（生物化学与分子生物学专业论文）serratia+plymuthica+csrb家族+srnas的功能分析.pdf

1 0 7 如 学位论文版权使用授权书 江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致， 允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入中国 学位论文全文数据库并向社会提供查询，授权中国学术期刊( 光盘版) 电子杂 志社将本论文编入中国优秀博硕士学位论文全文数据库并向社会提供查询。 论文的公布( 包括刊登) 授权江苏大学研究生处办理。 本学位论文属于不保密口。 学位论文作者签名：专耙 沙。1 年彳月i6 日 、 ， 指导教师签名：女1 3 j 鍪艺 2 , oi1 年6 月l6 r s e r r a t i a p l y m u t h i c ac s r b 家族s r n a s 的功能分析 f u n c t i o n a la n a l y s i so ft h ec s r b f a m i l ys m a l l n o n c o d i n gr n a s i ns e r r a t i a p l y m u t h i c a 姓 2 0 1 1 年6 月 江苏大学硕士学位论文 摘要 目前在细菌中已经鉴定了大量小r n a 参与调控许多重要的生命活 动。然而小r n a 在沙雷氏菌属( s e r r a t i a ) 中的作用还了解得很少。其 中r s m b 属于c s r b 家族的小r n a ，是翻译阻遏蛋白r s m a 的拮抗剂。 普城沙雷氏菌( s e r r a t i a p l y m u t h i c a ) g 3 分离自小麦内茎，是一种能产多 种抗菌因子和植物激素的内生细菌。 本研究旨在以g 3 菌株为模式细菌，构建c s r b 家族同源s r n a s r s m b & r s m c 的突变体，进一步通过表型分析和蛋白质组学技术初步 探讨了r s m b 介导的转录后全局调控机制。得出主要结论如下： ( 1 ) 通过基因同源重组构建了r s m b 、r s mc 基因删除、插入突变 菌株，并构建了相应的互补菌株和空载体对照菌株。 ( 2 ) 比较分析野生菌g 3 与突变体a r s m b 、r s mc 和a r s m b c 等衍生菌株的胞外酶、运动性、生物膜和抑菌活性等生防相关表型， 表明r s m b 正调控蛋白酶和几丁质酶活性、抑菌活性和生物膜的形成， 同时影响运动性，r s m b 突变体s w i m m i n g 和s w a r m i n g 能力减弱。另 外，r s m b 正调控群体感应( q u o r u ms e n s i n g ，q s ) 信号a h l s 的产生， 说明g 3 菌株中r s m 系统位于q s 信号通路的上游，形成复杂的调控 网络。 ( 3 ) 比较蛋白质组学分析g 3 和厶r s m b 的全细胞蛋白表达谱，有 1 3 3 个差异点，质谱鉴定出5 9 个点，其中上调的点3 8 个，下调的点 2 1 个。这些点如琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白亚基影响细菌的拮抗作用，蛋 白分解伴侣对胞外蛋白的分泌有重要意义，同时转录调节蛋白、g r e a 、 n u s g 和p 因子调节r n a 的水平和蛋白表达。 以上结果说明c s r b 家族小r n a 对sp l y m u t h i c a 内生菌株g 3 的生 s e r r a t i ap l y m u t h i c ac s r b 家族s r n a s 的功能分析 理功能具有重要的调控作用，为探索生防菌分子调控的机制提供了基 础。 关键词：s e r r a t i a p l y m u t h i c a ，小r n a ，r s m b ，r s m c ，生防相关表型， 蛋白质组学 i i 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t n o n c o d i n gr e g u l a t o r yr n am o l e c u l e s ( n c r n a s ) ，a l s ok n o w na ss m a l l r n a s ( s r n a s ) h a v eb e e ni d e n t i f i e di naw i d er a n g eo fb a c t e r i aa n df o u n d t op l a yc r i t i c a lr e g u l a t o r yr o l e si nm a n yb i o l o g i c a lp r o c e s s e s a l t h o u g h m o s to ft h e s es r n a ss e e mt of u n c t i o nb yb a s ep a i r i n gw i t hm r n a s ，t h e c s r bs r n a f a m i l ya c t sb ys e q u e s t e r i n ga nr n a b i n d i n gr e g u l a t o r yp r o t e i n c s r ao rr s m a i th a sb e e nk n o w nt h a tt h er s ms y s t e mp a r t i c i p a t e si n g l o b a lr e g u l a t o r yc i r c u i t st h a tc o n t r o lc e n t r a lc a r b o nf l u x ，t h ep r o d u c t i o no f e x t r a c e l l u l a rp r o d u c t s ，c e l lm o t i l i t y , b i o f i l mf o r m a t i o n ，q u o r u ms e n s i n ga n d p a t h o g e n e s i sd e p e n d i n go nt h ep a r t i c u l a rb a c t e r i u m h o w e v e r , i t sf u n c t i o n i nt h eg e n u so fs e r r a t i ar e m a i n sl e s su n d e r s t o o d s e r r a t i ap l y m u t h i c ag 3 w a sa ne n d o p h y t i cs t r a i ni s o l a t e df r o mo fw h e a tw i t hap o t e n t i a lt op r o d u c e a v a r i e t y o fa n t i f u n g a l f a c t o r s ，s u c h a st h ea n t i b i o t i c p y r r o l n i t r i n ， e x t r a c e l l u l a rc h i t i n a s ea n dp r o t e a s e ，a n ds i d e r o p h o r e s ，a sw e l la sp r o d u c t i o n o fi a af o rp l a n tg r o w t hp r o m o t i o n i nt h i ss d u t y ，w ep e r f o r m e dp r e l i m i n a r yi n v e s t i g a t i o no nt h eg l o b a l p o s t - t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t o r ym e c h a n i s m so ft h er s m b - l i k es r n a sf r o m s t r a i ng 3a n dt h em a j o rr e s u l t sa c h i e v e da r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) w ec o n s t r u c t e dr s m ba n dr s m cg e n ed e l e t i o na n di n s e r t i o n m u t a n t s ，c o m p l e m e n t a r ys t r a i na n d c o n t r o ls t r a i n ( 2 ) c o m p a r a t i v ea n a l y s i so f b i o c o n t r o l r e l a t e dt r a i t sf o rt h ew i l d t y p eg 3 a n dt h em u t a n t si nr s m ba n dr s m cs h o w e dt h a tr s m b p o s i t i v e l y r e g u l a t e dp r o t e o l y t i ca n dc h i t i n o l y t i ca c t i v i t i e s ，a n t i f u n g a la c t i v i t ya n d b i o f i l m f o r m a t i o n ，a sw e l l a s s w a r m i n g a n d s w i m m i n gm o t i l i t y a d d i t i o n a l l y , ar s m bm u t a n ti s d e f e c t i v ei np r o d u c t i o no fq ss i g n a l m o l e c u l e s ，a h l si m p l y i n gt h a tt h er s ms y s t e ml o c a t e si nt h eu p s t r e a mo f q ss i g n a l i n gt oi n t e g r a t ei n t oac o m p l e xn e t w o r k si ng 3 i i i s e r r a t i ap l y m u t h i c ac s r b 家族s r n a s 的功能分析 ( 3 ) c o m p a r a t i v ep r o t e o m i c sa n a l y s i so fe x p r e s s i o np r o f i l e so ft h e w h o l ec e l lp r o t e i n sf r o mt h ew i l dt y p es p l y m u t h i c ag 3a n dt h e a r s m b m u t a n t ，w ef o u n d1 3 3d i f f e r e n t i a le x p r e s s i o np r o t e i ns p o t sa n di d e n t i f i e d5 9 p r o t e i n sb ym a l d i t o fm a s ss p e c t r o m e t r y a m o n gt h e m ，i n c l u d i n g3 8 u p - r e g u l a t e ds p o t sa n d2 1d o w n r e g u l a t e ds p o t s ，i n c l u d i n gs o m ep o i n t s ， s u c ha ss u c c i n a t e d e h y d r o g e n a s e i r o n s u l f u r p r o t e i n s u b u n i t so f a n t a g o n i s t i cb a c t e r i a ，p r o t e i nd e c o m p o s i t i o np a r t n e r s e c r e t i o no f e x t r a c e l l u l a rp r o t e i n sa r ei m p o r t a n t ，w h i l et r a n s c r i p t i o nr e g u l a t o r yp r o t e i n s ， g r e a , n u s ga n dp f a c t o rr e g u l a t i n gt h el e v e lo fr n aa n dp r o t e i n e x p r e s s i o n t h er e s u l t sa b o v es u g g e s tt h a ts r n ar s m bo fs p l y m u t h i c ag 3 p l a y e da ni m p o r t a n tg l o b a lr e g u l a t o r yr o l ea tt h ep o s t t r a n s c r i p t i o n a ll e v e l i nb a c t e r i a l p h y s i o l o g y ，i t w i l lh e l pt of u r t h e re x p l o r et h em o l e c u l a r r e g u l a t o r ym e c h a n i s mi n v o l v e di nb i o c o n t r o lo fs t r a i ng 3v i ac o m p l e x g e n e t i cn e t w o r k s k e y w o r d s ：s e r r a t i a p l y m u t h i c a , s r n a s ，r s m b ，r s m c ， i v b i o c o n t r o l r e l a t e dp h y n o t y p e s ，p r o t e o m i c s 江苏大学硕士学位论文 第一章前言 目录 1 1 1 生物防治1 1 1 1 植物内生细菌。2 1 1 2 沙雷氏菌属与生物防治。3 1 2 s r n a s 4 1 2 1s r n a s 的调控原理5 1 2 2r s m bs r n a 及同源物的调控作用5 1 3 生物膜6 1 3 1 细菌生物膜定义6 1 3 2 生物膜的作用6 1 3 3 生物膜的形成过程一7 1 4 运动性8 1 5 次级代谢产物8 1 6 群体感应的作用1 0 1 7 本研究的目的和意义。1 0 1 8 研究的内容和技术路线1 0 1 8 1 研究内容1 0 1 8 2 技术路线。1 1 第二章s e r r a t i a p l y m u t h i c ag 3 的r s m b ，r s m c 基因克隆及突变体的构建1 2 2 1r s m b 、r s m c 的基因克隆1 2 2 1 1 材料1 2 2 1 2 方法1 4 2 1 3 结果与分析1 5 2 2 突变体的构建1 6 2 2 1r s m b 、r s m c 基因突变体构建流程图。1 6 2 2 2r s m b 、r s m c 基因删除突变体的构建1 7 2 2 3 突变体互补、对照的构建1 8 2 2 4 结果与分析1 8 2 3r s m b 、r s m c 基因的结构预测1 8 2 4 讨论与小结2 0 v s e r r a t i ap l y m u t h i c ac s r b 家族s r n a s 的功能分析 第三章突变分析r s m b 、r s m c 基因的功能 3 1 3 2 3 3 3 4 第四章 4 1 4 2 4 3 4 4 第五章 5 1 5 2 材料一2 2 方法。2 2 3 2 1 突变对a h l 信号产生的影响2 2 3 2 2 突变对生物膜形成产生的影响2 2 3 2 3 突变对其它生防相关表型产生的影响2 2 结果与分析2 2 3 3 1突变对a h l 信号产生的影响2 2 3 3 2 突变对生物膜产生的影响2 3 3 3 3 突变对蛋白酶和几丁质酶活性产生的影响2 3 3 3 4 突变对泳动运动性产生的影响2 4 3 3 5 突变对群集运动( s w a r m i n g ) 产生的影响2 5 3 3 6 突变对病原真菌的平板拮抗产生的影响2 5 讨论与小结。2 6 比较蛋白质组学分析s e r r a t i a p l y m u t h i c ar s m b 的功能2 7 实验仪器与材料2 7 4 1 1 实验仪器2 7 4 1 2 实验材料2 8 4 1 3 二维电泳相关试剂及其配置方法2 8 方法3 0 4 2 1 细菌全蛋白的提取与浓度测定3 0 4 2 2 二维电泳3 1 4 2 3 质谱鉴定3 1 结果与分析3 2 4 3 1 双向电泳结果3 2 4 3 2 质谱鉴定结果3 3 讨论与小结3 7 总结与展望。4 0 主要工作总结4 0 工作展望4 0 参考文献 致 谢 在校期间发表文章 参加课题 v i 4 2 4 8 4 9 4 9 江苏大学硕士学位论文 第一章前言 由于化学农药的长期、大量使用，有害生物已经产生很强的抗药性，许多害 虫的天敌被灭杀，致使一些病虫害十分猖獗，而且化学农药污染水体、大气和土 壤，并通过食物链进入人体，危害人类健康【1 1 。利用生物防治病虫害，能有效地保 护天敌，消灭害虫，对人畜危害小，对环境污染小，相对于化学农药来讲，其对 病虫害的控制作用具有持久性、效果显著性等特点，在绿地防护中具有广阔的发 展前景【2 】。 1 1生物防治 生物防治是利用有益生物或其他生物来抑制或消灭有害生物的一种防治方 法。内容包括：( 1 ) 利用微生物防治。常见的有应用真菌、细菌、病毒和能分泌 抗生物质的抗生菌，如应用白僵菌防治马尾松毛虫( 真菌) ，苏云金杆菌各种变种 制剂防治多种林业害虫( 细菌) ，病毒粗提液防治蜀柏毒蛾、松毛虫、泡桐大袋蛾 等( 病毒) ，5 4 0 6 防治苗木立枯病( 放线菌) 微孢子虫防治舞毒蛾等的幼虫( 原生 动物) ，泰山1 号防治天牛( 线虫) 。( 2 ) 利用寄生性天敌防治。主要有寄生蜂和 寄生蝇，最常见有赤眼蜂、寄生蝇防治松毛虫等多种害虫，肿腿蜂防治天牛，花 角蚜小蜂防治松突圆蚧。( 3 ) 利用捕食性天敌防治。这类天敌很多，主要为食虫、 食鼠的脊椎动物和捕食性节肢动物两大类。鸟类有山雀、灰喜雀、啄木鸟等捕食 害虫的不同虫态。鼠类天敌如黄鼬、猫头鹰、蛇等，节肢动物中捕食性天敌有瓢 虫、螳螂、蚂蚁等昆虫外，还有蜘蛛和螨类。 利用生态系统中各种生物之间相互依存、相互制约的生态学现象和某些生物 学特性，以防治危害农业、仓储、建筑物和人群健康的生物的措施。 传统的生物防治主要是研究有益微生物的活体应用，而现在生物防治生物放 置的趋势则是研究自然界中某些微生物对植物病原菌的抗生作用、空间竞争、重 寄生、促进植物生长以及诱导植物产生系统抗性等机制，从而为有效利用微生物 提供了理论基础【3 1 。 s e r r a t i a p l y m u t h i c ac s r b 家族s r n a s 的功能分析 1 1 1植物内生细菌 很早以前人们就发现在健康植物组织的内部有微生物存在，这类微生物被称 为植物内生菌( e n d o p h y t e ) ，但由于内生菌生活在没有外在感染症状的健康植物组织 内部，其存在和作用长期以来一直被人们所忽视。自2 0 世纪3 0 年代发现造成畜 牧业重大损失的牲畜中毒是由于食用了感染内生真菌的牧草，内生菌的研究才得 以深入地开展进来。植物内生细菌是从表面消毒的植物组织中分离得到或从植物 内部获得的、能够定殖在健康植物细胞间隙或细胞内，并未使植物的表型特征和 功能发生改变的细菌【4 】。植物本身就是一个复杂的微生态系统，不仅在植物体表存 在大量的细菌，而且在植物内部组织也存在大量的细菌【5 】o 目前，研究的关于微生 态的植物已经达到上百种，其中研究最多的植物有小麦、高粱、水稻、棉花、马 铃薯、番茄、黄瓜、甜菜等。人们不仅从不同植物上分离到了不同的内生细菌， 而且在同一种植物上的分离部位也趋于多样化。分离涉及到的内生细菌约有5 0 个 属，这大大拓宽了细菌的分类范围【6 】。 直到9 0 年代末，内生细菌才有了一个比较全面准确的定义，即植物内生细菌 是能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立和谐关系而不引起植物 病症的一类微生物门。目前，人们在3 0 多种植物的不同器官中分离到5 4 个属1 2 9 个 种的内生细菌。其中以假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l i u s ) ，肠杆菌 属但，l 纪，d 施c 把r ) 和土壤杆菌属似g r d 施c 纪，玩朋) 为主【8 1 。普遍认为植物内生细菌具有 如下特征：一是能在活体植物内定殖：二是不引起寄主植物组织结构发生明显变 化；三是在正常情况下，一般不引起寄主植物出现病害症状。 植物内生细菌产生两种主要的效应，一是通过增加根系的发育来促进植物从 土壤中吸收养分的能力和辅助植物吸收磷。二是植物内生细菌能够控制植物病害。 植物内生细菌对在被污染的土壤中生长的植物有积极的促进作用。为了更好的理 解植物与细菌的相互作用，根瘤内生细菌的差异性和根瘤菌与寄主植物的相互作 用是首要研究的【9 1 。 微生物接种的植物不仅改善了植物的营养生长、生理特性、p r 蛋白和酚含量， 除此之外还降低了植物病害的发生率【1 0 】。 2 江苏大学硕士学位论文 1 1 2 沙雷氏菌属与生物防治 沙雷氏菌属是革兰氏阴性杆菌，是肠杆菌科的一部分，大多数的沙雷氏菌具 有周生鞭毛，并利用它运动【l l 】。沙雷氏菌在土壤，水和植物表面广泛存在。现在 已经报道的沙雷氏菌有：s e r r a t i ae n t o m o p h i l a ，f i c a r i a ，sf o n t i c o l a ，sg r i m e s i i ， s 1 i q u e f a c i e n s ，s m a r c e s c e n s ，s o d o r i f e r a ，s p l y m u t h i c a ，s p r o t e a m a c ut a r s s q u i n i v o r a n s ，sr u b i d a e a 和su r e i l y t i c a 。某些类型的粘质沙雷氏菌是人类的条件 致病菌，临床表明它能侵袭病人的机体并引起尿路感染、肺部感染、心内膜炎、 脑膜炎及烧伤后败血症等疾病，但是有部分沙雷氏菌具有生防作用，如已经报道 的有：朋r c b 虻绷一1 2 1 ，s p r o t e a m a c u l a n s 1 3 1 ，se n t o m o p h i l a l l l l 。 关于沙雷氏菌的生防机制已经报道了很多，抗生素、几丁质酶、蛋白酶、营 养成分的竞争都有可能是生防菌抑制病原菌生长的机制。粘质沙雷氏菌株通过产 生几丁质酶，水解昆虫幼虫体表和中肠围食膜的几丁质，加速幼虫罹病进程，提 高幼虫死亡率1 1 4 】；植物内生菌s p l y m u t h i c a g 3 是可以产生是一种产几丁质酶，i a a ， 抗生素硝吡咯菌素的植物内生细菌，研究表明g 3 不仅可以通过产生抗生素对土传 病害有直接的生防效果，还具有诱导系统抗病性的潜能，可有效防治气传叶部病 害；粘质沙雷氏菌n 4 5 具有产生几丁质酶和蛋白酶的能力，同时可以产生灵红菌 素和表面活性剂，n 4 。5 菌株产生的灵红菌素可以直接抑制由终极腐霉菌引发的黄 瓜幼苗腐烂病；在新西兰，c o s t e l y t r az e a l a n d i c a 幼虫可以破坏牧草的根，减少三 叶草和苜蓿草的产量，s e n t o m o p h i l a 作为生防因子可以抑制幼虫的摄食能力，幼 虫被感染以后1 3 个月死亡【1 5 】。p l y m u t h i c a 菌株i c l 2 7 0 和i c l 4 可以产生几丁 质酶和硝吡咯菌素，两者都能有效地抑制橘子上的青霉和绿霉，研究表明i c l 2 7 0 和i c l 4 不仅能有效地拮抗土传病害，还可以控制橘子收获后产生的疾病。i c l 2 7 0 主要通过与病原菌竞争营养物质来抑制病虫害的成长，而i c l 4 则主要通过抗生素 和几丁质酶的直接抑制病原菌的生长f 1 6 1 。群体感应和细胞密度依赖的基因调节研 究表明，它们对定植和抑制病原菌有重要作用，它们抑制病原菌可能通过两种途 径，第一是通过调节细菌产生的信息素，第二是可以促进不同菌株的交流来共同 抑制病原菌【1 7 1 。 3 s e r r a t i a p l y m u t h i c ac s r b 家族s r n a s 的功能分析 1 2s r n a s 生物体中的r n a 依据功能可分为很多类型，其中m r n a 、t r n a 、r r n a 是人 们熟知的3 个主要类型长期以来人们一直致力于大分子r n a 的研究，近年来随 着对r n a 分子研究的深入，具有调控功能的非编码小r n a 分子( s m a l ln o n c o d i n g r n a ，s r n a ) 日益引起人们的重视，其存在于所有的生物体中，从真核的哺乳动物 一直到原核的细菌均有分布【1 8 , 1 9 】。 真核生物中的非编码r n a 分子的研究起步较早，相对于真核生物中的非编码 小r n a 分子而言，原核生物中非编码小r n a 分子的起步较晚，但是近年来研究 迅速【1 9 】。近年来，非编码的小r n a 分子也在原核生物中被发现，与真核生物中 非编码小r n a 分子类似，他们也主要是作为一种调节因子来调控m r n a 的翻译 和稳定性。对于原核生物小r n a 分子的研究最主要还是集中在细菌，尤其是大肠 杆菌中。随着近年来的研究在细菌中已经确定了超过1 5 0 多个小r n a 分子，其 中，在大肠杆菌中发现了约8 0 种s r n a 。在其他细菌中也有一些发现，如枯草芽 孢杆菌、霍乱弧菌、铜绿假单胞菌、葡萄球菌和单核细胞增多性李斯特菌等 2 0 l 。 细菌中的非编码小r n a 分子一般称为s m a l ln o n c o d i n gr n a s ( s r n ao r n c r n a ) ，大部分细菌小r n a 不编码蛋白质( 只有1 2 的小r n a 分子被发现是 具有编码蛋白质功能) ，而是参与体内的调控活动，目前已经证明s r n a 可以参 与生物体的各种生命活动，包括翻译的调控、铁的代谢、膜蛋白的生物合成、糖 代谢、群体感应以及致病菌的致病力调节等生命过程【1 8 m 】。与真核生物中的非编 码小r n a 分子不同，在细菌等微生物中s r n a 的转录产物一般不经过加工，通常 开始于一段能折叠成稳定茎环结构的序列，转录终止于一个r h o 不依赖的转录终 止子，茎环结构有助于稳定整个分子【1 9 】。对这些s r n a 体内稳定性的直接测试表 明大多数s r n a 明显比m r n a 稳定【1 9 1 。细菌中的s r n a 的来源有2 种形式：已 发现的大部分s r n a 是由位于2 个蛋白编码基因之间的非编码区( i n t e r g e n i c r e g i o n s ，i g r ) 序列转录而来；小部分s r n a ( h 前确认只有r y e b 和s r a c r y e a ) 是从 m r n a 的头部或尾部非翻译区剪切下来的【1 9 】，目前这一类型的s r n a 虽然较少， 但这一发现对研究s r n a 的功能、结构及起源具有重要意义，并且使人们更进一 步认识到s r n a 的复杂性。 4 江苏大学硕士学位论文 1 2 1 s r n a s 的调控原理 s r n a s 的功能和作用机制1 ) 与蛋白构成复合体发挥功能如4 5 s r n a 与蛋白 质构成复合体共同形成信号识别颗粒，参与蛋白质合成后的靶向运输。2 ) 模拟其他 核苷酸结构发挥功能如6 s r n a 。大肠杆菌的r n a 聚合酶是一个多亚基酶，其 中的6 亚基是识别启动子序列和转录起始所必需的，6 s r n a 结构与6 亚基识别的启 动子相类似，所以6 s r n a 可以模拟6 亚基识别的启动子与6 亚基结合，从而影响了 转录的过程。3 ) 通过与靶r n a 分子配对发挥功能这是s r n a 发挥功能最为普 遍的一种机制。通过影响其翻译效率和稳定性来发挥调节功能小r n a 。其中，第3 类小r n a 分子是迄今为止发现最多，也是研究最透彻的一类，主要以不完全碱基配 对方式与靶标m r n a 57 端相互作用进而发挥其生物学功能【1 8 。2 1 1 。 1 2 2r s m bs r n a 及同源物的调控作用 r s m b 基因编码的产物是一种s r n a ，在多数细菌中具有重要的调控作用，影 响细菌的胞外蛋白酶产生，运动性，毒力和生物膜的形成【1 0 ，2 2 1 。而且与群体感应 系统( q u o r u ms e n s i n g )，g a c a g a c s 双因子信号转导系统( g a c a g a c s t w o c o m p o n e n ts y s t e m ) 和r n a 结合蛋白r s r n a 相互作用，形成复杂的级联反应 1 2 3 - 2 5 】。细菌中主要有两类s r n a s ，一类为h f q 家族s r n a s ，一类为r s m a 家族 s r n a s 2 2 , 2 6 】。：第一类h f q 家族的s r n a s ，如d s r a 、o x y s 、r p r a 等，主要特征是 能有效地与r n a 伴侣蛋白h f q 结合，并通过与靶标m r n a 碱基配对调控其翻译 起始和稳定性( 如胁迫和稳定期的。因子r p o s ) ，在调控细菌的应激反应和毒力因 子等方面起重要作用【2 2 捌。第二类c s r b r s m b 家族的s r n a s ，以基因序列中存在 不配对的重复的g g a ( 或g g n a ) 基序为特征，通过多价螯和翻译阻遏蛋白c s r a ( c a r b o ns t o r a g er e g u l a t o r ) ，或其同源物r s m a ( r e g u l a t o ro fs e c o n d a r ym e t a b o l i s m ) ， 解除其翻译抑制，调控靶标m r n a 的翻译起始。同时c s r b r s m b 的转录受 g a c s g a c a 双因子系统的活化，从而形成g a c r s m 信号转导级联反应。随物种不 同，该系统参与碳贮藏、胞外产物合成、细胞运动性、生物膜形成、致病性和q s 等多种细胞生理过程的调控1 2 2 , 2 3 , 2 7 】。 迄今植物相关细菌中s r n a s 的研究主要限于软腐细菌e r w i n i ac a r o t o v o r a 和生 防细菌p s e u d o m o n a s f l u o r e s e n sc h a o 。ec a r o t o v o r a 中由r s m a r s m b 组成的r s m 5 s e r r a t i ap l y m u t h i c ac s r b 家族s r n a s 的功能分析 系统是q s 系统调控胞外酶、i i i 型分泌系统和致病性等所必需的。而只f l u o r e s e n s c h a 0 菌株中鉴定了3 个s r n a 卜球s i i ，r s m y ，r s m z ，可同时鳌合多个翻译阻 遏蛋白r s m a 和r s m e ，在转录后水平正向调控抗生素氢氰酸h c n ，间苯三酚 d a p g 和蛋白酶等抗真菌物质的产生，因此是发挥其生防活性所必需的 2 s - 3 0 】。 1 3 生物膜 1 3 1 细菌生物膜定义 细菌生物膜( b i o f i l m ，b f ) 是菌体附着到物体表面后分泌粘性胞外聚合物并在 其中生长繁殖而形成的细菌群落【3 1 1 。细菌生物膜广泛存在于含水和潮湿的各种表 面上，绝大多数细菌是附着在有活性或无活性物体( 自来水管道，工业管道、医 疗器械和人或动物的体内外) 的表面，以生物膜( b i o f i l m ) 形式生长，而不是以浮游 ( p l a n k t o n i c ) 形式。在植物中，植物支持细菌各种各样的的相互关系，包括根上和根 的周围，脉管系统和空气中的组织上的寄生，共生和共栖。这些微生物对植物的 健康和产量有深远的影响。细菌和表面相互作用形成复杂的多细胞生物或者是多 物种的集合，包括生物膜和小的聚集物【3 2 1 。近年来通过激光共聚焦扫描显微镜、 原子力显微镜、扫描电子显微镜等先进仪器的观察，进一步揭示了生物膜的真实 结构，生物膜不再被看做是一个连续的层状结构，而是一个组成成分复杂、具有 三维结构和信息传递系统的复杂的社会群体心【3 3 1 。 1 3 2 生物膜的作用 细菌以生物膜的形式存在增强了细菌对外界环境压力和极端条件的抵抗力， 对杀菌剂的耐力，同生生物的新陈代谢或者水平基因转移的机会。高种群密度提 供了执行某一过程的机会，但是单细胞不能有效地完成，比如分泌代谢产物或者 胞外酶的产生，它们只有在细菌密度达到一定阈值时才能产生，而生物膜的形成 是保持细胞临界数量的一种方式。对病原菌来说，生物膜的形成，使他们对抗生 素和宿主免疫防御机制的抗性很强，从而导致严重的临床问题，尤其是慢性和难 治的感染性疾病。对生防细菌来说，生物膜用来开启与植物有利的或者是拮抗的 作用【3 4 1 。 6 江苏大学硕士学位论文 1 3 3 生物膜的形成过程 生物膜可由纯菌种形成，也可由多菌种组成在多菌种生物膜中，不同菌种 在不同的时间和空间发展，存在着菌种的交替演变通过对生物膜形成过程的观 察，发现生物膜多细胞结构的形成是一个动态过程，这一过程包括细菌起始粘附、 生物膜粘附期、生长期、成熟和播散期等阶段，而生物膜细菌在各阶段则具有不 同的生理生化特性【3 1 3 5 3 8 1 。 ( 1 ) 粘附期：细菌借助鞭毛或者型菌毛首先运动到需要粘附的表面，粘附是 生物膜形成的第一步【绷。粘附作用主要是细菌表面特定的粘附素蛋白( a d h e s i n ) 识 别宿主表面受体( r e c e p t o r ) 的结果。浮游细菌首先粘附到物体表面，启动物体表面 生物膜形成单个附着细胞仅由少量胞外聚合物包裹，实际上这些附着的细菌还 未进人生物膜的形成过程，很多菌体还可以重新进入浮游生活方式，这时的粘附 是可逆的f 3 5 】。 ( 2 ) 生长期：细菌完成粘附以后，即调整其基因表达，在生长繁殖的同时分泌 大量胞外聚合物，这时细菌会产生大量的胞外多糖稳定生物膜，形成二维结构。 当与其它细菌相遇形成微菌落，大量微菌落不断堆积使生物膜加厚。 ( 3 ) 成熟期：成熟的b f 形成高度有组织的结构，利用激光共聚焦显微镜( c o n f o c a l s c a n n i n gl a s e rm i c r o s c o p e ，c s l m ) 观察到成熟b f 结构是不均匀的，即具有不均质性 ( h e t e r o g e n e i t y ) ，它是由类似蘑菇形状的微菌落组成的，在这些微菌落之间围绕着 输水通道，可以运送养料、酶、代谢产物和排出废物等f 3 9 1 。因此，有人将成熟的 生物膜内部结构比喻为原始的循环系统。 ( 4 ) 播散期( d e t a c h m e n o - 播散是一个用于描述细菌从生物膜或载体表面释放出 来的习惯用语。成熟生物膜通过蔓延、部分脱落或释放出浮游细菌等方式进行扩 展，从生物膜中脱落或释放出来的细菌重新变为浮游生长的细菌，它们又可以在 物体表面形成新的生物膜。 细菌生物膜作为相对新兴的研究领域，并无多少被广泛认可的标准方法。现 在人工生成生物膜的方法有很多，人工生物膜发生装置主要有试管法、微孔板法、 置片法、平板膜片法、管路法、流室法和旋碟法；生物膜检测技术主要有：菌体 计数法、染色法、荧光法、激光共聚焦显微镜、电子显微镜法和原子力显微镜。 7 s e r r a t i ap l y m u t h i c ac s r b 家族s r n a s 的功能分析 1 4 运动性 细菌通过运动来寻找营养物质，小生态位，对定植和致病性具有重要作用。 细菌的运动方式一般有三种：i ) s w i m m i n gm o t i l i t y ( 泳动运动) ，这主要依靠极化 鞭毛，这种运动可以在低琼脂培养基上观测到。在研究p s y r i n g a ep v t a b a c i 时发 现，鞭毛的糖基化在s w i m m i n g q b 起到重要作用，它可以稳定细丝的结构并润滑鞭 毛束的旋转。i i ) s w a r m i n gm o t i l i t y ( 群集运动) ，是指运动细菌以群体方式在培 养基表面由接种点向周围进行的依赖鞭毛的迁移运动。这种运动发生在半固体培 养基表面，这种运动需要鞭毛，生物表面活性剂，胞外多糖。群集运动的关键是 鞭毛的生物合成；f l h d c 鞭毛操纵子是支配分化和迁移的细菌调控网络的焦点。菌 细胞密度、表面接触和生物学信号均可成为群集运动的刺激因素【4 1 】。i i i ) s l i d i n g m o t i l i t y ( 颤搐运动) ，这种运动需要i v 型菌毛调节，这种运动主要发生在表面的界面。 a l b e r t i 和h a r s h e y 在研究s m a r c e s c e n ss w i m m i n g 和s w a r m i n g 两种运动形式 时细胞的状态时发现，当它们在s w i m m i n g 运动时，细菌是短的杆状只有一个到两 个鞭毛，展现了经典的s w i m m i n g 行为，而在s w a r m i n g 运动是，细菌形态发生了 改变，它们停止了分离，开始拉长并且表达可很多鞭毛( 约1 0 个到1 0 0 个) ，这 些表毛覆盖了细胞的侧面【4 2 1 。 对植物根际菌来说，细菌借助于运动性选择有效养分的植物表面，如 a b r a s i l e n s e 利用趋氧性来鉴别最佳氧密度，这样可以使它正常呼吸而不抑制固氮 酶，趋氧性和其它引诱物促进a b r a s i l e n s e 根际定植【4 3 1 。不同