（应用化学专业论文）萘系DNA靶向分子和汞离子生物探针的研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 通过琼脂糖凝胶电泳、荧光光谱、d n a 熔解温度曲线、细胞抑制试验等方法研 究了新的8 氧- 8 h 苊并 1 ，2 _ b 】毗咯9 腈类d n a 靶向分子a 1 a 5 与d n a 的相互作用 和抗肿瘤活性。结果表明，具有烷基氨取代的化合物a 1 通过静电吸引、嵌入两种方 式与d n a 作用，并且在长波长光( k 4 0 0 n m ) 激发下产生单线态氧切刻m 1 3m p l 8 单链环形d n a ，最低作用浓度5 0 u m 。其d n a 结合常数较a 2 a 5 高出1 0 1 0 0 倍， 达到2 6 2 1 0 6 f 1 。通过a 1 a s 的比较也表明碱性支链的引入在某种程度上确实具有 促进化合物生物活性的作用。以h e l a 细胞为靶细胞，通过m t t 比色法进一步证明 了该化合物比较理想的细胞毒性，其i c 5 0 8 “m 。尤其，a 1 的吸收波长为5 7 0 n m ， 作为一个长吸收波长的、具有d n a 光敏活性和比较高的细胞毒性的新化合物，a l 将可能成为一个很有价值的抗肿瘤光动力治疗先导化合物。 将原创性的汞离子荧光分子探针i i p n p 和e p n p 进一步发展应用到细胞生物学、 医学和植物学领域。结合激光共聚焦电子扫描显微镜，在哺乳动物细胞和植物细胞， 均首次实现了在o , m 水平上，高选择性、定量、可视化地研究单个活细胞内的汞离子。 在急性低浓度汞胁迫下，肾小管上皮细胞中的h 9 2 + 主要分布在细胞核周和核膜上； 在转m e r b 基因烟草细胞内，h 9 2 + 主要富集在叶绿体。通过对两个结构近似的探针获 得的生物学结果的比较还得出化合物性质与生物体系中行为的关系：h p n p 较强的水 溶性使其更适于在时间上反映h 9 2 + 进入细胞的过程；而e p n p 由于具有合适的两亲 性，具有本底低、成像清晰等特点，更适于研究细胞内h 9 2 + 的空间分布。提出了新 的生物研究用化学传感器的分子设计原则。 关键词：d n a 靶向分子；单线态氧；嵌入；汞离子荧光分子探针：活细胞 萘系d n a 靶向分子和汞离子生物探针的研究 a san o v e lf a m i l yo fd n a - t a r g e tm o l e c u l e s ，8 - o x o - 8 h a c e n a p h t h o 1 ，2 - b 】p y r r o l e - 9 - c a r b o n i t r i l ea n di t s d e d v a t i v e s ( a 1 - a s ) t h e i ri n t e r a c t i o nw i md n a a n da n t i t u m o r a b i l i t i e sa r ee v a l u a t e db ya g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s , f l u o r e s c e n c es p e c m m 1 ，d n am e l t c u r v e s ，c y t o t o x i c i t ye x p e f i e a c e t h er e s u h s i n d i c a t et h a tt h e c o m p o u n da 1w i t ha d i e t h y l a m i n eg r o u pc a l lb i n dt od n at h r o u g he l e c t r o s t a t i ca t t m 硝o n sa n di n t e r c a l a t i o n a n dt h e ng e n e r a t es i n g l e to x y g e nt oc l e a v em 1 3m p l 8s i n g l es t r a n dc i r c u l a rd n a u n d e r t h ei r r a d i a t i o no f l o n gw a v e l e n g t hl i g h t ( l 4 0 0m 吣，t h el o w e s te f f e c t i v ec o n c e n t r a t i o ni s 5 0 m ，i t sd n a b i n d i n gc o n s t a n ti s2 6 2 x 1 0 6 m 1w h i c h i s1 0 - 1 0 0t i m e sm o r et h a na 2 - a 5 t h ec o m p a r i s o no fa 1 - a 5a l s os h o w st h a tt h eb a s i cs i d ec h a i ni n d e e dc a l l p r o m o t e b i o l o g i c a l a b i l i t i e s o f c o m p o u n d m t t ( t h i a z o l y lb l u e ) t e s ta g a i n s t h e l ac e l l f u r t h e r m o r ep r o v e st h a ti c s 0o fa 1i s6 8 眦儿w h i c hi st h eh i g h e ra n t i c a n c e ra c t i v i t y e s p e c i a l l y , t h ea b s o r p t i o nw a v e l e n g t ho fa 1i s5 7 0 r i m ，w h i c hi l l a k e sa 1b eav a l u a b l e l e a d i n gc o m p o u n df o rt h es a f e a n t i t t t m o r p h o t o d y n a m i ct h e r a p e u t i ca g e n t sw i t hl o n g w a v e l e n g t h t w o o r i g i n a lh g ”f l u o r e s c e n c es e n s o r s ，h p n pa n de p n p ，赶ed e v e l o p e d t oa p p l yo n c e l lb i o l o g y b yl a s e rs c a n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p e ，t h es t u d yo fm e r c u r i ci o ni n s i n g l e l i v i n g c e l lo fm a m m a l i a na n dp l a n ti s h i g hs e l e c t i v e l y , q u a n t i f i c a t i o n a l l ya n dv i s i b l y a c h i e v e df o rt h ef i r s tt i m e ，u n d e rt h ea c u t es t r e s so fl o wc o n c e n t r a t i o nh 9 2 + 。i nh u m a n k i d n e yp r o x i m a lt u b u l a re p i t h e l i a lc e l l ，h 9 2 + m a i n l yl o c a t e sp e r i n u c l e a ra n do nn u c l e a r m e m b r a n e ；i nw a n s g e n i ct o b a c c oc e l l ，h 矿a c c u m u l a t e so i 1c h l o r o p l a s t b yc o m p a r i n gt h e b i o l o g i c a lr e s u l t so f t h et w of l u o r e s c e n c es e n s o r sh a v i n gs i m i l a rc h e m i c a ls t r u c t u r e s ，t h e r e l a t i o nb e t w e e nc o m p o u n dp m p e r 口a n di t sa c t i o ni nb i o l o g i c a ls y s t e mi ss u m m a r i z e d ： h p n pi ss u i t a b l et or a p i d l yr e f l e c tt h ep e r m e a b i l i t yr a t eo f r i 9 2 + i n s i d ec e i ls i n c ei ti sm o r e h y d r o p h i l i c ，w h i l et h ep r o p e ra m p h i p a t h yo f e p n p m a k e si t sb a c k g r o u n df l u o r e s c e n c el o w a n d i m a g i n gc l e a r , w h i c hi sm o r es u i t a b l ef o rr e s e a r c h i n gl o c a t i o no f i n t r a c e l l u l a r h g 计 k e y w o r d s ：d n a - t a r g e tm o l e c u l e ；s i n g l e to x y g e n ；i n t e r c a l a t i o n ；h 矿f h i o r e s e e n e e s e n s o r ；l i v ee e l l n 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得 大连理工大学或其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢 意。 作者签名：日期： 大连理工大学硕士学位论文 l 绪论 最近的2 0 3 0 年间，是现代生命科学迅速发展的年代。所有学科都在为认识生 命的本质作贡献。特别是化学学科，因为在分子水平上认识生命体系的过程，其核心 是化学的。其中，设计并发展用作抗癌药物的d n a 靶向化合物，及化学传感器作为 荧光探针，在分子水平上实现活细胞实时、视见的研究这两个新兴的研究领域，就是 化学为解决生命科学中重要问题所做的突破性贡献。 1 _ 1d n a 靶向化合物与d n a 相互作用概述 1 9 5 3 年w a t s o n 和c r i c k 提出d n a 的双螺旋结构模型，从分子水平上阐述了生 命遗传信息通过d n a 的半保留复制机理，因而有关生物基本遗传物质d n a 的研究 也就成为分子生物学和生物化学的重要课题，其中以d n a 为作用靶点的分子，即 d n a 靶向分子与d n a 之间相互作用的研究一直受到关注。早在6 0 年代，意大利、 法国、日本及美国的一些实验室就开展了有关d n a 一葸环抗生索道诺霉素 ( d a u n o m y e i n ，d n m ) j 1 1 合物的研究，发现蒽环化合物通过其带正电荷的糖残基与d n a 之间的静电作用及蒽环平面与d n a 的嵌入结合而形成加合物。道诺霉素的抗癌作用， 与其能够和d n a 形成加合物也是密切相关的。分子生物学和分子药理学的发展使人 们能够从基因水平上理解某些疾病的发病机理，并通过分子设计来寻找有效的治疗药 物。d n a 靶向化合物成为很重要的药物选择对象。临床上使用的许多抗癌药物都以 d n a 为作用的主要靶点，通过与癌细胞d n a 发生相互作用破坏其结构，进而影响基 因调控与表达的功能，表现出抗癌活性。一些抗病毒药物如治疗艾滋病的药物也是以 d n a 为作用靶点的分子。此外，一些致癌物也能与d n a 形成加合物，这种d n a 加 合物也是可能癌变的预警标志物。 因此，d n a 与其靶向分子相互作用的研究不论是对阐述抗癌、抗病毒药物的作 用机理、药物的体外筛选，还是对致癌物的致癌机理的研究都是非常有意义的。 1 1 。1 不同d n a 靶向化合物与d n a 的相互作用 影响d n a 靶向分子与d n a 相互作用的因素很多，最重要的是分子结构。因此， 1 萘系d n a 靶向分子和汞离子生物探针的研究 探讨d n a 靶向分子的结构与其对d n a 的识别模式和其生物活性之间的关系，对于 设计具有特定功能的d n a 靶向分子是很重要的。 1 金属配合物 无机金属离子配合物，尤其是过渡金属离子配合物构成了d n a 靶向化合物的一 大类，这类化合物具有两大用途：( i ) 可望设计成人工核酸酶，从而实现对d n a 链 上某些位点的特异性剪切；( 2 ) 可望设计并合成出性能优良的抗肿瘤药物或抗病毒剂。 a ) 金属卟啉配合物金属卟啉是一类广泛存在于自然界中的生物活性物质。阳离 子的四( 4 - n - 甲基吡啶基) 卟啉( t m p y p ) 及其金属配合物比阴离子型卟啉对癌细胞的光 动力效应强，因而被当作d n a 靶向模型化合物而广泛研究，其结构见图1 1 。研究 表明，这类阳离子卟啉不仅在癌症与肿瘤的光动力疗法中有诱人的前景，而且具有抗 逆转录病毒作用。一般认为，没有轴向配体的金属卟 啉阳离子优先嵌入结合在5 c g 3 ( c = 胞嘧啶；g = 鸟嘌 呤) 序列的碱基对平面之间【l 】，同时引起d n a 构象相 应的变化。具有轴向配体的金属卟啉阳离子因其产生 较大的空间阻碍，则以空间匹配及静电作用优先对 d n a 螺旋小沟中连续的a t ( a = 腺嘌呤：t = 胸腺嘧啶、 碱基对 a 。i t 。( n 2 ) 识别。除了中心金属离子、卟啉母 图l - 1m ( t m p y - p ) 的姑构 核上的取代基体积及卟啉的荷电性以外，溶液的离子( t m p y - p ) m - - m e t a l i o i l s 强度也是影响卟啉和金属卟啉与d n a 结合模式的一个重要因素。遗憾的是，虽然有 关卟啉删a 间相互作用的研究已开展很多，但迄今尚未找到不同结合模式与其生 物活性间的关系，因此探讨在生物体内具有最佳活性的作用模式十分重要。 另外，卟啉分予在与d n a 结合的基础上，经过光活化，电化学活化【2 或在氧及 其它化学活化剂如超氧化物离子 3 】存在的情况下，能选择性地断裂d n a ，因此可将 其看作是双功能化合物。并且这种双功能性可通过修饰而将其设计成序列选择性更好 的人工核酸酶或抗癌药物。 b ) 铂配合物 自6 0 年代r o s e n b c r g 发现顺二氯二氨合铂( 1 1 ) 的抗癌活性以来， 有关顺铂及其它具有类似结构的平面四边形铂配合物的抗癌活性研究一直非常活跃 【4 。目前除顺铂及卡铂已用于临床外( 其结构见图1 2 ) ，还有几种也已处于临床实 大连理工大学硕士学位论文 验阶段。大量研究表明，这类药物的抗 癌活性与其能和d n a 链共价结合并导 致d n a 结构变化的能力密切相关。有关 铂抗癌药物的结构与其生物活性及毒副 性间的关系，h a m b l e y 做了详细的综述。 由于顺铂及其类似物具有很强的毒副作 x ： ( 1 ) n h 3 n h 3 图1 2 顺铂及卡铂的化学结构 f 弛1 2s t r u c t u r eo f c i s - p l a t i n ( a ) a n dc a r b o p l a t i n ( b 用，而且某些肿瘤对它们产生抗药性，所以开发能克服抗药性或具有广谱抗肿瘤活性 的铂配合物成为目前及今后研究的重点。s a d l e r 等合成了一种双( 氨基膦) 铂配合物 c s p t c i m e 2 n ( c h 2 ) 2 p p h 2 - n , p m e 2 n ( c h 2 ) 2 p p h 2 p c 1 ，与顺铂相比，该配合物能够 以一种新的螫合物开环机理选择性地与d n a 碱基g 结合，并且a 2 7 8 0 细胞系对其所 产生的抗药性要比顺铂低得多。 2d n a 靶向抗生素 a ) 多肽及蛋白质类抗生素 博莱霉素( b l e o m y c i n ，b l m ) 是一种天然存在的糖肽，是 此类抗生素的代表，临床上常被用来治疗 头、颈及鳞状细胞癌。其结构通常可分为 3 个功能区( 见图1 3 ) ：n - 端，主要与金 属离子和氧结合并切断d n a ：糖残基被认 为是分子对细胞表面进行识别的功能区； 由二噻唑与不同阳离子取代基所构成的 c - 端则构成d n a 的识别区。b l m 的抗癌 活性被认为是在f e 或c u 等具有氧化还原 图1 3 b l m 的结构 f i g i 3s t r u c t u r eo f b l m 活性的金属离子与氧同时存在的条件下，断裂d n a 所致。虽然b l m 分子对单链d n a ( s s d n a ) 的切割机理已比较清楚，但它对d s d n a 的序列特异性切割机理直到最近 才有较多报道。v a n d e r w a l l 等提出一种新的模型，认为b l m 分子无需从d n a 链上 解离，即可同时催化互补的双链被切割。当然b l m 能对d n a 进行序列特异性剪切 首先取决于c 一端对d n a 的识别。有关b l m d n a 识别的模式也有不同的解释【5 ，6 。 m a n d e r v i l l e 等 7 】用二维n m r 及约束分子动力学方法对z n ( i i ) - b l m 与一种核苷酸 八聚物d ( c g c t a g c g ) 2 的相互作用进行研究，认为b l m d n a 间究竟采取何种结合 萘系d n a 靶向分子和汞离子生物探针的研究 模式取决于d n a 的碱基序歹i j 。进一步的研究将通过对b l m 分子不同功能区的修饰， 以增强其对d n a 分子的特异性识别能力，并降低其毒副作用及某些肿瘤细胞对其所 产生的抗药性。 近年来，从海洋生物中还发现了一系列高活性的抗癌肽，其结构多为小分子环肽。 它们不仅抗癌活性高，且稳定性好。有关此类抗癌肽作用机制的研究尚需进一步探索。 b ) 葸环抗生素 葸环抗生素是一类研究得比较多的抗癌抗生素，阿霉素( a d r i a m y - e i n , a d m ) 、道诺霉素( d n m ) 是这一家族中比较重要的两种抗生素，其结构见图1 4 。 此外还有诺加霉素( n o g a l a m y e i n , n g ) 、阿克拉霉素a 等，其共同的结构特征是含有 一个由3 个共平面的六元环所构成的四氢并四苯醌发色团。 关于a d m 的生物活性机理研究，迄今有两 种观点：一种认为a d m 直接与d n a 相互作用( 即 经典的嵌入结合) 而导致对d n a 复制及转录过 程的抑制【8 】；另一种观点则认为a d m 可诱导氧 自由基的形成，从而导致对核酸的切割。 w e i n e r 等 9 】用电子顺磁共振方法( h e e t r o n p a r a m a g n e f i cr e s o n a n e e , e p r ) 分掰研究了a d m 图1 ，4d n m 和a d m 的结构 与d s d n a 、s s d n a 及t r n a 的结合作用，认为 f i g 1 4s 劬。“”8o f 研q m ”d a d m a d m 必须先与核酸结合，然后才可产生能切割核酸的一o h ，这与s c h u s t e r 等人的观 点相似【l o 】，即认为具有蒽醌结构的衍生物可以被设计成入工核酸酶，并且与含双功 能基团的天然核酸内切酶相比，蒽醌衍生物具有结构简单、合成方便等优点，因此有 很大的研究与应用价值。 f r e d e r i c k 等【8 】研究发现，d n m 与a d m 相比虽然仅在c 1 4 位上存在着微小差别， 却导致了溶液中的溶剂分子、离子或其它一些大配体如聚胺、蛋白质等对 d n m ， d m m 叮a 加合物产生不同的作用。此研究结果有助于指导改进现有药物的化 学结构，从雨改善其生物活性。 蒽环类抗生素的共同缺点是骨髓抑制作用及造成的心脏毒性比较大，因而i 艋床应 用上受到定的限制。近来人们已致力于发展疗效相当而心脏毒性较小的药物，其中 蒽毗唑类成为较有希望的替代品，其结构为在a d m 的发色团上并上一个吡唑五环， 大连理工大学硕士学位论文 保持嵌入d n a 所需平面型及静电要求，但能够阻止半醌自由基的形成( 半醌自由基 的形成被认为是导致膜骺过氧化，引起组织损害的主要原因) d l ，1 2d n a 靶向分子与d n a 相互作用模式 虽然d n a 靶向化合物的数量非常之大，但是与d n a 的结合模式归纳起来大致 可以分为非共价结合、共价结合和剪切作用三类。 l 非共价结合 ( 1 ) 静电结合，即分子通过非特异性的相互作用结合于带负电荷的d n a 双螺旋 外部。通常认为这种作用模式在作为药物的应用上价值不大，但也并非完全如此。例 如，t m p y p 金属卟啉带正电的侧链与d n a 磷酸酯骨架问的静电作用对它能嵌入结合 在g c 碱基对之间起了必不可少的稳定作用。 ( 2 ) 嵌插结合，即在碱基对之间嵌入平面的或几乎平面的芳香环系统。嵌插结合 的作用力来自芳环的离域霄体系与碱基的丌体系间的聊c 相互作用及疏水相互作用。 这是药物分子与d n a 发生作用的最重要的形式之- - 1 1 。通常稠合芳环体系都倾向 于结合在g c 富集区，而对于一些含有庞大取代基的分子，如吡啶环取代的卟啉分子 在与d n a 作用时，吡啶环取代基会尽量旋转，以保持与母环的共平面，从而形成良 好的堆积形状与d n a 碱基嵌合。当d n a 靶向分子嵌入d n a 碱基对之间后，有的可 以直接抑制d n a 复制与转录的功能：有的则在经过进一步活化后如光照下产生羟基 自由基、单线态氧、超氧化自由基、超氧化阴离子自由基等活性物质，使d n a 断裂、 受损，从而影响其功能。 ( 3 ) 沟结合，即d n a 靶向分子与d n a 的大沟或小沟的碱基对边缘直接发生相 互作用。通常非稠合的芳环体系能通过一定的旋转后结合在小沟中a t 富集区，并且 在靶向分子的供体基团与小沟中a 的n 3 或t 的0 2 这些受体问常常有氢键形成。纺 锤菌素和h o e c h s t 3 3 2 5 8 两种经典的小沟结合分子与d n a 切割剂( 如阳离子卟啉) 连接 后，可以得到亲和性及对a t 序列选择性都明显增强的人工核酸酶。近年来发展起来 的反义寡聚核苷酸，因其能按照严格的碱基对互补原则，通过h o o g s t e e n 氢键结合在 双螺旋d n a 的大沟中而形成局部的三螺旋结构，因而可精确识别核酸所携带信息的 特# f i n y ) j 。因此一方面可通过将一些具有特定功能的活性基团缀接于寡聚核苷酸末 萘系d n a 靶向分子和汞离子生物探针的研究 端，而得到高度选择性的人工核酸酶或药物分子原型；另一方面如己知靶分子的核苷 酸序列，有可能根据反义寡聚核苷酸的碱基序列直接写下抑制物的化学结构，这点十 分有利于药物分子的合成。 2 共价结合以及剪切作用 与非共价结合作用相比，d n a 靶向分子与d n a 共价结合的序列特异性识别能力 要强得多。例如d u o c a r m y c i n 及其衍生物，只能在d n a 小沟中对a t 富集区识别，分 子中活泼的环丙烷与小沟内特定碱基序列中a 的n 3 共价结合后导致在该位点脱去嘌 呤 1 2 1 。晶体衍射及其它一些方法也都证实了顺铂中的p t 原子能够与d n a 小沟中同 一条链上相邻鸟嘌呤【d ( g p g ) 的n 7 共价结合形成链内加成物，并使d n a 双链解 旋及产生弯曲。 b l m 是一种典型的d n a 切割化合物，分子结构的特殊性使其能够识别并结合在 d n a 中5 g c 3 序列的鸟嘌呤上，然后经一系列活化反应最终导致d n a 断链，这 种双功能性对于设计人工核酸酶及发展有效的抗肿瘤药物都具有非常重要的指导意 义。事实上，已经有大量研究根据这一原理把对d n a 具有剪切功能的分子与特异性 识别d n a 序列的分子连接起来，获得序列特异性更高的人工核酸酶或抗肿瘤药物。 1 1 3 常用研究方法及其特点 d n a 与其靶向分子间的相互作用研究，以其在药物设计与合成及药物作用机理 研究方面的重要意义，引起众多学者的兴趣。许多方法及技术被引入此研究领域。 1 凝胶电泳 凝胶电泳是生物学中用来研究d n a 与其它分子相互作用最基本的手段。它可以 考察d n a 剪切或其它分子与d n a 螺旋共价结合留下的永久性“痕迹”，研究其它分 子与d n a 作用的序列特异性问题。在凝胶电泳中所用到的d n a 可以分为三类：质 粒d n a ；单链环型d n a ；线形双链d n a 。它们在其它分子作用下的损伤情况如图 1 5 所示，质粒d n a 超螺旋结构中的一条链被切刻变成松散型进一步损伤变成碎片 结构；单链环型d n a 可以被其它分子切刻为线形，进一步损伤变成小片段：线形双 链d n a 被损伤成为碎片。 大连理工大学硕士学位论文 质粒d n a 卜 鞴利眦o 一呻 线形双链d n a= 斗一三 图1 5 d n a 损伤示意图 f i g 1 5i l l u s t r a t i o n o f d n a d a m a g e 2 光谱法 d n a 分子中的碱基具有光学活性，在2 6 0 n m 附近处有吸收。许多d n a 靶向分 子或本身具有光学活性，或与d n a 结合后产生光学活性，因此用光谱方法通过考察 d n a 结合其靶向分子后结构上的变化来研究结合机理，是非常有效和应用最为广泛 的方法。其中紫外，可见吸收光谱及荧光光谱是研究d n a 与其靶向分子相互作用的最 方便、最常用的技术。通常其它分子与d n a 结合后会导致d n a 吸收谱带变宽、吸 收峰红移及减色效应或其它分子荧光强度的减弱( 若d n a 靶向分子本身具有荧光) ， 尤其是当其它分子以嵌入方式结合在双螺旋碱基对之间时，变化会更加明显 1 3 。而 线二色光谱( l d ) 由于采用了与固定光轴方向平行或垂直的平面偏振光，不仅能快速 区分经典的嵌入结合作用与沟结合、静电结合等其它模式，而且还可以获得d n a 靶 向分子结合在d n a 螺旋上时准确的方向信息及动力学数据。与其类似的圆二色光谱 ( c d ) 则是以高频变换的左旋或右旋偏振光作为入射光，一方面根据d n a 在2 6 0 r i m 处的吸收能提供有关其结构的信息；另一方面对一些本身虽然没有c d 信号，但在与 d n a 结合后能产生诱导c d 的分子，可获取有关其结构的间接信息。 共振喇曼光谱( r r ) 及时间分辨共振喇曼光谱技术( t r 3 ) 近年来在d n a 加和 物的结构研究中应用较为普遍【1 4 】。该方法的最大优点就是通用性好，因而不论在均 相还是多相介质中都可以方便地应用，并有可能提供多相微环境对其它分子与d n a 相互作用的影响 1 5 】。 3 电化学方法 用电化学方法研究其它分子与d n a 的相互作用，虽然受到分子有否电活性的限 萘系d n a 靶向分子和汞离子生物探针的研究 制，但对于一些吸收及荧光比较弱，或由于其电子跃迁谱带与d n a 的发生重叠，而 无法用诸如紫； t - 1 可见、荧光等方法来研究的分子，却有可能直接或间接地用伏安法 进行研究1 1 6 1 8 1 。尤其是对于些主要通过静电结合模式与d n a 作用的分子，采用 表面电化学方法可获得许多其它方法无法得到的信息。 此外还有许多其它物理化学方法，诸如：平衡渗析、粘度测定、x 射线晶体衍射 及n m r 等被用于d n a 靶向分子与d n a 相互作用机理的研究。总之，对于d n a 靶 向分子d n a 复杂体系的研究，仅仅用单一方法是远不能令人满意的，必须综台运用 各种方法和手段进行全方位的研究才能得到比较可靠的结论。 1 1 4d n a 靶向化合物研究展望 综上所述，人们对于d n a 与靶向分子相互作用的研究取得了一定成果。当然， 也还存在许多有待解决的问题。可以预计今后的研究将会在以下几方面有新的发展。 ( 1 ) 进一步深入研究d n a 靶向分子的作用机理，通过构效关系的研究，发现活性 基团或者高活性取代基的位置，和分子内电子排布规律，用于指导以d n a 为作用位 点的新药的合成及体外筛选工作。 ( 2 ) 设计、合成具有高度专一性的人工核酸酶。对于基因分离、大片段基因序列 分析以及肿瘤基因治疗等方面的研究将具有重要的意义。 ( 3 ) 合成有效的光物理、光化学d n a 结构探针，将有助于阐明d n a 高级结构的 生物学意义。 1 2 1 荧光分子探针在活细胞可视化研究中的意义 近年来，荧光染料作为功能性色素在科学技术的各个领域得到广泛应用。尤其作 为分子探针在生命科学【1 9 ，2 0 1 、超分子光化学【2 1 ，2 2 】方面的研究在全世界范围内备 受瞩目，是目前热门的研究课题之一。 二十世纪九十年代中期的重要科技成果基因芯片的关键技术之就是对核苷酸 的荧光标记【2 3 。荧光团( 即荧光染料母体) 上引入活性基团 19 ，如琥珀酰亚胺， 大连理工大学硕士学位论文 异硫氰酸酯，马来酰亚胺等，可以与生物分子上的氨基、巯基等基函通过共价键特异 性结合，从而对生物分子进行荧光标记。标记后的生物分子的各种变化，比如蛋白质 在细胞内的扩散和分布，构像变化等，可以很方便地用荧光检测。 除了标记用荧光探针( 带活性基团) 外，研究更多的是分子识别用荧光探针。这 类探针结构中含有荧光团和受体单元 2 4 】。客体分子与受体单元相结合，并影响荧光 团的光物理性质，通过荧光的变化直观的体现客体的存在。客体与受体的结合作用多 数情况下是分子间的弱键作用，如氢键，范德华力，库仑力，冗兀作用等。由于小分 子对生物大分子机能具有非常重要的调控作用，而且活体环境非常复杂，实现活细胞 中组分分析是在细胞水平上了解生化反应的基本要求，因此设计高灵敏、高选择性的 荧光分子探针并且实现活细胞内实时视见的研究具有重要的理论和实用价值。 细胞是生命体的最基本单位，对它的可视化研究尤其具有科学意义。“活细胞实 时视见研究”就是要研究单个分子，或者两个以上分子的运动轨线( t r a j e e t o r y ) ，或分子 闻相互作用的空闻、时间以及动力学过程，从而为细胞内分子的活动及作用提供直接、 真观的材料。以往对细胞内分子分子相互作用的理论及结论，基本上都是以浓度变 化、药理学效应这样一些资料得出的。迄今为止，对单个分子在单个活细胞环境下是 如何运动和相互作用的，它的轨迹如何，研究还很不深入。 现代科学技术的进步使得很多方法都可以对活细胞进行可视化分析研究。这里仅 对几种主要的物理和化学方法进行简单评述。 1 显微技术 显微技术具有直观、立体的特点，特别适于细胞分析。 光镊法是利用光与物质问动量传递的力学效应而形成的研究三维梯度光学势阱。 由于光镊具有微米的精确定位、选择个体、在生命状态下进行操作的特点，非常适合 生物细胞、亚细胞层次的研究。而较新的扫描电化学显微镜( s e c m ) 和原子力显微 镜( a f m ) 是一种超高分辨的表面分析技术，它们对活细胞的生物生理以及精细结 构等也可以进行观察研究。但是，这些技术都会损伤细胞，这个缺陷不利于准确的反 映活细胞的生理病理状态。因为对单个活细胞的分析研究要建立在其来受任何外界条 件影响的情况下的真实有效的分析。一旦活细胞因在分析过程中受到外界物理或化学 的刺激，就会引起一定的生理变化，从而导致分析结果的不准确性。 萘系d n a 靶向分子和汞离子生物探针的研究 而激光扫描共聚焦显微术，可在无任何损伤情况下，对单个活细胞作断层扫描， 细胞中任何局部的变化，在很短的时间内就能观察到，收集的数据通过功能强大的计 算机处理，进行三维显示。另外，紫外激光光学显微术 2 5 】，激光诱导特征荧光显微 术等都可以用于对单个活细胞进行无损分析。各种高分辨的新型显微镜将会在今后细 胞立体彩色成像分析中起更突出的作用。 2 化学标记技术 化学标记技术是研究活细胞实时视见问题的重要手段。其中光学技术是最受人关 注的方法，这是因为光子对受研究分子的扰乱最轻微，其结果更为可靠和赢截了当。 而在光学技术里，荧光最多被选用，因为它的测量灵敏度高，就活细胞单分子实时视 见研究而论，荧光标记技术是惟一的方法。 绿色荧光蛋白随着对基因的表达调控，蛋白质在活细胞中自然状态下的变化等 重要问题研究的深入，迫切需要一种操作方便，不用加外源底物，就能在活细胞中检 测的分子探针。1 9 9 4 年发现的绿色荧光蛋白( g r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 就能满 足以上要求 2 6 1 。在转g f p 基因动物研究中，不用破碎组织或外加底物，通过荧光显 微镜就能显示目的基因在动物中的表达情况：在活细胞蛋白的功能研究中，通过g f p 还可以实时观察外界信号刺激下，目的蛋白的变化过程。但是，绿色荧光蛋白还存在 些不足，如：g f p 的荧光敏感度较低，单细胞观察荧光需要一定的分子数，当温度 稍高时( 3 7 x 2 ) 荧光消失，此外，g f p 本身是一个有2 3 8 个氨基酸残基的大分子，能 否找出分子量较小的标记物，有待探索。 荧光共振能量转移荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c et e s o l l a l l o _ ee n e r g yt r a n s f e r ， f 强) 是近年来生命科学领域出现的一种崭新技术，利用这种技术能够定时、定量、 定位、无损伤检测活细胞内蛋白质一蛋白质间的相互作用 2 7 ，2 9 。荧光共振能量转 移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到 更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的 受体分子转移( 即发生能量共振转移) 。f r e t 作为生物系统中的“光谱尺”，其最为经 典和广泛的应用是测量蛋白结构中两个位点的位置和在液体中它们的聚集及其拓扑 结构。但是，目前对于f r e t ，已经做了大量的两个分子间相互作用的实验，而单个 分子与单个分子间的共振能量转移还刚刚开始。 大连理工大学硕士学位论文 综上所述，为了改进现存荧光检测方法的不足，我们应该着手予对特定分子的特 异性荧光分子探针的开发，尤其是低分子量、高光学效率荧光分子探针的设计与应用 研究。设计精巧的化学荧光标记技术具有来源稳定、操作安全方便、光学性能好、实 时在线等优点，可以将细胞光学特性与生物学特性紧密地联系起来，对活细胞中的离 子、酶、基因等进行分析。此外，荧光显微技术也是细胞内微环境观测的一种有用的 工具。荧光分子探针和荧光显微镜结合，使单个活细胞结构和功能的分析达到前所未 有的精确性和清晰度，使化学、物理学交叉在生命科学领域，是解决活细胞生命活动 可视化研究的最前沿技术。经过特殊设计的荧光分子探针可以将单个活细胞内微环境 的变化信息转交为光信号，从而使人一分子的对话成为可能，架起宏观世界与微观世 界的桥粱。 1 2 2 荧光分子探针的基本设计原理 通过以上评述，设计高光学效率、对特定分子特异性识别强、耐漂白且分子量小 的荧光分子探针成为我们的目标，如下几个理论可以作为设计荧光分子探针的参考。 光诱导电子转移p e t 2 4 ，2 9 1 ( p h o t o i n d u o e d e l e c a o nt r a n s f e r ) p e t 荧光探针中，荧光团与受体单元之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常 强的淬灭作用，因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光缀弱。一旦受 体与客体相结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射 出强荧光，p e t 荧光探针的作用机制可由前线轨道能量来说明( 见图1 6 ) 。由于与客 体结合前后，荧光强度差别非常大，呈明显的“关”，“开”状态，这类探针又被称做荧 光开关。 e ：壶斗8 l u i 肿疆 国i 6 描述p e t 转换机理的前线轨道能量图 f i g ，1 6 f r o n t i e r o r b i t a le n e r g y d i a g r a me l a b o r a t i n g t h e m e c h a n i s mo f p e ts w i t c h e s 萘系d n a 靶向分子和汞离子生物探针的研究 分子内共轭电荷转移i c t 3 0 】( i n t r a m o l c c u l a rc h a r g et r a n s f e r ) i c t 荧光探针的荧光团具有强的推一拉电子体系，电子供给体与接受体共轭相连， 在光激发下会产生从电子供给体向接受体的电荷转移。i c t 荧光探针的客体受体单元 往往是推一拉电子体系整体中的一部分，多数情况是电子的供给体，但也可能是电子 的接受体。当受体单元与客体结合时，很显然会对荧光团的推一拉电子作用产生影响， 或是减弱了分子内电荷转移，或是强化了电荷转移，从而导致荧光变化。 扭曲的分子内电荷转移t i c t 3 1 ，3 2 】( t w i s i t e d i n l r a m o l e e u l a r c h a r g e t r a n s f e r ) t i c t 实际是i c t 的特例。推一拉电子共轭体系的荧光团中，如果电子供给体( 一 般为二烷基氨基，如二甲氨基) 通过活动的单键与芳环相连，当光激发时，由于强烈 的分子内光诱导电荷转移，连接电子供给体与芳环的单键会发生扭转，使原来与芳环 共平面的电子供给体与芳环平面处于正交状态，原来的共轭系统被破坏，部分电荷转 移变为完全的电子转移，形成t i c t 激发态，原有的i c t 荧光则被淬灭。t i c t 激发 态由于正负电荷的完全分离，具有非常高的极性，因此强极性溶剂有利于t i c t 激发 态的形成，而且由于在极性溶剂中t i c t 态能量降低，波长大幅度红移，并使其与处 于低能级的三线态或基态的能隙大大缩小，大大增加了其非辐射跃迁的凡率，所以， t i c t 态往往是无荧光或者发射非常弱的长波荧光，少数情况下出现i c t 与t i c t 双 重荧光现象。由于t i c t 荧光化合物对各种环境效应非常敏感，因此常常被用于检测 微环境，比如胶束。囊泡，环糊精，分子筛，细胞膜等中的极性，粘度，温度等。 激发单体一激基缔合物 3 3 1 ( m o n o m e r - e x c i m e r ) 激基缔合物是指一个激发态分子与同种化合物的基态分子因电荷转移相互作用 而形成碰撞络含物。激基缔合物形成时，其发射光谱将展现一个新的、强而宽、长波、 无精细结构发射峰。形成激基缔合物需要激发态分子与基态分子达到“碰撞”距离，两 个同种荧光团的距离成为激基缔台物形成和破坏的关键，利用这一特点可以设计荧光 探针。 1 2 3 已经用于活细胞的荧光分子探针 基于以上原理设计的荧光分子探针已有许多应用到活细胞内，这里就它们的生物 大连理丁大学硕士学位论文 应用做些概述。 z n 2 + 离子荧光分子探针 c h r i s t o p h e rj c h a n g e 3 4 荧光素为平台通过亲电取代反应合成了一系列针对 z n ”的p e t 荧光分子探针z p ( 图1 7 ) 。这些探针在神经科学的应用方面具有许多吸引 人的性质，如可见的激发和发射光谱，这可以减少细胞和组织的损害并且可以避免细 胞的自发荧光；在生物体丰富的c a 2 + 、m 9 2 + 存在- f f x , j - z n 2 + 的高选择性：结合z n 2 + 后的 荧光增强比起传统的基于喹啉的z n 2 + 荧光探针增强5 0 倍。尽管具有这些优点，z p 探针 在细胞内的生物应用方面还是遇到了挑战：受体中结合金属离子的原子在生理条件下 很容易质子化，产生了干扰荧光，这一点严重限制了p e t 探针的生物应用。但是，其 q b z p 3 ( 3 ) 克服了这一点被应用到活细胞中对z n 2 + 进行实时实空监测( 图1 8 ) 。虽然如 z p 3 ( 3 ) 有一些z n 2 + 荧光分子探针能被用于生物体，但是它们仍然面临很多问题如不充 分的选择性和敏感性、荧光强度依赖于探针浓度等。而比例测量荧光分子探针可以避 免这些问题，它们可以缩小仪器效率、探针含量、光照强度、发射光收集率等额外因 素的影响从而减少矫作物并且提供精确的数据，一些探针可以实现细胞内的定量监 测。s a t o k om a r u y a m a 等 3 5 】借助分子内电荷转移机理( i c t ) 作为探针设计的基础， 将苯并呋喃衍生物作为发色团，t p e n 衍生物作为z n 2 + 受体设计并合成了z n a f r 1 和 z n a f r 2 ( 图1 7 ) 。其中当z n a f r 2 分子和z n 2 + 形成复合物时，其激发波长从3