类型的影响、作用毒理学研究研究药物对生命有机体的有害作用，即副作用,生物技术药物的开发和质量控制,新药专利的申请为什么要申请专利对新药进行知识产权的保护专利保护的力度强，范围广保护的范围包括产品以及制备工艺和用途；不仅保护生产和使用，还保护销售和进出口专利的独占性未经专利权人的许可，严禁以同样的产品出售获利目的在于防范仿制药品对专利药品的侵权保护时间长与药品有关的发明只能申请发明专利，保护期长达20年,生物技术药物的开发和质量控制,临床试验人体试验临床试验指任何在人体（病人或健康志愿者）中进行药物的系统性研究，以证实或揭示试验药物的作用、不良反应及/或试验药物的吸收、分布、代谢和排泄，目的是确定试验药物的疗效与安全性临床试验三阶段（I期、II期、III期）,生物技术药物的开发和质量控制,新药的审批FDA的职权FDA：Food&DrugAdministration食品和药物管理局大多数时候特指美国食品和药物管理局职责是确保本国生产或进口的食品、化妆品、药物、生物制剂、医疗设备和放射产品的安全上述产品必须经过FDA检验证明安全后，方可在市场上销售FDA有权对生产厂家进行视察、有权对违法者提出起诉SFDA：StateFood&DrugAdministration国家食品药品监督管理局（中国）,生物技术药物的开发和质量控制,美国FDA负责药物、器械和食品的分管机构,生物技术药物的开发和质量控制,FDA药品评价和研究中心审核新药申请的过程,FDA还可能向技术委员会咨询，但技术委员会通常不参与评价。,生物技术药物的开发和质量控制,我国生物技术药物开发和注册程序,生物技术药物的开发和质量控制,我国生物技术药物开发和注册程序,生物技术药物的开发和质量控制,名词GLP：GoodLaboratoryPractice药物非临床（实验室）研究质量管理规范。它明确规定药物试验的范围，包括单次给药的毒性试验、反复给药的毒性试验、生殖毒性试验、致突变试验、致癌试验、各种刺激性试验、依赖性试验，以及与评价药品安全性有关的其他毒性试验核心内容是药物的体外毒理学研究GLP对进行药品非临床研究的场所、设施、人员、受试对象（动物等）、原料和试验方法等方面均作出严格的规定各国均制定了适用于本国的GLP文件，我国的药物非临床研究质量管理规范从1994年开始实施，现行的GLP是经修改后于2007年1月1日起实施的,生物技术药物的开发和质量控制,名词GCP：GoodClinicalPractice药品临床试验质量管理规范。是一种对涉及人类受试者的临床试验的设计、实施、记录及报告的国际性道德和科学质量标准，是临床试验全过程的标准规定，具体内容包括方案设计、组织实施、监查、稽查、记录、分析总结和报告目的：保证临床试验过程的规范性，保证试验结果的科学可靠，保护受试者的权益并保障其安全任何药物在获得批准之前，都必须完成临床试验，包括I期、II期和III期临床试验，否则无法得到批文我国的GCP制度从1998年开始试行。现行的GCP是2003年9月1日起实施的版本,生物技术药物的开发和质量控制,名词GMP：GoodManufacturePractice药品生产质量管理规范，对药品生产和销售等全过程的各个环节均作出严格的规定，涉及人员、厂房、设备、原料、加工过程、检验、包装、销售、运输、用户意见及反应处理等诸方面目的：最大限度降低生产过程中出现的差错，保证药品的安全和有效我国卫生部1988年正式颁布药品生产质量管理规范；我国现行的药品生产质量管理规范认证管理办法是由SFDA颁布执行，2005年10月1日生效,生物技术药物的开发和质量控制,生物药物的毒理学简介药物毒理学是研究药物在一定条件下，可能对机体造成的损害作用及其机理的一门科学目的：对新药上市前进行安全性评价和危险性评估，保证药品在常用剂量下出现尽可能小的毒副作用几个毒理学名词：毒性（toxicity）：指理化或生物物质在一种生命有机体中可能产生的任何有毒有害作用毒物（toxicant）：通常指人工制造的毒性物质毒素（toxin）：一般指天然产生的毒性物质,生物技术药物的开发和质量控制,药物中毒的特征量效关系（dose-effectrelationship）药物的毒性效应与剂量在一定范围内成比例关系，称为量效关系毒性效应强弱呈连续增减的量变，称为量反应因服用剂量过大而立即发生的毒性作用称为急性毒性因长期用药后逐渐发生的毒性作用称为慢性毒性有些毒性效应只能用全或无、阴性或阳性表示，称为质反应,生物技术药物的开发和质量控制,药物中毒的特征量效曲线左右对称的S形曲线，在最大效应的50%的位置斜率最大绿线：药效的量效曲线红线：毒性的量效曲线,最大效应（）,对数剂量,生物技术药物的开发和质量控制,药物中毒的特征半数有效量（ED50：medianeffectivedose）在量效曲线上，能引起50%的动物或实验标本产生药效的浓度或剂量半数致死量（LD50：medianlethaldose）在量效曲线上，能引起50%的动物或实验标本产生中毒死亡效应的浓度或剂量治疗指数（TI）某一种药物对同一种实验对象的LD50和ED50的比值用来估计药物的安全性，数值越大表明此药物越安全,生物技术药物的开发和质量控制,药物中毒的特征部分物质的LD50数据,生物技术药物的开发和质量控制,药物毒性作用的类型变态反应（过敏反应）是一种免疫反应。非肽类药物作为半抗原与机体蛋白结合后，经过敏感化过程而发生的反应反应因人而异，反应的严重程度差异很大常见于过敏体质病人某些药物在用药前，可以通过做皮肤过敏试验来发现某些类型的过敏反应典型例子：青霉素注射前的皮试,生物技术药物的开发和质量控制,药物毒性作用的类型毒性反应在剂量过大或药物在体内蓄积过多时对用药者各脏器或组织发生的危害性反应一般比较严重，但可以通过临床前研究而预知，也应该避免在临床发生急性毒性一般多损害循环、呼吸及神经系统慢性毒性一般多损害肝、肾、骨髓、内分泌系统氨基糖苷类抗生素的耳毒性和肾毒性四环素对骨骼和牙齿生长的抑制氯霉素抑制骨髓造血功能,生物技术药物的开发和质量控制,药物毒性作用的类型致癌性是长期用药产生的毒性，主要通过损伤遗传物质产生肿瘤化学致癌与多种修复失败因素及各种修复机制功能障碍有关致突变与遗传毒性用药后引起遗传物质损害而产生遗传突变，影响本人及后代染色体畸变：染色体数目与结构的变化生物大分子损伤：DNA中的碱基取代和移码突变往往表现为恶性肿瘤,生物技术药物的开发和质量控制,药物毒性作用的类型生殖毒性和发育毒性生殖毒性是用药后对生殖系统及与生育相关的神经系统、内分泌系统产生的毒性发育毒性关注药物对胚胎产生的影响，体现为出现畸胎、形态异常及生理异常等典型案例：1960年代“反应停事件”反应停是抗妊娠反应的镇静药沙利度胺的俗称。孕妇在怀孕一二个月之间，服用了反应停的母亲生出畸形儿。这种婴儿手脚比正常人短，甚至根本没有手脚。截至1963年在世界各地由于服用该药物而诞生了12000多名这种形状如海豹一样的可怜的婴儿。这种药物的(R)-构型是安全有效的，而(S)-构型被妊娠妇女服用后却能造成短肢畸胎。,生物技术药物的开发和质量控制,药物毒性作用的类型1960年代“反应停”事件,生物技术药物的开发和质量控制,药物毒性作用的类型特异质反应由于用药者有先天性遗传异常，对某些药物反应特别敏感，出现的反应性质和常人不同这是一种药理遗传异常所致的反应，不是免疫异常反应，没有预先的致敏过程实例红细胞内缺少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，服用抗疟疾药物伯氨喹的时候，由于不能迅速补充NADPH，因此不能保护红细胞膜而引起溶血，并因为不能将高铁血红蛋白还原为亚铁血红蛋白而引起高铁血红蛋白症（血液携带氧气的效率低，引起机体缺氧）。,生物技术药物的开发和质量控制,药物毒性作用的机制药物毒性作用发展的潜在阶段,生物技术药物的开发和质量控制,药物毒性作用的机制在给药部位引起的毒性药物仅仅存在于机体的关键部位而没有与靶分子相互作用这种毒性是药物的直接毒性终毒物与靶分子反应：毒性发展继发步骤药物毒性最初经由终毒物与靶分子反应的特殊介导，继而呈现一系列继发的生化反应，最终导致生物组织各个水平的功能障碍或损伤毒性是由终毒物和靶分子反应而被激发的,生物技术药物的开发和质量控制,终毒物与靶分子反应：毒性发展继发步骤,生物技术药物的开发和质量控制,药物毒性作用的机制细胞功能失调导致毒性,生物技术药物的开发和质量控制,药物毒性作用的机制错误修复许多药物能改变生物大分子的结构，如果这些大分子未经修复或修复错误，将导致机体高水平的损害修复可以发生在分子层面、细胞层面和组织层面修复错误或修复失败导致的毒性组织坏死：分子损伤不可逆纤维症：一种以异常组分在细胞外过度沉积为特征的病理状态，主要原因是修复不全。如肝硬化、矽肺等致癌：DNA修复失败或细胞凋亡失败,生物技术药物的开发和质量控制,生物技术药物的分析检测电泳分析（electrophoresisanalysis）凝胶色谱分析（gelchromatographyanalysis）酶分析法（enzymeassaymethod）酶活性测定底物测定免疫分析（immunoassay）,生物技术药物的开发和质量控制,电泳分析法电泳（首先是一种分离方法）带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象利用不同带电粒子在电场中具有不同的迁移率而分离粒子间的分离程度与电荷性质及分子量有关利用电泳分析方法测定相对分子质量是一种参比分析法生物技术药物常用的电泳分析手段SDS-PAGE蛋白质类药物琼脂糖凝胶电泳核酸类药物等电聚焦与二维电泳蛋白质组分析毛细管电泳,生物技术药物的开发和质量控制,电泳分析法SDS-PAGE蛋白质亚基解离、变性，游离成单独的肽链用SDS掩蔽蛋白质表面的电荷，使所有肽链均带上相同密度的负电荷，因此肽链在聚丙烯酰胺凝胶中迁移的速率只取决于肽链的相对分子质量当肽链的相对分子质量在15,000200,000范围内时，其迁移率与其相对分子质量的对数值呈线性关系用已知相对分子质量的标准蛋白（marker）作为参比，可以测得待测蛋白亚基的相对分子质量,生物技术药物的开发和质量控制,电泳分析法SDS-PAGE分析结果示例（条带经考马斯亮蓝R250染色）,生物技术药物的开发和质量控制,电泳分析法琼脂糖凝胶电泳核酸分离及相对分子质量测定的首选方法核酸片段在琼脂糖中的迁移率取决于核酸分子大小和形状核酸片段在琼脂糖凝胶中的迁移率与其相对分子质量的对数值成反比DNA的构型对迁移率产生很大的影响，迁移率按从大到小依次为：共价闭合环状DNA线型DNA开环的双链环状DNA,生物技术药物的开发和质量控制,电泳分析法琼脂糖凝胶电泳分析结果示例（在紫外线照射下，条带因含有荧光染色剂而发光）,生物技术药物的开发和质量控制,电泳分析法等电聚焦与二维电泳测定蛋白质的等电点利用特殊的缓冲液在电场中形成由阳极向阴极逐步增加的pH梯度，当蛋白质样品加入到这一体系中后，不同的蛋白质即移动并聚焦于与其等电点相当的pH值的位置上分辨率很高，可以区分出0.010.02pH单位的蛋白质，并具有浓缩聚集作用，几乎无条带扩散现象在等电聚焦的基础上朝垂直方向进行SDS-PAGE，即得到二维电泳，用于蛋白质组的分析,生物技术药物的开发和质量控制,电泳分析法二维电泳图谱示例（银染色）,生物技术药物的开发和质量控制,电泳分析法毛细管电泳以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的分析方法淌度：单位场强下离子的平均电泳速度优点：毛细管能有效散热，避免因电流产生的热量导致的区带扩散，因此可以使用高电压，提高了分辨率和灵敏度，加快分析速率毛细管电泳兼有色谱技术和电泳技术的特点，常用于微量分析和痕量分析,生物技术药物的开发和质量控制,电泳分析法毛细管电泳,生物技术药物的开发和质量控制,凝胶色谱分析法测定大分子相对分子质量的一种常用方法，可以测定大分子相对分子质量的分布，尤其是多糖由于不同的大分子具有不同的空间尺寸，因此它们在凝胶层中移动的路径不同流动相：分子很小，可以自由出入体积大的分子：渗入凝胶的大孔，但不能进入小孔，在凝胶内部保留时间短；或者完全无法进入凝胶孔隙而被排斥体积小的分子：可以渗入大孔和小孔，在凝胶内部保留时间长，不易洗脱大分子优先于小分子被洗脱,生物技术药物的开发和质量控制,t1,t2,t3,t0,生物技术药物的开发和质量控制,酶分析法酶分析法是利用酶的催化反应进行待测物测定的一类分析方法酶活通常用一定条件下催化某一化学反应的速率（单位时间内转化的底物量或产物的生成量）来表示，因此通过测定反应中底物的减少量或产物的增加量来测定酶活性酶活力的测定药用酶的检测底物浓度的测定,生物技术药物的开发和质量控制,酶分析法酶传感器结构,葡萄糖氧化酶电极示意图,生物技术药物的开发和质量控制,酶分析法传感器上的固定化酶,生物技术药物的开发和质量控制,酶分析法酶传感器举例葡萄糖的检测将葡萄糖氧化酶（GOD）用戊二醛交联在聚丙烯酰胺凝胶中做成敏感膜，以Pt、Pb分别为阴阳电极，在Pt电极表面覆盖一层透氧气的聚四氟乙烯膜，外层包覆一层葡萄糖氧化酶膜反应原理由于氧浓度的下降，相应电极的还原电流减少。通过检测到的电流值的变化而确定葡萄糖的浓度。,生物技术药物的开发和质量控制,免疫分析免疫分析法是利用抗原/抗体之间的特异性结合作用来选择性识别和测定可作为抗体或抗原的待测物的分析方法特点：高特异性，高敏感性免疫分析法的应用药物代谢动力学的研究和生物利用度的测定临床检测（特别对不良反应较重、治疗指数较小的药物）测定细胞培养液中有效成分的含量，对生产过程的在线监测药物中特定微量杂质的检测,生物技术药物的开发和质量控制,免疫分析抗原（antigen，Ag）能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质特征1：具有免疫原性抗原进入机体内，能促使机体产生循环抗体或改变免疫细胞的反应性特征2：具有抗原特异性能选择性地与某种抗体结合并发生作用完全抗原同时具有免疫原性和抗原特异性的物质不完全抗原或半抗原（hapten）只能与特定的抗体作用但不引起机体免疫应答的简单分子,生物技术药物的开发和质量控制,免疫分析抗体（antibody，Ab）抗体是机体经抗原刺激，由免疫细胞产生的一组免疫球蛋白具有高度的特异性，一般只能与相应的抗原起专一的反应功能：防御外界物质对机体的侵袭免疫球蛋白家族（5种）最常用的抗体是免疫球蛋白G（IgG），它在血清免疫球蛋白中的含量最高，约占70%,生物技术药物的开发和质量控制,免疫分析免疫球蛋白家族,生物技术药物的开发和质量控制,免疫分析IgG的结构,生物技术药物的开发和质量控制,免疫分析标记免疫分析技术将试剂抗原/抗体用具有很高检测灵敏度的标记物标记，发生免疫反应后测定反应物或复合物中标记物的量的变化，间接测定待测抗原或抗体的含量/浓度。标记的原因：反应物或产物不可测，或检测灵敏度太低标记后：可测，检测灵敏度放大标记必须在测定之前进行标记物种类：放射性同位素、荧光染料、酶、化学发光试剂,生物技术药物的开发和质量控制,免疫分析酶联免疫吸附分析法（ELISA）（enzyme-linkedimmuno-sorbentassay）ELISA是将抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合而发展的一种免疫分析方法ELISA的基本原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性夹心式的结构,生物技术药物的开发和质量控制,免疫分析抗体抗原抗体夹心式结构,生物技术药物的开发和质量控制,免疫分析抗体抗原抗体夹心式结构streptavidin-HRP：链霉亲和素-辣根过氧化物酶链霉亲和素能和生物素特异性结合,生物技术药物的开发和质量控制,免疫分析增加第二检测抗体（抗抗体）的夹心法,生物技术药物的开发和质量控制,免疫分析间接测定法,生物技术药物的开发和质量控制,免疫分析ELISA的基本操作步骤,生物技术药物的开发和质量控制,生物技术药物的质量控制药物质量标准的研究目标研究目标产品的均一性建立目标产品的生物学活性的测定方法研究建立目标产品免疫学活性、效价的测定方法及质控标准研究建立国家标准品或参考品建立目标产品生产相关杂质限量的分析方法和标准在以上研究基础上制定出保证上述生物技术产品临床安全有效、与世界卫生组织（WHO）标准相一致的质量控制标准和规范化的检定方法,生物技术药物的开发和质量控制,生物技术药物质量评价和控制的主要内容a)活性和比活性（力）生物技术药物通常不用重量单位来表征，而采用活性来表征例如：药用酶的活性，以催化底物S转化或生成产物P的变化率表示活性的标准计量需要使用已知效价的标准品或参考品比活性（力）是单位剂量蛋白质（酶）的生物学活性，间接反映了药用蛋白质空间结构的改变引起的药效变化,生物技术药物的开发和质量控制,生物技术药物质量评价和控制的主要内容b)纯度和杂质的检测有效成分含量至少应大于95%杂质的鉴定分析主要针对蛋白质杂质和非蛋白质杂质蛋白质杂质：宿主细胞蛋白和培养基中的蛋白成分，以及目标蛋白的降解及错误折叠的产物非蛋白质杂质：宿主及杂菌的核酸、内毒素、热原以及生产过程中引入的抗原性小分子物质等残留溶剂的检测,生物技术药物的开发和质量控制,生物技术药物质量评价和控制的主要内容c)理化性质鉴定相对分子质量测定吸收光谱测定生物大分子的组成和序列分析其他理化性质蛋白质药物的等电点测定和免疫原性分析核酸类药物的杂交试验，杂交分子解链温度（Tm）的测定,生物技术药物的开发和质量控制,生物技术药物质量评价和控制的主要内容d)生物利用度的评价生物利用度（bioavailability）药物制剂中活性成分或治疗组分被吸收并运送到作用部位的速度和程度生物利用度与药物的剂型、给药方式的关系十分密切药物在组织中的分布药物的油/水分配系数（logKo/w）给药途径与药物降解途径,生物技术药物的开发和质量控制,生物技术药物质量评价和控制的主要内容e)生物技术药物稳定性的评价生物技术药物大多是高分子物质，具有空间高级结构，对温度、光、pH、湿度等外界因素变化比较敏感，因此，生物技术药物的稳定性评价是一项非常重要的内容物理稳定性：药品是否因物理变化而引起稳定性改变化学稳定性：药品是否与外界物质（水、光、酸、碱、CO2等）或制剂中组分发生反应而引起稳定性变化微生物稳定性：药品是否受细菌、霉菌等利用、降解而变质,生物技术药物的开发和质量控制,生物技术药物质量评价和控制的主要内容f)生物技术药物分析方法的评价目的是证明所采用的分析检测手段能够适用于这种药物的分析检测要求准确度（accuracy）精密度（precision）专属性（specificity）灵敏度（sensitivity）线性范围（linearrange）和线性度（linearity）稳定性（stability）和耐用性（robustness）,生物技术药物的开发和质量控制,生物技术药物质量评价和控制的主要内容g)生物技术药物的安全性评价通常在临床前进行，它需要借助毒理学的研究结果，但药物的安全性评价还涉及开发和生产过程及其他过程生物技术药物的安全性问题包括对环境的和对人体的安全性两方面涉及社会伦理道德方面的问题（基因治疗、干细胞技术等）药物毒理学评价生产过程的工艺控制及工艺稳定性，以及对周边环境和操作人员的影响,生物技术药物的开发和质量控制,药物质量控制实例DNA重组制品原材料质量控制生产过程质量控制最终产品质量控制,生物技术药物的开发和质量控制,药物质量控制实例DNA重组制品1)原材料质量控制(a)表达载体和宿主细胞表达载体的详细资料（载体来源、构建方法、遗传特性、抗性标记、酶切图谱等）宿主细胞资料（细胞株/系名称、来源、传代历史、基本生物学特征等）载体引入宿主的方法和存在方式（是否整合到染色体、基因拷贝数、遗传稳定性等）(b)克隆基因的序列包括组成基因、启动子附近控制区等各段序列(c)启动和控制克隆基因表达所采用的方法、表达水平,生物技术药物的开发和质量控制,药物质量控制实例DNA重组制品2)生产过程质量控制(a)细胞库主细胞库、生产细胞库同一时间、批次、人员，不得同时操作两种不同的细胞/菌种提供在保存和复苏条件下宿主和载体的稳定性证据采用新的种子批时，重新作全面鉴定对于细胞的致肿瘤性应有详细报告,生物技术药物的开发和质量控制,药物质量控制实例DNA重