（细胞生物学专业论文）细菌内毒素体外诱导鲫鱼淋巴细胞凋亡及其机制初步研究.pdf

致谢 首先要把我衷心的感谢献给我尊敬的导师一一邵健忠老师和项黎新老师，是 你们的支持和鼓励，你们的耐心和热情让我能够实现顺利成长的愿望。三年来， 两位老师严谨的治学态度，渊博的专业学识，谦逊的处世原则，特别是孜孜以求 事业的精神和宽厚待人的作风时时刻刻感动感染我。我很幸运能在你们的关怀熏 陶下进步成长，我将受益终生。无论未来怎样，我都会自豪地铭记：我来自 s h a o ，l a b 一个很多可爱天才聚在一起的温馨世界。 感谢实验室的兄弟姐妹们，和你们在一起，我们共同营建了实验室严肃认真 的学习氛围、轻松愉悦的生活气息；和你们在一起，我感受幸福、感悟成长。非 常感谢师弟洪旭涛、陈烨，师妹王惠菊、陈小永，是你们的帮助让我走出实验的 困境，顺利完成毕业论文工作! 感谢师兄刘军为我毕业论文打下的良好基础以及 在实验操作过程中所传授的经验乖帮助! 同时感谢实验室的其他兄弟姐妹：师姐 冯碧、孟真、潘雪霞、刘欣梅；师兄佥红健、周庆军；师妹胡若真、林慧芳、温 轶、陈颖；师弟黄洪敏、董伟仁、方玮、黄伟! 有很多的感动和收获是你们给予， 我一生珍惜；有很多的遗憾和愧疚我已带不走，只好请你们慢慢淡忘。相信未来 我会常常想起一一四楼的团结、和谐、快乐总是生科院一道亮丽风景! 还要感谢在我学习上、生活中给予很多快乐和帮助的寝室兄弟们，和你们一 起在球场上、牌场上、酒场上战斗的情景将是我未来美好的回忆。感谢在实验上 给过我很多帮助的陈汉民老师、张杭君同学、刘晓月同学。 最后要感谢时刻关注我成长的家人，你们的信任和希望、你们的无私付出和 坚定支持是我前进的巨大动力。特别要感谢我的妻子慧慧，无论我怎样的艰难失 意，却总有你在背后支持鼓励，默默奉献。我今天所有的收获和明天所有的成绩 都与最爱的你一起分享! 再次衷心的感谢所有关心、支持和帮助过我的亲人、老师和朋友们! 过去的 岁月，有你们陪我走过，我不孤独! 人生会很精彩，你们将是我这一生的财富和 记忆! ! 中文摘要 以鲫鱼头肾淋巴细胞为研究对象，用细菌内毒素体外诱导其凋亡，通过荧光 染色、d n a 电泳、t u n e l 、电镜以及流式细胞仪分析等多种凋亡检测方法，检测 凋亡发生情况。结果显示，在1 0 i j - g m l 以上浓度的内毒素作用1 8 后或以1 0 0 u g m l 浓度的l p s 作用6 h 以上，淋巴细胞即可出现明显的凋亡形态学变化，表现 为染色质凝集和周边化，核断裂，形成凋亡小体，d n a 发生特异降解产生典型 的“梯状”电泳图谱，呈现t u n e l 阳性标记等，并通过流式细胞术证实这种凋 亡具有时间和剂量的依赖性。 在确证内毒素能诱导鲫鱼淋巴细胞凋亡的基础上，对内毒素引起淋巴细胞凋 亡的信号转导机制和基因表达变化作了研究。结果显示，经不同浓度的内毒素诱 导不同时间后，鲫鱼淋巴细胞内线粒体膜电位( 甲) 和a t p 含量明显f 降，而 氧自由基浓度明显上升，提示线粒体死亡通路可能是l p s 诱导鲫鱼淋巴细胞凋亡 的机制。在凋亡相关基因的研究中，发现在1 0 0ug m ll p s 诱导6 、1 2 、2 4 h 后 发生凋亡过程中，细胞内相关基因的表达发生了不同的变化。其中t n f a 基因 的表达在正常对照组和三个时间段的诱导组中没有发生明显变化，而b c l 家族的 抑制凋亡基因b c l - 2 和促凋亡基因b a x 的表达量发生了显著的变化，b c l 一2 随着 诱导时闻的延长表达下降，丽b a x 表达增加。对n o 合成酶( n o s ) 基因表达韵检 测发现，与正常对照组相比，n o s 基因在诱导组中表达的变化不明显，提示n o 与淋巴细胞凋亡的关系不大。鱼类淋巴细胞凋亡过程中t n f 一和n o s 基因表达的 变化不同于巨噬细胞的研究结果，提示内毒素诱导淋巴细胞凋亡的机制不同于巨 噬细胞。 总结实验结果，我们认为内毒素能在体外直接诱导鱼类淋巴细胞凋亡，而凋 亡的发生涉及线粒体信号通路和b c l 家族相关基因的调控，内毒素诱导淋巴细胞 凋亡的分子机制不同于巨噬细胞。 关键词：细菌内毒素；鲴鱼；淋巴细胞：凋亡；线粒体膜电位( 掣) ：a t p 氧自由基：线粒体凋亡通路；n o s 基因；b c l 家族基因：调控 a b s t r a c t i nt h ef i r s tp a r to fo u rp r e s e n ts t u d y , t h ek i d n e yl y m p h o c y t e sf r o mc a r a s s i u s a r u a t u si sc h o o s e da st h er e s e a r c hm a t e r i a l t h e s ec e l l sa r ei n d u c e db yd i f f e r e n tl p s c o n c e n t r a t i o n sa n du n d e rd i f f e r e n tt i m ei nv i t r o t h ea p o p t o t i ce f f e c t so fl p sa r e d e t e c t e db yv a r i o u ss k i l l ss u c ha sf l u o r e s c e n c es t a i n i n g ，t u n e lr e a c t i o n ，d n a a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，e l e c t r o nm i c r o s c o p ya n df l u o r e s c e n c ea c t i v a t e d c e l l s o r t i n g ( f a c s ) o u rr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t f i s hl y m p h o c y t e sw o u l db ea p o p t o t i c u n d e rd i f f e r e n tl p sc o n c e n t r a t i o n s ( a b o v e10ug m 1 ) a n dd i f f e r e n tt i m e ( a b o v e6 h ) i n d u c i n g ，w h i c hi sc h a r a c t e r i z e db yc o n d e n s a t i o na n dm a r g i n a t i o no fc h r o m a t i n ，t h e f o r m a t i o no fa p o p t o t i cb o d i e s t h ed n a f r a g m e n tb ya g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s s h o w e dt h et y p i c a ll a d d e rp a t t e r na n dd n as t r a n d3 - o hn i c ke n dw a sd e t e c t e db y t u n e lr e a c t i o n i na d d i t i o n ，l p si n d u c e dl y m p h o c y t ea p o p t o s i si nt i m e a n d d o s e d e p e n d e n tm a n n e ra n a l y s i s e db yf a c sw i t ht h ep is t a i n i n g i np a r ti i 。姒t lt h ee v i d e n c eo fl y m p h o c y t e sa p o p t o s i si n d u c e db yl p s ，w e i n v e s t i g a t e d w h e t h e rm i t o c h o n d r i a la p o p t o t i ep a t h w a yr e g u l a t e dt h el y m p h o c y t e a p o p t o s i sa n dw h a th a p p e n e di na p o p t o s i s r e l a t e dg e n ee x p r e s s i o n t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ei n t r a c e l l u t a ra t pa n dm i t o e h o n d r i am e m b r a n ep o t e n t i a lf 甲) d e c r e a s e d ，b u tt h e0 2 。i n c r e a s e d s ow ed e d u c e dt h a tm i t o c h o n d f i a la p o p t o t i cp a t h w a y d e t e r m i n e dt h e 印o p t o s i so fl y m p h o c y t e i nt h ef u r t h e rr e s e a r c h ，w ep r o v e dl y m p h o c y t em r n ae x p r e s s i o nl e v e lo f a p o p t o s i sr e l a t e dg e n ei n d u c e db y1 0 0 pg m ll p sa t6 、1 2 、2 4 hw e r en o ti nt h e s a m e c o m p a r e dw i t ht h a to ft h ec o n t r o l ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h el y m p h o c y t e m r n ae x p r e s s i o nl e v e l so ft n f aw e r en oc h a n g e sa n dt h a to fn o sw e r en o t r e m a r k a b l ed i f f e r e n te a c hi n d u c e dg r o u p ，b u tt h eb c lf a m i l y g e n eb c l - 2w a s d o w n r e g u l a t e da n db a xi su p - r e g u l a t e di n c r e a s ec o n s i s t e n t l y t h er e s u l t so ft n f a a n dn o s g e n ee x p r e s s i o ns u g g e s t e dt h a t t h em e c h a n i s mo fl y m p h o c y t ea p o p t o s i s i n d u c e db yl p si sd i f f e r e n tf r o mt h a to f m a c r o p h a g ea p o p t o s i s i na 1 1 t h em e c h a n i s mo fl y m p h o c y t ea p o p t o s i si n d u c e db yl p si sr e g u l a t e db y m i t o c h o n d r i a ta p o p t o t i cp a t h w a ya n di ti sd i f f e r e n tf r o mt h a to fm a c r o p h a g e a p o p t o s i s k e yw o r d s ：l p s ，c a r a s s i u sa r u a t u s ，l y m p h o c y t e ，a p o p t o s i s ，m i t o c h o n d f i m m e m b r a n ep o t e n t i a l ，0 2 ，a t p , m i t o c h o n d r i a la p o p t o t i c p a t h w a y ， n o s ，b c lf a m i l yg e n e ，r e g u l a t i o n 2 第一部分文献综述 内毒素及其致病机制的研究进展 内毒素( e n d o t o x i n ) 又称脂多糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e ，l p s ) ，是革兰氏阴性菌 细胞壁外膜的主要结构成分，分布在外膜的外页中，由亲水性的多糖( 0 特异性 多糖、核心多糖) 及疏水类的类脂a 构成，具有相对保守的分子结构，它与蛋 a 质、磷脂等共同构成革兰氏阴性细菌的外膜1 1 1 。对细菌内毒素的研究已有2 0 0 多年的历史，但细菌内毒素真正开始受到普遍关注却是源于1 9 世纪末对霍乱弧 菌( v i b r i oc h o l e r a ) 的研究。德国微生物学家k o c h 和p f e i f f e r 等在研究霍乱弧菌 时，发现这种革兰氏阴性菌能产生一种牢固结合在细胞上、具有生物学活性、对 热稳定的毒性成分，由于该成分与已发现的不耐热外毒素显著不同，p f e i f f e r 等 将这种热稳定物质命名为“内毒素( e n d o t o x i n ) ”。早期研究的内毒素均是细菌过 滤后含多种细菌产物的混合物。1 9 5 2 年，w e s t p h a l 和l u d e r i t z 建立了经典的分离 脂多糖方法热一酚水抽提法，将蛋白质成分与多糖和类脂成分分开，制备和 纯化出无蛋白的脂多糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e ，l p s ) ，并且证明这种物质具有粗制 内毒素的所有特性 2 1 。从此，脂多糖就成为内毒素表明其确切化学性质的名称。 最近数十年来，随着生物医学研究的迅速发展，各种免疫学、分子生物学、生物 化学、基因工程等先进技术手段的广泛应用，内毒素研究已经逐步成为生命科学 和医学研究中活跃的领域，内毒素的生物学功能、病理学作用、致病机制以及相 应治疗措施的探索正在全面展开并不断取得可喜成果。 目前证实内毒素作为革兰氏阴性菌的主要结构对细菌的生长和活力至关重 要，同时也作为革兰氏阴性菌的主要致病因子，具有重要的生理学功能和病理学 意义。近年来的凋亡研究发现，细胞凋亡作为宿主内基因调控的主动而有序的细 胞自我消亡反应，与内毒素作用于宿主细胞并导致多种l p s 疾病密切相关。 一、内毒索的生物学功能 1 ) 对细菌的保护作用 正常细菌外膜对疏水性分子的通透性极低，保护细菌内环境稳定性；如果用 e d t a 处理细菌，由于钙离子被e d t a 螫合丽导致外膜中脂多糖分子的横向作用 减弱，以及脂多糖分子从细胞壁中释放出来，从而使细胞壁中的肽聚糖层更易受 到溶菌酶消化分解，同时使外膜对许多疏水性试剂的通透性增高。脂多糖成分中 的o 抗原特异性多糖链具有亲水性、带负电荷，可以保护细菌抵抗吞噬细胞的 调理吞噬作用。o 抗原特异性多糖链的高度变异性，可以保护细菌免受宿主体内 已存在的抗体和消化酶对其的清除反应。多糖链较完整的脂多糖分子因其长链的 空间位阻效应，可阻止补体复合物攻击黏附在细胞壁上的疏水性外膜，从而避免 细菌遭受补体损害口。 2 ) 增强宿主的非特异性免疫 小剂量内毒素能激活b 淋巴细胞产生抗体：促进t 淋巴细胞的发育成熟； 激活n k 细胞活性；激活巨噬细胞，增强其吞噬和消化能力，并合成分泌干扰素、 肿瘤坏死因子等多种细胞因子，调理免疫应答反应：内毒素可以通过替补途径激 活补体，发挥补体激活的一系列生物学效应。此外。内毒素与其他可溶性颗粒抗 原一起注射入机体中，能使可溶性抗原刺激机体产生抗体的效价显著增高。所以， 内毒素可通过上述机制增强机体的非特异性免疫能力、促进粒单核细胞增殖、 增强吞噬细胞免疫功能、具有免疫佐剂活性等利于宿主机体的作用【5 】。 3 ) 可诱导内毒素耐受和非特异性感染耐受 小裁量内毒素刺激巨噬细胞等细胞后，再用较大裁量内毒素刺激，缨胞因子 的释放将大幅度减少或不分泌，可保护机体免受内毒素致死性毒性反应；而直接 以较大剂量内毒素刺激后，只能诱导微量细胞因子的释放，抵御内毒素的知识效 应，这些都反应内毒素的作用可以诱导内毒素耐受1 6 。j 。进一步的研究表明，人 为诱导内毒素耐受现象只能在一定条件下维持，一旦维持条件去除，耐受现象就 会消失，而天然内毒素耐受则与其信号转导分子的表达和性质发生变化有关，主 要表现为t o l l 样受体4 ( t l “) 基因、c d l 4 基因等一系列信号转导途径中关键 分子的基因突变失活以及n f - k b 复合物分子、蛋白激酶c 、丝裂原激活蛋白m a p 等信号转导分子的诱导性改变8 9 】。小剂量内毒索激活免疫细胞，其中n f k b 、 s t a t 等信号途径为许多细腱困子所共有。n f k b 复合勘等转录园子从胞质转位 进入细胞核内诱导其管辖的基因表达，影响其他细胞因子、病原体以及产物的信 号传导，并通过表达抑制性细胞因子产生非特异性感染耐受现象【1 0 】。 4 4 ) 诱导肿瘤坏死和细胞凋亡 内毒素可激活组织中单核一巨噬细胞、中性粒细胞、内皮细胞等分泌大量的 t n f 及集落刺激因子、y 一干扰素等细胞因子，通过受体信号转导途径诱导肿 瘤细胞发生坏死和凋亡 1 1 - 1 2 】。大剂量内毒素可以降低动物对肿瘤的抵抗力，但适 量的内毒素又可以增强机体抗肿瘤能力。内毒素还可以通过信号转导作用，激 活多个转录因子，如n f k b 、a p 1 等，促使t n f a 、i l 1 、i l 。6 等表达，进而通 过其下游的相关受体传导信号，最终激活凋亡蛋白酶( c a s p a s e ) ，诱导细胞发生 凋亡，通过细胞凋亡，影响各种组织器官的功能。 5 ) 抗辐射作用 内毒素能够增强机体抵御x 射线对抗感染能力的破坏作用，与之相关的小 白鼠实验证实这一点。经过x 射线照射杀菌因子急剧减少的小白鼠，注射内毒 素后数小时后，内毒素可通过病原体相关分子模式( p a m p ) 受体激活天然免疫， 促使细胞分泌大量炎性细胞因子，后者进一步诱导非特异性免疫应答，使非特异 性免疫力增高，杀菌因子恢复至正常水平 1 4 - 1 5 】。 6 ) 诱导白细胞粘连分子粘连到内皮细胞上 内毒索诱导整联蛋白表达增强，通过整联蛋白和细胞闻黏附分子等作用，使 白细胞黏附到血管上，促使白细胞迁移到炎症部位，分泌多种细胞因子、趋化因 子等生物学介质，并通过这些介质进一步作用，对机体产生有利或不利的多种生 物学效应发挥免疫效应【l 。 7 ) 致热性 内毒素作用于血液和组织中的单核细胞、巨噬细胞，使之分泌t n f a 、i l i 、 i l 6 等生物学介质，通过这些介质作用于下丘脑的体温调节中枢的体温调定点， 使该点的阚值上升。此时，体温凋节中枢发出神经冲动对体温进行重新调节，通 过垂体内分泌激素使代谢增加或通过运动神经使骨骼肌阵缩表现为寒战，从而使 产热增多。另一方面，还可以通过交感神经使皮肤血管及竖毛肌收缩，使排汗停 止，减少散热。通过这一综合性调节作用，使机体产热大于散热，体温升高直到 与新的体温调定点相适应瑚。 二、内毒素的病理学意义 l 内毒素与相关疾病 l p s 作为机体肠道内大量存在的革兰氏阴性茵的主要结构与机体的健康状 态密切相关。正常情况下，l p s 对机体无害，而且对维持肠道微生态平衡、肠道 屏障免疫功能、促进肠道消化、吸收功能具有重要的生理意义。但是一旦其进入 体循环，即形成内毒素血症，就会引起明显的病理生理反应。这些反应包括发热、 血管扩张、血管通透性增加、机体血压下降等，严重时可导致败血症、弥散性血 管内凝血、呼吸抑制综合症、多器官功能衰竭等多种危险临床症状甚至死亡【1 9 - 2 0 1 。 随着有创技术、免疫抑制剂、细胞毒化疗以及广谱抗生素不断使用，内毒素引起 的各种疾病发病率自2 0 世纪5 0 年代以来一直星上升趋势。目前研究的众多l p s 相关疾病，除了确证的革兰氏阴性菌脓毒症或感染性休克外，研究者认为一些局 部特定疾病的发生发展可能与l p s 的参与有关涉及范围可至消化系统、呼吸 系统、心血管系统、泌尿系统等多个系统1 2 ”。此外，l p s 在- 一，些自身免疫性疾病 ( 如类风湿性关节炎) 的发生发展中也能起一定作用。 2l p 5 的致病机制 1 ) 受体与l p s 致病 脂多糖作为革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要成分，其分子结构具有相对保守 的特性，这种保守的分子结构是病原菌致病性不可缺少的成分，对微生物生存和 致病性十分重要，能引起宿主天然免疫系统强烈反应，近年研究证实，宿主细胞 表面存在一些进化上高度保守的膜蛋白分予，正是这些分子决定着宿主细胞对病 原茵或其保守结构的识别和反应，j a n e w a y 将病原菌细胞膜上类似脂多糖的这些 保守结构称为病原菌相关分子模式( p a t h o g e na s s o c i a t e dm o l e c u l a rp a t t e r n s ， p a m p s ) ，而将识别p a m p s 的细胞膜分子统称为模式识别受体( p a t t e r nr e c o g n i t i o n r e c e p t o r s ，p r r s ) 1 2 4 】。现已发现的p r r s 主要有白细胞分化抗原1 4 、白细胞整联 蛋白、潦道夫受钵、t o i i 撵受体等；分别以膜结合蛋白形式存在 二天然免痉细斑 表面；研究表明，p r r s 在内毒素致病机制中扮演重要角色，它们把内毒素作用 于宿主细胞的信号传递至胞内，是宿主识别病原菌的“感受器”并发挥启动宿主 防御和效应功能的作用f 2 5 】。目前主要研究的p r r s 主要有：白细胞分化抗原 6 c d l 4 、白细胞整联蛋白c d l l c d l 8 、清道夫受体、t o l l 样受体t l r 4 等，它们 在内毒素致病过程中发挥不同的作用。 c d l 4 抗原是机体免疫反应过程中的关键分子之一，参与宿主的天然防御反 应，其胞外区含有多个富亮氨酸重复序歹 f j ( l x x l x l x ) ，这一结构域形成双歧1 3 折 叠与类脂作用，是c d l 4 识别并结合l p s 的关键区域。根据c d l 4 在体内存在的 形式可分为存在细胞表面的膜结合型c d l 4 ( m e m b r a n e b o u n dc d l 4 ，m c d l 4 ) 和 存在于血浆内的可溶性c d l 4 ( s o l u b l ec d l 4 ，s c d l 4 ) 。c d l 4 在细胞表面高度表 达，主要生物学活性是作为l p s 或l p s l b p 复合物的受体，它可以浓集内毒素 分子，参与受俸配体的内化过程，通过内化活动，激活细胞因子的表达，参与 核内毒素分子等物质的降解及解毒效应【2 6 1 。c d l 4 还能将配体传给相应受体，发 挥受体配体结合效应，转导内毒素信号，激活一系列酶学级联反应。另有报道， c d l 4 在参与l p s 刺激的细胞凋亡、细胞与细胞相互反应、骨重吸收、内毒素耐 受等方面龟有重要功能田1 。 c d l l c d l 8 是广泛存在于白细胞表面的一类跨膜糖蛋白，其主要效应是增 加细胞之间的亲和力，介导黏附作用，与细胞迁移有关。在内毒素作用过程中， c d tl c d l 8 是与l p s 相关的有亲和力受体，主要在白细胞上表达，它与其他的 内毒素相关整联蛋白家族成员一起组成异源性受体分子，参与l p s 信号的跨膜 传递，在某些方面存在类似c d l 4 与内毒索结合的生物学效应，在信号转导中存 在一些共同的转导系统1 28 1 。但是c d l1 c d l 8 较之c d l 4 又存在区别：c d l1 c d l 8 胞外结合l p s 后，其结构域中的胞质区并不参与起内毒索信号转导，仅仅为吞 噬活动所需的，要实现信号传递需要其他受体共同参与；l b p 能将l p s 转移给 c d l 4 ，僵尚无证据证实l b p 也能将l p s 转移给c d l l c d l 8 ；另外，c d l l c d l 8 的信号转导效应主要发生于高浓度l p s 刺激条件下，而低浓度l p s 刺激下的信 号转导只对c d l 4 具依赖性【”j 。 清道夫受体( s c a v e n g e rr e c e p t o r , s r ) 是一类具有结合被修饰低密度脂蛋白 能力的缨胞表面糖蛋白。业已证明，s r 具有受体的模式识别特性，但s r 与l p s 其他受体不同，s r 与l p s 结合后，迅速经细胞的摄粒作用，将l p s 内移到溶酶 体内，经脱磷酸和脱酰基作用，内毒素被降解和灭活，在此过程中并不引起巨噬 细胞的激活，也不释放t n f a 等细胞炎症因子，即只是参与宿主对l p s 的清除作 7 用，无激活效应口o 】。 t o l l 样受体是生物进化过程中高度保守的古老蛋白质，主要分布于淋巴细 胞、白细胞、单核巨噬细胞等细胞表面，其他细胞表面也有不同程度表达。其 胞外区主要包括一段串连的富亮氨酸重复基序( 1 e u c i n e r i c hr e p e a t s ，l r r s ) ，其 问有非l r r 序列分隔，l r r 的功能主要识别微生物的p a m p s 。胞内段由t o l l 同源结构域和分子羧基端的短尾肽组成。t o l l 同源结构域又称为t o l i i l i r ( t i r ) 同源区，是t o l l 样蛋白和i l l r 向下游进行信号转导的功能元件。在t l r 家族 成员中，t l r 4 被认为与革兰氏阴性菌及其内毒素的识别激活作用有关【3 1 1 。t l r 4 能识别多种配体，但其主要配体是l p s ，t l r 4 不仅特异性识别l p s ，而且能转 导l p s 的跨膜信号，在介导细胞l p s 反应中发挥重要作用1 3 2 i 。 2 ) 血浆蛋白与l p s 致病 l p s 进入体循环形成内毒素血症并产生病理生理反应的过程中，循环内的很 多血浆蛋白对l p s 致病机制的形成具有重要的影响，其中又以脂多糖结合蛋白、 杀菌通透性增强蛋白和一些脂蛋白为主。 脂多糖结合蛋白( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d eb i n d i n gp r o t e i n ，l b p ) 是一种存在于人 和许多动物血浆和其他液体内的耱蛋白，主要由肝细胞合成、分泌，是可溶性的 模式识别分子。l b p 与l p s 结构中的类脂a 具有高度亲和性，能够识别和结合 l p s ，促使l p s 聚集体或微团解离为l p s 单体，并形成l b p l p s 复合物，是l p s 发挥其生理学作用的重要载体1 3 引。l b p 还具有类脂转移作用，可将l p s 单体转 递给c d l 4 ，也可直接以l p s l b p s c d l 4 复合物的形式进行转递，从而显著降 低l p s 激活细胞所需要的最低浓度，增强l p s 对天然免疫系统的激活作用，产 生t n f 、t l 1 等炎性介质，介导炎症反应，造成机体损伤：l b p 也可通过调理 作用，促进l p s 被吞噬清除，减轻炎症反应，但l b p 传递l p s 、介导炎症反应 的活性较缓解炎症的活性更强1 3 “。 杀菌通透性增强蛋白( b a c t e r i c i d a l p e r m e a b i l i t y i n c r e a s i n g p r o t e i n ，b p t ) 是一 种主要存在于多型核自细胞的嗜天青颗粒中，也可微量表达于单核细胞表面的糖 蛋白。b p l 分子结构和氨基酸序列与l b p 相似( 也由4 5 6 个氨基酸残基组成) ， 虽然结构相似，但在介导l p s 与细胞作用时两者作用经常不同，w a s i l u kk r 等 【3 5 】研究证实b p i 结合l p s 后促使l p s 聚合并抑制l p s 与c d l 4 结合，从而不激 发炎症反应，而l b p 却促使l p s 解聚并激活细胞产生炎症反应：他们还证实b p i 与l p s 的亲和力要远远高于l b p 与l p s 的结合，因此b p i 可通过优先竞争结合 l p s 的作用机制，中和游离l p s 、抑制炎症介质释放，减轻内毒素血症和防止休 克发生等，阻断或降低感染时由l b p 与l p s 结合引起的病理损伤，而血清补体 成分、磷脂酶、p m n 产生的p 1 5 蛋白等可协助b p i 作用，增强其杀菌抗病活性。 此外，血浆中的一些高、低、极低密度脂蛋白也能影响l p s 的作用。他们通过 增加其他细胞对l p s 的结合或排出，改变l p s 的分布，减少靶细胞所受到的影 响，从而起到中和反应的效果，防止l p s 过度激活免疫系统，缓解失控性炎症 反应 3 6 - 3 7 】。 3 ) 细胞因子与l p s 致病 l p s 作用于体内单核巨噬细胞等免疫靶细胞后能诱导多种反应介质的过量 分泌，这些介质分子在局部或随血液播散至机体各部，对机体各组织器官造成一 系列病理效应，而细胞因子在其中的作用最为突出，t n f - a 、i l 1 、i l 一6 、i f n y 等细胞因子均与l p s 疾病的发病机制密切相关1 3 蕃】：t n f - a 是内毒素发病早期 的重要介质，用内毒素刺激辊体后，单核一巨噬细胞等组织细胞内t n f a m r n a 和血液t n f ，a 浓度均显著上升；t n f a 可通过直接促进内皮细胞黏附中性粒细 胞、单核细胞、嗜中性多型核白细胞进入炎症部位，释放细胞因子，参与和放大 全身炎症反应综合症( s i r s ) ，从而在启动l p s 诱导的炎症反应中起主导作用。 i l l 主要也是由l p s 刺激单核一巨噬细胞产生的，动物注射实验表明败血症可 引起i l 1 水平升高，i l 1 还可协同t n f a 启动l p s 相关疾病的反应，它与t n f a 一样，可通过促进与机体炎症反应过程相关物质基因的表达和改变某些酶的活 性，从而影响机体正常状态。败血症病人死亡率的升高也与i l 6 的水平上升有 关，但与t n f a 、i l 1 不同的是，i l 一6 本身除引起发热和急性期蛋白外，没有他 们所引起的毒性效应。l p s 诱导产生的i f n y 则可通过巨嗷细胞产生t n f 、h 2 0 2 等，促使炎症反应及休克的发生。 4 ) l p s 致病的信号通路 9 t o l l 样受体的跨膜信号转导途径 在t l r s 介导的该通路中，l p s 刺激信号经过l b p 和c d l 4 分子的传递后， 在m d 2 的协同下与细胞表面的t l r 4 结合；t l r 4 接受刺激信号后构象改变， 发生二聚化，募集下游分子m y d 8 8 ；m y d 8 8 作为广泛存在的接头蛋白，起着衔 接作用，它通过其c 末端的t i r 区与t l r 的t i r 区以同源结合方式直接相连， 同时又通过其n 一末端的死亡结构域( d d ) 与白介素1 受体相关激酶( i r a k ) 的死亡结构域相互作用，从而使t l r m y d 8 8 i r a k 共同形成受体复合物，并使具 有丝氨酸苏氨酸蛋白质激酶活性的i r a k 发生自身磷酸化；浚复合物聚集在细 胞膜附近，对信号跨膜转导起关键作用【39 1 。自身磷酸化的i r a k 又将肿瘤坏死因 子受体相关因子一6 ( t r a f 6 ) 这一接头蛋白募集至t l r m y d 8 8 i r a k 受体复合 物，引起t r a f 6 寡聚化而激活；转移生长因子1 3 活化激酶1 ( t a k 一1 ) 能借助 其结合蛋白( t a b ) 与活化的t r a f 6 结合，而t a k 1 活化后又能进一步激活 n f kb 诱导激酶( n l k ) 和i kb 激酶( 1 l k ) ，使i k k 磷酸化、降解，n f 活 化向核内迁移，同时通过t o l l 途径进化成保守中间体( e c s i t ) ，使全长的m e k k 加工成具有活性的m e k ，进而导致活化蛋白1 ( a p 1 ) 转录因子家族中的j u n 和f o s 也被活化，n f kb 和a p 一1 转录因子的活化最终促进核内细胞因子基因的 转录表达 4 0 1 。 丝裂原活化的蛋白激酶信号通路 l p s 与受体c d l 4 的结合还可通过细胞内酪氨酸激酶或g 蛋白偶联的信号途 径以激活细胞内重要的蛋白激酶丝裂原活化的蛋白激酶( m a p k ) 家族的成 员，从而对内毒素信号进行转导。在该通路中，三个连续的细胞内蛋白激酶活化 构成了整个通路的主要环节：l p s 与细胞表面受体结合，启动一系列快速反应如 脂类递质的形成、受体跨膜蛋白胞浆段的磷酸化唰或去磷酸化，引起g t p a s e 通 过接头蛋白在胞浆内侧聚集并激活丝裂原活化蛋白激酶的激酶的激酶 ( m a p k k k ) ，后者通过磷酸化进一步激活双位点特异性的丝裂原活化蛋白激酶的 激酶( m a p k k ) 。此后，m a p k k 对m a p k s 上相邻的苏氨酸和酪氨酸进行双 磷酸化激活m a p k 家族成员如细胞外信号调节激酶( e r k ) 、c j u nn 末端激酶 ( j n k ) 和蛋白激酶p 3 8 等，活化的m a p k 家族成员进入细胞核，引起特异性 激酶、基因调控蛋白和转录因子的磷酸化修饰，最终导致特定基因表达改变而产 i o 生应答，其中p 3 8 能够独立于n f k b 而促进t n f a 、g m c s f 等多种炎症介质的 基因转录，并能在转录后调控表达 4 1 - 4 2 j 。 j a n u s 激酶信号转导和转录激活子( j a k s t a t ) 途径 虽然j a k s t a t 途径是细胞因子信号转导的重要通路，但新近研究揭示陔途 径可能参与l p s 的信号转导途径，并有可能是l p s 诱导炎症介质生成的重要机 制。j a l ( s t a t 途径的信号转导主要由以下三个步骤完成：首先，l p s 与细胞表 面的受体结合后诱导受体二聚化，并通过酪氨酸磷酸化作用激活j a k ：继而活化 的j a k 又反过来磷酸化受体的酪氨酸残基，使之形成s t a t 结合位点，而s t a t 与受体结合后其某个位点的酪氨酸残基也被j a k 磷酸化，使之从受体上解离下 来；最后活化的s t a t 形成同源或异源二聚体转入核内，并与相应基因启动子上 的s t a t 结合位点结合，调节基因的转录。此外j a 列s t a t 的活化还可上调一 些细胞因子受体的表达，这些受体与相应的细胞因子结合后有进一步促进j a k 活化，从而对j a k s t a t 途径进行正反馈 4 3 t 。j a k 还可与体内其他信号通路的激 酶交互调节，成为其中关键的交叉点。 三、细胞凋亡参与l p s 疾病发生 1 细胞凋亡的信号转导通路 1 ) 死亡受体转导途径： 主要通过细胞膜上的死亡受体超家族介导，它与携带凋亡信号的配体结合 后，启动细胞凋亡效应机制。该途径中，死亡受体与相应的配体结合后被激活， 一方面膜上的鞘磷脂被水解产生神经酰胺( c m ) ，引起胞浆c e + 浓度升高，从 而激活依赖c a 2 + 的核酸酶导致凋亡效应的出现。另一方面，死亡受体通过其 胞内段的死亡结构域募集胞质中的调节分子，再通过调节分子的死亡效应结构域 ( d e d ) 和c a s p a s e 8 酶原的d e d 相互作用形成诱导死亡信号复合体。引起 c a s p a s e 一8 酶原聚集于细胞质表面，当酶原达到一定浓度，就进行同性活化，分 子的两个亚单位相互靠近剪切，自身水解成为有活性的蛋白酶c a s p a s e 一8 ，而后 通过异性活化，相继催化水解下游的同源酶c a s p a s e - 6 、c a s p a s e - 7 或c a s p a s e 一3 ， 对细胞成分执行剪切，导致细胞发生包括d n a 片段化、染色质凝聚、膜呈泡状， 细胞内陷分解为由膜包被的凋亡小体等凋亡过程( “l 。 2 ) 线粒体转导通路： 线粒体参与捅亡转导的机制主要涉及两个方面：线粒体质膜的通透性改变和 线粒体物质的释放反应。线粒体通透性转变是细胞凋亡发生的先导，在各种促凋 亡信号作用下，线粒体通透性转变孔( p t p ) 不可逆过度开放，导致线粒体跨膜 电位崩解下降，呼吸链解偶联，线粒体基质渗透压升高，线粒体膨胀，外膜破裂， 细胞骨架被破坏，引起凋亡。同时由于外膜的破裂，位于线粒体膜间隙的细胞色 素c ( c y tc ) 等大量线粒体物质释放至胞浆，胞质c y tc 则和凋亡蛋白酶活化因 子a p a f - 1 羧基端的w d 4 0 重复序列结合，促使a p a f - 1 发生寡聚化，同时通过 a p a f - i 氨基端的c a s p a s e 募集结构域( c a s p a s er e - e m i t m e n td o m a i n ，c a r d ) 募 集胞质中的c a s p a s e 9 酶原，形成死亡信号复合体。引起c a s p a s e 9 酶原进行自 我剪切而活化，激活下游c a s p a s e 3 ，完成对其相应底物的切割，引起细胞凋亡1 4 “。 3 ) 内质网转导通路 内质网在凋亡信号处理过程中也发挥重要作用。内质网受到凋亡信号刺激 后，应激诱导胞内的c a s p a s e 1 2 表达，同时也导致胞质的c a s p a s e 7 转移到内质 网表面。c a s p a s e 一7 激活c a s p a s e - 1 2 ，激活后的c a s p a s e - 1 2 可进一步剪切c a s p a s e 一3 而引发凋亡。在这一凋亡通路中，c a 2 + 的调节发挥重要作用f 4 矾。 4 1 通路之间的相互联系 b c l 一2 家族成员b i d 连接死亡受体通路和线粒体通路，经死亡受体通路激活 的c a s a s e 8 可切割b i d 为活性的t b i d ，引起后者移位，诱发线粒体上b c l - - 2 家 族其他成员的基因表达变化，从而促进线粒体凋亡通路的活化。 内质网通路和线粒体通路之间存在密切的联系，内质网c a 2 + 的释放是线粒体释 放c y tc 的一个早期事件，促凋亡b c l 2 家族成员b a k 和b a x 可迅速清空内质网 c a 2 + ，使线粒体对c a 2 + 内流和c y t c 释放敏感，从而调节线粒体信号通路。 内质网膜上的b a p 3 1 可被死亡受体通路中的c a s p a s e 一8 特异剪切，c a s p a s e _ 8 对内 质网b a p 3 1 的剪切诱导c e + 依赖的线粒体分裂，提高c y t e 的释放；而未剪切的 b a p 3 l 与内质网的a 4 蛋白牢固结合，抑制f a s 诱导。 5 ) c a s p a s e 通路的激活 从以t 凋亡转导通路所述可知，尽管凋亡信号以及随后的反应途径多种多 样，但是他们在细胞凋亡后期的共同途径是c a s p a s e s 的激活。c a s p a s e s 在细胞凋 亡中所起的作用主要包括：激活的c a s p a s e s 可以水解包括细胞调节、细胞信号 转导、d n a 修复、组织平衡、细胞存活等环节中重要的蛋白，从而使细胞表现 为凋亡特有的形态学及生化特征：细胞皱缩、断裂，染色质聚集，d n a 降解， 以及随后的凋亡细胞被吞噬细胞迅速地清除等。 2 l p s 诱导凋亡及其致病 细胞凋亡作为维持机体内环境稳定、发挥积极防御功能的重要措施，多年来 关于其在l p s 相关疾病发生过程中的作用一直是研究者关注的热点。近年来随 着研究的目益深入，细胞凋亡作为l p s 新的致病机制的观点正在逐渐成为共识。 截止目前，已有充足的实验资料显示l p s 可以诱导单核一巨噬细胞、淋巴细胞、 中性粒细胞、内皮细胞、上皮细胞、胰岛细胞、纤维原细胞等多种细胞的凋亡m 4 7 - 4 9 o 例如，休克时全身细胞，包括血管内皮细胞、中性粒细胞、单核一巨噬细胞， 除了可发生变性坏死外都可发生细随 凋亡。给小鼠腹腔注射内毒素数小时后，出 现大量的肠黏膜上皮细胞凋亡。用盲肠结扎穿刺术造成败血症模型18 2 4 h 后小 鼠肺泡上皮细胞、肝星形细胞、肾小管上皮细胞以及心肌细胞都出现不同程度的 凋亡。这些凋亡的作用过程不完全相同，l p s 可以通过激活单核一巨噬细胞、中 性粒细胞、纤维原细胞等释放t n f ，a 、i l 1 等细胞因子，促使凋亡相关受体如 f a s 、t l r 2 、c d l 4 等表达增加，引起细胞凋亡；也可诱导巨噬细胞、胰岛细胞 等分泌n o 、i n o s 等生物活性物质，通过线粒体通路引起细胞凋亡。 细胞在l p s 的诱导作用下发生凋亡后引起的一系列反应会导致很多l p s 疾 病的发生。l p s 诱导的胰岛细胞凋亡在引起胰岛素分泌功能障碍过程中起重要作 用，l p s 通过整体作用诱导炎症细胞和胰岛细胞i n o s 活化表达产生n o ，而由 n o 生成的过氧化硝基化合物( o n o o